UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

PPG - ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

SEMINÁRIO
Nanotecnologia aplicada à
saúde e alimentos

Artigo "Eugenol loaded chitosan nanoemulsion for food

protection and inhibition of Aflatoxin B1 synthesizing
genes based on molecular docking"

Janaína Barreto Alves

Impact factor: 10.723
HIPÓTESE

Investigar se o encapsulamento de eugenol no biopolímero de

quitosana na forma de nanoemulsão pode atuar como
antifúngico, impedindo micotoxinas e espécies reativas de
oxigênio (EROs) durante armazenamento de arroz.
 O armazenamento de grãos pode afetar sua qualidade e
INTRODUÇÃO
segurança alimentar.

A umidade relativa do
ar e temperatura
são os parâmetros fundamentais para o
Arroz desenvolvimento desse fungo.

flavus
Aspergillus

Cilos de
arroz Regiões tropicais e subtropicais
 Fungos podem produzir metabólitos secundários,
INTRODUÇÃO
denominados de micotoxinas, que são prejudiciais à saúde

Após conversões hepáticas, a AFB1 torna-se AFB1-epóxido,

que reage com macromoléculas celulares.

flavus
Aspergillus
Carcinógeno humano
Difurano-cumarínico
Aflatoxina B1 (AFB1)

RNA e DNA
Classe 1
 INTRODUÇÃO
Alternativa ecológica biodegradável ​à base
de plantas para proteger os produtos
alimentares armazenados.
 EUGENOL
Pode sofrer degradação oxidativa

Responsável pelo aroma do cravo-da-índia

Reduz ação compostos bioativos
Como superar esse desafio?
Como superar esse desafio? NANOTECNOLOGIA!
Encapsular os compostos biativos com
matrízes poliméricas.

Quitosana
 QUITOSANA

Reação de desacetilação Quitosana

Quitina
 QUITOSANA
NHCOH3
(Acetamida)

Base forte + Δ

NH2
(Amina)
 QUITOSANA
NHCOH3
(Acetamida) NH2
(Grupo amina)

Base forte + Δ Ácido fraco

NH2
(Grupo amino protonado)
(Amina)
VANTAGENS
Tem recebido grande interesse na comunidade científica como
carreadores encapsulantes

Baixo custo Atóxico Biodegradável

VANTAGENS
Tem recebido grande interesse na comunidade científica como
carreadores encapsulantes

Solubilidade em água η de encapsulação Aprovada

 Todos os produtos químicos, solventes e meios microbianos foram
MATERIAL E MÉTODOS adquiridos do Sisco Research Laboratory (SRL), Mumbai, Índia.

Quitosana Arroz
flavus
Aspergillus
(Oryza sativa L., Kala joha, Maniki madhuri joha e Kon joha)
Mv = 200-350 KDa A. sydowii , A. niger , A. luchuensis , A. candidus , Penicillium italicum ,
Mycelia sterilia, Curvularia lunata , Fusarium poae , F. oxysporum ,
GD > 80% Cladosporium herbarum , Alternaria humicola e A. alternata

Cepa isolada do arroz

As nanoemulsões de eugenol e quitosana foram realizada por duas etapas conforme método
de Hasheminejad, Khodaiyan e Safari (2019)
 Todos os produtos químicos, solventes e meios microbianos foram
MATERIAL E MÉTODOS adquiridos do Sisco Research Laboratory (SRL), Mumbai, Índia.

Como foi obtido?

Quitosana Comprado? extraído?
flavus
Aspergillus
Mv = 200-350 KDa Cepa isolada do arroz
GD > 80%

As nanoemulsões de eugenol e quitosana foram realizada por duas etapas conforme método
de Hasheminejad, Khodaiyan e Safari (2019)
 Síntese das nanoemulsões: "droplet formation and solidification"
MATERIAL E MÉTODOS

Eugenol + Diclorometano (DCM)

T = 45 °C
t=2h

Quitosana 1,5% (p/v) Surfactante

Ácido acético 1% Tween 80
 Síntese das nanoemulsões: "droplet formation and solidification"
MATERIAL E MÉTODOS

Eugenol + Diclorometano (DCM)

T = 45 °C
t=2h

Quitosana 1,5% (p/v) Surfactante

Ácido acético 1% Tween 80

FASE FASE
AQUOSA OLEOSA
Homogeneização de alta velocidade *

FASE
OLEOSA

FASE
AQUOSA
*12.000 rpm por 13 min
Homogeneização de alta velocidade *

EMULSÃO O/A
Retirada de DCM

FASE
OLEOSA

FASE
AQUOSA
*12.000 rpm por 13 min
 Tripolifosfato de sódio
Emulsão (TPP)

Técnica de gelificação ionotrópica

Produz nanopartículas a partir das interações

eletrostáticas entre duas espécies iônicas sob
certas condições.
 Tripolifosfato de sódio
Emulsão (TPP)

Técnica de gelificação ionotrópica

Produz nanopartículas a partir das interações

eletrostáticas entre duas espécies iônicas sob
certas condições.
 Tripolifosfato de sódio
Emulsão (TPP) EUGENOL

Técnica de gelificação ionotrópica

TPP
Produz nanopartículas a partir das interações
eletrostáticas entre duas espécies iônicas sob
certas condições.
 Preparo de amostra

Centrifugação Sonificação
11.000 rpm por 10 min (4 °C) 60 W por 8 min com 1 s de pulsação e 1 s de descanso
 Preparo de amostra

Centrifugação Sonificação
11.000 rpm por 10 min (4 °C) 60 W por 8 min com 1 s de pulsação e 1 s de descanso

Objetivo: remover as partículas não ligadas e Objetivo: separar as partículas aglomeradas.

impurezas orgânicas como DCM.

Nanoemulsão de Eugenol
Procedimento semelhante sem a adição de eugenol foi realizado para a
preparação da nanoemulsão de quitosana.

Nanoemulsão de Quitosana
Nanoemulsão de Quitosana e
Quitosana/Eugenol

Liofilização
T = -52 °C
P=?
 Liofilização

Transforma a água de alimentos (ou amostras

úmidas) do estado sólido para o gasoso, a partir
de baixas temperaturas e pressão negativa.

Liofilização
Sólido | Líquido | Gasoso
T = -52 °C
P=?
 Liofilização

Objetivo: retirar umidade das amostras,

consequentemente aumentando sua vida útil.

Liofilização
Sólido | Líquido | Gasoso
T = -52 °C
P=?
 Caracterização das nanoemulsões.
MATERIAL E MÉTODOS

Tamanho médio de partícula; MEV FTIR DRX

Potencial zeta;
Índice de polidispersão
Dispersão dinâmica de luz

*revestimento de ouro

Zetasizer FE-SEM Quanta 200FEG IR Affinity-1 Bruker Advance

 Caracterização das nanoemulsões.
MATERIAL E MÉTODOS

Eficiência de encapsulamento (EE);

Capacidade de carga (LC);
Rendimento de nanopartículas de eugenol (NY)

Indicadores críticos para avaliar o aprisionamento

eficiente de óleos essenciais ou componentes
bioativos de nanoemulsões em matrizes poliméricas.
 Perfil de liberação in vitro de nanoemulsão de eugenol
MATERIAL E MÉTODOS
carregada com quitosana

Foi investigada em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4).

Etanol
absoluto
300 μL PBS
Espectrofotômetro UV/Vis
281 nm
 Eficácia fungitóxica in vitro e inibição de AFB 1
MATERIAL E MÉTODOS

Nanoemulsão de eugenol e quitosana + eugenol

meio SMKY
(sacarose, 200 g; MgSO 4 7H 2 O, 500 mg; KNO 3 , 300 mg;
extrato de levedura, 7 g em 1 L de água destilada)

Aspergillus flavus
25 μL (10 6esporos/mL)
Condições: incubada a 27 ± 2 °C por 10 dias.
 Eficácia fungitóxica in vitro e inibição de AFB 1
MATERIAL E MÉTODOS

Nanoemulsão de eugenol e quitosana + eugenol

meio SMKY
(sacarose, 200 g; MgSO 4 7H 2 O, 500 mg; KNO 3 , 300 mg;
extrato de levedura, 7 g em 1 L de água destilada)

Também realizou-se para diferentes fungos

contaminantes de alimentos
Aspergillus flavus
25 μL (10 6esporos/mL)
Condições: incubada a 27 ± 2 °C por 10 dias.
 Eficácia fungitóxica in vitro e inibição de AFB 1
MATERIAL E MÉTODOS

Determinação

Aflotoxina B1 (AFB1)

Espectrofotômetro UV/Vis
360 nm
Placa cromatográfica de camada fina
 Modo de ação bioquímico
MATERIAL E MÉTODOS

Extração de ergosterol em n-heptano e água destilada.

leitura: 230−300 nm.
Tian et al. (2012)

Integridade da membrana celular de AFB 1

 Docagem molecular
MATERIAL E MÉTODOS

softwares SWISS-DOCK e PYMOL

Explorar o mecanismo de ação antiaflatoxigênico in silico , a

estrutura tridimensional (3D) do gene de biossíntese de AFB 1
 Modelagem de homologia in silico do gene Ver-1 para
MATERIAL E MÉTODOS
inibição de AFB1

softwares SWISS-DOCK e PYMOL

Interação molecular foi observada entre eugenol e Ver-1

 Atividade antioxidante de eugenol e nanoemulsão de
MATERIAL E MÉTODOS
eugenol: DPPH˙ e ABTS˙
 Eficácia in situ de eugenol e nanoemulsões contra produção de A.
MATERIAL E MÉTODOS flavus , AFB 1 e proteção de nutrientes dietéticos em arroz ( Oryza
sativa L.): O sistema alimentar modelo

Arroz
HPLC

1 ano
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 O potencial zeta é um importante parâmetro que governa a atração e repulsão entre
RESULTADOS E DISCUSSÃO sistemas particulados, influenciando a distribuição e aglomeração, e assim a estabilidade
de nanoemulsões.

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 O valor positivo do potencial zeta foi sugerido como resultante dos grupos amina
RESULTADOS E DISCUSSÃO presentes na quitosana.

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 Uma dispersão estável das partículas pode ser obtida quando os valores do potencial zeta

RESULTADOS E DISCUSSÃO estiverem acima de ±30 mV

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 O índice de polidispersão revela as características de distribuição das partículas presentes

RESULTADOS E DISCUSSÃO no meio suspenso.

Homogeneidade na distribuição das partículas = uniformidade de diâmetro.

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 Partículas monodispersas com distribuição homogênea em nanoemulsão de

RESULTADOS E DISCUSSÃO quitosana/eugenol.

Tabela 1. Análise baseada em DLS do tamanho médio de partícula, potencial zeta e índice de
polidispersão para nanoemulsão de quitosana e nanoemulsão de quitosana carregada com eugenol.
 Partículas redondas com tamanho variável e parede lisa.

RESULTADOS E DISCUSSÃO O tamanho expandido das partículas de quitosana-eugenol pode ser devido à assimilação
de superfície e incorporação de eugenol dentro da nanomatriz de quitosana

Figura 1. MEV das nanopartículas de quitosana (A) e quitosana-eugenol (B).

 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR): fornece evidências

RESULTADOS E DISCUSSÃO da presença de grupos funcionais presentes na estrutura de uma substância, podendo ser
utilizada na identificação de um composto ou para a investigar sua composição química.

Figura 2. FTIR de quitosana, nanopartículas de quitosana, eugenol e quitosana/eugenol.

 A nanopartícula de quitosana apresentou mudanças nas estruturas químicas dos picos que

RESULTADOS E DISCUSSÃO sugerem a ligação adequada do grupo amina da quitosana com TPP.

Figura 2. FTIR de quitosana, nanopartículas de quitosana, eugenol e quitosana/eugenol.

 A Difração de raio X (DRX) é uma técnica que utiliza o fundamento de difração. Quando um

RESULTADOS E DISCUSSÃO raio x incide sob um material sólido (cristal) há um "desvio".

Difração = capacidade das ondas de contornar obstáculos.

Figura 3. Perfil de DRX de quitosana, nanopartícula de quitosana e quitosana/eugenol.

 1. A quitosana exibiu um forte pico de difração cristalográfica;

RESULTADOS E DISCUSSÃO 2. O decréscimo na cristalinidade pode ser devido à natureza dos vários componentes
cristalinos que participaram da dissolução do cristal na superfície do solvente da
matriz.

Figura 3. Perfil de DRX de quitosana, nanopartícula de quitosana e quitosana/eugenol.

 Capacidade de carga (LC) e Eficiência de encapsulamento (EE) confirmam o aprisionamento

RESULTADOS E DISCUSSÃO bem-sucedido do eugenol.

Figura 4. LC (A) e EE (B) das nanoemulsões de quitosana/eugenol.


RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 4. LC (A) e EE (B) das nanoemulsões de quitosana/eugenol.
Capacidade de carga
EE e(LC)
LC enaEficiência
proporçãode encapsulamento
1:1 = saturação(EE)
de confirmam
eugenol o aprisionamento
bem-sucedido do eugenol.
durante a homogeneização.
Volatilidade parcial do eugenol.
 Figura 5. Eficácia fungitóxica e inibitória de AFB 1 do eugenol (A),
RESULTADOS E DISCUSSÃO Nm-eugenol (B) e espectro fungitóxico do eugenol e Nm-eugenol
contra 14 fungos contaminantes de alimentos (C).
 Figura 6. Efeito de eugenol e nanoemulsão na proteção fúngica in
RESULTADOS E DISCUSSÃO situ de AFB 1 (A), preservação de macronutrientes (C, H, N, S) (B),
conteúdo de minerais (C) e conteúdo de MDA (D) em arroz.
 CONCLUSÃO

Nanoemulsões de quitosana com eugenol exibiu eficácia antifúngica e inibidora de AFB1;

As características da nanoemulsão indicaram adequação da quitosana como material eficiente de

encapsulação do eugenol;

As nanoemulsões cumpriram os requisitos para proteção de alimentos e mitigação de contaminação por

micotoxinas.
OBRIGADA

Janaína Barreto Alves

ninajbalves@gmail.com
(51) 98401-1662
 REFERÊNCIAS

DAS, Somenath et al. Eugenol loaded chitosan nanoemulsion for food protection and inhibition of Aflatoxin B1
synthesizing genes based on molecular docking. Carbohydrate Polymers, v. 255, p. 117339, 2021.

HASHEMINEJAD, Nayeresadat; KHODAIYAN, Faramarz; SAFARI, Mohammad. Improving the antifungal activity of
clove essential oil encapsulated by chitosan nanoparticles. Food chemistry, v. 275, p. 113-122, 2019.

HOSSEINI, Seyed Fakhreddin et al. Two-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan
nanoparticles: preparation, characterization and in vitro release study. Carbohydrate polymers, v. 95, n. 1, p. 50-
56, 2013.

KEAWCHAOON, Lalita; YOKSAN, Rangrong. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-
loaded chitosan nanoparticles. Colloids and surfaces B: Biointerfaces, v. 84, n. 1, p. 163-171, 2011.
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
PPG - ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

SEMINÁRIO
Nanotecnologia aplicada à
saúde e alimentos

Artigo ""Eugenol loaded chitosan nanoemulsion for food

protection and inhibition of Aflatoxin B1 synthesizing
genes based on molecular docking"

Janaína Barreto Alves