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Simões et ai.Morte celular e doença (2018) 9: 297 DOI

10.1038 / s41419-018-0351-1
Morte celular e doença

ARTIGO Acesso livre

A neurodegeneração induzida por glutamato e

mediada pelo receptor NMDA implica a ativação
do receptor P2Y1
Ana P. Simões1, Carla G. Silva1, Joana M. Marques1, Daniela Pochmann1, Lisiane O. Porciúncula1, Sofia Ferreira1.2,
Jean P. Oses1, Rui O. Beleza1, Joana I. Real1, Átila Kofalvi1.2, Ben A. Bahr3, Juan Lerma4, Rodrigo A. Cunha1,5e
Ricardo J. Rodrigues1.2

Abstrato
Apesar das etiologias e fenótipos característicos, diferentes distúrbios cerebrais dependem de eventos patogênicos comuns. A
neurotoxicidade induzida por glutamato é um evento patogênico compartilhado por diferentes distúrbios cerebrais. Outro evento que ocorre
em diferentes condições patológicas cerebrais é o aumento dos níveis de ATP extracelular, que agora é reconhecido como um sinal perigoso e
prejudicial no cérebro, conforme anunciado pela capacidade dos receptores P2 (P2Rs) de afetar uma ampla gama de distúrbios cerebrais . No
entanto, como o ATP e o P2R contribuem para a neurodegeneração permanece mal definido. Para esse propósito, agora examinamos a
contribuição de ATP extracelular e P2Rs para a neurodegeneração induzida por glutamato. Descobrimos in vitro e in vivo que o ATP/ADP
através da ativação do P2Y1R contribui para a morte neuronal induzida pelo glutamato no hipocampo de ratos. Descobrimos em neurônios do
hipocampo de ratos cultivados que a exposição ao glutamato (100 µM) por 30 minutos desencadeia um aumento sustentado dos níveis de ATP
extracelular, o que contribui para a morte neuronal hipocampal mediada pelo receptor NMDA (NMDAR) através da ativação de P2Y1R.
1234567890 ():,;
1234567890 ():,;

Também determinamos que P2Y1R está envolvido na excitotoxicidade in vivo, pois o bloqueio de P2Y1R atenuou significativamente a morte
neuronal do hipocampo de rato após administração sistêmica de ácido caínico ou após injeção intra-hipocampal de ácido quinolínico. Essa
contribuição do P2Y1R diminui com o aumento da intensidade das condições excitotóxicas, o que indica que o P2Y1R não está contribuindo
diretamente para a neurodegeneração, mas se comportando como um catalisador diminuindo o limiar a partir do qual o glutamato se torna
neurotóxico. Além disso, desvendamos que tal processo de excitotoxicidade começou com uma sinaptotoxicidade precoce que também foi
prevenida/atenuada pelo antagonismo do P2Y1R, tanto in vitro quanto in vivo. Isso deve depender do dano observado no citoesqueleto axonal
mediado por calpaína induzido por glutamato, provavelmente favorecido por um aumento impulsionado por P2Y1R de Ca mediado por
NMDAR2+entrada seletiva nos axônios. Isso pode constituir um mecanismo degenerativo compartilhado por diferentes doenças cerebrais,
particularmente relevante em estágios patogênicos iniciais.

Introdução
Os diferentes distúrbios cerebrais apresentam etiologias e doenças cerebrais crônicas apresentam a excitotoxicidade do
fenótipos característicos e são sublinhados por mecanismos glutamato como um evento patogênico chave no desenvolvimento da
patogênicos distintos. No entanto, tanto aguda como neurodegeneração1-3. O dano neuronal induzido por glutamato envolve
uma concentração anormal de Ca2+fluxo mediado principalmente por
Receptores NMDA (NMDARs)4,5. Este Ca2+A sobrecarga
Correspondência: Ricardo J. Rodrigues (ricardojrodrigues@gmail.com)
1CNC — Centro de Neurociências e Biologia Celular, Universidade de Coimbra, 3004-504 então leva à ativação de calpaínas e outras proteases que
Coimbra Portugal mediam danos no citoesqueleto6, paralelamente à geração
2Instituto de Investigação Interdisciplinar, Universidade de Coimbra, 3030-789
de espécies reativas de oxigênio, disfunção mitocondrial e
Coimbra Portugal
A lista completa de informações do autor está disponível no final do artigo subsequente apoptose neuronal7-10.
Editado por D Bano

© O(s) Autor(es) 2018

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FIGO. 1 ATP extracelular e P2Y1Rs são necessários para a morte neuronal induzida por glutamato. umaNeurônios do hipocampo de ratos foram expostos ao
glutamato (100 µM) por 30 min, o que induziu um aumento significativo na morte celular (PI — incorporação de iodeto de propídio) 24 h depois. A porcentagem média
± SEM de células mortas foi quantificada de 8 a 12 culturas analisando 300 células por cultura. Barra de escala, 200 .m. ***p<0,001 one-way ANOVA com teste de Sidak
para comparações de tempo combinado.bMorte neuronal induzida por glutamato a 30 e 100 µM. *p<0,05 e **p<0,01 ANOVA unidirecional com teste de Dunnet vs.
não tratada.cA exposição ao glutamato induziu um aumento sustentado nos níveis extracelulares de ATP. Os dados são expressos como a mudança de vezes nos
níveis de ATP no meio de cultura (média ± SEM) vs. não tratada; *p<0,05 e **p<0,01, teste t de uma amostra (valor hipotético de 1).d A morte neuronal induzida por
glutamato não foi observada na presença de apirase (5 U/mL) ou PPADS (10 µM; antagonista de P2R);epersistiu na presença de Brilliant Blue G (BBG; 100 nM;
antagonista P2X7R) ou TNP-ATP (10 μM; antagonista do receptor contendo P2X1-3);ffoi prevenida por Reactive Blue 2 (RB2; 10 μM; antagonista de preferência P2YR),
por MRS2179 (10 µM; antagonista de P2Y1R); egpor MRS2500 (0,1 e 1 µM; antagonista de P2Y1R). hNa presença de apirase, ADPβS (5 µM; agonista de P2Y1,12,13Rs)
restaurou a morte neuronal induzida por glutamato, efeito prevenido por MRS2179. Os dados são porcentagem média ± SEM de células mortas quantificadas de 3 a 8
culturas analisando 300 células por cultura. *p<0,05 e ***p<0,001 one-way ANOVA com teste de Sidak para glutamato vs. não tratado

Outro evento que ocorre sistematicamente em diferentes
distúrbios cerebrais é o aumento dos níveis de ATP extracelular,
que agora é reconhecido como um sinal de perigo e nocivo no
cérebro11, como anunciado pela capacidade dos receptores ATP P2
(P2Rs) para afetar diferentes patologias cerebrais12. Em particular,
há evidências crescentes de que o antagonismo do P2X7R
proporciona neuroproteção em uma ampla gama de distúrbios
cerebrais, principalmente através do controle da neuroinflamação
13. A atenção também foi direcionada aos P2Y1Rs, pois seu
antagonismo proporciona neuroproteção, principalmente na
isquemia14,15ou trauma16. O controle de dano cerebral mediado
por P2Y1R tem sido atribuído ao controle de astrócitos16,17. No
entanto, P2Y1Rs também estão localizados em neurônios e
direcionados para sinapses onde podem modular a função
neuronal através do controle da liberação de neurotransmissores
18,19, NMDARs20, ou canais de cálcio e potássio21,22. Esta
neuromodulação impulsionada por P2Y1R parece ser proeminente
em condições patológicas23,24, e mostrou controlar o dano
neuronal na isquemia15. A contribuição do ATP para condições
neuropatológicas pode acarretar ainda outros P2Rs12. Assim, há
agora uma força
evidências para a contribuição de ATP extracelular e P2Rs para
a patogênese de uma ampla gama de distúrbios neurológicos.
No entanto, os mecanismos pelos quais o ATP extracelular e
os P2Rs contribuem para a neurodegeneração permanecem
mal definidos. Agora nos concentramos em um processo
comum a diferentes distúrbios cerebrais, a neurotoxicidade
induzida por glutamato, para examinar a contribuição do ATP
extracelular e dos P2Rs para a neurodegeneração.
Descobrimos in vitro e in vivo que o ATP/ADP extracelular
através da ativação do P2Y1R catalisa a perda sináptica
induzida pelo glutamato e posterior morte neuronal no
hipocampo e o mecanismo de ação subjacente revelado pode
constituir um novo mecanismo comum em doenças cerebrais.
Resultados
A ativação extracelular de ATP e P2Y1R é necessária para a
degeneração induzida por glutamato de neurônios do hipocampo
de ratos
A exposição de neurônios do hipocampo de ratos ao glutamato
(30-100 μM) por 30 min induziu um aumento significativo na morte
neuronal 24 h depois (Fig.1a, b). Glutamato (100 µM)

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FIGO. 2 O bloqueio farmacológico de P2Y1Rs atenua a neurodegeneração induzida por convulsões no hipocampo de ratos. umaA administração intraperitoneal (ip) de
10 mg/kg de cainato (KA) em ratos causou período convulsivo de cerca de 2 h, que induziu a morte neuronal hipocampal 24 h depois, medida por células FluoroJadeC-
positivas (FJC+), tanto nas regiões CA1, CA3 e giro denteado (DG), conforme ilustrado nas imagens representativas (barra de escala, 200 µm) e quantificado no
histograma. Os hipocampos dos animais injetados com solução salina estavam ausentes de FJC+células. O número de FJC+células induzidas por KA foi
significativamente atenuada pela injeção icv prévia de 1 nmol MRS2500 (15 min antes da injeção de KA), em DG e CA1, mostrando também uma tendência de redução
na região CA3 (p =0,0815). Os dados são expressos como o número de FJC+célulasporfatia (média ± SEM) quantificada de 4 animais porgrupo e analisando 12 cortes
coronais separados sucessivamente por 240 representam representando todo o hipocampo de cada animal. *p<ANOVA de 0,05 one-way com teste de Sidaks.bWestern
blot de substratos de calpaína espectrina e CRMP2 em extratos de proteínas do hipocampo preparados 24 h após injeção de solução salina / KA. Os animais injetados
com KA apresentaram um aumento na porcentagem de produtos de degradação da espectrina (SBDPs) com um peso molecular aparente de ~ 145 kDa, e da forma
truncada de CRMP2 (CRMP255kDa). A injeção prévia de MRS2500 atenuou ou preveniu a clivagem mediada por calpaína de espectrina ou CRMP2, respectivamente. Os
dados são média ± SEM da porcentagem relativa de Espectrinacomprimento total/ SBDPs e CRMP2A + B/ CRMP255kDa (n =4). **p<0,01 e ****p<0,0001 one-way ANOVA com
teste de Sidak para KA vs. salina.##p<0,01 e###p<0,001 ANOVA de duas vias

desencadeou um aumento sustentado nos níveis extracelulares de
ATP logo no início, antes da franca degeneração neuronal (Fig.1c).
A remoção do ATP/ADP extracelular pela apirase (5 U/mL) foi
suficiente para anular a morte neuronal induzida pelo glutamato
(Fig.1d). Uma neuroproteção semelhante foi observada na
presença do antagonista de P2R, PPADS (Fig.1d). Nem o
antagonista seletivo de P2X7R, G azul brilhante, nem o antagonista
de P2X1-3-
contendo receptores, TNP-ATP, mimetizou essa
neuroproteção (Fig.1e). Em vez disso, o antagonista de
P2YR preferido, azul reativo 2, e o antagonista seletivo de
P2Y1R MRS2179 anularam a morte neuronal induzida por
glutamato (Fig.1f). Neuroproteção semelhante foi
observada com outro antagonista de P2Y1R, MRS2500,
reforçando que a neuroproteção observada se deve ao
bloqueio de P2Y1R (Fig.1g). Essa neuroproteção por

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FIGO. 3 O glutamato induz a morte celular em neurônios do hipocampo de ratos por meio da ativação de NMDARs de maneira dependente de P2Y1R. umaA exposição
de neurônios do hipocampo cultivados em ratos ao glutamato (100 µM) por 30 min induziu uma diminuição na viabilidade celular 24 h depois, que foi prevenida pelo
antagonista de NMDAR MK801 e imitada pela exposição ao NMDA (100 µM) por 30 min. Os dados são média ± SEM da porcentagem de redução de MTT vs. respectivo
controle, quantificado de 4 a 7 culturas diferentes, analisando triplicatas por condição por cultura. **p<0,01 uma amostratteste (valor hipotético de 100);#p<0,05 teste t
não pareado para glutamato + MK801 vs. glutamato sozinho.bA morte neuronal induzida por NMDA foi prevenida por PPADS (10 µM) ou MRS2179 (10 µM). Os dados
são a média ± SEM da porcentagem de células mortas (incorporação de iodeto de propídio) quantificadas a partir de quatro culturas analisando 300 células por
condição por cultura. ***p<0,001 one-way ANOVA com teste de Sidak para NMDA vs. não tratada.cA administração intra-hipocampal de 120 nmol de ácido quinolínico
(QA) em ratos causou morte neuronal hipocampal 24 h depois, medida como células Fluoro-Jade C-positivas (FJC+), conforme representado nas imagens
representativas (barras de escala, 200 µm) e quantificado no histograma. A coadministração de 1 nmol de MRS2500 atenuou significativamente o número de FJC+
células nas regiões DG e CA3. A média ± número SEM de FJC+por fatia foi quantificada a partir de 4 animais por grupo e analisando 12 cortes coronais separados
sucessivamente por 240 µm e representando todo o hipocampo de cada animal. *p<0,05 ANOVA unidirecional com teste de Sidak

O bloqueio de P2Y1R foi observado em neurônios tanto aos 7 dias
in vitro (DIV7) quanto aos 14 dias in vitro (DIV14). Observamos
ainda que na presença de apirase, a neurotoxicidade do glutamato
é restaurada pela adição de ADPβS (5 µM), um agonista dos
receptores P2Y1, 12, 13, efeito prevenido pelo bloqueio de P2Y1R
com MRS2179 (Fig.1h). Esses resultados mostram que o ATP/ADP
através da ativação do P2Y1R está envolvido na morte neuronal
induzida pelo glutamato.
O bloqueio de P2Y1R atenua a neurodegeneração
hipocampal induzida por convulsões
Para avaliar se o P2Y1R está envolvido na excitotoxicidade in
vivo, usamos a administração sistêmica de ácido caínico (KA), um
modelo de rato amplamente utilizado de epilepsia do lobo
temporal, que é acompanhado por degeneração hipocampal25
e usado como um modelo in vivo de excitotoxicidade26.
Consequentemente, a perda neuronal (coloração positiva para
Fluoro-Jade C (FJC)) tanto nas regiões CA1, CA3 e DG (Fig.2a) esteve
presente 24 h após a injeção intraperitoneal de KA, em animais
que apresentaram pelo menos estágio III na escala de Racine27.
Uma única injeção intracerebroventricular (icv) de MRS2500 (1
nmol) 15 min antes da administração de KA diminuiu
significativamente o número de células FJC-positivas em CA1 e DG,
exibindo também uma tendência decrescente para a região CA3
(Fig.2uma). MRS2500 não modificou o comportamento convulsivo.
Esses dados mostram que o antagonismo de P2Y1R é
neuroprotetor contra excitotoxicidade também in vivo.
Também observamos um aumento da imunorreatividade do produto
de degradação da espectrina de 145 kDa (SBDP) associado à clivagem
mediada por calpaína no hipocampo de ratos injetados com KA (Fig.2
b), conforme relatado anteriormente28e consistente com o estado de
mal epiléptico induzido pela calpaína

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FIGO. 4 A contribuição de P2Y1Rs para a morte neuronal induzida por glutamato diminui com o aumento da gravidade das condições excitotóxicas. uma Imagens
representativas de culturas primárias de hipocampo de rato mostrando imunorreatividade para P2Y1Rs em neurônios (MAP2 - marcador dendrítico; SMI31 - marcador
axonal) e astrócitos (GFAP+). Barras de escala, 20 .m.bAs culturas primárias do hipocampo incubadas com AraC (2 µM) em DIV2-5 para inibir a proliferação de astrócitos
apresentaram um número reduzido de GFAP+células (DIV7), conforme ilustrado nas imagens representativas (barra de escala, 50 µm) e quantificado no histograma
esquerdo. Nas culturas incubadas com AraC, a exposição ao glutamato (100 µM) por 30 min induziu um aumento significativo na morte neuronal (incorporação de PI)
observada 24 h depois, que foi atenuada pela presença de MRS2500 (1 µM). Os dados são porcentagem média ± SEM de células viáveis vs. respectivo controle,
quantificado a partir de quatro culturas diferentes analisando 300 células por cultura por condição.cA exposição de neurônios do hipocampo cultivados em ratos ao
NMDA (100 µM) por 30 min induziu uma diminuição na viabilidade celular 24 h depois avaliada tanto pela redução de MTT (gráfico superior) quanto pela incorporação
de PI (gráfico inferior), o que não foi observado na presença de MRS2500 (1 µM). A diminuição da viabilidade celular observada 24 h após a exposição ao NMDA (100
µM) por 12 h não foi modificada pelo MRS2500. Gráfico superior — os dados são a média ± SEM da porcentagem de redução do MTT vs. respectivo controle,
quantificado de 5 a 8 culturas diferentes, analisando triplicados por condição por cultura. Gráfico inferior - os dados são a média ± SEM da porcentagem de células
mortas (incorporação de PI) vs. respectivo controle quantificado a partir de quatro culturas analisando 300 células por condição por cultura. *p<0,05,
* p*<0,01 e ***p<0,001 teste t de uma amostra (valor hipotético de 100);##p<0,01 não pareadotteste;&p<0,05,&&p<0,01, e&&&p<ANOVA bidirecional de 0,001
com teste de multicomparação de Sidak

morte neuronal mediada29. O aumento da atividade da calpaína foi
ainda confirmado pela clivagem observada da proteína CRMP2 em
CRMP255 kDaproduto, previamente demonstrado ser desencadeado
em condições excitotóxicas in vitro30
(FIG.2b). A administração de MRS2500 atenuou ou preveniu a
clivagem mediada por calpaína de espectrina ou CRMP2,
respectivamente (Fig.2b). Esses achados não apenas
confirmam o envolvimento do P2Y1R na neurodegeneração
mediada por excitotoxicidade in vivo, mas também fornecem
uma ligação entre o P2Y1R e a atividade da calpaína.
P2Y1R é necessário para perda neuronal hipocampal de rato
induzida por glutamato e mediada por NMDAR
A morte neuronal hipocampal induzida por glutamato foi
prevenida pelo antagonista de NMDAR MK801 (Fig.3uma).
Consequentemente, uma diminuição semelhante da viabilidade
neuronal foi observada quando os neurônios do hipocampo de
ratos foram expostos a NMDA (100 μM) em vez de glutamato (Fig.
3uma). Esses resultados confirmam que a morte neuronal
induzida por glutamato é mediada por NMDARs, consistente com
relatórios4,5. A morte neuronal hipocampal induzida por NMDA
foi prevenida pelo antagonismo de P2Y1R (Fig.3b).
Neurodegeneração hipocampal de rato observada após
injeção de KA e atenuada pelo bloqueio de P2Y1R (Fig.2a)
demonstrou ser essencialmente dependente de NMDARs31.
Confirmamos ainda que o antagonismo P2Y1R proporciona
neuroproteção contra a toxicidade induzida por NMDAR
in vivo, pela observação de uma atenuação da morte
neuronal induzida por uma administração intrahipocampal
do agonista de NMDARs ácido quinolínico (QA, 120 nmol),
com a co-injeção de MRS2500 (Fig.3c).
Esses resultados mostram que a neurotoxicidade induzida por
glutamato envolve NMDARs e a morte neuronal induzida por
NMDAR também envolve a ativação de P2Y1R.
A contribuição de P2Y1R para a morte neuronal induzida por glutamato
diminui com o aumento da gravidade dos estímulos excitotóxicos
Os P2Y1Rs são expressos tanto em neurônios do hipocampo de ratos
quanto em astrócitos (por exemplo, Rodrigues et al.18e Bowser e

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FIGO. O bloqueio farmacológico de P2Y1Rs aumenta a densidade de corrente induzida por NMDAR em neurônios do hipocampo de ratos. uma [3H] Curva de ligação
específica de saturação de ácido aspártico a NMDARs em membranas sinaptossômicas do hipocampo de rato com umBmáximode 923,9 ± 110,5 fmol/mg de proteína e
com KDou 199 ± 48 nM (média ± SEM;n =7). A ligação não-NMDAR foi definida na presença de D-AP-5 (30 µM). Nem MRS2179 (10 µM) nem MRS2500 (10 µM) afetaram o
Bmáximoe aKDvalores de [3H] ligação específica do ácido aspártico (gráficos de barras;n =6).bTraços representativos de correntes de entrada induzidas por NMDA em
neurônios do hipocampo de rato na ausência e na presença de MRS2179 (10 µM).cNeurônios do hipocampo de ratos expostos a MRS2179 (10 µM) por 30 min
apresentaram maior densidade de corrente induzida por NMDA em relação às células não tratadas. Os dados são expressos como a média ± SEM do pico de densidade
de corrente induzida por NMDA (pA/pF). *p<0,05 não pareadotteste (n =6–7)

Khakh32). Assim, pudemos detectar imunorreatividade para
P2Y1R em ambos os neurônios e astrócitos cultivados (Fig.4
uma). Portanto, avaliamos a contribuição putativa do P2Y1R
astrocitário para a neurotoxicidade induzida por glutamato.
Apesar de termos observado uma neuroproteção pelo
bloqueio de P2Y1R não apenas em DIV14, mas também em
DIV7, onde a porcentagem de astrócitos é relativamente baixa
(<15%), avaliamos a contribuição de P2Y1R para a morte
neuronal induzida por glutamato agora em culturas expostas
à citosina 1-β-D-arabinofuranosídeo (AraC) para inibir a
proliferação de astrócitos (Fig.4b). Nesses
condições, pudemos observar que o bloqueio de P2Y1R com MRS2500
apenas atenuou a morte neuronal induzida por glutamato. Isso mostra
que os P2Y1Rs neuronais contribuem para a neurotoxicidade induzida
por glutamato. Mas também sugere uma contribuição de P2Y1Rs
astrocíticos. No entanto, a morte neuronal causada pela exposição ao
glutamato foi consideravelmente maior em culturas nas quais a
proliferação de astrócitos foi inibida (~ 45% de morte neuronal; Fig.4b)
em comparação com culturas primárias regulares (20-25%),
provavelmente devido à falta de captação de glutamato pelos
astrócitos. Isso também levanta a possibilidade de que a contribuição
de

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FIGO. 6 (Veja a legenda na próxima página.)

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(ver figura na página anterior)

FIGO. 6 P2Y1Rs regulam diferencialmente os NMDARs de uma maneira subcelular específica. a-cImagens representativas de neurônios do hipocampo de ratos
mostrando a imunorreatividade para P2Y1Rs emumao corpo celular,bdendritos (MAP2 — marcador dendrítico), predominantemente em regiões proximais, axônios
(SMI31 — marcador axonal) ecterminais nervosos (sinaptofisina — marcador sináptico).dTraços representativos de Ca2+-análise de imagem em neurônios do
hipocampo de ratos (carregados com Fluo-4) mostrando [Ca2+]eutransientes representados por aumento de fluorescência (ΔF488) induzida por ADPβS (5 µM) e anulada
por MRS2179 (10 µM), registrada em dendritos (roxo), soma (azul) e em axônio proximal e distal (amarelo-verde e magenta, respectivamente). Barras de escala, 10 .m.
por exemplo Ca2+imagem de neurônios do hipocampo de ratos previamente expostos a condições não tratadas, ADPβS (5 µM), MRS2179 (10 µM), ou ADPβS +
MRS2179 por 30 min, e desafiados com NMDA (100 µM) e KCl (30 mM). Em neurônios previamente expostos ao ADPβS, a perfusão de NMDA por 1 min induziu Ca2+
transientes emeo soma efdendritos e um Ca mais alto2+subir emgaxônios em relação às células não tratadas, conforme representado nos traços médios de
intensidade de fluorescência e quantitativamente resumidos nos histogramas. Esses efeitos induzidos por ADPβS não foram observados na presença de MRS2179, que
por si só induziu uma maior quantidade de Ca induzida por NMDA2+transientes no soma e dendritos, mas não nos axônios. A despolarização química com KCl induziu
Ca2+transientes nos neurônios de cada condição. A média ± SEM de ΔF488foi quantificado a partir de quatro culturas diferentes e analisando um mínimo de oito células
por cultura por condição. *p<0,05 e **p<0,01 vs. não tratada e###p<0,001 entre as barras indicadas, ANOVA unidirecional com teste de Sidak. NS não significativo

P2Y1R pode ser reduzido com condições excitotóxicas
mais intensas. Assim, enquanto a presença de MRS2500
impediu a diminuição da viabilidade celular observada 24
h após a exposição ao NMDA (100 µM) por 30 min, não
modificou a morte neuronal causada pela exposição ao
NMDA (100 µM) por 12 h ( FIGO.4c).
Esses resultados mostram que os P2Y1Rs neuronais contribuem para
a morte neuronal induzida por glutamato e também indicam que essa
contribuição desaparece com condições excitotóxicas mais intensas.
P2Y1R induz um aumento no Ca mediado por NMDAR2+
entrada seletiva nos compartimentos axonais
Nem MRS2500 nem MRS2179 afetaram a ligação do ligante aos
NMDARs (Fig.5a) ou ativação e corrente de NMDARs modificados
(Fig.5b). Isso descartou qualquer eventual ação fora do alvo dos
antagonistas de P2Y1R testados diretamente em NMDARs, o que
poderia estar proporcionando a neuroproteção observada. Assim,
nós hipotetizamos que P2Y1R poderia estar contribuindo para a
neurodegeneração induzida por glutamato, induzindo um
aumento na densidade de NMDARs e, consequentemente,
favorecendo um Ca tóxico mediado por NMDAR2+entrada.
Surpreendentemente, os neurônios do hipocampo de ratos
incubados por 30 min com MRS2179 exibiram uma densidade de
corrente induzida por NMDAR mais alta em comparação com
neurônios não tratados (Fig.5c), o que está em desacordo com a
neuroproteção proporcionada pelo antagonismo de P2Y1Rs contra
a toxicidade de NMDARs.
Como as gravações de patch-clamp de célula inteira fornecem
essencialmente a corrente total da célula, essa análise pode estar
mascarando qualquer eventual aumento de NMDARs impulsionado por
P2Y1R específico de subcelular. Para testar essa hipótese, primeiro
avaliamos a distribuição subcelular de P2Y1Rs em neurônios do
hipocampo de ratos. A imunorreatividade do P2Y1R foi encontrada no
soma (Fig.6a), dendritos e axônios (Fig.6b), como descrito de forma
semelhante em neurônios do hipocampo de camundongos33. A
colocalização de P2Y1R com sinaptofisina também indicou a presença
de P2Y1Rs em alguns contatos sinápticos (~ 20% de sinaptofisina
puncta; Fig.6c). Este subcelular
localização de P2Y1Rs foi funcionalmente confirmada por Ca2
+
imagem. Ca induzido por ADPβS2+eleva-se tanto no soma
quanto nos dendritos, e predominantemente nos axônios distais,
ambos ausentes na presença de MRS2179 (Fig.6d).
Usando Ca2+-análise de imagem, os neurônios pré-incubados
com MRS2179 por 30 min exibiram um Ca induzido por NMDA
mais alto2+transientes tanto no soma quanto nos dendritos (Fig.6e,
f), semelhante ao observado em gravações de patch-clamp (Fig.5
c). Consequentemente, as células pré-incubadas com ADPβS
apresentaram um menor teor de Ca induzido por NMDA2
+
- transientes no soma e dendritos, um efeito prevenido pelo
MRS2179 (Fig.6e, f). Em contraste, as células incubadas com ADPβS
apresentaram Ca induzido por NMDA ~ 2 vezes maior2+transientes
em compartimentos axonais (Fig.6g), um efeito prevenido pelo
MRS2179 (Fig.6g). MRS2179 per se não modificou o Ca induzido
por NMDA2+transientes nos axônios. Ca2+transientes
desencadeados pela despolarização química com KCl (30 mM) não
foram significativamente modificados pela manipulação
farmacológica de P2Y1Rs em nenhum dos compartimentos
celulares (Fig.6e – g) descartar o envolvimento de uma regulação
de canais de cálcio dependentes de voltagem (VGCCs) acionada
por P2Y1R. Portanto, esses resultados mostram que o P2Y1R
modula de maneira bidirecional e subcelular específica o Ca
induzido por NMDA2+
entrada, diminuindo-a no soma e dendritos e
aumentando-a nos axônios.
O bloqueio de P2Y1R previne o dano inicial do citoesqueleto
axonal induzido por glutamato
A degeneração neurítica causada por excitotoxicidade precede a
morte do soma celular e envolve a atividade da calpaína34. A lesão
neuronal mediada por calpaína está associada ao Ca NMDAR
mediado2+sobrecarga4,35. Assim, a identificação de um aumento
impulsionado por P2Y1R em Ca mediado por NMDAR2+A entrada
seletiva nos axônios levou à hipótese de que os P2Y1Rs podem
estar contribuindo para a neurodegeneração, promovendo um
aumento tóxico no Ca axonal mediado por NMDAR2+entrada e
subsequente dano do citoesqueleto axonal mediado por calpaína.
De fato, em neurônios do hipocampo de ratos,

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Simões et ai.Morte celular e doença (2018) 9: 297 Página 9 de 17

FIGO. 7 O glutamato induz uma ativação inicial de calpaína e degeneração do citoesqueleto no axônio de neurônios do hipocampo de ratos de maneira dependente de
P2Y1R. umaImagens representativas de análises imunocitoquímicas de neurônios do hipocampo de ratos (DIV14) mostrando produtos de degradação de espectrina
(SBDPs — magenta), 1 h após a exposição ao glutamato (100 µM; 30 min) em axônios (SMI31; marcador axonal; ciano), mas não em dendritos ( MAP2; marcador
dendrítico; verde), o que não foi observado na presença do antagonista seletivo de P2Y1Rs, MRS2179 (10 µM).bImagem representativa mostrando uma redução
coincidente da imunorreatividade SMI31 (p-neurofilamentos) com a marcação de SBDPs na estrutura axonal definida pela linha tracejada amarela entre os pontos aeb,
conforme representado quantitativamente no gráfico inferior.cNos neurônios expostos ao glutamato, as estruturas axonais imunopositivas para SBDPs apresentam
uma média reduzida na intensidade de fluorescência do SMI31 em comparação aos segmentos axonais negativos para SBDPs. Os dados são expressos como a
mediana com intervalo interquartil da intensidade de fluorescência média de SMI31 quantificada a partir de 36 segmentos com comprimento mínimo de 50 a partir de
estruturas axonais sem ou com imunorreatividade SBDP. Os pontos representam segmentos únicos. ***p<0,001 Mann – teste de Whitney. Dentrob, c,as intensidades
de fluorescência das imagens de 8 bits (escala de 256 cores) foram convertidas diretamente em uma escala de 0–1, sendo a ausência de fluorescência definida como 0
e a intensidade máxima definida como 1. Barras de escala, 20 µm

detectamos imunorreatividade com um anticorpo que se liga
especificamente ao produto resultante da clivagem da espectrina
pela calpaína I36, 1 h após a exposição ao glutamato (Fig.7uma).
Isso está de acordo com a observação anterior de ativação rápida
da calpaína, com pico 30 min após o insulto excitotóxico37.
Surpreendentemente, essa imunorreatividade foi observada
apenas em estruturas imunomarcadas com SMI31, que reage
predominantemente com o neurofilamento H fosforilado presente
nos axônios, mas ausente nas estruturas positivas para MAP2
(dendritos). Além disso, pudemos observar uma diminuição da
imunorreatividade do SMI31 nos segmentos imunopositivos para
SBDPs (Fig.7b, c). Isso mostra uma correspondência entre a
atividade da calpaína e o dano do citoesqueleto axonal,
particularmente mostrando a degradação de
neurofilamentos, que são substratos de calpaína38. A
imunorreatividade induzida por glutamato para SBDPs não foi
observada na presença de MRS2179 (Fig.7uma). Esses dados
mostram que o glutamato induz a ativação da calpaína e
danos no citoesqueleto inicialmente nos axônios de maneira
dependente de P2Y1R.
A ativação do receptor P2Y1 contribui para a perda sináptica
precoce induzida pelo glutamato
A disfunção/perda sináptica é um passo primordial na cascata
de eventos neurodegenerativos em diferentes distúrbios cerebrais
39. Assim, observamos uma redução significativa da densidade
sináptica em neurônios do hipocampo de ratos 12 h após a
exposição ao glutamato medida tanto por

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Simões et ai.Morte celular e doença (2018) 9: 297 Página 10 de 16

FIGO. 8 O glutamato induz a perda sináptica antes da morte neuronal de forma dependente de P2Y1R. umaNeurônios do hipocampo de ratos (DIV14) expostos ao
glutamato (100 µM; 30 min) exibem uma diminuição na densidade da sinaptofisina puncta por comprimento dendrítico após 12 h, um efeito não observado na
presença de MRS2179 (10 µM), conforme ilustrado em as imagens confocais representativas (barra de escala, 10 )m). Os dados são média ± SEM de sinaptofisina
puncta por comprimento dendrítico quantificado a partir de quatro culturas diferentes analisando um mínimo de 2000 µm de MAP2+estruturas de duas lamelas
independentes por condição, por cultura.bTraços representativos de mEPSC registrados em neurônios do hipocampo de ratos (DIV14) 12-14 h após a exposição ao
glutamato (100 ;M; 30 min) na ausência ou na presença de MRS2179 (10 µM).CDHistogramas cumulativos (esquerda) e dados agrupados (direita) da média dec
frequência instantânea oudamplitude de pico de mEPSCs. Os dados agrupados são média ± SEM da frequência/amplitude média de mEPSCs calculada a partir de bins
de 180 s registrados de 11 a 15 neurônios por condição. *p<0,05 e **p<0,01 Kruskal – Wallis com teste de Dunn para frequência e ANOVA de uma via com teste de
Sidak para amplitude.eAnálise de Western blot de marcadores sinápticos gerais, sinaptofisina e sintaxina1A,f marcadores sinápticos glutamatérgicos, vGluT1 e PSD-95
egMarcadores sinápticos GABAérgicos, gefirina e vGAT, em extratos protéicos totais preparados a partir de hipocampos de ratos previamente injetados ip com solução
salina ou cainato (KA, 10 mg/kg). Os extratos de proteínas do hipocampo dos animais injetados com KA apresentaram uma diminuição significativa na
imunorreatividade de todas as proteínas sinápticas avaliadas, exceto para a gefirina.p =0,1205), em comparação com camundongos injetados com solução salina,
conforme representado nos Western blots representativos (à esquerda) e resumidos nos histogramas (à direita). A injeção icv de 1 nmol de MRS2500 15 min antes da
administração de KA preveniu ou atenuou a diminuição da imunorreatividade dos diferentes marcadores sinápticos. O MRS2500 per se não causou nenhuma
modificação significativa na densidade dos marcadores sinápticos. Os dados são a porcentagem (média ± SEM) da razão de marcadores sinápticos de
imunorreatividade/controle de carga em relação à razão média obtida em amostras do grupo aCSF/Sal (n =4). *p<0,05, **p< 0,01 e ***p<ANOVA de 0,001 one-way com
teste post hoc de Sidak para KA vs. respectiva solução salina

análise morfológica (Fig.8a) e por uma redução da frequência
de correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura
(mEPSCs; Fig.8b, c). Esses dados demonstram uma
sinaptotoxicidade induzida pelo glutamato antes da
degeneração neuronal franca, apenas significativa 24 h depois
(Fig.1uma). Esta perda sináptica induzida por glutamato
também envolve P2Y1R, uma vez que foi prevenida pela
presença de MRS2179 (Fig.8a-c). Também observamos uma
diminuição na amplitude de mEPSCs em neurônios expostos
ao glutamato, que também era dependente de P2Y1R (Fig.8d).
Uma diminuição na imunorreatividade dos marcadores sinápticos
também foi observada no hipocampo de ratos 24 h após a injeção de
KA. Uma redução significativa da imunorreatividade dos marcadores
sinápticos gerais sintaxina1A e sinaptofisina
(FIG.8e), os marcadores sinápticos glutamatérgicos vGluT1
e PSD-95 (Fig.8f), e os marcadores sinápticos GABAérgicos
vGAT e gefirina (Fig.8g) foi avaliado. A injeção icv única de
MRS2500 15 min antes da administração de KA
tração prevenido / atenuado esta induzido por convulsão
diminuição da imunorreatividade dos marcadores sinápticos (Fig.8
por exemplo). Esses dados mostram a existência de uma perda
sináptica induzida por excitotoxicidade antes da morte neuronal,
que também envolve a ativação de P2Y1R.
Discussão
No presente estudo, demonstramos tanto in vitro quanto in vivo
que a excitotoxicidade envolve a ativação extracelular de ATP/ADP
e P2Y1R. Descobrimos que o glutamato desencadeia uma

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Simões et ai.Morte celular e doença (2018) 9: 297
aumento sustentado dos níveis de ATP extracelular, o que
contribui para a morte neuronal hipocampal induzida por
glutamato através da ativação de P2Y1R. Esta contribuição de
P2Y1Rs desaparece com o aumento da intensidade das condições
excitotóxicas. Isso indica que o P2Y1R não está contribuindo
diretamente para a neurodegeneração, mas se comportando
como um catalisador de excitotoxicidade, diminuindo o limiar a
partir do qual o glutamato se torna neurotóxico. Além disso,
verificamos que a excitotoxicidade começou com uma
sinaptotoxicidade precoce que também foi prevenida/atenuada
pelo antagonismo do P2Y1R, tanto in vitro quanto in vivo. Isso
deve ser devido a um ganho de função específico subcelular de
NMDARs impulsionado por P2Y1R, favorecendo um aumento nos
níveis tóxicos de Ca mediado por NMDAR2+entrada, levando a
danos no citoesqueleto axonal mediados por calpaína.
Várias evidências suportam o envolvimento de ATP extracelular
e P2Rs na patogênese de uma ampla gama de distúrbios
cerebrais. A excitotoxicidade mediada por glutamato é um evento
patogênico associado a diferentes distúrbios cerebrais agudos e
crônicos2. Assim, os presentes dados reforçam um papel
proeminente da sinalização ATPérgica em condições patológicas
cerebrais. Além disso, embora um grande foco tenha sido
dedicado ao P2X7R, provavelmente atuando no controle da
neuroinflamação13, nossos dados apontam um papel patológico
particular de P2Y1Rs.
Demonstrou-se que os P2Y1Rs estão envolvidos na
neurodegeneração em condições isquêmicas14e trauma16. A
neuroproteção proporcionada pelo bloqueio do P2Y1R nessas
condições patológicas tem sido atribuída ao controle da função
astrocitária14,16,17. Por outro lado, P2Y1Rs são expressos em
neurônios18,32e foi demonstrado que o P2Y1R neuronal também
pode afetar diretamente o dano cerebral15. No presente estudo,
em culturas de baixo astrócitos, ainda pudemos observar a
neuroproteção proporcionada pelo bloqueio de P2Y1R, apoiando o
envolvimento de P2Y1Rs neuronais (Fig.4b). A observação de uma
neuroproteção parcial pelo antagonismo de P2Y1Rs nessas
culturas também poderia indicar uma contribuição adicional de
P2Y1Rs astrocíticos. A capacidade de P2Y1Rs para induzir a
liberação de glutamato de astrócitos40, posteriormente ativando
NMDAR em neurônios41poderia ser um mecanismo através do
qual os P2Y1Rs astrocíticos poderiam estar promovendo a morte
neuronal. No entanto, o ADPβS não é neurotóxico per se. Além
disso, em tal cenário, seria de se esperar que a remoção de
astrócitos tivesse uma ação pró-sobrevivência. Em vez disso,
observamos uma maior morte celular. Isso provavelmente se deve
à falta de captação de glutamato pelos astrócitos, o que poderia
mascarar um efeito pró-sobrevivência decorrente da remoção de
P2Y1Rs astrocíticos neurotóxicos. No entanto, também
observamos que o bloqueio de P2Y1Rs falhou em modificar a
morte neuronal causada por um estímulo excitotóxico mais
prolongado (Fig.4c) mostrando um impacto diminuído de P2Y1Rs
com condições excitotóxicas mais intensas. Assim, embora não
descartando totalmente uma contribuição parcial dos P2Y1Rs
expressos em
Jornal oficial da Cell Death Differentiation Association
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astrócitos, os dados disponíveis favorecem um envolvimento proeminente
dos P2Y1Rs neuronais, indicando também que os P2Y1Rs não são
diretamente neurotóxicos, antes se comportando como promotores das
condições que favorecem uma ação neurotóxica do glutamato.
A contribuição de P2Y1Rs como promotores em vez de
efetores na excitotoxicidade está mais de acordo com a
observação de atenuação do que com a prevenção da
degeneração hipocampal induzida por convulsões ou mediada
por NMDAR pelo bloqueio de P2Y1Rs (Figs.2um e3c). Além
disso, também concorda com os diferentes perfis
neuroprotetores exibidos pelo antagonismo P2Y1R em cada
modelo, atenuando a morte neuronal nas regiões DG e CA3
no modelo QA (Fig.3c), enquanto no modelo KA proporcionou
neuroproteção em DG e CA1, apresentando menor efeito em
CA3 (Fig.2uma). Isso pode não ser devido a uma ação
neuroprotetora específica da região do bloqueio de P2Y1Rs,
pois foi neuroprotetor em CA3 no modelo QA e em CA1 no
modelo KA. Em vez disso, pode ser devido à conhecida
vulnerabilidade seletiva dos neurônios do hipocampo a
diferentes excitotoxinas, relacionadas à distribuição dos
diferentes receptores ionotrópicos de glutamato nas
diferentes regiões do hipocampo42. No modelo QA, a
neurodegeneração mediada por NMDAR é desencadeada pela
ativação direta de NMDARs, enquanto no modelo KA a morte
neuronal mediada por NMDAR é provocada indiretamente
através do aumento da excitabilidade neuronal impulsionada
pelos receptores AMPA e KA31. Por exemplo, a administração
de KA induz dano hipocampal principalmente em CA343, uma
região particularmente enriquecida com KARs44. À medida que
a contribuição dos P2Y1Rs diminui com o aumento do
estímulo excitotóxico, espera-se que a neuroproteção
proporcionada pelo antagonismo do P2Y1R seja reduzida/
ausente nas regiões onde o estímulo excitotóxico é mais
intenso, como observado na região CA3 no modelo KA.
A neurotoxicidade induzida por glutamato está bem associada
ao Ca intracelular2+ascender4, principalmente associado ao Ca2+
influxo através de NMDARs em vez de não-NMDARs ou VGCCs
45. Consistentemente, observamos que a neurotoxicidade
induzida por glutamato foi prevenida pelo bloqueio de
NMDAR e imitada pelo agonismo de NMDAR, que também era
dependente da ativação de P2Y1R (Fig.3). Além disso, a morte
celular tem sido associada principalmente à ativação de
NMDARs extrassinápticos46. No entanto, essa noção de tóxico
NMDARs extrassinápticos vs. sináptica pró-sobrevivência
NMDARs está em debate47e pode depender essencialmente do Ca
2+carga mediada por NMDARs48. Independentemente do
envolvimento de NMDARs extrassinápticos e/ou sinápticos, a
ativação excessiva de NMDARs tem sido indicada para danificar
principalmente estruturas pós-sinápticas. No entanto, nossos
resultados apontam claramente para uma degeneração inicial dos
compartimentos axonais após a exposição ao glutamato antes de
qualquer dano dendrítico detectável, elevando a degeneração
axonal como um evento degenerativo primário na
excitotoxicidade. Tal dano axonal induzido por glutamato
Simões et ai.Morte celular e doença (2018) 9: 297
parece ser desencadeado por um aumento de NMDARs axonais
impulsionado por P2Y1R, uma vez que: (i) P2Y1Rs estão
predominantemente localizados nos axônios (Fig.6b, d); (ii) o dano do
citoesqueleto axonal induzido por glutamato depende da ativação de
P2Y1R (Fig.7uma); (iii) P2Y1Rs aumentam o Ca induzido por NMDA2+
transitórios seletivamente nos axônios (Fig.6por exemplo); (iv) isso
deve ser devido a um aumento impulsionado por P2Y1R em
NMDARs axonais em vez de uma regulação de VGCCs. Esta visão
concorda com evidências anteriores mostrando que os axônios
distais são dotados de NMDARs49e pode ser um alvo direto para a
excitotoxicidade50. Além disso, os resultados obtidos indicam
ainda que esse aumento dos NMDARs axonais deve ocorrer
apenas em condições patológicas como Ca induzido por NMDA
modificado pelo bloqueio de P2Y1R2+transientes em dendritos e
soma, mas não em axônios. Apenas a ativação farmacológica de
P2Y1Rs modificou os NMDARs axonais. Assim, ao contrário de
dendritos e soma, onde há uma regulação tônica constitutiva de
NMDARs por P2Y1Rs, como observado anteriormente em outras
preparações20, o aumento impulsionado por P2Y1R de NMDARs
axonais deve ocorrer apenas em condições patológicas,
provavelmente apoiado por um aumento sustentado dos níveis de
ATP extracelular (Fig.1b). Talvez mais surpreendente seja o fato de
que o Ca NMDAR mediado2+os transitórios nos axônios são muito
menores em comparação aos observados tanto nos dendritos
quanto no soma. Isso sugere que a ação tóxica do NMDAR pode
não ser determinada pela quantidade de Ca2+entrada. Em vez
disso, pode depender essencialmente do equilíbrio entre o Ca2+
carga e a capacidade de tamponamento da célula para preservar
Ca2+
homeostase, e/ou em um acoplamento mais eficiente às
vias degenerativas.
Embora não haja uma evidência clara que demonstre uma
relação causal entre dano axonal e perda sináptica, a degeneração
axonal é um fenômeno compartilhado por doenças
neurodegenerativas agudas e crônicas51-53, que são caracterizadas
por uma disfunção/perda sináptica inicial e degeneração neurítica
antes da morte do soma39,54. Prevenir o dano axonal e a perda
sináptica em vez de proteger os corpos celulares tem sido
proposto como a estratégia terapêutica mais eficaz para prevenir
a neurodegeneração52. Isso é anunciado pela observação em
modelos de doenças do neurônio motor que proteger os corpos
celulares da morte não tem impacto na progressão da doença55,
enquanto a inibição da degeneração do axônio e da perda
sináptica atenuou a apoptose neuronal56. Assim, embora a
degeneração dos processos neuronais seja mecanicamente
independente das vias de morte celular, não envolvendo caspase57
,58, mas sim calpain34,38, como também corroborado pelos
presentes dados, a degeneração inicial do axônio parece não
apenas preceder, mas também constituir um gatilho de morte
neuronal apoptótica. Assim, observamos que o MRS2179 aplicado
12 h após a exposição ao glutamato, quando a perda sináptica é
evidente na ausência de morte neuronal, não preveniu a morte
celular induzida pelo glutamato. Em conjunto, essas evidências
apontam para a prevenção de danos axonais
Jornal oficial da Cell Death Differentiation Association
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como a estratégia terapêutica mais promissora para deter distúrbios
cerebrais53. Nós agora determinamos que a degeneração axonal, pelo
menos em condições excitotóxicas, é favorecida por P2Y1R
promovendo dano ao citoesqueleto axonal mediado por calpaína,
provavelmente refletindo um aumento impulsionado por P2Y1R de Ca
axonal mediado por NMDAR2+entrada. Curiosamente, as calpaínas
também estão associadas à patogênese de diferentes doenças
cerebrais10. Assim, esta nova via pode constituir um mecanismo
degenerativo compartilhado por diferentes doenças cerebrais,
particularmente relevante em estágios patogênicos iniciais.
O uso de antagonistas de NMDAR como estratégias terapêuticas
não pode ser explorado devido aos papéis vitais dos NMDARs59.
Além disso, a falta de ferramentas para manipular seletivamente a
atividade da calpaína a jusante impediu o direcionamento dessas
proteases como estratégia terapêutica10. Nossas descobertas
agora identificam os P2Y1Rs como um novo alvo terapêutico
potencial a montante e levam a considerar o uso de antagonistas
de P2Y1R como uma estratégia promissora para intervenção
terapêutica em doenças neurodegenerativas, pelo menos para
retardar seu início/manifestação.
materiais e métodos
Animais
Ratos Wistar machos (250-300 g; 8-10 semanas) foram
alojados em grupo, mantidos em um ciclo claro/escuro de 12
h, e receberam comida e água ad libitum. Para a preparação
de culturas neuronais primárias, foram utilizados embriões
Wistar machos e fêmeas de rato (E18). Todos os
procedimentos relativos ao manejo e abate de animais foram
aprovados e supervisionados pela Comissão de Cuidados e
Uso de Animais do Centro de Neurociências e Biologia Celular,
Portugal, e daInstituto de Neurociências,CSIC-UMH, Espanha,
de acordo com as diretrizes da Comissão Europeia (2010/63 /
UE), FELASA e ARRIVE.
Culturas primárias de hipocampo de rato
As culturas primárias de células do hipocampo de embriões E18 de
rato Wistar foram preparadas conforme descrito anteriormente60. Nas
culturas baixas de astrócitos, as células foram incubadas com citosina
AraC (Sigma-Aldrich, Sintra, Portugal) a uma concentração de 2 µM em
DIV2-5. Para ensaios de viabilidade celular, imunocitoquímica, Ca2+
imagens e registros eletrofisiológicos, as células foram revestidas em
lamelas de vidro a uma densidade de 12.500 células / cm2. As células
foram utilizadas tanto em DIV7 quanto em DIV14, exceto para
densidade sináptica (análise morfológica e eletrofisiológica) e avaliação
de imunorreatividade SBDP realizada apenas em DIV14, e no ensaio de
viabilidade celular em culturas de baixo astrócitos realizado apenas em
DIV7.
Ensaios de viabilidade celular in vitro
Neurônios do hipocampo de ratos foram expostos a
glutamato (1-100 MM) ou NMDA (100 μM) por 30 min ou 12 h.
As diferentes drogas testadas foram adicionadas 15 min antes
da exposição ao glutamato/NMDA e estiveram presentes até a
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final do experimento. A viabilidade celular foi então avaliada em foram coletados em diferentes pontos de tempo (3-24 h) de
diferentes períodos após a exposição do glutamato até 24 h usando cada poço e misturados com 50 μL da mistura de ensaio de
uma dupla coloração com as sondas fluorescentes iodeto de propídio ATP bioluminescente luciferina-luciferase da Sigma (FLAAM). A
(PI) e SYTO-13 (Molecular Probes, Alfagene, Carcavelos, Portugal). luz emitida foi quantificada usando um luminômetro
Resumidamente, as células foram carregadas por 3 min em tampão (PerkinElmer Victor3, Villepinte, França) e os níveis de ATP
Krebs (em mM: NaCl 132, KCl 4, MgCl2 foram quantificados usando uma curva de calibração de
1,4, CaCl21, glicose 6, HEPES-Na 10, pH 7,4) contendo 4 μM padrões de ATP. A quantificação em cada condição e ponto de
SYTO-13 e 4 μg/mL PI. As células foram então visualizadas tempo foi realizada em triplicata.
e as imagens foram adquiridas usando um microscópio
Zeiss Imager.Z2 de fluorescência invertida e o software Ca de célula única2+imagem
Axiovision SE64 Rel.4.8 (Zeiss, Grupo Taper, Sintra, Neurônios do hipocampo de rato foram carregados com Fluo-4
Portugal). Neurônios viáveis apresentam núcleos AM (2 μM, 30 min a 37 ° C; Molecular Probes, Alphagene) no
homogeneamente marcados com Syto-13 (núcleos verdes seguinte meio (em mM): NaCl 160 mM, KCl 2,5, CaCl2
fluorescentes). Em contraste, neurônios apoptóticos 1,8, glicose 10, HEPES 10, MgCl22 (pH 7,2). As células foram então
putativos mostram núcleos condensados e fragmentados lavadas duas vezes para remover o Fluo-4 AM remanescente e
marcados com Syto-13 (apoptose primária) ou com Syto-13 montadas em uma pequena câmara de perfusão (Warner
mais PI (apoptose secundária), e neurônios necróticos Instruments, EUA) no estágio de um microscópio de fluorescência
apresentam núcleos intactos marcados com PI (núcleos invertido Zeiss Axiovert 200 (Zeiss) equipado com uma câmera
fluorescentes vermelhos, homogêneos e grandes ). Cada CCD resfriada (Roper Scientific, Tucson, AZ, EUA) que permitiu a
experimento em diferentes culturas celulares foi realizado aquisição de imagens de 12 bits a uma taxa de 1 Hz usando o
em triplicata e a contagem de células foi realizada em seis software MetaFluor 5.0 (Zeiss). As drogas foram aplicadas às
campos por lamínula analisando um número mínimo de células no mesmo meio de Krebs, exceto Ca induzido por NMDA2+
300 células por lamínula. transientes em que MgCl2foi omitido. Os dados de curso de tempo
A viabilidade celular foi ainda avaliada por ensaios de Alamar Blue e brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- representam a média da intensidade de fluorescência obtida nas
difeniltetrazólio (MTT). Neurônios do hipocampo de ratos cultivados foram incubados com corante azul Alamar a 10% (v/v) regiões de interesse.
(Invitrogen, Alphagene) ou MTT (0,5 mg/mL). No ensaio Alamar Blue, após 4 h de incubação, alíquotas do meio foram

coletadas de cada poço e a absorbância da forma reduzida (570 nm) ou oxidada (600 nm) foi medida. A alteração relativa na Registros eletrofisiológicos
redução no ensaio Alamar Blue foi considerada equivalente à alteração relativa na viabilidade celular, pois é proporcional ao As correntes induzidas por NMDA foram registradas em
número de células viáveis contendo mitocôndrias competentes. No ensaio MTT, após 2 h de incubação, o produto insolúvel neurônios do hipocampo de ratos a -60 mV por fixação de patch
roxo formazan resultante da redução do MTT por oxidorredutases dependentes de NAD(P)H presentes em células com de célula inteira usando um amplificador AxonPatch 200B
mitocôndrias viáveis foi solubilizado em dimetilsulfóxido por 1 h em temperatura ambiente, sob agitação e protegido da (Molecular Devices) ou amplificador List EPC-7. As micropipetas de
luz. A porcentagem de MTT reduzida foi medida pela diferença entre as absorbâncias em 570 e 600 nm lidas em um vidro borossilicato utilizadas tinham uma resistência de 4–6 MΩ e
espectrofotômetro (Spectramax Plus 384, Molecular Devices, UK). A porcentagem de redução do MTT foi calculada foram preenchidas com a seguinte solução interna (em mM):
comparando a diferença da absorbância em 570 e em 600 nm de cada amostra. Poços de controle contendo apenas meio CsMeSO4130, CsCl 10, CaCl20,5, EGTA 5, HEPES 10 e NaCl 10 (pH 7,3
(sem células) foram usados para subtrair a absorbância de fundo. Os resultados são apresentados como porcentagem de ajustado com CsOH). As células foram perfundidas com solução
controle (poços incubados com veículo). A porcentagem de MTT reduzida foi medida pela diferença entre as absorbâncias extracelular contendo 160 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,8 mM de
em 570 e 600 nm lidas em um espectrofotômetro (Spectramax Plus 384, Molecular Devices, UK). A porcentagem de redução CaCl2, HEPES 10 mM, glicose 15 mM e glicina 10 µM (pH 7,4
do MTT foi calculada comparando a diferença da absorbância em 570 e em 600 nm de cada amostra. Poços de controle ajustado com NaOH). Todos os fármacos foram preparados
contendo apenas meio (sem células) foram usados para subtrair a absorbância de fundo. Os resultados são apresentados diariamente em solução extracelular e perfundidos rapidamente
como porcentagem de controle (poços incubados com veículo). A porcentagem de MTT reduzida foi medida pela diferença com um sistema de controle de válvula de perfusão de seis canais
entre as absorbâncias em 570 e 600 nm lidas em um espectrofotômetro (Spectramax Plus 384, Molecular Devices, UK). A VC-77SP / perfusão fast-step SF-77B (Warner Instruments, EUA). As
porcentagem de redução do MTT foi calculada comparando a diferença da absorbância em 570 e em 600 nm de cada gravações de mEPSCs foram realizadas a -70 mV usando uma
amostra. Poços de controle contendo apenas meio (sem células) foram usados para subtrair a absorbância de fundo. Os solução interna contendo o seguinte (em mM): CsMeSO4125, NaCl
resultados são apresentados como porcentagem de controle (poços incubados com veículo). Poços de controle contendo 8, HEPES 10, EGTA 5, Qx-314 1, Mg-ATP 4 e Na-GTP 0,5 (pH 7,2). A
apenas meio (sem células) foram usados para subtrair a absorbância de fundo. Os resultados são apresentados como solução de banho continha o seguinte (em mM): NaCl 140, KCl 2,5,
porcentagem de controle (poços incubados com veículo). Poços de controle contendo apenas meio (sem células) foram CaCl21,8, MgCl21, HEPES 10 e glicose 15 (pH 7,4) mais 1 μM de
usados para subtrair a absorbância de fundo. Os resultados são apresentados como porcentagem de controle (poços tetrodotoxina e 100 μM de picrotoxina (Tocris, Reino Unido). Todos
incubados com veículo). os experimentos foram realizados em temperatura ambiente
(22-25 ° C). As correntes foram filtradas a 1-10 kHz (filtro
Butterworth de 2 pólos, -12 dB/oitava, ou filtro passa-baixa Bessel)
e digitalizadas a uma taxa de amostragem de 20 kHz para um
Quantificação de ATP extracelular computador pessoal para serem analisadas com o software
Após a exposição de neurônios do hipocampo cultivados ao pClamp (AXON Instruments, EUA).
glutamato (100 µM, 30 min), 50 μL de meio de cultura

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Neurodegeneração induzida por KA in vivo
Ratos Wistar machos (pesando 250-300 g) foram
submetidos à administração intraperitoneal de KA (10 mg/
kg) ou veículo (0,9% NaCl). Quinze minutos antes, os
animais foram administrados com uma única injeção icv
de MRS2500 (1 nmol; Tocris) ou líquido cefalorraquidiano
artificial (em mM: NaCl 124, KCl 3, NaH2PO41,25, NaHCO3
26, MgCl21, CaCl22 e glicose 10) através de uma cânula
guia previamente implantada no ventrículo lateral nas
seguintes coordenadas em relação ao Bregma: −0,8 mm
anteroposterior; -1,5 mm lateral e -3,5 mm dorso-ventral. A
administração foi feita na taxa de 0,5 μL/min. Ao final da
injeção a agulha permaneceu no local por 3 minutos antes
de ser retirada lentamente da cânula, para evitar refluxo.
Esta dose de MRS2500 foi previamente validada em um
modelo in vivo de isquemia cerebral15.
O comportamento convulsivo foi monitorado por um período de
2 horas. As convulsões induzidas por KA (10 mg/kg, Sigma) foram
classificadas em cinco estágios de acordo com a escala de Racine27
: autômatos Ifaciais de palco; estágio II — aceno de cabeça;
estágio III clônus do membro anterior e postura lordótica; estágio
IV — clônus do membro anterior à medida que o animal cria;
estágio V — clônus do membro anterior e criação com queda ou
perda do reflexo de endireitamento. Os estágios III – V são
considerados convulsões motoras ou convulsivas e devem ocorrer
até 2 h após a administração de KA para garantir a
neurodegeneração hipocampal25. Assim, apenas os animais que
atingiram pelo menos o estágio III da escala de Racine foram
submetidos à análise histológica ou bioquímica 24 horas depois.
Para análise de Western blot, os hipocampos foram removidos e
homogeneizados em uma solução de sacarose 0,32 M contendo 1
mM de EDTA, 10 mM de HEPES e 1 mg/mL de albumina de soro
bovino (BSA) (pH 7,4) a 4°C. Os homogeneizados foram
centrifugados a 300 ×gpor 10 min a 4 ° C. O pellet foi descartado e
o sobrenadante foi centrifugado a 100.000 ×gpor 30 minutos a
4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em
solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5% com inibidores de
protease (Roche Diagnostics, Amadora, Portugal).
Neurodegeneração induzida por QA
Ratos Wistar machos (pesando 250-300 g) foram colocados
em uma estrutura estereotáxica (Stoelting) conectada a um
sistema de anestesia (EZ-7000 Classic System da EZ
Anesthesia, Plexx BV) contendo isoflurano (ISOFLO®, Esteve
Veterinaria, Espanha), que manteve os animais anestesiados
apenas durante o procedimento estereotáxico. Cada animal
recebeu uma única injeção intra-hipocampal unilateral
(coordenadas relativas ao Bregma: antero-posterior
- 3,5 mm, lateral -2,5 mm e dorso-ventral -4,0 mm) de 1 µL
na taxa de 0,2 µL/min controlada por um sistema injetor
automático (bomba de seringa, modelo 11 plus, Harvard
Apparatus), seja de aCSF ou ou 120 nmol ou QA. Dentro de
cada grupo, alguns dos animais foram coadministrados
com 1 nmol de MRS2500. A osmolalidade de todos
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das soluções injetadas foi ajustada com NaCl. Os
animais foram monitorados para convulsões por 2 h
após as injeções intra-hipocampais e a avaliação
histológica foi realizada 24 h depois.
Coloração FJC
Para avaliação histológica da neurodegeneração hipocampal por coloração FJC, os
cérebros foram fixados por perfusão transcardial e cortados em cortes coronais de 20 μm
compreendendo todo o hipocampo, usando um criostato (CM3050 S da Leica
Microsystems, Carnaxide, Portugal). As fatias do cérebro foram organizadas em séries de
12 seções separadas sucessivamente por 240 m, sendo cada série representativa de todas
as partes do hipocampo. As seções do cérebro foram descongeladas, secas e imersas por 5
min em NaOH 0,01% preparado em uma solução de etanol a 80%. Após 2 min em etanol
70% e 2 min em água destilada, as fatias foram transferidas para solução de
permanganato de potássio 0,06% durante 10 min, sob agitação constante e protegidas da
luz. Os cortes foram novamente lavados em água destilada por 2 minutos e imersos em
0,0001% FJC (Histo-Chem Inc., EUA) em 0. 1% de ácido acético por 10 min, protegido da luz
e sob agitação. Após três etapas de lavagem de 1 min com água destilada, as fatias foram
secas em um aquecedor de lâminas, desidratadas em gradiente de etanol (50%, 70% e
100%) e clarificadas em xileno. As fatias foram então montadas em meio de montagem
não aquoso DPX (Merck, Algés, Portugal). As imagens foram adquiridas em um
microscópio Zeiss Imager.Z2 usando o Axiovision SE64 Rel. 4.8 softwares. Células FJC-
positivas de séries completas contendo o hipocampo de cada rato (12 seções por série)
foram quantificadas usando o contador de células do software ImageJ 1.48v. As fatias
foram então montadas em meio de montagem não aquoso DPX (Merck, Algés, Portugal).
As imagens foram adquiridas em um microscópio Zeiss Imager.Z2 usando o Axiovision
SE64 Rel. 4.8 softwares. Células FJC-positivas de séries completas contendo o hipocampo
de cada rato (12 seções por série) foram quantificadas usando o contador de células do
software ImageJ 1.48v. As fatias foram então montadas em meio de montagem não
aquoso DPX (Merck, Algés, Portugal). As imagens foram adquiridas em um microscópio
Zeiss Imager.Z2 usando o Axiovision SE64 Rel. 4.8 softwares. Células FJC-positivas de séries
completas contendo o hipocampo de cada rato (12 seções por série) foram quantificadas
usando o contador de células do software ImageJ 1.48v.
Análise imunocitoquímica
Neurônios do hipocampo de ratos foram fixados com
paraformaldeído a 4% em solução de NaCl a 0,9% e solução de
sacarose a 4% por 30 min e permeabilizados com PBS 0,2% Triton
X-100 por 10 min. As células foram então bloqueadas com PBS 3%
BSA por 30 min para evitar a ligação não específica e depois
incubadas com os anticorpos primários em solução de bloqueio
por 1 h à temperatura ambiente. Os neurônios do hipocampo
foram imunomarcados com um anti-P2Y1R policlonal de coelho (1:
200, Abcam, Reino Unido, Cat # ab104616 RRID: AB_10863775),
anti-sinaptofisina monoclonal de camundongo (1: 200, Sigma, Cat
# S5768, RRID: AB_477523), camundongo anti-SMI31 monoclonal
(1: 1000, Covance; LusoPalex, Sintra, Portugal, Cat # SMI-31R-100,
RRID: AB_10122491), galinha policlonal anti-MAP2 (1: 2500, Abcam,
Cat # ab92434, RRID: AB_2138147) e/ou anticorpo policlonal de
coelho dirigido contra SBDPs mediados por calpaína (1: 300; Bahr
et al.36). Em seguida, as células foram incubadas com anti-rato de
burro conjugado com AlexaFluor-488 (1: 400), anti-coelho de cabra
conjugado com AlexaFluor-555 (1: 400) e AlexaFluor-633-
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anti-frango de cabra conjugado (1:400) em solução de bloqueio
por 1 h à temperatura ambiente. As lamínulas foram então
montadas em lâminas de vidro usando meio de montagem
suplementado com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol)
(Vectashield, Vector Laboratories, Baptista Marques, Lisboa,
Portugal), as células foram visualizadas usando um scanner a laser
Zeiss LSM 510 Meta microscópio confocal e imagens processadas
com software ImageJ 1.48v. A análise morfológica quantitativa da
densidade de sinaptofisina puncta por comprimento dendrítico foi
realizada usando o software Neurolucida (MBF Bioscience,
Holanda) analisando um mínimo de 2000 ofm de MAP2+estruturas
de duas lamelas por condição por cultura. As medições de
intensidade de fluorescência de SMI31, SBDPs e MAP2 foram
realizadas usando o software ImageJ. As intensidades de
fluorescência das imagens de 8 bits (escala de 256 cores) foram
convertidas diretamente em uma escala de 0 a 1, sendo a ausência
de fluorescência definida como 0 e a intensidade máxima definida
como 1.
Análise de Western Blot
Extratos de proteína de neurônios hipocampais
cultivados ou homogeneizados hipocampais foram
diluídos em 6 × de tampão de amostra de eletroforese em
gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
(0,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 6,8), 30% glicerol, 10% SDS, 0,6 M
ditiotreitol e 0,012% de azul de bromofenol), fervidos a
95°C por 5 min e depois separados por eletroforese SDS-
PAGE a 10%. Após a eletrotransferência das proteínas, a
proteína CRMP2 foi detectada usando um anticorpo de
coelho direcionado contra CRMP2 (1: 500; Abcam, Cat #
ab36201, RRID: AB_731750) e os diferentes marcadores
sinápticos foram detectados usando anticorpos
monoclonais de camundongo direcionados contra PSD-95
( 1: 20.000; Millipore, Merck, Cat # P246, RRID: AB_260911),
sinaptofisina (1: 2000–1: 20.000; Sigma, Cat # S5768, RRID:
AB_477523) e sintaxina 1 A (1: 2000; Sigma, Cat # S0664,
RRID: AB_477483), anti-vGluT1 policlonal de cobaia (1:
10.000; Synaptic Systems, Goettingen, Alemanha, Cat #
135304 RRID: AB_887878), anti-vGAT (1: 1000; Synaptic
Systems; Cat # 131004, RRID: AB_887873), e anti-gefirina
policlonal de coelho (1: 10.000; Abcam, Cat # ab25784
RRID: AB_1209349), todos diluídos em TBS-T (solução
salina tamponada com Tris, 0,1% Tween 20) contendo 5%
de leite em pó. A espectrina foi detectada usando um
anticorpo de camundongo direcionado contra a cadeia α
de Espectrina (1: 500; Millipore, Cat # MAB1622, RRID:
AB_94295) diluída em TBS-T contendo 5% de BSA. Um
anticorpo de coelho dirigido contra GAPDH (gliceraldeído
3-fosfato desidrogenase) (1: 1000; Abcam, Cat # ab9485
RRID: AB_307275) e anticorpos monoclonais de
camundongo contra α-tubulina (1:20 000; Sigma, Cat #
T6074 RRID: AB_477582) ou β-actina (1: 20.000; Sigma, Cat
# A5316 RRID: AB_476743) foram usados como controles
de carga.
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anticorpos (1: 10.000; Pierce) e subsequentemente com
o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico
(Pierce, Alfagene) ou com o substrato Luminata Forte
Western HRP (Millipore). A imunorreatividade foi
visualizada no aparelho VersaDoc3000 e analisada no
software ImageLab (BioRad, Amadora, Portugal).
[3H] Ensaio de ligação ao ácido aspártico
Sinaptossomas purificados por Percoll preparados como
descrito anteriormente18foram ressuspensos em 15 mL de meio
de ensaio de ligação hiposmolar (Tris/HCl, 50 mM; MgCl20,3 mM;
CaCl2, 1 µM; Depois de2EDTA, 2 mM; coquetel de inibidor de
protease (Sigma), 1/L/mL, pH 7,4) e centrifugado a 20.000gpor 40
min para permitir a separação das membranas sinaptossômicas.
Em seguida, essas membranas sinaptossômicas foram diluídas no
meio de ensaio para atingir a concentração de proteína de 11 mg/
mL, e alíquotas de 100 aL desta suspensão foram misturadas com
100 µL de meio de ensaio com ou sem o antagonista seletivo de
NMDARs D-AP-5 (30 μM , Tocris) para determinar a ligação não-
NMDAR e com ou sem um dos seguintes dois antagonistas
seletivos de P2Y1R, MRS2179 (10 µM) ou MRS2500 (10 µM) (Tocris).
Finalmente, a mistura de 200 proteinL proteína-ligante do receptor
foi combinada com uma terceira alíquota de 100 µL contendo [3H]
ácido aspártico (atividade específica: 11,3 mCi/mM; PerkinElmer).
As concentrações finais testadas (3-300 nM) de [3H] ácido aspártico
foram escolhidos com base em um estudo anterior de ligação de
NMDAR em cérebro de rato61. Cada combinação de drogas
pareada com cada concentração de radioligante foi realizada em
duplicata em 6-7 ratos. Depois de deixar as misturas de 300 µL no
fundo de tubos de ensaio de vidro com volume de 15 mL por 30
min à temperatura ambiente, eles foram rapidamente
enxaguados em 10 mL de meio de ensaio gelado e
instantaneamente filtrados a vácuo em filtros de borosilicato
Whatman GF / B (Sigma ). Os filtros foram então coletados e a
retenção de radioatividade foi contada com um contador Tricarb β
(PerkinElmer).BmáximoeKDforam calculados a partir dos dados de
ligação específicos com a ajuda do GraphPad Prism.
Análise estatística
Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de
umaexperimentos. As diferenças de grupo foram analisadas
usando um método não pareado bicaudaltteste (comparação
de dois grupos independentes) ou análise de variância
unidirecional (ANOVA) (comparação de vários grupos
independentes). Onde a ANOVA revelou efeitos de grupo
gerais significativos, o teste post hoc de Dunnet foi usado para
comparar diferentes grupos com o grupo controle e o teste
post hoc de Sidak foi usado para comparações múltiplas.
Modificações na frequência de mEPSCs foram analisadas pelo
teste de Kruskal – Wallis com o teste post hoc de comparação
múltipla de Dunn. O efeito do MRS2500 na clivagem induzida
por KA de espectrina e CRMP2 foi avaliado por ANOVA de duas
vias. A comparação do impacto do MRS2500 na morte celular
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induzida pela exposição por 30 min e por 12 h ao NMDA (100
µM) foi avaliada por ANOVA de duas vias com teste de
multicomparação de Sidak. Os níveis extracelulares de ATP em
cultura, as densidades de proteínas determinadas na análise
de Western blot e a redução de MTT foram expressas como a
mudança de vezes ou porcentagem relativa vs. condições de
controle. Essas diferenças relativas foram analisadas por uma
amostratteste por comparação com um valor hipotético de 1
ou 100 (condição de controle). As intensidades médias de
fluorescência de SMI31 em segmentos sem vs. com
imunorreatividade SBDP foram analisadas pelo teste de Mann-
Whitney. Em todas as análises realizadas, um nível de
confiança familiar de 95% (p<0,05) foi aplicado. Todo o
processamento e análise dos dados foram realizados no
software Prism 6.0 (GraphPad).
Agradecimentos
O presente trabalho foi financiado por fundos nacionais portugueses através
Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), no âmbito dos projetos EXPL/NEU-
NMC/0671/2012 e PTDC/NEU-NMC/3567/2014 concedidos à RJR; pela Alzheimer
Association sob o projeto NIRG-15-361884 concedido à RJR; e porSanta Casa da
MisericórdiaePrêmio Maratona Saúdeconcedido ao RAC Este trabalho foi também
financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), através do
Programa Operacional Regional Centro 2020 no âmbito do projeto
CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BrainHealth2020, e através do COMPETE 2020 —
Programa Operacional para a Competitividade e Internacionalização e fundos
nacionais portugueses via FCT, no âmbito do projeto POCI-01-0145-FEDER-007440.
APS foi bolsista de pós-doutorado (SFRH/BPD/91683/2012); JMM foi apoiado por
uma bolsa de pós-doutorado (SFRH/BPD/107903/2015). A JL reconhece o apoio
financeiro do Ministério da Economia e Competitividade espanhol, através do
Programa “Severo Ochoa” para Centros de Excelência em I&D (SEV — 2013-0317).
Agradecemos ao Prof. Carlos B. Duarte pela ajuda técnica na avaliação da atividade
da calpaína.
Detalhes do autor
1CNC — Centro de Neurociências e Biologia Celular, Universidade de Coimbra, 3004- 504
Coimbra Portugal.2Instituto de Investigação Interdisciplinar, Universidade de Coimbra,
3030-789 Coimbra Portugal.3Centro de Pesquisa e Treinamento em Biotecnologia,
Universidade da Carolina do Norte-Pembroke, Pembroke, NC 28372, EUA.
4Institutode Neurociências, Centro Misto da Universidade Miguel Hernández de
Elche e Conselho Superior de Investigações Científicas, 03550 San Juan de Alicante
Espanha.5Faculdade de Medicina Universidade de Coimbra 3004-504 Coimbra
Portugal
Conflito de interesses
Os autores declaram não ter conflito de interesse.
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais
em mapas publicados e afiliações institucionais.
Recebido: 16 de outubro de 2017 Revisado: 28 de dezembro de 2017 Aceito: 24 de
janeiro de 2018
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