Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Resumo
Os opiáceos são moléculas de origem natural ou sintética, cujos efeitos a nível da célula
são transmitidos por recetores específicos, tanto a nível do sistema nervoso central,
como do sistema nervoso periférico. As principais vias de administração de opiáceos
incluem a via oral e intravenosa, embora os opióides possam também ser inalados ou
fumados. A heroína é o opióide mais comumente vendido no mercado ilegal de drogas,
sendo rapidamente metabolizada por desacetilação em monoacetilmorfina (6-MAM) e
depois em morfina. Neste estudo realizou-se a validação de um método de confirmação
de análise qualitativa do metabolito 6-MAM por cromatografia gasosa acoplada a
espectrofotometria de massa, em urina humana. Para a validação da técnica recorreu-se
a cinco parâmetros de validação, tendo-se obtido resultados aceitáveis. Concluiu-se que
a técnica utilizada é altamente precisa e sensivel. O presente estudo irá permitir efectuar
com rapidez e fiabilidade, as análises rotineiras dos colaboradores da Marinha.
Abstract
Opioids they are molecules of natural or synthetic origin whose effects on the cell are
transmitted by specific receptors at both of the central nervous system as the peripheral
nervous system. The major routes of administration of opioids include oral and
intravenous administration. Although opioids can also be inhaled or smoked. Heroin is
an opioid most common sold on the illegal drug market, being rapidly metabolized
bydeacetylation in monoacetilmorfina , then morphine.This study was performed to
confirm that method of qualitative analysis of the metabolite 6-MAM by gas
chromatography coupled to mass spectrometry in human urine. To validate the
technique we appealed up to five parameters, Having obtained acceptable results. It was
concluded that the technique is highly accurate and sensitive. This study will allow
quickly and reliably perform the routine analysis of employees of the Navy.
1
fumada, inalada ou injetada sendo que no mercado ilícito também estão disponíveis
vários outros opiáceos sintéticos, como a buprenorfina, a metadona e o fentanil. (2)
A heroína (3,6-o-diacetilmorfina, diamorfina, DAM) é o opióide mais comummente
vendido no mercado ilegal de drogas.(8) O consumo de heroína, quando por via
intravenosa, tem efeitos mais violentos. (7) (9)
A heroína é rapidamente metabolizada, tem uma semi-vida de aproximadamente 5
minutos, no organismo, é rapidamente metabolizada por desacetilação em
monoacetilmorfina (6-MAM) e depois em morfina. (5) (8) (10) (11)
A presença de 6- monoacetilmorfina na urina é considerada como um marcador
específico para o uso ilegal de heroína. (8) (11)
As técnicas forenses para a detecção de drogas, como os opiáceos na urina, envolvem a
detecção de morfina ou de codeína, ou de ambas. Normalmente, apenas a morfina total
ou a codeína total é determinada, o que torna difícil determinar a origem dos opiáceos
detetados na urina. (8)
Tanto a cromatografia líquida acoplada à espectrofotometria de massa (LC-MS) como a
cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (GC-MS) fornecem
resultados precisos, específicos e sem interferência de substâncias semelhantes às
analisadas, sendo também reprodutíveis em amostras de urina. (12)
A GC-MS fornece um processo mais sensível para a quantificação de opiáceos comuns,
utilizando uma pequena quantidade de amostra. É considerado um método sensível e
confiável para a análise de diversas substâncias em simultâneo, incluindo o metabolito
6-MAM, mostrando também ser preciso e exacto. (13)
Segundo Guillot, Lefebvre e Weber, a cromatografia gasosa acoplada à
espectrofotometria de massa (GC-MS) parece ser o método mais adequado para análises
forenses, pois dá-nos uma indicação conclusiva quanto à droga presente na amostra. (14)
Com vista a validar esta mesma técnica e no contexto das análises de rotina realizadas
em urina de colaboradores da marinha portuguesa, propusemo-nos realizar a avaliação
de cinco parâmetros, sendo estes, a especificidade/seletividade, capacidade de
identificação, limite de detecção, arrastamento e repetibilidade, de modo a permitir a
validação de um método de confirmação do consumo de heroína através da detecção do
seu metabolito (6-MAM), com o intuito de permitir futuramente análises mais rápidas,
com elevada fiabilidade e de menor custo com a utilização de um pequeno volume de
amostra permitindo assim a optimização do método.
2
Metodologia
Parâmetros de validação
Amostras
3
As urinas utilizadas para a avaliação dos vários parâmetros de validação correspondem a
amostras negativas de urina, oriundas de controlo negativo da Thermo SCIENTIFIC
Level 1 Negative com certificado nº XS12051.
Procedimento geral
Para o pesquisa do metabolito 6-MAM de heroína por GC-MS guiamo nos pelo seguinte
procedimento:
4
1. Especificidade / selectividade
2. Capacidade de identificação
Tabela 1- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM Tabela 2- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM D3
5
3. Limite de detecção
Foi preparada uma curva de calibração com 10 pontos para a 6-MAM. A fortificação das
urinas foi feita utilizando soluções metanólicas do metabolito 6- MAM. As concentrações
escolhidas para os pontos das curvas de calibração e os respectivos volumes utilizados
das soluções metanólicas apresentam-se na tabela 3. O volume de urina utilizado foi de
2.5 mL, tal como descrito nos parâmetros de validação de confirmação qualitativa da 6-
Mam.
Foram usados como padrões internos uma solução metanólica de 6- MAM-D3,
preparadas a partir de diluições da solução-mãe. O volume utilizado de padrão interno foi
60 L.
Tabela 3
Preparação da curva de calibração do estudo do limite de detecção e quantificação 6-Mam
Concentracção (ng/mL) Volume (L)
1 50 15
2 60 18
3 70 21
4 80 24
5 90 27
6 100 30
7 110 33
8 120 36
9 130 39
10 140 42
11 150 45
12 160 48
13 170 51
14 180 54
15 190 57
16 200 60
LD = (3.3 Sy/x)/b
5. Repetibilidade
Resultados/ Discussão
1. Especificidade/ Seletividade
Parte I
Código da Urina branca Resultado Interferências Observações
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
7
PERCENTAGEM DE FALSOS POSITIVOS 0%
Parte II
Código da Urina Positiva Resultado Interferências Observações
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
2. Capacidade de identificação
8
Tabela 5- Valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas dos iões
25 - 50% 20%
< 25% 5%
Diferença máxima
Valores m/z Controlo (positivo10) admissivel T.R.R
dos iões
diagnósticos Abundância Abundância Sinal/ruido Diferença Diferença
absoluta relativa absoluta relativa
399 2098 100,0% - -
< 1%
Diferença máxima
Positivo 1 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
Diferença máxima
Positivo 2 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
9
Diferença máxima
Positivo 3 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2447 100,0%
399 - - < 1%
2339 88,8%
340 - 84.1-104.1
1406 57,7%
287 - 47.0-67.0
Diferença máxima
Positivo 4 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1918 100,0%
399 - - < 1%
1706 88,8%
340 - 84.1-104.1
1100 57,7%
287 - 47.0-67.0
Diferença máxima
Positivo 5 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1856 100,0%
399 - -
1743 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1044 57,7%
287 - 47.0-67.0
Diferença máxima
Positivo 6 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2094 100,0%
399 - - < 1%
1842 88,8%
340 - 84.1-104.1
1194 57,7%
287 - 47.0-67.0
Diferença máxima
Positivo 7 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2123 100,0%
399 - -
2067 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1241 57,7%
287 - 47.0-67.0
10
Diferença máxima
Positivo 8 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1689 100,0%
399 - -
1621 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
951 57,7%
287 - 47.0-67.0
Diferença máxima
Positivo 9 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2291 100,0%
399 - -
2035 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1321 57,7%
287 - 47.0-67.0
Para considerar uma amostra como positiva é necessário que o ião principal,o ião 399,
esteja presente e seja o mais abundante na amostra, correspondendo a uma abundância
relativa de 100%. A abundância relativa dos iões diagnóstico 340 e 287 são obtidos
através da abundância absoluta dos mesmo, quando comparados com a abundância
absoluta e abundância relativa obtidas para o ião 399. Para as amostras serem
consideradas positivas, para além da presença do ião 399, os valores da abundância
relativa dos iões 340 e 287 têm obrigatoriamente que respeitar os critérios de
conformidade baseados nos valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas
dos iões admitidos para GC-MS (tabela 5).
Como para todas as amostras testadas os valores da abundância relativa dos iões 340 e
287 respeitam os valores de tolerância máxima admíssivel para GC-MS, valores entre
84.1 e 104.1 para o ião 340 e entre 47.0 e 67.0 para o ião 287, podemos considerar todas
as amostras como positivas. Para a validação do método é necessário que a percentagem
referente aos falsos negativos seja igual ou inferior a 10%.
Com base nestes resultados e nos dados obtidos no parâmetro anterior (especificidade /
selectividade) relativamente à percentagem de falsos negativos, neste caso 0% de falsos
negativos, podemos considerar o método válido.
11
Perante estes resultados concluisse que o método de confirmação qualitativa da 6-Mam
em urina humana por GC/MS possui uma capacidade de identificação conforme com os
resultados acima descritos, pois a percentagem de falsos negativos é inferior a 10%.
3. Limite de Detecção
Quantidade mínima de analito que pode ser detectada por um método mas não
necessariamente quantificada. (17)
LD =13,3631057
12
Obteve se o seguinte resultado:
Alguns autores consideram esta técnica simples e reprodutível, uma vez que proporciona
um baixo limite de detecção (14), tal como é possível observar pelo resultado obtido para a
avaliação do limite de detecção, cujo resultado é menor que o valor mínimo de detecção.
O método de confirmação qualitativa da 6-MAM em urina humana por GC/MS possui o
limite inferior de detecção de 13,4 ng/mL no equipamento HP GC 6890/MSD 6890
(GCMS01).
Para a validação deste parâmetro é necessário que o limite de detecção obtido seja menor
que o valor mínimo de detecção, sendo que o valor aplicado para o 6-MAM é de 100
ng/mL.
O método cumpre os requisitos definidos para os limites de detecção, atendendo a que o
resultado obtido foi de 13,4 ng/mL pode constatar-se o cumprimento dos requisitos para
os limites de detecção.
4. Avaliação do Arrastamento
Critério de conformidade
7,743 8,143
6MAM 7,943
TR
PI 7,926 ou
TRR 1,002 0,992 1,012
13
ARRAST-NEG1 ID Abundância Abund. relativa Conformidade
5. Repetibilidade
15
Tabela 9- Tratamento dos resultados do estudo da repetibilidade com gama alta
Área
6-mam 6MamD3 Arel
CTR 200 313 464 0,674569
CTR 200 348 543 0,640884
CTR 200 399 485 0,82268
CTR 200 338 496 0,681452
CTR 200 324 480 0,675
media 0,698917
s 0,06349
cv(%) 9,0841
Tabela 10- Tratamento dos resultados do estudo de repetibilidade com gama baixa
Área
6-mam 6MamD3 Arel
CTR 1000 2252 598 3,765886
CTR 1000 1922 512 3,753906
CTR 1000 1530 401 3,815461
CTR 1000 998 288 3,465278
CTR 1000 1458 398 3,663317
media 3,700133
s 0,123937
cv(%) 3,349535
16
O facto de se utilizar 2,5 mL de amostra, leva a que se possa considerar o método como
destrutivo, pois o ideal seria utilizar um menor volume de amostra para cada análise, o
que permitiria realizar uma possível repetição da análise ou até mesmo a realização de
uma contra-prova se assim fosse solicitado, embora a utilização de volumes menores não
proporcione uma capacidade de identificação tão aceitável como a proporcionada pelo
volume utilizado.
Conclusão
Com base nos conhecimentos já adquiridos relativos à análise qualitativa, seria pertinente
futuramente validar este método, quanto à deteção quantitativa do metabolito 6-MAM,
recorrendo, a um acréscimo de seis parâmetros de validação.
Bibliografia
1. Castro, Mário Ferreira de, Cleto, Carlos Ramos e Silva, Natacha Torres da. Segurança e Saúde
no trabalho e a prevenção do consumo de substâncias psicoativas. Lisboa, Novembro 2011,
Instituto da Droga e da Toxicodependência IDT e Autoridade para as Condições do Trabalho ACT.
3. Ferreira Borges, Carina e Cunha Filho, Hilson. alcoolismo e toxicodependencia. s.l. : Climepsi,
2000.
17
5. P.Angel, Richard, D. e Valleur, M. Toxicomanias. paris : Climepsi editores, 2000.
10. Al-Asmari, Ahmed, et al. Method for the Quantification of Diamorphine and its Metabolites
in Pediatric Plasma Samples by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. . Journal of
Analytical Toxicology, . May de 2010, , Vols. Vol. 34, pp. 177-95.
11. Yeh, S.Y., McQuinn, R.L. e Gorodetzky. Urinary excretion of heroin and its metabolites in
man. Journal Pharmacology Exp. Ther. C.W. 1976, , Vols. pp. 249-56.
12. Stout, Peter R., et al. A comparison of the Validity of Gas Chromatography-Mass
Spectrometry and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis of Urine
Samples for Morphine, Codeine, 6-Acetylmorphine, and Benzoylecgonine. Octobre de 2009, Vol.
33, pp. 398-408.
13. Tiscione, Nicholas B., et al. Quantitation of Opioids in Whole Blood by Electron Impact-Gas
Chromatography-Mass Spectrometry. March de 2011, Vol. 35, pp. 99-107.
14. Determination of Heoin, 6-Acetylmorphine, and Morphine in Biological Fluids Using Their
Propionyl Derivates with Ion Trap GC-MS. . Guillot, J.G., Lefebvre, M. e Weber, J.P. March/April
de 1997, Vol. Vol. 21.
18
21. Organization, World Health. The International Classification of Functioning, Disability and
Health: ICF. Geneva: WHO. 2001.
22. Vorce, S.P. e Kuntz, D.J. Confirmation: traditional and newer analytical techniques. [A. do
livro] J.D. Ropero-Miller e B.A. Goldberger. Handbook of Workplace Drug Testing. 2ª edição. s.l. :
AACC Press, 2009, pp. 61-98.
26. S., Hyman. Why does the brain prefer opium to broccoli? Harv Rev. 1994;, Vol. Psychiatry.
27. Castro, Mario Ferreira de, Cleto, Carlos Ramos e Silva, Natacha Torres da. Segurança e
Saúde no trabalho e a prevenção do consumo de substâncias psicoativas. Lisboa : s.n.,
Novembro 2011.
29. Geier, A., Bergemann, L. e Von Mayer, L. Evaluation of a solid-phase extraction procedure
for the simultaneous determination of morphine, 6-monoacetylmorphine, codeine and
dihydrocodeine in plasma and whole blood by GC/MS. 1996, pp. 80-83.
30. Fogerson, Robert, et al. Qualitative Detection of Opiates in Sweat by EIA and GC-MS.
October de 1997, Vol. 21, pp. 451-58.
31. Marriott, Blagoj Mitrevski & Paul Wynne & Philip J. Comprehensive two-dimensional gas
chromatography applied to illicit drug analysis. 2011.
34. Bonet, Rafael Cabrera e Forneiro, José Cabrera. Las Drogas de Abuso: Un reto sanitario. s.l. :
IGRAFICAS, S.A, , 1994.
19