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Livrodebioquimicapratica 140515120506 Phpapp01
Livrodebioquimicapratica 140515120506 Phpapp01
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BIOQUMICA PRTICA
Corpo tcnico:
Colaboradores:
Desing da capa:
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NDICE
Pgina
Apresentao 04
08 Enzimas ................................................................................... 59
REFERNCIAS CONSULTADAS 89
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APRESENTAO
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1. REGRAS GERAIS DE SEGURANA EM LABORATRIO
Vesturio Apropriado
Vesturio NO RECOMENDADO
1. Bermuda ou short.
2. Sandlia, Chinelo, Sapato aberto.
3. Uso de braceletes, correntes ou outros adereos.
4. Avental de naylon ou 100% poliester.
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HBITOS INDIVIDUAIS
Faa no Laboratrio
No Faa no Laboratrio
1. Fumar
2. Comer
3. Correr
4. Beber
5. Sentar ou debruar na bancada
6. Sentar no cho
7. No use cabelo comprido solto
8. No (ou evite) trabalhar solitrio no laboratrio
9. No manuseie slidos e lquidos desconhecidos apenas por curiosidade
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pessoal da coleta de lixo, catadores de lixo etc. Estes, por serem leigos no assunto,
ficam sobremaneira expostos s consequncias do seu manuseio inadequado.
Alm do contato direto com a pele, os diversos agentes qumicos manuseados em
laboratrios podem agredir o organismo humano por trs vias:
a) Por inalao: constitui a principal via de intoxicao. A absoro de gases, vapores,
poeiras e aerossis pelos pulmes e a sua distribuio pelo sangue, que os leva s
diversas partes do corpo, extremamente facilitada pela elevada superfcie dos
alvolos pulmonares. A equivocada cultura de que laboratrios tm naturalmente odor
de produtos qumicos com freqncia leva a atitudes negligentes, provocando efeitos
crnicos sade, com danos muitas vezes permanentes ou irreversveis.
b) Por absoro cutnea: a pele e a gordura protetora so barreiras bastante efetivas,
sendo poucas as substncias que podem ser absorvidas em quantidades perigosas.
Os efeitos mais comuns da ao de substncias qumicas sobre a pele so as
irritaes superficiais e sensibilizaes decorrentes da combinao do contaminante
com as protenas. Como decorrncia destes fatos, o agente qumico pode penetrar pela
pele, atingindo a corrente sangunea. Neste sentido necessrio especial cuidado
quando houver danos integridade da pele feridas expostas devem ser
devidamente protegidas.
c) Por ingesto: pode ocorrer de forma acidental, ou ao ingerir partculas
que estejam retidas no trato respiratrio, resultantes da inalao de ps ou fumos. Os
riscos de ingesto por contaminao das mos e alimentos sero inexistentes se
houver a devida ateno e higiene no trabalho.
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4. No pipete, aspirando com a boca, lquidos custicos, venenosos ou corantes,
use pra de segurana.
5. No use o mesmo equipamento volumtrico para medir simultneamente
solues diferentes.
6. Volumes de solues padronizadas, tiradas dos recipientes de origem e no
utilizadas, devem ser descartados e no retornados ao recipiente de origem
3. Muito cuidado com as tampas dos frascos, no permita que ele seja
contaminada ou contamine-se. Se necessrio use o auxlio de vidros de relgio,
placas de Petri, etc. Para evitar que isso acontea.
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Cuidados com aquecimento, includo: reao exotrmica, chama direta,
resistncia eltrica e banho-maria.
5. No aquea fora das capelas, substncias que gerem vapores ou fumos txicos.
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SAIBA COMO AJUDAR A SI MESMO E A OUTROS MEMBROS DO LABORATRIO
EM CASO DE EMERGNCIA
Bombeiros 193
Polcia 190
SAMU 192
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Se houver queimaduras qumicas nos olhos, lav-los abundantemente com
gua (lava-olhos) e em seguida procurar atendimento mdico.
Quando houver inalao de gases, vapores ou poeiras, deve-se afastar a
pessoa afetada da rea contaminada e lev-la para outro bem arejado,
afrouxar-lhe a roupa e mant-la deitada de lado enquanto aguarda socorro
mdico. Nunca dar gua, leite ou qualquer lquido.
Se houver ingesto acidental de slidos ou lquidos deve-se levar a pessoa
imediatamente a um hospital, cuidando para levar junto a anotao das
especificaes da substncia ingerida. Jamais provocar o vmito.
Todos os acidentes devem ser imediatamente relatados ao professor
responsvel.
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2. PREPARO DE REAGENTES E SOLUES
SOLUES
Soluo Diluda
Soluo Concentrada
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Soluo em que a proporo de soluto numa determinada quantidade de
soluo grande. O parmetro soluo que apresenta mais de um dcimo de mol de
soluto por litro de soluo.
Soluo Saturada
Coeficiente de Solubilidade
260
240
(g de KNO3/ 100 g de gua)
220
200 Regi o da s
180 soluoes
160 supersa turadas
(instve is)
140
120
100
Regi o da s
80 soluoes no
60 satura da s
(ou inst ve is)
40
(e stve is)
20
0
20 40 60 80 100
Temperatura (C)
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- Soluo supersaturada: apresenta quantidade de soluto dissolvido superior ao
coeficiente de solubilidade nessa temperatura. uma soluo instvel.
UNIDADES DE CONCENTRAO
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Molalidade a relao entre a quantidade de matria em nmero de mol
absoluto e a massa do solvente em quilogramas.
SOLUO DE GLICOSE A 1%
Soluto: glicose (C6H12O6).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Pesar 1g de Glicose e completar com gua destilada para 100mL,
homogeneizando bem.
Condies de armazenamento: manter em geladeira.
Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.
SOLUO DE FRUTOSE A 1%
Soluto: frutose (C6H12O6).
Solvente: gua destilada (H2O).
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Procedimento: Mea em uma proveta 1mL de Frutose. Transferir para um bquer,
lavando vrias vezes a proveta. Completar com gua destilada para 100mL,
homogeneizando bem.
Condies de armazenamento: manter em geladeira.
Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.
SOLUO DE SACAROSE A 1%
Soluto: sacarose (C12H22O11).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Pesar 1g de Sacarose e completar com gua destilada para 100mL,
homogeneizando bem.
Condies de armazenamento: manter em geladeira.
Prazo de validade: devido sua instabilidade deve ser preparada pouco antes da
realizao dos experimentos.
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SOLUO DE NaOH (HIDRXIDO DE SDIO) 10%
Soluto: Hidrxido de Sdio (NaOH).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Pesar 10g de NaOH e dissolver em 70mL de gua destilada.
Completar o volume para 100mL, homogeneizando bem.
Obs.: Imediatamente aps a pesagem do NaOH, cubra-o com filme plstico.
Substncia muito higroscpica.
Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco emtico.
Prazo de validade: soluo estvel indefinidamente.
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SOLUO DE CIDO ACTICO 1:2
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Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: Esta soluo estvel indefinidamente.
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Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
REAGENTE DE MILLON
Soluto: cido ntrico (HNO3) e mercrio (Hg).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Adiciona-se 40mL de cido ntrico concentrado frio em 20g de cido
ntrico , deixa-se dissolver por aquecimento e dilui-se com gua duas vezes em
volume. Deixa-se decantar durante 24 horas e usa-se a soluo superficial. Para
recuperar a eficincia desta soluo, adicionam-se diversas gotas de soluo aquosa
de NaNO2 a 1% ou KNO2 a 1%.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco e emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.
SOLUO DE -NAFTOL
Soluto: -Naftol (C10H8O).
Solvente: lcool etlico (CH3CH2OH).
Procedimento: Pesar 5g de -Naftol e completar com lcool etlico para 100mL.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.
REAGENTE DE LUGOL
Soluto: Iodato de Potssio (KIO3).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Pesar 5g de Iodo e 10g de Iodato de Potssio. Misturar em 60mL de
gua destilada, em seguida completar o volume para 100mL, homogeneizando bem.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
SOLUO DE LUGOL A 1%
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Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Diluir 1mL do reagente de Lugol em 100mL de gua destilada.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
SOLUO DE AMIDO A 1%
REATIVO DE BENEDICT
Solutos: citrato de sdio (Na3C6H5O7), carbonato de sdio anidro (Na2CO3) e sulfato
de cobre (CuSO4) cristalizado.
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Dissolver 85g de citrato de sdio e 50g de carbonato de sdio anidro
em cerca de 350mL de gua quente. Dissolver parte, em 50mL de gua quente, 0,5g
de sulfato de cobre cristalizado. Transferir lentamente, com agitao constante, a
soluo cprica para a primeira. Completar o volume para 500mL com gua destilada,
e filtrar se necessrio.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
REATIVO DE FEHLING
SOLUO A
Soluto: sulfato de cprico (CuSO4).
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Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Dissolver 34,64g de sulfato de cobre cristalizado em 300mL de gua
quente. Completar o volume para 500mL.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico de
vidro.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
SOLUO B
Soluto: Hidrxido de Potssio (KOH) e Tartarato duplo de sdio e potssio
(KNaC4H4O64H2O).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Dissolver 125g de Hidrxido de Potssio e 173g de Tartarato duplo de
sdio e potssio em 400mL de gua destilada. Completar o volume para 500mL.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico de
polietileno.
Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.
REAGENTE DE SELIWANOFF
Soluto: Resorcinol (C6H4(OH)2)
Solvente: cido clordrico (HCl).
Procedimento: Dissolver 0,05g de Resorcinol em 100mL de HCl diludo (na proporo
1:2).
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e
emtico.
Prazo de validade: aproximadamente de 1 ano.
REAGENTE DO BIURETO
Solutos: sulfato cprico (CuSO4), hidrxido de sdio (NaOH) e tartarato de sdio e
potssio (KNaC4H4O64H2O).
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Dissolver 150mg de sulfato cprico em 50mL de gua quente. Misturar
esta soluo com 30mL de soluo de NaOH a 10% e 600mg de tartarato de sdio e
potssio. Completar o volume com gua destilada para 100mL.
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Condies de armazenamento: Armazenar em frasco de polietileno e ao abrigo da luz
direta.
Prazo de validade: Este reativo estvel indefinidamente, porm deve ser desprezado
caso aparecer precipitado escuro.
SOLUO DE UREASE A 1%
Soluto: urease
Solvente: gua destilada (H2O).
Procedimento: Pesar 0,1g de urease e completar com gua destilada para 10mL,
homogeneizando bem.
Condies de armazenamento: Manter na geladeira em frasco emtico e mbar.
Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.
SOLUO DE NINHIDRINA
Soluto: ninhidrina (C9H6O4).
Solvente: acetona (C3H6O).
Procedimento: Pesar 0,2g de ninhidrina e diluir em 100mL de acetona, homogeneizar
e acondicionar em frasco emtico.
Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico.
Prazo de validade: aproximadamente 1 dia.
EXERCCIOS
1- Cada litro de gua do mar possui cerca de 3,5g de cloreto de sdio (NaCl), ou seja C
g
= 3,5 /L. Qual o volume de gua do mar necessrio ser evaporado para ter-se 700g
de sal?
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2- Uma soluo de sacarose (acar comum) possui concentrao C = 90,0 g/L.
Quanto de acar existir em uma garrafa de 330 mL (miliLitros, ou 0,330L)?
4 - Qual o volume de soluo AlCl3 0,8M necessrio para conter 2,0 mols deste sal?
RESULTADOS
3- Resoluo:
M = 1,5 mol/1,0L = (x)mol/0,4L
onde 1,0L (x)mol = 1,5mol 0,4L
x = 0,6 mol deste cido.
4 - Resoluo:
M = 0,8 mol/1,0L = 2mol/(x)L
onde 0,8mol (x)mol = 2,0mol 1,0L
x = 0,25 litros desta soluo.
5 - Resoluo: Primeiro achamos quantos mols existem em 0,8 litros desta soluo
M = 2,5 mol/1,0L = (x)mol/0,8L
onde 1,0L (x)mol = 2,5mol 0,8L
x = 2,0 mol deste cido.
Depois transformamos estes 2,0 mols em gramas, pois 1 mol de Na2CO3 = 106 gramas
106g 0,8 mol = 84,8 gramas de Na2CO3
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3. CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS
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ao meio (alfa-naftol, conhecido como reativo de Molisch). O fenol reage com os
produtos, incolores e provoca o aparecimento de um anel de colorao lils.
O
O C
H -naftol
C5H10O 5 + H2SO 4 Composto violeta
furfural
O
HOH2C O C
H -naftol Composto violeta
C6H12O 6 + H2SO4
b) Objetivo: Evidenciar ahidroximetilfurfural
presena de monossacardeos nas amostras
analisadas.
c) Materiais:
Vidrarias:
d) Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Frutose (Tubo 2) e gua
(Tubo 3). Pipetar para primeiro tubo 2mL de glicose, ao segundo 2mL de frutose e
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ao terceiro 2mL de gua destilada, que vai servir como um controle negativo.
Acrescentar 5 gotas da soluo de alfa-naftol e agitar. Pipetar cuidadosamente 2
mL de cido sulfrico concentrado com o tubo inclinado, deixando escorrer pelas
paredes do tubo sem agitar.
e) Resultado esperado:
f) Resultado obtido:
Tubo1: _____________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
Tubo 3: _____________________________________________
a) Fundamentao terica:
Este teste permite diferenciar aldoses de cetoses que, sob ao de cidos fortes,
so transformadas em derivados de furfural que se condensam com o resorcinol,
presente no reativo de seliwanoff formando um produto vermelho de composio
incerta. A reao com cetoses rpida e mais intensa pela maior facilidade de
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formao do derivado furfural. Logo, a frutose e o mel de abelha, por conter frutose
reagem positivamente.
O
Aquecimento O C Resorcinol
Cetose + HCl H
Composto violeta
Furfural
c) Materiais:
Vidrarias:
Reagente de Seliwanoff
cido Clordrico concentrado
Soluo de Glicose 1%
Soluo de Frutose 1%
Mel de abelha
Equipamentos:
Banho-Maria
Acessrios:
d) Procedimentos:
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Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Frutose ou mel de
abelha (Tubo 2) e gua (Tubo 3). Pipetar para o primeiro tubo 1mL de glicose, ao
segundo 1mL de frutose ou mel de abelha e ao terceiro 1mL de gua destilada,
que vai servir como um controle negativo, com pipetas de 1mL. Adicionar em
todos os tubos de ensaio 1,5mL de cido clordrico e 0,5mL de reativo de
Seliwanoff*. Agitar cuidadosamente. Deixar em banho-maria fervente at
completar a reao. Observar.
e) Resultado esperado:
f) Resultado Obtido:
Tubo1:______________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
Tubo 3: _____________________________________________
a) Fundamentao terica:
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Reao para identificar carboidratos redutores. Nas estruturas cclicas dos
monossacardeos os tomos de carbono anomricos(C1 nas aldoses e C2 nas
cetoses) so susceptveis de oxidao por vrios agentes oxidantes contendo ons
cpricos (Cu2+) devido a presena de grupos aldeidos ou cetonas livres ou
potencialmente livres. Na reao de Benedict os ons cpricos so reduzidos pela
carbolina dos carboidratos a ons cuprosos formando xido cuproso que tem cor
vermelho tijolo. Tal princpio til na anlise de acares e, por muitos anos, foi
utilizado na determinao dos nveis sanguneos de glicose no sangue e na urina como
diagnstico da diabetes melito. Atualmente, h testes mais sensveis para dosagem
rpida da glicose, baseadas em ensaios enzimtico (glicofita/glicose-oxidase) e que
so muito mais prticos, por no exigirem a disponibilidade dos reagentes
mencionados.
Meio alcalino
Cu(OH)2 CuO + H2O
(azul) Aquecimento (preto)
Meio Alcalino
Cu (OH)2 Cu2O + H2O
(azul) Aquecimento (amarelo/vermelho)
c) Materiais:
Vidrarias:
1 pipeta de vidro de 5mL
3 pipetas de vidro de 1mL
3 Tubos de ensaio
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Reagentes:
Reagente de Benedict
Soluo de Glicose 1%
Soluo de Sacarose 1%
Equipamentos:
Banho-Maria
Acessrios:
d) Procedimento
Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Sacarose (Tubo 2) e gua
(Tubo 3). Pipetar, com auxlio da pipeta de 5mL, para os trs tubos de ensaio 5mL do
reativo de Benedict. Acrescentar ao primeiro tubo 5mL de glicose, ao segundo 5mL de
sacarose e ao terceiro 5mL de gua destilada, que vai servir como um controle
negativo, com pipetas de 5mL. Agitar at completa homogeneizao. Deixar em banho-
maria fervente por cinco minutos. Observar a reao.
e) Resultado esperado:
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Glicose Sacarose gua destilada
f) Resultado obtido:
Tubo1:______________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
Tubo 3: _____________________________________________
a) Fundamentao terica:
c) Material:
Vidrarias:
Lugol
Soluo de amido 1%
Acessrios:
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Estante para tubos de ensaio
Pra de borracha
Papel Toalha
Descarte para pipetas
Frasco com gua destilada
d) Procedimento:
e) Resultado esperado:
Tubo 1 (Amido): Mudana de cor da soluo transparente ou leitosa para uma cor
azul intensa, resultado positivo.
f) Resultado obtido:
Tubo1: ______________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
PESQUISA
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2. Na reao de Benedict carbonos anomricos so susceptveis de oxidao por
vrios agentes oxidantes contendo ons cpricos isso devido a presena de quais
grupos livres?
3. O princpio que utilizado na reao de Benedict foi por muito tempo um mtodo
que permitia analisar aucares a nveis sanguneos contribuindo para determinao
do diabetes melitos. Explique o princpio que utilizado na reao de Benedict que
permite a analise dos aucares?
a) Fundamentao terica
c) Material
Vidrarias:
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2 pipetas de vidro de 1mL
Reagentes:
leo vegetal
Acessrios:
Papel de filtro
gua destilada
d) Procedimento
Pipetar para o centro do primeiro papel de filtro 0,5 ml de gua, e para o centro
do outro 0,5 ml de leo. Espere secar 20 mim e observe.
e) Resultado Esperado
Formao de uma mancha translcida caracterstica da presena de lipdeos
permanece no papel de filtro. O aluno pode ler o roteiro da aula pratica atravs do
papel de filtro
f) Resultado Obtido
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________
a) Fundamentao Terica
Devido a natureza apolar, os lipdios apresentam baixa solubilidade em gua e
boa solubilidade em solventes orgnicos.
c) Materiais
Vidrarias:
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Reagentes:
Colocar 2ml de ter etlico em dois tubos de ensaio. Adicionas a cada tubo duas
gotas de NaOH 0,1N, e uma gota de fenolftaleina. Observar.
f) Resultado obtido
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________
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3. REAO DE SAPONIFICAO
a) Fundamentao terica:
Triacilglicerol
c) Materiais
Vidrarias:
38
Banho-Maria
Acessrios:
d) Procedimento
Pipetar para um tubo de ensaio rotulado 2 mL de leo e 5mL da soluo de
potassa alcolica. Aquecer no banho-maria fervente durante cinco minutos. A
reao de hidrlise alcalina estar completa quando o tubo de ensaio apresentar
uma fase. Pipetar para o tubo de ensaio rotulado (tubo 1) 1mL de gua e 2 mL da
soluo de sabo. Agitar vigorosamente e observar.
e) Resultado esperado
Tubo 1: Formao de espuma indica a presena de sais de cidos graxos
f) Resultado obtido
Tubo 1: _________________________________________
Tubo 2: _________________________________________
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a) Fundamentao terica:
c) Materiais
Vidrarias:
d) Procedimento:
e) Resultado esperado
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Tubo 1: reao positiva com a formao de compostos de vermelho
amarronzada.
Colesterol
f) Resultado obtido
Tubo 1: _______________________________________________
PESQUISA
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5. CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS
1. REAO DE BIURETO
a) Fundamentao terica:
Est reao especfica para substncias que possuem pelo menos dois grupos
CO-NH unidos por carbono ou nitrognio como ocorre no biureto, que empresta o seu
nome para a reao. Biureto o nome dado estrutura originada a partir da
42
decomposio da uria, quando esta submetida a uma temperatura de,
aproximadamente, 180oC:
c) Materiais
Vidrarias:
43
2 Tubos de ensaio
Reagentes:
Reativo de Biureto
Soluo de ovoalbumina 10%
Acessrios:
d) Procedimento
e) Resultado esperado
f) Resultado obtido:
Tubo1: ______________________________________________
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Tubo 2: _____________________________________________
2. REAO XANTOPROTICA
a) Fundamentao terica
c) Materiais
Vidrarias:
Banho-Maria
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Acessrios:
d) Procedimento
e) Resultado esperado
Aquecimento
NaOH
Ovoalbumina
f) Resultado obtido
Tubo1: ______________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
3. REAO DE MILLON
a) Fundamentao terica
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Quando se aquece um composto que contm tirosina com o reativo de Millon,
observa-se a formao de um produto colorido avermelhado. Explicado pela formao
de um fenolato de mercrio por reao ao grupo hidroxifenil da tirosina com o mercrio
do reativo.
c) Materiais
Vidrarias:
Reativo de Millon
Soluo de ovoalbumina 10%
Equipamentos:
Banho-Maria
Acessrios:
d) Procedimentos
e) Resultado esperado
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Tubo 1 (Ovoalbumina): a soluo adquire colorao vermelha roxa, indicando
positividade da reao.
Aquecimento
Ovoalbumina
f) Resultado obtido
Tubo1: ______________________________________________
Tubo 2: _____________________________________________
PESQUISA
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6. CARACTERIZAO DOS CIDOS NUCLICOS
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No genoma humano so encontrados 46 cromossomos, cada um formado por
uma molcula de DNA. O DNA uma longa molcula helicoidal constituda de dois
filamentos de nucleotdeos enrolados de forma helicoidal. Os dois filamentos so
unidos por pontes de hidrignio que se estabelecem entre as bases nitrogenadas,
obedecendo ao seguinte pareamento: uma adenina se liga a uma timina por duas
pontes de hidrognio (A=T); uma citosina se une a uma guanina por trs pontes de
hidrognio (CG). Note que na molcula de DNA no encontrada a base uracila (U),
exclusivas das molculas de RNA.
A separao das duas fitas de DNA pode ser obtida ao serem rompidas as
pontes de hidrognio entre as bases, o que se faz submetendo-se o DNA a
temperaturas elevadas, por exposio a pH extremos ou diminuindo-se a fora inica.
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RNA ribossomal (rRNA)
Unidos a protenas, constituem os ribossomos, responsveis por ler a
infomao gentica levada pelos RNAs mensageiros at o citosol. Podem permanecer
livres no citosol ou ligados ao retculo endoplasmtico. So formados por duas
subunidades (uma maior, outra menor) que se unem no momento da sntese protica.
1. Extrao de DNA
a) Fundamentao Terica
A extrao de DNA hoje uma tcnia extensamente utilizada com diversos fins,
como na medicina forense, em investigaes criminais, na excluso de paternidade, na
busca de marcadores tumorais ou agentes infecciosos, entre outros.
Detergentes
Rompem as membranas celulares pela desestruturao da bicamada lipdica
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Sais
Fornecem ctions que diminuir neutralizam as cargas negativas do grupo fosfato
do DNA , diminuindo sua solubilidade e facilitando a aglomerao dessas molculas
lcool
Como o DNA tende a no ser solvel em lcool, sua desidratao com esse
componente impede que fique dissolvido no meio aquoso, facilitando seu agrupamento.
Quanto mais gelado o lcool, menos solvel ser o DNA.
c) Materiais
Vidrarias
Vidro de relgio
2 bqueres
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1 proveta de 100 mL
2 Bastes de vidro
Funil de vidro
Amostra e Reagentes
1 banana
gua destilada
NaCl (sal de cozinha)
Detergente para loua
lcool etlico a 95% gelado (-10C)
Acessrios
Banho-maria (60C)
Balana analtica
Papel de filtro
Caixa de isopor com gelo
d) Procedimento
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11. Observe o resultado final.
e) Resultado esperado
Precipitao das molculas de DNA com formao de nuvem na fase alcolica.
PESQUISA
4. Visto que o DNA no solvel em lcool, o que ocorre com suas molculas quando
colocadas neste meio?
7. DESNATURAO PROTICA
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assim como por mudanas do pH, cidos e bases, ons de metais pesados, certos
solventes orgnicos, como o lcool ou as cetonas, por certos solutos como a uria ou,
por detergentes. Muitas destas substncias ligam-se s cadeias de protenas formando
precipitados.
a) Fundamentos terica
Os ons positivos de metais pesados (Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+) formam compostos
insolveis com as protenas. Os metais positivos reagem com as cargas negativas de
protenas, principalmente se o pH estiver acima do ponto isoeltrico da protena (ponto
neutro), formando precipitados.
Quando a protena est com pH abaixo do ponto isoeltrico, as bases
provenientes de cidos fortes so exemplos de ons negativos que combinam-se com
partes positivas de protenas, formando complexos insolveis, que precipitam na
soluo. Como exemplos dessas bases podemos citar os alcalides, uma classe de
compostos naturais, e as bases derivadas do cido tricloroactico (TCA). Esses
reagentes tambm tm ao desnaturante, ou seja, provocam a perda da conformao
tridimensional da protena de forma irreversvel. Conseqentemente, a protena
separada por esse mtodo perde a sua funo. Esse mtodo bastante utilizado para
remover protenas de amostras de soro, plasma e leite, quando se deseja analisar a
presena de minerais, tais como clcio e magnsio, ou a contaminao por metais
pesados, como chumbo e nquel.
55
c) Materiais
Vidrarias
d) Procedimento
e) Resultado esperado
Ovoalbumina
56
f) Resultado Obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
a) Fundamentao terica
c) Materiais
Vidrarias:
d) Procedimentos
57
Pipetar para um tubo de ensaio 2 mL da soluo de ovoalbumina. Acrescentar 5
gotas de soluo de acetato de chumbo. Observar a reao.
e) Resultados esperados
f) Resultado Obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
a) Fundamentao terica:
58
Os precipitados proticos resultantes da precipitao por salificao mantm sua
conformao nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver
desnaturao. Conseqentemente, a funo da protena pode ser recuperada aps o
trmino do processo e remoo do sal.
c) Materiais
Vidrarias:
d) Procedimento
Pipetar para um tubo de ensaio (A) 2 mL da soluo de ovoalbumina. Adicionar,
pelas paredes, 2mL da soluo concentrada de (NH4)2 SO4
e) Resultado esperado
TuboA: resultado positivo com a formao de uma soluo leitosa com
precipitados brancos
59
f) Resultado Obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
PESQUISA
60
so formados ao final. As enzimas so, geralmente, bastante especficas com
relao aos substratos, formando um complexo com estes durante a catlise:
E S ES E P
61
Cadeias de alfa-D-glicose costumam enrolar-se em espiral, formando
essa estrutura helicoidal na qual as hidroxilas esto voltadas para o exterior.
O lugol cora o amido porque o iodo fica preso no interior dessas hlices.
62
desramificadora) capaz de hidrolisar essas pontes 1:6, permitindo a completa
digesto da amilopectina.
c) Material
Soluo de amido a 1%
Soluo de lugol
Soluo de HCl 1:2
Soluo salina a 0,95%
Soluo de saliva: secretar 1ml d saliva em um tubo de ensaio adicionar 9ml de
saliva e misturar
63
- Rotular trs tubos de ensaio em AA1, AA2 e AA3, cada um deles contendo 5ml
de gua destilada.
- Rotular trs tubos de ensaio em AE1, AE2 e AE3, cada um deles contendo 5ml
de gua destilada.
64
- Retirar os tubos de banho de gelo
g) Resultado Obtido
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
PESQUISA
2) Caracterizao da Urease
a) Fundamentao terica
65
b) Objetivos: demonstrar a natureza protica da enzima.
c) Materiais
Vidrarias
3 Tubos de ensaio
8 pipetas de vidro de 2 ou 5 mL
Reagentes
Soluo de urease
Reativo de Biureto
cido Ntrico Concentrado
Acessrios
d) Procedimentos
1) Reao do Biureto
2) Reao de Heller
66
Em outro tubo de ensaio colocar 4 gotas de soluo de urease e 2ml de gua
destilada. Agitar. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede 1ml de cido ntrico
concentrado, sem agitar.
Urease
f) Resultado Obtido
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________________________
PESQUISA
67
3) Explique a ausncia de atividade da urase, quando previamente
fervida
4) Explique a inibio da enzima por sais de mercrio
a) Fundamentao Terica
c) Procedimento
68
Preparar 2 tubos de ensaio contendo em cada um deles de pirogalol 0,1M e 3mL
do tampo citrato-fosfato, pH 6,0. Um tubo ser o branco (B) e o outro tubo teste (T).
Tubos Substrato pirogalol (mL) Tampo Ac, Ctrico-Fostafo pH 6 (mL) H2O (mL)
B 2,0 3,0 -
T 2,0 3,0 -
C - 3,0 2,0
10
Terminada a leitura de todos os tempos indicados proceder a leitura dos tubos branco
(B) e controle (C).
69
Representar graficamente a absorbncia em funo do tempo.
PESQUISA
70
Neste livro, nos deteremos ao exame qualitativo de urina (EQU), que nos
fornece informaes de grande utilidade clnica, no apenas no mbito do
funcionamento do sistema urinrio, mas tambm de outros rgos, como o pncreas
endcrino e o fgado. A presena de glicosria e/ ou cetonria so bons indicativos
de Diabetes Mellitus, j a presena de bilirrubinria, urobilinogenria, cristais de
blirrubina, e/ ou cristais de urato de amnia so indicativos de doena heptica.
Neste exame so analisados aspectos fsico-qumicos da urina que, somados a
outros exames laboratoriais e aos achados clnicos, ajudam no diagnstico de vrios
quadros patolgicos.
a) Fundamentao terica
c) Materiais
Vidrarias:
1 pipeta de vidro de 5 mL
1 pipeta de vidro de 1 mL
1 Tubo de ensaio
Reagentes: Reagente de Benedict
Amostra: Urina
Equipamentos:
Banho-Maria
Acessrios:
71
Pra de borracha
Pina
Termmetro
Cronmetro
Papel Toalha
Descarte para pipetas
d) Procedimento
e) Resultados esperados
Negativo Positivo
f) Resultado obtido
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
g) Interpretao do resultado
72
(defeito reabsortivo generalizado dos tbulos renais). Resultados falso-positivos podem
ocorrer em ingesto elevada de carboidrato pouco antes da coleta da urina.
a) Fundamento da tcnica
c) Materiais
Vidrarias:
2 pipetas de vidro de 5 mL
1 Tubo de ensaio
Funil de vidro
Bquer de 25 mL
Reagentes: cido Ntrico
Acessrios:
d) Procedimento
73
Em um tubo de ensaio limpo e seco pipetar 3 mL de urina filtrada e adicionar 2
mL de cido ntrico, lentamente no fundo do tubo, de modo que os dois lquidos no se
misturem.
e) Resultado esperado
Negativo Positivo
f) Resultado obtido
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
g) Interpretao do resultado
a) Fundamentao terica
74
b) Objetivo: Evidenciar a presena de protena na urina pela desnaturao com cido
ntrico.
c) Materiais
Vidrarias:
1 pipeta de vidro de 5 mL
1 pipeta de vidro de 1 mL
1 Tubo de ensaio
Funil de vidro
Bquer de 25 mL
Reagentes: cido Sulfossaliclico 20%
Acessrios:
d) Procedimento
e) Resultado esperado
75
Negativo Positivo
f) Resultado obtido
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
g) Interpretao do resultado
a) Fundamentao terica
c) Materiais
Vidrarias:
2 pipetas de vidro de 5 mL
1 pipeta de vidro de 1 mL
1 Tubo de ensaio
76
Reagentes: Reagente de Imbert
Hidrxido de amnio
Acessrios:
d) Procedimento
e) Resultado esperado
Negativo Positivo
f) Resultado obtido
77
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
g) Interpretao do resultado
a) Fundamentao terica
c) Materiais
Vidrarias:
Tubos de ensaios
Funis de vidro
Pipetas graduadas de 10 mL
Reagentes:
78
Soluo aquosa de tionina Merck a 0,1% (esta soluo deve ser preparada
a quente para que o corante se dissolva completamente)
Soluo aquosa de tionina a 0,01%
Soluo de molibdato de amnia a 4% (preparada a soluo acidula-se com
1 gota de cido clordrico para cada 25 mL de soluo)
cido actico
Amostra: Urina flitrada
Acessrios:
d) Procedimento
Aps coleta e verificao de pH (a urina deve ter pH < 7), filtra-se a urina. Em
seguida ferve-se durante 1 minuto, espera-se esfriar e filtra-se novamente. Nestas
condies, a amostra pode ser submetida ao Test de Donnaggio, constitudo em 2
fases.
1 Fase:
A reao feita em uma srie de 6 tubos de ensaio, designados por A1, A2, A3,
A4, B1 e B2, nos quais os reativos sero colocados em diferentes propores, dentro
da ordem exposta no quadro abaixo e que deve ser atentamente observada. Deve se
ter o cuidado de agitar a cada nova mistura.
79
Tubo A2 2 mL de urina 1 mL tion. 0,1% 2 mL mol. de am.
A soma dos graus de cada tubo constitui o resultado da primeira fase da reao.
80
2 Fase:
e) Resultado obtido
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
f) Interpretao do resultado
PESQUISA
81
2) Com o passar do tempo, alm da eventual alterao de pH devido
fermentao da urina, que outra alterao podemos esperar no tubo positivo
para a reao de Benedict?
3) A determinao do teor de glicose circulante (glicemia) o elemento bsico para
o diagnstico de diabetes, no sendo fundamental a pesquisa de glicosria, pois
resultados falsamente positivos ou negativos podem ser encontrados.
Exemplifique estas situaes.
4) Concentraes elevadas de glicose na urina esto associadas a algumas
condies no necessariamente patolgicas. Exemplifique situaes fisiolgicas
em que podemos encontrar glicosria.
5) Qual o papel do nitroprussiato de sdio, presente no reativo de Imbert, na
caracterizao de corpos cetnicos na urina?
6) Em que condio a cetonria pode estar presente mesmo que no seja
detectada pela anlise da urina?
7) Presena de cetonria em pacientes diabticos indica descompensao
metablica grave. Por outro lado, indivduos normais aps jejum prolongado
tambm podem apresentar cetonria. Explique os mecanismos envolvidos nas
duas situaes.
8) O que representa o anel branco leitoso formado no tubo positivo para a reao
de Heller?
9) Explique o mtodo sulfossaliclico para deteco de proteinria (protena na
urina).
10) Qual a importncia clnica da deteco precoce de microalbuminria (excreo
urinria de albumina entre 30 e 300mg/24h ou entre 20 e 200g/min, na
ausncia de infeco urinria ou doenas agudas) em pacientes diabticos e ou
hipertensos?
82
10. COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA
UV IV
Visve
83
Io = IA + I
recipiente que contm a soluo, entretanto, nas anlises bioqumicas este fenmeno
pode ser desconsiderado j que a natureza das cubetas (quartzo ou vidro) onde as
solues so depositadas para a leitura ou eliminadas por comparao de amostra.
Pode-se escrever portanto que:
Io a intensidade da luz incidente na amostra ser igual a luz absorvida (IA) e a luz
transmitida (IT) de acordo com o esquema abaixo:
IA
Io I
Luz Monocromtica
l
Espessura da soluo
84
Os fotocolorimetros e espectrofotmetros so aparelhos que se baseam nestes
fenmenos fsico-quimicos para quantificar uma determinada amostra tendo um padro
de referncia.
a) Fundamentao teorica
85
aldeido da glicose formando uam glicosilamina e uma base de Schiff
correspondente.
c) Material
Vidraria
Pipetas
Tubos de enasio
Provetas
Bequer
Reagentes
Acessrios:
d) Procedimento
86
T2 0,16mL 1,84mL 10,0mL
T3 0,24mL 1,76mL 10,0mL
T4 0,32mL 1,68mL 10,0mL
T5 0,40mL 1,60mL 10,0mL
e) Resultado obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
a) Fundamentao terica
Vidraria
Pipetas
Tubos de enasio
Provetas
Bequer
Reagentes
Reativo de Biureto
87
Soluo padro de protena: pesar soroalbumina bovina (B.S.A.)
5mg/mL de NaOH a 1%
Acessrios:
d) Procedimento
e) Resultado obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
3. Determinao de Vitamina A
a) Fundamentao terica
88
O retinol, retinal e cido retinico so formas ativas da vitamina A, uma
vitamina lipossolvel sintetizada pelas plantas como carotendes mais complexos. A
vitamna A participade vrias funces biolgicas principalmente na manuteno da
viso e da pele.
c) Materias
Vidrarias
Erlenmeyer 150mL
Tubos de ensaio
Proveta
Pipetas
Funil de separao
Bequer
Reagentes
Equipamentos
Banho-Maria
Espectrofotometro
Balana
Acessrios
89
Estante para tubos de ensaio
Pra de Borracha
Papel toalha
d) Procedimento
e) Resultado obtido
___________________________________________________________
___________________________________________________________
90
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Laws. http://www.bdt.org.br/bdt/oeaproj/biossegurana, 1998.
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Brasil, Ncleo de Biossegurana Fiocruz-RJ - CGLAB-BSB,2001.
www.usp.br/fo/biossegur/biosseguranca.htm/
LEHNINGER, A.L., NELSON, D.L. & COX, M.M. Princpios de Bioqumica. 2 ed.,
Editora Sarvier, So Paulo, 1995.
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STEVENS, C. L. Qumica orgnica. 2o edio. Rio de Janeiro: Editora Guanabara,
1978.
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Ponzio. Bioqumica: Guia de Aulas prticas. PUCRS: Porto Alegre, 2003.
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ALMEIDA, F. A. Microalbuminria como marcador precoce de comprometimento
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MILLER, O. et al. Laboratrio para o Clnico. 8 ed. So Paulo: Editora Atheneu, 1998.
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em: http://www.revistadeeducacaofisica.com.br/artigos/1939/46_ocontroledafadiga.pdf.
Acesso em: 09 de maro de 2009.
93