Monitoramento e controle

microbiológico em usinas

Leveduras

Profa. Sandra Regina Ceccato Antonini

 As características essenciais de um
processo microbiológico industrial
MICRORGANISMOS
Substrato
Vírus
Adicionados no
Bactérias
meio de cultura
Fungos
Algas
Protozoários

Recuperação e
Purificação do
RESIDUO
Produto
OU
Produtos do MATERIAL
metabolismo DE
EXCREÇÃO
Célula microbiana
Fração das
células
Características gerais e
identificação de leveduras
Características gerais das
leveduras
„ Grupo heterogêneo
„ Unicelulares
„ Diversidade
– Cor das colônias
– Textura
„ Reprodução
Aspecto colonial de fungos que apresentam crescimento
filamentoso (F) e leveduriforme (L).
Bolor ou
fungo filamentoso

Levedura
Brotamento
Ciclo de vida de S. cerevisiae e sua relação com
as condições ambientais

+ ferormônio Ciclo diplóide

Ciclo haplóide
Ciclo de vida de S. cerevisiae
 A. B.

Leveduras. Em A, células de leveduras

e de bactérias. Em B, células de
Saccharomyces cerevisiae, mostrando
células em brotamento. Em C,
pseudomicélio de Saccharomyces cerevisiae,
em meio Corn-meal agar.

C.
A levedura Pichia stipitis,
fermentadora de xilose,
durante crescimento
vegetativo (A), esporos em
formação (B), e sob limitação
de carbono (C). Foto Tom
Kuster.
Leveduras apiculadas
 IDENTIFICAÇÃO GENÉRICA

Extrato de malte Microcultivo Meio de acetato

Agar fubá Outras provas:
Gorodkowa -Urease
Tween 80 YM
Corn meal agar -Cápsula
Água de torneira -Meio DBB
Macroscopia
Sedimento
Resíduo Microscopia
Anel Microscopia Produção esporos sexuais:
Ilhota Pseudomicélio, Ascos e ascósporos
Película Micélio verdadeiro,
Microscopia Balistósporos
Forma e tamanho Clamidósporos
das células
 IDENTIFICAÇÃO ESPECÍFICA

Auxanograma Zimograma Meios diferenciais

Fermentação Outras provas:
Assimilação -meio TTC -Crescimento 37ºC
Alcoólica de -ágar molibdênio
Fontes C e N açúcares -Produção de
-ágar azul Tripan compostos amilóides
-meio de Nickerson -tubo germinativo
-meio de CGB -resistência a
Cicloheximida
-fenol oxidase
 Teste do DBB. As linhagens CCA 181, 506 e 567 são DBB
negativas, enquanto a CCA379 é DBB positiva (utilizada como
controle positivo) – Linhagens basidiomicéticas são DBB+
S. cerevisiae

ESPOROS
SEXUAIS

S. cerevisiae
Produção
de pseudomicélio
Candida albicans - pseudomicélio
 Para caracterização de linhagens de Dekkera

Teste de produção de ácido a partir da glicose em meio carbonato

de cálcio, por 7-10 dias, a 30º C.
 FERMENTAÇÃO DA GLICOSE

- - - + +
 C arbono N itrogênio

Succínico
Ac. Succínico
Lactico
Melezitose

Ac. Lactico
Melezitose

Citrico
Galactose

Arabinose
Celobiose

Ac. Citrico
Linhagem

Galactose

Arabinose

Ramnose
Celobiose
Sacarose

Melibiose
Linhagem

Etilamina
Ramnose
Sacarose

Melibiose
Rafinose

Etilamina
Rafinose

Maltose
Glicose

Maltose
Manitol

Inositol
Glicose
Eritritol

Manitol

Inositol

Nitrato
Eritritol

Etanol

Nitrato
Xilose

Etanol

Lisina
Xilose

Lisina
Ac.
Ac.

Ac.
0 05 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - + -
0 06 - + + + + + + + + + + + + - + + + - + + -
0 07 - + - + + + + - - - + - + - - - - - - + -
0 08 - + + - - + + - - + + - + - - - - + - - -
0 12 - + + + + + + - - - + - + - - - + + + + -
0 22 - + - + - + - - + - + - - - - - - - - nd -
0 23 - + + + + + + - - + + - + - - - - + - - -
0 27 - + - + - + + - - - + - + - - - - - - nd -
0 35 - + - + + - + - + - + - + - - - - - - nd -
0 37 - + + - + + - - - + + - + - - - - + - - -
0 53 - + + + + + + + - - + - + - - + + + + + +
0 59 - + - - + + + + - - + - + - - - + + + + +
0 77 - + + + - + - + + - + + + - - - + + + + +
0 83 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - - -
1 15 - + - + + + + - + - + + + - + - - + + + -
1 51 - + - - - - + - - - + - - - - - - - + - -
1 55 - + - + + + + + - - + + + - - + + + + + +
1 81 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + -
2 09 - + + + + + - - - + + - - - - - + - - -
3 73 - + - + + + + - + - + + + - - - + + - + -
3 85 - - - - - - + - - - + - + - - - - - - - -
3 97 - + - + - + + - - - + - - - - - + + - - -
4 47 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + -
4 67 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + +
4 71 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + -
5 06 - + - + + + + + + + + + + - + - + + + + -
5 40 - + - + nd + + - + - + + + - + - + + + + -
5 67 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + -
5 93 - + + + + + + - + - + + + - + - + + + + -
6 10 - + - - + + + + + - + + + - + - - + + + -
6 12 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + -

1
1 - (+) = p ositivo; (-) = neg ativo e (nd) = não d eterm ina do;
 Chaves de identificação
„ Kreger-van Rij, N.J.W. The yeasts. A
taxonomic study. Elsevier, 1984.

„ Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D.

Yeasts: characteristics and identification.
Cambridge Univ. Press, 1990.
Importância do estudo da
diversidade de leveduras
na fermentação alcoólica
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf
Técnicas utilizadas no
monitoramento da
fermentação alcoólica
CONTAGEM DIRETA
AO MICROSCÓPIO

CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 400X

Ao microscópio – aumento de 100X

Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras –
células azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas
Utilização de meios
seletivos
3 X 109 células de S. cerevisiae / ml
3 X 103 células de leveduras selvagens / ml

1 ml sem diluição Meio contagem geral

Não seletivo
>>> 300 colônias

Dorna de fermentação

1 ml diluição 10-8
Meio contagem geral
Não seletivo
30 colônias
{3 X 109 / 108 } = 30
{3 X 103 / 108 } = < 1

1 ml diluição 10-2 Meio seletivo

{3 X 103 / 102 } = 30
Regra: contar Exemplo: actidione
entre 30 e 300 colônias inibe o crescimento
de S. cerevisiae
Efeito da diluição no plaqueamento
MEIO DE CULTURA WLN – Wallerstein Laboratory Nutrient Medium
 Contagem geral Para Saccharomyces não-cerevisiae

Diluição
10-10
Sem
diluição

Para Saccharomyces não-cerevisiae

Para não-Saccharomyces

Sem Sem
diluição diluição
Tosta, C.D., Ceccato-Antonini, S.R. Eficiência de meios seletivos
no monitoramento de leveduras na fermentação alcoólica
atestada por PCR. In: XV Simpósio Nacional de Bioprocessos,
2005, Recife-PE (Anais).

„ Analisou a eficiência de três meios seletivos (Agar-lisina,

LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens
através dos testes de taxonomia clássica e de PCR.
„ Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos
meios seletivos pertenceram exclusivamente a gêneros
não Saccharomyces, com bandas de DNA da região ITS
entre 420 e 550 bp.
„ Linhagens de Saccharomyces cerevisiae, isoladas
exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de
800 bp, característico desta e da demais espécies do
grupo Saccharomyces sensu stricto.
„ Os meios seletivos testados permitiram a distinção entre
linhagens selvagens e do processo.
S. cerevisiae

Colônias
rugosas

= S. cerevisiae
Colônias
mucosas
Oliveira, M.C.F.L., Silva, R.B.O. Biotipo
Saccharomyces cerevisiae em cadeias
multicelulares ramificadas na fermentação
contínua. In: XVII Congresso Brasileiro de
Microbiologia, 1993, Santos-SP.

Identificaram uma levedura selvagem com as

mesmas características, apresentando elevado
poder competitivo em relação à levedura usual do
processo e às demais leveduras selvagens,
substituindo em cerca de 50% o fermento de
partida.
Ceccato-Antonini, S.R., Parazzi, C. Isolamento
de levedura selvagem floculante e efeitos da
contaminação em processo de fermentação
etanólica contínua. In: VI Congresso Nacional
da STAB, 1996, Maceió-AL.

Verificaram uma proporção de 1:1 entre

leveduras rugosas e não-rugosas no fermento e
no vinho, ocasionando uma queda de 10% no
rendimento fermentativo e 18% na produção de
álcool. Para a retomada do rendimento a valores
~ 89,5%, o fermento teve que ser substituído. Os
focos de contaminação eram a água de diluição
e o melaço.
 A pesquisadora Silene C. L. Paulillo (Fermentec)
apresentou os resultados de um trabalho realizado
durante 3 safras consecutivas (2002, 2003 e 2004)
sobre as características de 300 leveduras selvagens que
contaminaram 46 destilarias. As leveduras identificadas
pela cariotipagem formavam colônias de borda lisa
(57%) ou rugosa (43%). Todas as leveduras de colônias
com borda rugosa apresentaram problemas na
fermentação como: espuma em excesso, floculação e/ou
sobra de açúcar no vinho. Entre as leveduras de
colônias de borda lisa, 65% apresentaram pelo menos
um dos problemas citados.As leveduras com estas
características foram submetidas a mais dois ciclos
fermentativos com mosto contaminado por lactobacilos
(~1 x 107 bactérias/mL).

Nestas condições, as leveduras contaminantes flocularam intensamente (como

indicado pelas setas amarelas), enquanto que, a linhagem PE-2 (referência), não
foi afetada. Estes resultados mostraram a importância do uso de leveduras
selecionadas e quanto se pode perder com leveduras contaminantes.
Alguns resultados de
monitoramento utilizando
meios seletivos
 Fermento da cuba

1,00E+14
1,00E+12
UFC ou células
viáveis/mL
1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00
22-jun

29-jun

6-jul

13-jul

20-jul

27-jul

3-ago

10-ago

17-ago

24-ago

31-ago

7-set

14-set

21-set
Safra 2005/2006 Data da coleta

Não Sacch Não Sacch. cerev.

Leveduras totais Células viáveis
Bactérias totais
 Vinho dorna 1

1,00E+14
1,00E+12
UFC ou células
viáveis/mL

1,00E+10
1,00E+08
1,00E+06
1,00E+04
1,00E+02
1,00E+00
22-jun

29-jun

6-jul

13-jul

20-jul

27-jul

3-ago

10-ago

17-ago

24-ago

31-ago

7-set

14-set

21-set
Safra 2005/2006
Data da coleta

Não Sacch Não Sacch. cerev.

Leveduras totais Células viáveis
Bactérias totais
 Mosto

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06

1,00E+05
UFC/mL

1,00E+04

1,00E+03

1,00E+02

1,00E+01

1,00E+00
22-jun
29-jun

6-jul
13-jul

20-jul
27-jul
3-ago

10-ago
17-ago
24-ago

31-ago
7-set

14-set
21-set
Safra 2005/2006
Data da coleta

Não Sacch Não Sacch. cerev.

Leveduras totais Bactérias totais
 Tem se trabalhado com contaminação média de safra de cerca de
106 bastonetes/ml

Evitar o uso indiscriminado de antibióticos e ácido sulfúrico,

o qual acaba prejudicando a levedura.
 UFC/ml

1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07

20/6
27/6
4/7
11/7
18/7
25/7
1/8

8/8
15/8
22/8
29/8
Bactérias

5/9

Data das amostras

12/9

19/9
26/9
3/10
10/10
17/10
24/10
31/10
Vinho
Fermento
Análise microscópica do vinho e bactérias isoladas
do vinho após Coloração de Gram
Esta foto foi tirada da amostra
do vinho do dia 20 de
junho/2006, após coloração de
Gram. Verificar as células de
leveduras coradas de roxo e os
bastonetes também corados de
roxo, sendo portanto Gram-
positivos.

Esta foto foi tirada das colônias

crescidas nas placas, em
grande número, da amostra do
dia 20 de junho/2006, após
coloração de Gram. São
bastonetes gram-positivos.
 V iabilidade celular (%)

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

20/6
27/6
4/7
11/7
18/7
25/7
1/8
8/8
15/8
22/8
29/8
5/9
Viabilidade da levedura

Data das amostras

12/9
19/9
26/9
3/10
10/10
17/10
24/10
Vinho

31/10
Fermento
PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Técnicas avançadas no
estudo da diversidade de
leveduras
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS
como era feita há 20 anos

Morfologia das células e

colônias;
Características bioquímicas e
fisiológicas;
Classificação de espécies mas
não de linhagens.
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS
como é feita hoje
Cariotipagem: análise do DNA
cromossômico das leveduras.

Técnicas baseadas em PCR (RAPD) e

RFLP.

Cada linhagem possui um padrão único

de cromossomos ou bandas de DNA
(como um código de barras).
2007 – Anais do XVI Sinaferm
ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterização das
leveduras floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentação
alcoólica. In: SINAFERM, 2003, Florianópolis. XIV SINAFERM, 2003.

Todos os isolados pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e

apresentaram o mesmo cariótipo. No entanto, um dos três tipos morfológicos
isolados, em cada coleta, apresentou desempenho industrial diferente dos
demais. Os dados obtidos indicam que a determinação do desempenho
fermentativo, pelas técnicas utilizadas, além de avaliar a performance industrial
de cepas de levedura, pode proporcionar a diferenciação final entre cepas S.
cerevisiae de mesmo cariótipo.
 RAPD

Região ITS
 Metodologia da Capacidade Fermentativa (Andrietta et al., 1999)

Tabela 1 – Pontuação e limites das faixas de variação dos parâmetros utilizados na classificação da
leveduras (Andrietta et al., 1999).
Dígito Parâmetro 1 (Alto) 2 (Médio) 3 (Baixo)
Primeiro Yx/s (gMS/gSubst) > 0,044 0,041 a 0,044 < 0,041
Segundo VCS (gSubst/Lxh) > 5,7 5,2 a 5,7 < 5,2
Terceiro NCO (%) > 98,5 90 a 98,5 < 90
Quarto µmax (1/h) > 0,55 0,45 a 0,55 < 0,45
Quinto PROD (gEt/Lxh) > 2,4 2,2 a 2,4 < 2,2
Sexto Yp/s (gEt/gSubst) > 0,45 0,45 a 0,42 < 0,42

Andrietta, S. R.; Migliari, P. C. e Andrietta, M. G. S. (1999), Classificação das

cepas de leveduras de processos industriais de fermentação alcoólica utilizando
capacidade fermentativa. STAB – Açúcar, Álcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.54-
59.
Tabela 2 - Valores de participação populacional, PP (%); rendimento em células, Yx/s

2003, Florianópolis. XIV SINAFERM, 2003.

floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentação alcoólica. In: SINAFERM,
ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterização das leveduras
(gMS/gSubst); velocidade de consumo de substrato, VCS (gSubst/Lxh); nível de conversão de
substrato, NCO (%); velocidade específica máxima de crescimento, µmax (1/h);
produtividade, PROD (gEt/Lxh); rendimento em etanol, Yp/s (gEt/gSubst); grupo de
desempenho, para as leveduras isoladas.
Coleta
Isolado PP Yx/s VCS NCO µm PROD Yp/s Grupo
(dias/safra)
IN 74 100,0 0,0412 5,81 99,65 0,50 2,60 0,4774 211.211
78 0,0412 5,81 99,62 0,51 2,49 0,4579 211.211
79 77,3 0,0412 5,80 99,50 0,47 2,51 0,4618 211.211
80 0,0440 5,80 99,50 0,49 2,54 0,4672 211.211
81 0,0410 5,80 99,50 0,48 2,47 0,4540 211.211
60 82 12,5 0,0424 5,80 99,50 0,49 2,53 0,4650 211.211
83 0,0432 5,80 99,50 0,46 2,57 0,4715 211.211
84 0,0422 4,45 76,36 0,46 2,00 0,4878 233.231
85 10,2 0,0443 3,92 67,27 0,45 1,86 0,5199 233.231
86* 0,0434 5,80 99,49 0,46 2,55 0,4688 211.211
96 0,0423 5,80 99,50 0,51 2,46 0,4528 211.211
97 55,2 0,0419 5,80 99,50 0,48 2,48 0,4555 211.211
98 0,0436 5,80 99,50 0,48 2,45 0,4511 211.211
99 0,0430 4,78 81,94 0,53 2,02 0,4574 233.231
120 100 29,3 0,0433 4,79 82,21 0,55 2,00 0,4513 233.231
101 0,0433 5,80 99,44 0,47 2,44 0,4502 211.211
102 0,0419 5,80 99,50 0,50 2,45 0,4517 211.211
103 15,5 0,0435 5,80 99,50 0,49 2,46 0,4539 211.211
104 0,0434 5,80 99,50 0,50 2,46 0,4527 211.211
114 0,0440 3,37 57,85 0,48 1,59 0,5207 233.231
115 43,3 0,0440 3,77 64,63 0,50 1,58 0,4598 233.231
116 0,0417 5,79 99,41 0,47 2,52 0,4645 211.211
117 0,0420 5,80 99,50 0,47 2,46 0,4521 211.211
180 118 31,7 0,0411 5,80 99,51 0,48 2,56 0,4702 211.211
119 0,0416 5,80 99,51 0,46 2,53 0,4657 211.211
120 0,0410 5,80 99,50 0,47 2,52 0,4633 211.211
121 25,0 0,0420 5,80 99,51 0,46 2,49 0,4577 211.211
122 0,0415 5,80 99,50 0,45 2,50 0,4600 211.211
* Variante morfológico.
 O que o nosso
laboratório tem feito ?

Laboratório de microbiologia agrícola e molecular (LAMAM)

www.cca.ufscar.br/lamam/

E-mail: antonini@cca.ufscar.br
PESQUISA
Filamentação em Saccharomyces
cerevisiae : aspectos genéticos e
fisiológicos

Álcoois Superiores (butanol, isoamílico), deficiência

de carbono e nitrogênio
 80

Filamentation rate (%)

70
60
50
24H
40
30 48H
20
10
0
O22 O37 022 mpk1 037 mpk1
derivative derivative
Strains

Deleção do gene MPK1

0% AIA 0.5% AIA 24 hours
CCA 037

em linhagens haplóides
ee S. cerevisiae
0% AIA 0.5% AIA 24 hours
CCA 037 MPK1 derivative
 100
6

98 5

Etan o l (g /100m
V iabilidade
ce lular (%)
4
96
3
94
2
92 1

90
0
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c 10
C i c l os f e r me nt a t i v os C iclo s fe r m e n tativo s

0%AIA 0,1%AIA 0% A IA 0,1% A IA

Sem álcool
isoamílico Com 0,1%
álcool
isoamílico

20% das células estão filamentadas

Efeito da filamentação no processo fermentativo –
levedura PE-02
Biotipagem de leveduras
industriais através do sistema
killer

CCA209 Ö

CCA151
Ö
Dekkera e Brettanomyces : caracterização e
comportamento fermentativo de linhagens
contaminantes da fermentação alcoólica

1 kb →
500 bp →

Tamanho da região ITS do

Morfologia celular DNA ribossomal

Concentrações de 10 a 1000 células/ml destas leveduras causam diminuição

do rendimento fermentativo.
Efeito da contaminação com Dekkera bruxellensis sobre o processo de
fermentação alcoólica

11.173 5.940 15.296 81.698

120.000

100.000

Álcool produzido (m3)

80.000

60.000

40.000

20.000

0
F1 F2 F3 F4 F5
Ferm entações

Volume de álcool produzido (m3) durante as fermentações puras e mistas de S.

cerevisiae e D. bruxellensis, em meio de caldo de cana, extrapolando-se os resultados
obtidos em escala de laboratório para os números de ART da cana de uma destilaria
de médio porte. O volume de álcool que deixou de ser produzido nas fermentações
com D. bruxellensis esta destacado em vermelho e expresso em números sobre as
barras. Legenda: F1: 108 células/mL de S. cerevisiae; F2: 108 células/mL de S.
cerevisiae + 101 células/mL de D. bruxellensis; F3: 108 células/mL de S. cerevisiae +
102 células/mL de D. bruxellensis; F4: 108 células/mL de S. cerevisiae + 103
células/mL de D. bruxellensis; F5: 108 células/mL de D. bruxellensis FONTE:
MENEGHIN, M.C. Dissertação de mestrado, 2007, ESALQ/USP)
EXTENSÃO
„ Monitoramento da fermentação através da
análise de viabilidade e plaqueamento em
meios seletivos
„ Testes de biocidas utilizando a técnica de
concentração mínima inibitória para
bactérias
„ Análise microbiológica de água, açúcar e
outros alimentos
„ Cursos e treinamentos nas usinas
Obrigada !