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ABER Materiais Avançados do Fungal

TO
Mycelium: Fabricação e Afinação
de Propriedades Físicas
Muhammad Haneef1,2 , Luca Ceseracciu1 , Claudio Canale1, Ilker S. Bayer 1, José A. Heredia-
recebido: 27 de julho de 2016
Guerrero 1& Athanassia Athanassiou 1
aceite: 19 de Dezembro de Neste trabalho é apresentada uma nova categoria de materiais compostos naturais, fibrosos e
2016 auto-criados com propriedades físicas controladas, que podem ser produzidos em grandes
Publicado em: 24 de Janeiro de quantidades e em grandes áreas, com base no micélio, o corpo principal dos fungos. Micélios de
2017 dois tipos de fungos medicinais comestíveis, Ganoderma lucidum e Pleurotus ostreatus, foram
cuidadosamente cultivados, sendo alimentados por dois bio-substratos:
celulose e celulose/potato-dextrose, sendo a segunda mais fácil de digerir pelo micélio devido à
presença de açúcares simples na sua composição. Após tempos específicos de crescimento, os micélios
foram processados de forma a interromper o seu crescimento. Dependendo do seu substrato alimentar,
as estruturas fibrosas finais apresentaram diferentes concentrações relativas em polissacarídeos,
lipídios, proteínas e quitina. Tais diferenças são refletidas como alterações na morfologia e
propriedades mecânicas. Os materiais cultivados em celulose continham mais quitina e apresentaram
maior módulo de Young e menor alongamento do que aqueles cultivados em substratos contendo
dextroses, indicando que os materiais micélicos ficam mais rígidos quando seu substrato de
alimentação é mais difícil de digerir. Todos os materiais fibrosos desenvolvidos foram hidrofóbicos com
ângulos de contacto com a água superiores a 120°. A possibilidade de personalizar as propriedades dos
materiais de micélio, escolhendo adequadamente os seus substratos nutritivos, abre caminho para a
sua utilização em várias aplicações em escala.

A química dos materiais e a nanotecnologia têm demonstrado grandes capacidades no desenvolvimento de

novos materiais com qualquer propriedade desejada, já que sua ação sinérgica pode engendrar matéria ao nível
de átomos ou moléculas1-4. No entanto, a capacidade de reprodução dos organismos biológicos permanece
única na natureza e é impossível de ser duplicada pela engenharia de materiais. A introdução de sistemas
biológicos vivos na ciência dos materiais e na nanotecnologia para a realização de materiais a partir de
recursos biológicos, desenvolvidos de forma controlada, é uma estratégia que está atraindo esforços
significativos de pesquisa5-7. Isto está de acordo com a necessidade, cada vez mais crucial nos dias de hoje, do
desenvolvimento de novos materiais verdes e sustentáveis que não serão uma fonte de poluição para o nosso
planeta8-12. De facto, as questões globais de degradação ambiental dos plásticos sintéticos13,14 em combinação
com os problemas de esgotamento fóssil são as principais razões que empurram a investigação relacionada
com os materiais para materiais poliméricos obtidos a partir de recursos renováveis15-17. Intensos esforços de
pesquisa estão focando o desenvolvimento de materiais poliméricos de fontes naturais, como celulose18,
lignina19, pectina20,21 de plantas, proteínas de plantas e animais22,23, poliésteres de bactérias24 ou plantas25,
etc., todos materiais que são sustentáveis, biocompatíveis e biodegradáveis com uma grande variedade de
propriedades26,27. O desenvolvimento de tais materiais necessita geralmente de métodos difíceis e complicados
de processamento de suas fontes biológicas, para sua extração, desenvolvimento e funcionalização, que podem
ser caros, demorados e com baixo rendimento de produção28. Por esse motivo, esses materiais, embora
possam resolver vários problemas ambientais, ainda são caros e têm usos muito limitados29,30.
Uma estratégia para superar esses problemas poderia ser o desenvolvimento de biomateriais compostos
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com propriedades
controladas e
sintonizáveis durante seu
crescimento, que estariam
prontos para uso sem a
necessidade de métodos
de processamento caros e
sofisticados. Para
materializar esta
estratégia escolhemos o
micélio, a parte inferior
vegetativa dos fungos. O
micélio foi identificado
como o maior organismo
vivo na Terra (uma rede
de micélio ocupa quase 10
km2 nas Montanhas
Azuis do Oregon)31,32.
Cresce devido à sua
relação simbiótica com os
materiais que o
alimentam, formando
redes enredadas de fibras
ramificadas33, Fig. 1A.
Os filamentos do micélio
fibroso são chamados de
hifas e consistem em
células alongadas. Estas
células são separadas
umas das outras por uma
cruz porosa interna.

1Smart Materials,
Departamento de
Nanofísica, Istituto
Italiano di Tecnologia (IIT),
via Morego 30, 16163,
Genova, Itália. 2DIBRIS,
Universidade de Génova,
via Opera Pia, 13, 16145,
Génova, Itália.
Correspondência e
pedidos de material
devem ser dirigidos à
J.A.H.-G. (e-mail:
jose.heredia-
guerrero@iit.it) ou A.A. (e-
mail:
athanassia.athanassiou@ii
t.it)

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Figura 1. Representação esquemática da fisiologia do micélio em diferentes escalas. (A) Imagem

microscópica óptica de um filme de micélio mostrando uma rede ramificada de micro-filamentos (hifas). (B)
Representação esquemática
de uma hifa que é formada por células separadas por paredes cruzadas (septa), todas fechadas dentro de uma
parede celular. (C) Representação esquemática da parede celular que é composta por uma camada de quitina na
membrana celular, uma camada de glucanos (cuja composição varia de espécie para espécie) e uma camada de
proteínas na superfície (adaptado da ref. 36).

e estão todas fechadas dentro de uma parede celular tubular, Fig. 1B. A parede celular (Fig. 1C) desempenha
vários papéis fisiológicos na morfogênese dos fungos, protegendo as hifas34,35 e fornecendo a resistência
mecânica a todo o micélio36. É composta de quitina, glucanos e uma camada externa de proteínas, como
manoproteínas e hidrofobinas37. O crescimento de hifas é feito através da extensão da membrana celular e da
parede celular na ponta hifalina.
O micélio é composto principalmente de polímeros naturais como a quitina, celulose, proteínas, etc., por
isso é um material fibroso composto polimérico natural. Devido à sua estrutura e composição únicas, prevemos
a produção de grandes quantidades de materiais à base de micélio. Até agora os micélios têm sido explorados
principalmente por uma empresa americana, que utiliza biomassa não processada colada por micélios
resultando em estruturas espumosas38 , mas ainda há muito espaço para melhoria e desenvolvimento dos
materiais à base de micélio.
Este trabalho apresenta a combinação de micélio com substratos à base de polissacarídeos de diferentes
composi- tos, para obter filmes fibrosos cuidadosamente concebidos com propriedades sintonizáveis. Dois
tipos de fungos medicinais comestíveis, Ganoderma lucidum (G. lucidum) e Pleurotus ostreatus (P. ostreatus),
foram utilizados. Eles pertencem ao grupo dos fungos da podridão branca e têm a possibilidade de excretar
uma variedade de enzimas, algumas das quais também são capazes de degradar componentes vegetais difíceis
de hidrolisar, como a lignina. Há grande interesse científico nestas duas espécies devido aos importantes
fitoquímicos que elas contêm, mas neste trabalho o aspecto mais importante para sua escolha é que elas podem
secretar enzimas semelhantes, podendo assim decompor os mesmos substratos, desenvolvendo estruturas
filamentosas entre as duas veias39-41.
Como mencionado acima, os micélios penetram em seus substratos alimentares por pressão física e segredo
enzimático, a fim de quebrar polímeros biológicos em nutrientes facilmente absorvidos e transportados, como
os açúcares. Os substratos nutritivos escolhidos para este trabalho são biopolímeros de celulose pura e caldo de
batata celulósica dextrose (PDB) desenvolvidos com um método já publicado pelo nosso grupo42. A escolha
foi baseada no fato de que a celulose celulose é o polímero natural mais abundante, enquanto o PDB é o meio
mais comum que promove o crescimento fúngico, uma vez que é rico em açúcares simples de fácil digestão
pelo micélio. Devido à natureza polissacárida comum dos dois substratos alimentares, espera-se que enzimas
fúngicas semelhantes sejam usadas pelo micélio para a sua hidrólise. Além disso, devido ao seu método de
desenvolvimento42 , os dois substratos são muito homogêneos, com superfícies regulares. Isto garante que o
processo de crescimento do micélio ocorre em uma plataforma de nutrição invariável, resultando em materiais
de forma unitária. Estes dois substratos de alimentação são ideais para provar a capacidade dos riais fibrosos
desenvolvidos para afinar suas propriedades dependendo do substrato de alimentação, e podem ser usados
como referência para outros substratos mais complexos. O resultado mais promissor do presente trabalho é
que os materiais compostos naturais desenvolvidos de micélio apresentam propriedades estruturais e
mecânicas sintonizáveis e muito bem controladas, conseguidas através da exploração de diferentes substratos
nutritivos para o crescimento das hifas, provando assim que as propriedades dos micélio-materiais estão
intimamente relacionadas com os seus substratos nutritivos. Verificou-se que os materiais fibrosos do micélio
são mecanicamente mais rígidos, com maior módulo Young, quando são cultivados sobre a celulose amorfa,
que é mais difícil de digerir em comparação com os substratos celulósicos contendo PDB. Além disso, todos os
materiais fibrosos desenvolvidos apresentam um caráter altamente hidrofóbico, o que é um aspecto difícil de
ser alcançado em materiais de origem natural.

Resultados e Discussão
Caracterização Morfológica. Um material característico de P. ostreatus mycelium após seu crescimento
por 20 dias em um substrato celulósico é mostrado na Fig.2A. A película fibrosa auto-criada cobre toda a área da
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sub-estratégia de alimentação (uma área circular de 9,5 cm de diâmetro) após o período específico de
crescimento. Como esperado, o período de crescimento foi idêntico para ambas as espécies de micélio nos dois
substratos utilizados, uma vez que as duas espécies pertencem ao mesmo grupo de fungos da podridão branca,
de modo que podem excretar enzimas semelhantes, e os substratos eram em ambos os casos ricos em
polissacarídeos. Embora os materiais finais de micélio totalmente cultivados apareçam macroscopicamente em
todos os casos como membranas fibrosas,

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Figura 2. Caracterização topográfica. (A) fotografia de um filme de P. ostreatus alimentado com celulose
amorfa durante 20 dias. (B) imagens topográficas de AFM de hifas fúngicas no estágio inicial de
desenvolvimento (2 dias de idade) em substratos de celulose e de celulose PDB. Barra de escalas: 5 μm. (C)
perfis de altura dos filamentos correspondentes às linhas verdes em "B".

Como o mostrado na Fig. 2A, suas morfologias microscópicas individuais apresentam diferenças tanto no
estágio inicial quanto no estágio avançado de crescimento.
A morfologia das hifas jovens (2 dias de idade) (os filamentos do micélio fibroso) foi caracterizada pela
AFM, Fig.2B e C. A caracterização foi realizada nas pontas das hifas, a fim de destacar as diferenças nesta fase.
Como mostrado nos perfis das hifas características apresentados na Fig.2B, as hifas de P. ostreatus têm, em
geral, diâmetros maiores do que as de G. lucidum, independentemente do substrato em crescimento. Em ambos
os casos, as hifas são relativamente planas, com uma relação largura/espessura próxima de 3. Em relação às
diferenças relacionadas com os subestratos em crescimento, pode-se observar que a morfologia das hifas de G.
lucidum cultivadas em PDB-celulose e subestratos de celulose parece muito semelhante. Por outro lado, a
mudança de substrato tem um forte efeito sobre as hifas de P. ostreatus, uma vez que no caso do seu
crescimento sobre o substrato PDB-celulósico apenas as paredes celulares na sua periferia são visíveis, o que
sugere o colapso das hifas, um fenómeno que será analisado mais detalhadamente pela SEM.
As características de superfície das amostras cultivadas em diferentes épocas de crescimento foram
analisadas pela SEM na Fig. 3A. A densidade dos filamentos foi claramente aumentada com o tempo de
crescimento, atingindo uma estrutura microporosa compacta após cerca de 20 dias. Especificamente, os filmes
de G. lucidum mostram dois tipos de estruturas: semelhantes a tubos e semelhantes a fios durante cada fase de
crescimento. As estruturas tubulares curtas e altamente enredadas são mais comuns durante os primeiros dias
de crescimento, mas com o tempo, a presença de filamentos compactos aumenta. Também se pode notar que
os diâmetros dos filamentos compactos permanecem quase inalterados com o tempo. Não foram observadas
diferenças significativas no diâmetro dos filamentos cultivados nos dois substratos de alimentação após 20
dias, Fig. 3B. Mais especificamente, a largura média dos filamentos dos filmes fibrosos de G. lucidum foi de 0,8 μm
para crescimento tanto em substratos de celulose quanto em substratos de PDB celulósico. Por outro lado, os
filmes de P. ostreatus apresentam um tipo único de filamentos comprimidos, Fig. 3A. Neste caso, a largura dos
filamentos depende claramente dos substratos de alimentação que apresentam valores mais altos quando os
filmes foram cultivados em celulose, em comparação com o substrato de P. ostreatus, Fig3B. Para este último
substrato, os filamentos de micélio parecem colapsados ao longo de sua parte central, um efeito já observado
com AFM (Fig.2B) e este colapso é muito provavelmente responsável pela sua largura reduzida em
comparação com os filamentos de celulose-PDB. A pressão hidrostática interna (turgor) fornece o suporte
mecânico das hifas enquanto contribui para o crescimento hifálico ao causar o fluxo de massa do citoplasma
em direção às pontas hifálicas43. A parede celular protege contra a lise osmótica das hifas, devido à pressão
hidrostática interna. Quando o crescimento do micélio pára por tratamento térmico durante 2 h a 60 °C os seus
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filamentos já não são suportados pela pressão hidrostática interna e por esta razão aparecem achatados nas
imagens AFM e SEM, especialmente no caso do P. ostreatus. O G. lucidum

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Figura 3. Caracterização morfológica. (A) Micrografias SEM de G. lucidum e P. ostreatus em substratos

celulósicos e PDB-celulósicos a 5, 10 e 20 dias de crescimento. Barra de escalas: 5 μm. (B) histogramas de larguras
de crescimento de hifas após 20 dias.

Os filamentos são muito menores e, portanto, a sua estrutura pode ser menos afectada pelo tratamento térmico.
O lapso central dos filamentos de P. ostreatus cultivados na celulose PDB pode ser avaliado em relação à sua
natureza química, que é discutida na seção seguinte sobre medidas de ATR-FTIR.

Caracterização química. A espectroscopia ATR-FTIR foi utilizada para caracterizar a natureza química
dos filmes fibrosos de micélio autoproduzidos e foram encontradas diferenças importantes entre eles devido
aos diferentes substratos de alimentação. Fig. 4A mostra espectros típicos de ATR-FTIR dos quatro diferentes
tipos de amostras após 20 dias de crescimento. Em geral, os espectros de absorção infravermelha dos micélios
estão associados às biomoléculas que os compõe, por exemplo, lipídios (3000-2800 cm-1, ∼1740 cm-1),
proteínas (amida I a 1700-1600 cm-1, amida II e III a 1575-1300 cm-1), ácidos nucléicos (1255-1245 cm-1) e
polissacarídeos (1200-900 cm-1)44,45. Uma atribuição detalhada da faixa das amostras é mostrada na Tabela 1.
Uma observação geral sobre a comparação dos espectros das duas espécies de micélio é que,
independentemente dos substratos alimentares, os filmes fibrosos de G. lucidum mostraram uma maior
contribuição de lipídios, enquanto os filmes de P. ostreatus mostraram bandas relativamente mais intensas
atribuídas aos polissacarídeos. Curiosamente, a natureza química dos substratos de alimentação é também
responsável por alterações distintas nos espectros infravermelhos dos filmes de micélio. Em particular,
Os filmes de G. lucidum cultivados em substratos de celulose PDB mostraram um incremento significativo das
bandas atribuídas aos lipídios (modos de alongamento assimétrico e simétrico do CH2 em ∼2930 e 2855 cm-1,
respectivamente, e o ester C=O vibração de alongamento em 1743 cm-1) em relação aos que cresceram em
substratos de celulose amorfa pura. Também foi apreciado um grande deslocamento (18 cm-1, de 1686 a 1668
cm-1) para os ondenímetros inferiores da faixa atribuída ao amido I de β-turns. Isto se deve a alterações do
ambiente molecular de tais estruturas secundárias como conseqüência da modificação química da composição
do micélio quando seu substrato de alimentação muda46. Além disso, a presença relativa de quitina foi
reduzida quando a PDB-celulose foi utilizada para alimentar o micélio G. lucidum. A relação entre a
intensidade do pico de absorção associada ao modo de dobra C-H da quitina (∼1374 cm-1) e a do
alongamento C-C dos polissacarídeos (∼1043 cm-1) diminuiu de um valor de 0,3 para substratos de
alimentação de celulose pura para cerca de 0,1 para substratos de alimentação de PDB-celulose.
Para as amostras de P. ostreatus foi detectado um aumento relativo de proteínas e lipídios quando os filmes
eram cultivados sobre a celulose PDB em comparação com os cultivados sobre a celulose pura. Na verdade, a
proporção da faixa em 1645 cm-1 (amide I em β- folhas de estruturas secundárias) para a faixa em 1030
cm-1 (estiramento C-C de polissacarídeos) foi de 0,3 para amostras de celulose celulósica e 0,5 para amostras
cultivadas em substratos de PDB-celulose. Além disso, similar ao G. lucidum, a relação quitina/polissacarídeo
(1371 cm-1/1030 cm-1) foi reduzida de um valor de 0,08 para celulose para 0,06 para celulose PDB-celulose.
Tal diminuição na quantidade relativa de quitina rígida da parede celular está muito provavelmente
relacionada ao colapso da área central das fibras de micélio quando elas crescem nos substratos de celulose-
PDB, como observado pela AFM e SEM (Fig. 3A). De fato, tem sido relatado que mutantes fúngicos incapazes
de sintetizar a quitina são morfologicamente alterados e osmoticamente sensíveis47.

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Figura 4. Caracterização química, térmica e da captação de água. (A) Espectros ATR-FTIR de amostras
de 20 dias de idade na faixa de 3800-600 cm-1. As principais absorções associadas a lipídios, proteínas,
quitina, ácidos nucléicos e polissacarídeos têm sido destacadas. B) Absorção de água das diferentes
amostras, com 20 dias de idade. (C) análise termogravimétrica das amostras com 20 dias de idade.

Caracterização hidrodinâmica e termomecânica. As medidas de captação de água foram formadas

por micélio em filmes fibrosos após 20 dias de crescimento, Fig.4B. Todas as películas são bastante resistentes à
umidade, absorvem baixas quantidades de água. Para umidade de até 50% HR, a absorção foi baixa (< 4%) e
independente do substrato e do organismo inicial. Com 85% de HR, a absorção torna-se ligeiramente maior,
cerca de 6%, ainda não mostrando diferença entre as várias amostras. Finalmente, com 100% de RH, o P.
ostreatus cultivado com celulose PDB apresentou a maior absorção, 20% contra os 12 a 13% dos outros
materiais. Este valor de absorção de P. ostreatus cultivado em PDB-celulose deve estar relacionado com a sua
diferente composição química e especialmente com a da sua parede celular, onde a redução relativa da quitina
pode ser responsável pela sua sensibilidade à humidade. A baixa absorção de água está de acordo com a
natureza hidrofóbica dos filmes auto-celulósicos, que mostraram valores de WCA de (122 ± 3)° e (121 ± 2)°
para G. lucidum e P. ostreatus, respectivamente, independentemente dos substratos de alimentação. Esses altos
valores de WCA podem estar relacionados à natureza hidrofóbica de proteínas específicas (como
manoproteínas e hidrofobinas) que podem ser encontradas na camada mais externa da parede celular
fúngica48,49, e também à rugosidade micrométrica das amostras relacionada à natureza fibrosa dos filmes (ver
seção AFM abaixo). A análise termogravimétrica dos filmes fibrosos autocrescidos após 20 dias de crescimento
(Fig.4C) não mostrou diferença significativa entre as diferentes amostras, com etapa de degradação única,
começando em torno de 225 °C e terminando próximo a 300 °C. Esta alta temperatura de degradação dos
materiais auto-criados desenvolvidos prova que eles também são termicamente estáveis, expandindo seus
campos de aplicação. Além disso, o peso do resíduo de carvão foi bastante significativo para todas as amostras,
entre 15 e 25% em peso.

Caracterização mecânica. Os testes de caracterização mecânica são mostrados na Fig. 5, onde também são
mostradas curvas mentais típicas de cada tipo de filme cultivado durante 20 dias (Fig. 5A). As curvas de
tensão-deformação são bastante orelha-linha, com falhas frágeis, precedidas por algumas dobras, apenas nos
materiais alimentados por celuloses, indicando fratura progressiva da rede. Os parâmetros medidos mostram
diferenças significativas entre todas as amostras, considerando tanto as espécies fúngicas quanto os substratos.
Em geral, os materiais baseados em P. ostreatus são mais rígidos que os baseados em G. lucidum e têm um
alongamento menor na fratura. A maior rigidez do P. ostreatus em comparação com os filmes fibrosos de G.
lucidum pode ser explicada considerando os resultados da análise ATR-FTIR, que mostra um maior conteúdo
de polissacarídeos no material anterior. Assim, o maior alongamento de G. lucidum é consistente com a maior
quantidade de constituintes proteicos e lipídicos, que podem atuar como plastificantes.
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A mudança do substrato de alimentação teve um efeito semelhante, tanto na rigidez como no alongamento
dos materiais de micoleão auto-criados, naturalmente decorrentes da sua composição química diferente. Em
particular, quando o PDB estava presente

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Wavenumber (cm-1) (Intensitya)

G. lucidum G. lucidum P. ostreatus P. ostreatus Componente de
Atribuição Celulose PDB-celulose Celulose PDB-celulose micélio
(contribuição
principal)
O-H alongamento 3360 (s) 3342 (s) 3315 (s) 3294 (s) Polissacarídeos
Alongamento
2932 (m) 2926 (s) 2922 (m) 2924 (m) Lípidos
2assimétrico do CH

Alongamento
2855 (m) 2855 (s) 2855 (m) 2853 (m) Lípidos
2simétrico de
CH
Ester C=O alongamento 1743 (m) 1736 (sh, w) 1734 (sh, w) Lípidos
Amide I (β-turn) 1686 (m) 1668 (m) 1670 (m) 1670 (m) Proteínas
Amide I (β-sheet) 1643 (m) 1645 (m) 1645 (m) 1645 (m) Proteínas
Amide II 1545 (w) 1543 (w) 1543 (w) 1543 (w) Proteínas
2curva CH 1452 (m) 1454 (m) 1454 (m) 1454 (m) Lípidos
flexão C-H 1375 (w) 1373 (w) 1371 (w) 1371 (w) Chitin
Amida III 1275 (w) 1282 (w) Proteínas
PO2- assimétrico
1248 (w) 1248 (w) 1252 (w) 1248 (w) Ácidos
alongamento
nucléicos
Alongamento C-C +
Alongamento C-O + 1202 (w) 1202 (w) 1202 (w) 1202 (w) Polissacarídeos
deformação C-H
C-O...H alongamento 1148 (w) 1148 (m) 1142 (sh, m) 1134 (sh, m) Polissacarídeos
Alongamento C-O 1063 (vs) 1068 (vs) 1063 (vs) 1067 (vs) Polissacarídeos
Alongamento em C-C 1044 (vs) 1042 (vs) 1030 (vs) 1030 (vs) Polissacarídeos
Glucan β-anomer C-H
889 (w) 893 (w) 893 (w) 891 (w) Polissacarídeos
dobrando
banda Mannan 800 (w) 800 (w) 800 (w) 800 (w) Polissacarídeos

Tabela 1. Faixas observadas nos espectros de IV (3800-600 cm-1) das amostras de micélio cultivadas nos
diferentes substratos alimentares. como: forte, m: médio, w- fraco, vs: muito forte, vw: muito fraco, b: largo,
sh: ombro.

nos substratos alimentares, os materiais de micélio eram mais ricos em lípidos ou proteínas e mais pobres em
quitina. Assim, a adição de caldo de dextrose de batata, que é rico em açúcares, fácil de ser absorvido pelos
micélios em relação à celulose, estimula a biossíntese de plastificantes (lipídios, proteínas) e reduz a produção
de polímeros rígidos (quitina), induzindo um comportamento mais dúctil nos filamentos de micélios.
A força máxima, por outro lado, é quase inafectada pela origem do material, Fig. 5B. A energia de fratura
permite obter uma esti- mação global das propriedades mecânicas, um parâmetro que é uma combinação de
resistência e alongamento: ambos os materiais de G. lucidum apresentam valores mais elevados em
comparação com o P. ostreatus, respectivamente. Este comportamento é atribuído à diferença de morfologia,
com maior flexibilidade da estrutura torcida e ramificada de G. lucidum, o que torna a falha mais progressiva e,
portanto, mais suave.
Os resultados mecânicos das medições de indentação de AFM em amostras de 2 dias são mostrados na Fig.
5C. Os modulos medidos seguem a mesma tendência dos testes macroscópicos, sendo os materiais
alimentados com PDB-celulose sis tematicamente mais macios que os alimentados com celulose pura, devido
ao aumento da presença de lipídios ou proteínas, que podem atuar como plastificantes, e a diminuição da
presença de quitina rígida no primeiro caso, como mostrado no estudo FTIR. Por outro lado, os valores da
distribuição dos módulos de Young são semelhantes para G. lucidum e P. ostreatus, embora os materiais à base
de G. lucidum apresentem uma distribuição mais ampla dos módulos de Young em ambos os substratos. Os
valores semelhantes do módulo de Young para os dois tipos de micélio são a principal diferença em relação aos
testes macroscópicos e podem ser atribuídos ao caráter local da indentação do AFM, onde as medidas são
influenciadas pela parede celular e, em menor grau, pela estrutura interna das células, na qual muitas
diferenças composicionais podem ocorrer. O AFM foi usado também para avaliar a rugosidade dos materiais
fibrosos desenvolvidos e foi encontrado entre 6000 e 7500 nm com um valor médio da barra de erro de 1500
nm para todos os materiais cultivados com exceção do P. ostreatus, cuja rugosidade chegou a 10000 nm muito
provavelmente devido ao colapso da parte central dos filamentos das hifas.

Comparação dos filmes de micélio com outros materiais auto-cultivantes produzidos por
bactérias. A celulose bacteriana e os poli-hidroxialcanoatos (especificamente o poli(3-hidroxibutirato) ou
P(3HB)) são dois biopolímeros inter-esting alternativos aos plásticos derivados do petróleo50,51 que podem ser
considerados auto-cultivantes, como os materiais de micoleão, uma vez que são produzidos por
microorganismos. Por esta razão, apresentamos na Tabela2 uma comparação entre as principais características
dos filmes à base de micélio e destes biopolímeros. As principais diferenças podem ser atribuídas à natureza
desses três sistemas: enquanto a celulose bacteriana e o P(3HB) são homopolímeros com pesos moleculares
muito longos, os filmes de micélio são materiais compostos poliméricos, compostos por uma variedade de
biopolímeros (principalmente lipídios, polissacarídeos e proteínas). Alterações na composição química dos
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nutrientes podem produzir diferenças no rendimento final de celulose bacteriana e P(3HB) e nos seus pesos
moleculares. Para os filmes de micélio, entretanto, estas mudanças podem induzir modificações específicas na
contribuição relativa dos biopolímeros e na sua forma, permitindo um melhor controle das propriedades
finais. Outras diferenças importantes estão na purificação e isolamento dos materiais finais. Como foi descrito
acima, os materiais de micélio são obtidos com um ligeiro

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Figura 5. Caracterização mecânica. (A) curvas de tensão-deformação típicas de filmes de micélio com 20 dias
de duração.
(B) Módulo, alongamento e força das diferentes amostras de jovens. (C) Histogramas de medidas do módulo de
Young calculados por indentação de AFM em amostras de 2 dias de idade.

Ganoderma Ganoderma Pleurotus Pleurotus

lucidum lucidum ostreatus ostreatus Poli
Parâmetro sobre a sobre sobre a sobre a Celulose (3-hidroxibutirato)
celulose celulose-PDB celulose celulose-PDB Bacteriana
Filmes fibrilares
Filmes fibrilares brancos. ∼0.9 Películas fibrilares brancas. semitransparente Granulado. 0,2-0,5 μm
Descrição morfológica μm e ∼0.6 μm diâmetros de ∼4 μm diâmetro das diâmetro56
s. 40-60 nm de
hifas. hifas. diâmetro da
fibra50,53-55
E (MPa) 12 4 28 17 ∼970057 ∼350058

Stress na pausa (MPa) 1.1 0.8 0.7 1.1 ∼24057 ∼4058

Alongamento na pausa (%) 14 33 4 9 ∼2.657 ∼658

Ângulo de contacto com a água ∼122 ∼122 ∼121 ∼121 ∼2659 ∼8960

(°)
T decomposição térmica (°C) 294 293 295 295 36561 ∼30062

Tabela 2. Resumo das principais propriedades das fibras fúngicas, celulose bacteriana e poli(3-
hidroxibutirato).

processo de tratamento térmico no final do seu processo de crescimento. Por outro lado, a celulose bacteriana
é normalmente purificada por várias lavagens em soluções quentes de hidróxido de sódio, seguidas de lavagem
em água até atingir um pH neutro. No caso do P(3HB), solventes orgânicos como clorofórmio são utilizados
durante o processo de purificação.
Quanto às propriedades mecânicas, os valores do módulo de Young e do stress na quebra para a perda
bacteriana de cellu- e P(3HB) são muito mais elevados do que os dos filmes fúngicos. Entretanto, a celulose

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bacteriana muda suas propriedades dependendo do seu teor de água, e torna-se extremamente frágil e,
portanto, difícil de manusear, quando está seca. Isto também se reflete no alongamento na ruptura, que tem o
menor valor para a celulose bacteriana. P(3HB) tem elon- gation em valores de ruptura entre os de P. ostreatus
materiais cultivados em celulose e PDB em celulose, enquanto que foram encontrados valores
significativamente mais altos para G. lucidum materiais (especificamente para as amostras alimentadas com

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substratos celulósico-PDB). Assim, os materiais à base de micélio são mais macios, menos frágeis e, portanto,
mais manejáveis que a celulose bacteriana e o P(3HB).
Além disso, os filmes de micélio são materiais hidrofóbicos com altos valores de ângulo de contato
(superior a 120°) e baixa absorção de água. P(3HB) está próximo do limite hidrofóbico com valores de ângulo
de contato de 89°, bastante inferiores aos obtidos com os materiais fibrosos de micélio. Pelo contrário, a celulose
bacteriana apresenta um caráter hidrofílico significativo com baixos valores de ângulo de contato (~26°). A
hidrofobicidade é uma propriedade muito importante dos materiais de micélio apresentados neste trabalho, já
que o forte caráter hidrofílico e a sensibilidade à água são uma importante desvantagem da maioria dos
polímeros naturais atualmente disponíveis em quantidades industriais (ou seja, amido, celulose) em relação aos
polímeros sintéticos convencionais, o que limita fortemente suas aplicações no mercado52. Finalmente, a
estabilidade térmica é semelhante para filmes de micélio e P(3HB) (com temperatura de degradação térmica
em torno de 300 °C, o que corresponde à maioria dos plásticos derivados da gasolina). A celulose bacteriana é
termicamente mais resistente, com uma temperatura de degradação de 365 °C.

Conclusões. Neste estudo fabricamos filmes fibrosos à base de micélio, a partir de duas espécies fúngicas
comestíveis e medicinais que pertencem ao mesmo grupo de fungos da podridão branca (G. lucidum e P.
ostreatus), podendo assim segregar as mesmas enzimas e quebrar os mesmos polímeros naturais para os
absorver e crescer. O crescimento dos materiais de micélio foi feito alimentando-os com dois substratos
poliméricos naturais, cellu- perdido amorfo puro e uma mistura de celulose e PDB. A alimentação dos
substratos biopoliméricos foi homogênea, garantindo a absorção uniforme dos nutrientes pelo micélio durante
todo o processo de crescimento e, portanto, o desenvolvimento de materiais homogêneos de micélio. Ambos os
substratos nutritivos eram à base de polissacarídeos, enquanto o que continha PBD contaminado foi mais
facilmente absorvido pelo micélio devido a sua maior concentração em açúcares simples. No final do seu
período de crescimento, os filmes de micélio foram tratados termicamente a fim de cessar o crescimento e
obter as membranas fibrosas finais.
As propriedades físico-químicas dos filmes auto-criados são definidas pelo caráter fisiológico intrínseco -
istico das duas espécies e, mais importante, pelos diferentes substratos alimentares. De fato, a presença de PDB
afetou a estrutura secundária das proteínas de G. lucidum, e foi responsável pelo aumento da porcentagem
relativa de lipídios em materiais à base de G. lucidum, de proteínas em P. ostreatus e pela redução da presença
relativa de quitina em ambas as espécies. A quitina é um polímero rígido que é sintetizado na parede celular do
micélio para proteger seus filamentos por pressão osmótica interna, umidade externa e outros desafios
químicos e físicos. Neste trabalho descobrimos que os micélios sintetizam mais quitina quando são
alimentados por puro cellu- perdem. Como a celulose é mais difícil de hidrolisar em relação ao PDB e
mecanicamente mais difícil de penetrar (ver figura suplementar S1 para as propriedades mecânicas dos dois
substratos de alimentação), as fibras de micélio precisam sintetizar o polímero forte de quitina para realizar
esta ação.
Todas estas modificações químicas induzem diferenças nas propriedades mecânicas dos materiais de
micélio autoproduzidos. Quando os substratos de alimentação continham PDB, os materiais fibrosos
autoproduzidos apresentaram valores mais baixos do módulo Young e aumentaram o alongamento na quebra e
a energia de fratura em comparação com os materiais alimentados com celulose. Assim, a presença do PDB
torna os materiais de micélio menos rígidos e mais dúcteis. Por outro lado, todas as amostras apresentaram
altas temperaturas de degradação, indicando que são termicamente estáveis. Além disso, estes materiais
fúngicos eram hidrofóbicos com altos valores de ângulo de contacto com a água e valores de absorção de água
relativamente baixos. Estas propriedades são essenciais para muitas aplicações, tanto de pequena como de
grande escala.
Os materiais fibrosos de micélio estudados neste trabalho podem ser uma alternativa realista aos tiques
plastificados à base de petróleo, apresentando características adicionais a alguns biopolímeros produzidos por
bactérias como a celulose bacteriana e o P(3HB). Como muitos países desenvolvidos estão adotando
progressivamente o uso de materiais sustentáveis como estratégia para reduzir a poluição ambiental, estes
novos materiais à base de micélio aqui propostos apóiam fortemente esta estratégia. Os micélio-materiais
desenvolvidos são compósitos poliméricos naturais (quitina, celulose, proteínas, etc.) que requerem um
mínimo de energia para a produção (auto-cultivo), e suas características podem ser ajustadas através da
modificação de seus substratos nutritivos. Portanto, este trabalho pode abrir caminho para o autocrescimento
controlado de uma variedade de micélio-materiais fúngicos em grandes quantidades com baixos custos.

Métodos
Materiais. Celulose microcristalina (CCM) e ácido trifluoroacético (TFA) 99% foram adquiridos da Sigma-
Aldrich e usados como recebidos. Caldo de batata dextrose (PDB), assim como Ganoderma lucidum e Pleurotus
ostreatus fungal species foram fornecidos pelo Mushroom Spawn Laboratory (Pennsylvania State University)
USA e armazenados no escuro a 4 °C.

Preparação de substratos de alimentação. Foram preparados dois tipos de substratos de alimentação,

baseados no CCM e uma mistura de CCM com o PDB (1:1, w-w). Os materiais iniciais foram resolvidos em
TFA a 0,5 wt.% em frascos de vidro de 60 mL. Para isso, os frascos foram selados com parafilme e colocados em
um agitador de laboratório de bancada por 3 dias, formando soluções viscosas. Em seguida, as soluções obtidas
foram fundidas em placas de Petri e mantidas em um capuz químico até a evaporação completa do solvente
(geralmente 3-4 dias), obtendo-se finalmente filmes independentes. Estes dois tipos de substratos alimentares
são denominados "celulose" e "celulose PDB".

Crescimento de filmes de micélios. Todos os materiais e substratos de alimentação foram autoclavados

(SYSTEC VX-40) a 120 °C durante 15 minutos antes da sua utilização. Depois disto, um pequeno inóculo de
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micélio (G. lucidum ou P. ostreatus) foi fixado nos diferentes substratos de alimentação para a germinação dos
micélios. Um volume de 5 μL de cultura de PDB foi largado no substrato onde o inóculo do micélio foi fixado
para facilitar o início do crescimento. Todos os substratos de inóculo foram incubados a 25-30 °C e 70-80% HR
numa câmara de crescimento de plantas (Memmert) durante 20 dias (a não ser que indicado o contrário no
manuscrito). No final do procedimento de crescimento, o micélio desenvolvido

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Os materiais fibrosos foram colocados num forno durante 2 h a 60 °C para inibir o crescimento posterior. Os
filmes fibrosos de micélio foram suavemente removidos de seus substratos de crescimento antes de qualquer
outro teste.

Caracterização morfológica e mecânica local. Para a caracterização da Microscopia Electrónica de

Varrimento (SEM) foi utilizado um microscópio JEOL JSM 6490LA, utilizando uma tensão de aceleração de 15
kV. Antes da avaliação da MEV, as amostras foram revestidas com ouro. Em seguida, as amostras obtidas
foram montadas em tocos de alumínio, com uma fita adesiva de carbono de dupla cola.
As fibras de micélio simples foram caracterizadas em um ambiente líquido de solução salina tamponada de
fosfato (PBS) por microscopia de força atômica (AFM). Uma cabeça Nanowizard III AFM (JPK Instruments,
Alemanha) montada em um microscópio óptico invertido Axio Observer D1 (Carl Zeiss, Alemanha) foi
empregada. Foram utilizados cantilevers de nitreto de silício DNP em forma de V (Bruker, Massachussets,
EUA) com uma constante nominal de mola de 0,24 N/m, frequência de ressonância no ar variando de 40 kHz a
75 kHz e raio de curvatura típico da ponta de > 20 nm. A constante da mola de cada cantilever foi determinada
in situ usando o método de ruído térmico. As imagens foram adquiridas em modo de imagem quantitativa
(QI). Uma força máxima de 7 nN foi aplicada na amostra e foram adquiridas 256 × 256 curvas de força-
distância (FD) por cada imagem. Em seguida, as curvas FD foram convertidas em força-indentação (FI) e a
rigidez foi extraída da inclinação das curvas através do encaixe hertziano.

Caracterização química. Os espectros de infravermelho das amostras foram obtidos com um acessório de
reflexão total atenuada (ATR) (MIRacle ATR, PIKE Technologies) acoplado ao espectrômetro FTIR da
transformada de Fourier (Equinox 70 FT-IR, Bruker). Todos os espectros foram registrados na faixa de 3800 a
600 cm-1 com resolução de 4 cm-1, acumulando 128 varreduras. Em uma medida típica, a amostra foi
suavemente colocada no local do acessório ATR e pressionada lentamente. Para garantir a reprodutibilidade
dos espectros obtidos, foram medidas três amostras de cada tipo.

Caracterização hidrodinâmica. Um goniômetro do ângulo de contato (CA) (DataPhysics OCAH 200) foi
utilizado para medições estáticas do ângulo de contato com a água à temperatura ambiente. 5 μL gotas de cada
líquido foram depositadas nas superfícies correspondentes e as imagens laterais das gotas foram capturadas após
1 s. As CA foram automaticamente cal- culadas encaixando a forma da gota capturada. Foram realizadas até 15
medições de ângulo de contato em cada amostra em locais aleatórios e seus valores médios e desvio padrão
foram relatados.
Para a captação de água, as amostras secas foram pesadas em uma balança eletrônica sensível e depois foram
colocadas em diferentes câmaras de umidade. As amostras foram secas por condicionamento em um exsicador
por vários dias. Foram definidas as seguintes condições de humidade: 0%, 15%, 45%, 85%, e 100%. Depois de
permanecer em câmaras de humidade durante vários dias, cada película foi pesada e a quantidade de água
adsorvida foi calculada com base no peso seco inicial.

Análise termogravimétrica. A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada utilizando uma TGA Q500
(TA Instruments) para a análise do comportamento de degradação térmica dos filmes fibrosos. As medições
foram realizadas em amostras de 5-8 mg em uma panela de alumínio sob atmosfera de N 2inerte, onde a vazão
foi de 50 mL/min e a faixa de temperatura foi de 30 a 600 °C, com uma taxa de aquecimento de 5 °C/min. A
perda de peso e sua derivada foram registradas simultaneamente, em função do tempo/temperatura. Foram
realizadas três repetições para cada amostra.

Caracterização mecânica. A caracterização mecânica das amostras foi realizada em uma máquina de teste
universal dual col- umn (Instron 3365). Foram cortadas tiras de 4 mm de largura e 25 mm de comprimento a
partir de amostras cultivadas durante 20 dias em forma retangular com espessuras entre 0,1 e 0,3 mm, e
montadas nas braçadeiras da máquina. As amostras foram deformadas a uma taxa de 2 mm/min até falha. O
módulo E de Young, resistência à tração final UTS e alongamento na fratura foram extraídos das curvas de
tensão-deformação. A energia da fratura foi calculada como a área abaixo de cada curva. Foram realizadas seis
medições em cada amostra para confirmar a reproduci- bilidade dos testes de tração, e os resultados foram
relatados como valores médios e desvio padrão. Todos os testes foram realizados à temperatura ambiente, 23
°C.

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Contribuições do Autor
I.S.B., J.A.H.-G. e A.A. conceberam o estudo e conceberam as experiências. J.A.H.-G. e A.A. escreveram o
texto principal do manuscrito. M.H. realizou as caracterizações morfológicas, térmicas, químicas e de
molhabilidade. L.C. e C.C. analisaram as propriedades mecânicas das amostras. Todos os autores escreveram a
seção experimental de sua competência, e revisaram o manuscrito.
Informações adicionais
Informações complementares acompanham este artigo em http://www.nature.com/srep
Interesses financeiros concorrentes: Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.
Como citar este artigo: Haneef, M. et al. Materiais Avançados do Micélio Fungoso: Fabrico e Afinação de
Propriedades Físicas. Rep. Sci. 7, 41292; doi: 10.1038/srep41292 (2017).
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© O(s) Autor(es) 2017

Repórteres Científicos | 7:41292 | DOI: 20

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