Biossistemas e Biorreações

Prof. Maria Alice Zarur Coelho

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química
UFRJ
Metabolismo – nosso principal ator
Top-down versus Bottom-up

Petranovic and Nielsen, Trends in Biotechnology (2008)

Primeiro Genoma Bacteriano
Sequenciado
Número de genomas
sequenciados

http://sulab.org/2013/06/sequenced-genomes-per-year/
Bottom-up metabolic systems biology

1. COMPONENTS
Determine the system components (genes, proteins
and metabolites)
2. NETWORKS
Identify the component interactions (enzyme-substrate,
protein-DNA)
3. MODELS
Develop a system model (qualitative or quantitative)
4. PHYSIOLOGY
Model-based design or hypothesis-driven discovery
Usos de outros dados de ômicas em
modelos de escala genômica
 Reações Químicas e Bioquímicas

• Químicas: fase gás frequente. Altas temperaturas e pressões.

• Bioquímicas: fase aquosa duluída. Temperatura ambiente.

• Características:
• Químicas: Estequiometria simples. Cinética por ser baseada em
mecanismos detalhados. Transferência de calor e massa são
importantes.
• Bioquímicas: Estequiometria complexa que muda com as
condições ambientais. Cinética ainda crua. Transferência de calor e
massa são raramente importantes.

A célula é o biorreator e a reção é autocatalítica.

 Estequiometria

• Síntese de Metanol: CH4 + H2O → CO + 3 H2

2 H2 + CO → CH3OH

Fermentação com leveduras:

CH2O + 0.0164 NH3 → 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.077 CH8/3O
+ 0.137 CH1.74O0.60N0.12 + 0.037 H2O
CH2O = ”glicose” (1 C-atom)
CH3O1/2 = etanol (1 C-atom)
CH8/3O = glicerol (1 C-atom)
CH1.74O0.60N0.12 = ”biomassa” (1 C-atom)

A estequiometria muda com T, pH, pO2, cNH3, cCH2O etc.

 Mas mesmo……….
..a estequiometria das biorreações pode ser modelada

A conversão de glicose a biomassa, etanol e glicerol pode

ser expressa como três caminhos metabólicos:

v1 = -1.12 CH2O + 0.12 CO2 + X + 0.15 NADH -1.80 ATP = 0

v2 = - 3/2 CH2O + CH3O1/2 + ½ CO2 + ½ ATP = 0
v3 = - CH2O + CH8/3O – 1/3 NADH – 1/3 ATP = 0

Quando os balanços redox (NADH) e energético (ATP)

fecham, obtém-se a estequiometria experimental.
 Processo de produção de solventes usando
Clostridium acetobutylicum
v2
Glucose CH2O0.5N0.25
CO2
v7 v1 CO2
acn PYR v4
v3 HLac
CO2
v13
AcCoA NADH H2
v5 v6
CO2
v8 HAc
EtOH v9
AcetoAcCoA ac
v10 HBu BuCoA
BuCoA
v11 v12
BuOH HBu

A rede tem 13 fluxos e 4 nós internos: com um balanço de NADH e outro

de ATP, 7 taxas podem ser mensuradas para determinar v1- v13
Rede Estequiométrica com ”caminhos diretos”
 Cinética

• Expressões muito simples podem ser usadas:

Estado Estacionário (ou crescimento balanceado):

qx = Ypx qp = Ysx qs (kg m-3 h-1) = x rx
rx = k cs (Ks + cs)-1 (kg (kg X)-1 h)-1.

Mudanças rápidas no ambiente:

Falta de conhecimento do sistema regulatório da célula inibe qualquer
construção de uma cinética geral (com base mecanicística).
Pedaços da rede de reações podem ser modelados.
 Exceto pela estequiometria ………..

• …….. projeto dos bioprocessos não é muito diferente

daqueles relacionados aos processos químicos
convencionais.
• O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para
estudar as interações entre os diferentes caminhos
metabólicos e quantificar as distribuições de fluxo em torno
do pontos de bifurcação…

• … não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo

metabólico!!!

• O controle do fluxo metabólico é importante para:

• (i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos
face a uma dada condição ambiental não permitindo um
aumento ou uma queda catastrófica nas concentrações
intracelulares destes compostos
• (ii) modificação racional dos fluxos metabólicos
•Mecanismos moleculares que possuem papel
importante no controle do fluxo metabólico (1950’s):
 Inibição por feed-back
 Cooperatividade enzimática
 Modificações enzimáticas por ligação covalente
 Controle da síntese enzimática

Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.:

“… fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do

fluxo glicólitico nos músculos.”

ou

“o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante.”

Não necessariamente correto!!!

 Regulação da Atividade
Enzimática
Controle da Disponibilidade Enzimática:
A quantidade de uma dada enzima na célula depende
da sua taxa de síntese e da sua taxa de degradação

Controle da Atividade Enzimática:

A atividade catalítica de uma enzima pode ser
diretamente regulada por meio de alterações
conformacionais ou estruturais
Aspartato transcarbamoilase
(ATCase)
ligação cooperativa
homotrópica positiva para
ambos os substratos
heterotropicamente inibida
pela cistidina trifosfato (CTP)
heterotropicamente ativado
pela adenosina trifosfato (ATP)

-2 - - - -
H2N – CO – OPO3 + OCO – CH2 – CH – COO ATCase OCO – CH2 – CH – COO
+
NH3 NH

carbamoil fosfato aspartato H2N – CO

-
+ H2PO4
Mudanças conformacionais na
ATCase
 Enzimas Alostéricas e com
Múltiplos Sítios Ativos
A presença do substrato em um dos sítios influencia:
- a ligação do substrato aos demais sítios vazios
- a taxa de formação de produto nos sítios ocupados

O próprio substrato atua como um modificador

ou um efetor

Ativação (incluindo respostas sigmoidais de v verus [S])

ou Inibição
 Sítios não-cooperativos
K K
E + S S ES P E + P
+ +
S S
K K
S S

K K K
E + P P SE + S S SES P SE + P
K
P

ES + P

[S ] [S ] 2
+ 2
v KS KS
= VMAX = 2 K P [E] t
VMAX 2 [S ] [S ] 2
1+ + 2
KS KS

KS - constante de dissociação intrínseca

Constante de dissociação intrínseca
constante de um sítio isolado, ou seja, a
constante cinética de um sítio desconsiderando
sua associação com os demais sítios da mesma
molécula enzimática

descreve o equilíbrio entre o substrato livre, o sítio

ativo livre e o complexo sítio-substrato

Constante de dissociação efetiva

descreve o equilíbrio entre o substrato livre, enzima
disponível e o complexo enzima-substrato
 Ligações cooperativas

Se a ligação de uma molécula de substrato induz a

mudanças estruturais ou eletrônicas que resultam em
alterações nas afinidades dos sítios vazios

a curva de velocidade não seguirá mais o modelo

cinético de Henri-Michaelis-Menten

Enzima Alostérica
(curvas de velocidade sigmoidais)
Aumento das afinidades dos sítios vazios de ligação:

ligação cooperativa ou cooperatividade positiva com

respeito a ligação do substrato, ou resposta homotrópica
positiva

Interações entre substrato e inibidor

ou substrato e ativador:

respostas heterotróficas positivas (ativador) ou

negativas (inibidor)
 Resposta sigmoidal
à variação do substrato

proporciona um maior controle da taxa de reação

pelas variações na concentração de substrato
 Modelos de Interação
Seqüencial
assumem mudanças seqüenciais ou progressivas
nas afinidades dos sítios vazios a serem ocupados

Modelos de Simetria Orquestrada

a enzima pré-existe como uma mistura em equilíbrio

de oligômeros de alta afinidade e oligômeros de baixa
afinidade
Distribuição das espécies
enzimáticas
enzima com 4 sítios
catalíticos idênticos e
sem cooperatividade

enzima com 4 sítios

catalíticos onde a
ligação de cada molécula
de substrato aumenta as
constantes de ligação
dos sítios vazios
isocitrato desidrogenase -
NAD dependente (leveduras)
 Equação de Hill
n = número de sítios de ligação ao substrato por
v [S ] n
= molécula de enzima
VMAX K ' + [S ] n
K’ = KSn (an-1bn-2cn-3...z1) = constante envolvendo os
fatores de interação (a, b, c, ... z) e a constante de
ligação intrínseca

dv n K ' VMAX [S] n−1

=
d[S] (K ' + [S] n ) 2

d2v / d[S]2 = 0 - ponto de inflexão

 Modelo Genérico de Interação
Seqüencial de Koshland-
Nemethy-Filmer
E ES ou SE SES

+S S +S S S

A2 BSA ou ABS B2S2

Modelos tetraédricos:

Modelos lineares:

Modelos quadráticos:
 Modelo de Geometria
Orquestrada
(Monod, Wyman e Changeux)

T representa a
conformação de
baixa afinidade em
equilíbrio
com R a forma da
enzima de alta
afinidade
Modelos Híbridos

primeira coluna -
modelo de simetria
orquestrada

quarta coluna -
modelo de interação
seqüencial