Bioquímica Experimental

Prof. Me. Kevin Felipe Ramos

CARACTERIZAÇÃO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL:

DESIDROGENASE SUCCÍNICA

CAIQUE MOUREIRA TAVARES

GUSTAVO MANOEL MARTINES

MILENE KATHLEEN CAVALCANTE DA SILVA

PRESIDENTE PRUDENTE
10 / ABRIL – 2023
 2

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
PARTE EXPERIMENTAL
RESULTADOS E DISCUSSÃO 12
CONCLUSÕES 18
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19
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1. INTRODUÇÃO

Há duas principais condições básicas para a manutenção da vida: o

organismo deve ser apto para se auto replicar, e também ser capaz de catalisar
reações químicas. Se não houvesse a presença da catálise as reações químicas
fundamentais para a vida, como a oxidação da sacarose, não ocorreriam em tempo
adequado para a sustentação da vida (NELSON e COX, 2019).
As enzimas são proteínas que atuam como catalisadores biológicos, ou seja,
elas aumentam a velocidade das reações envolvidas nos processos bioquímicos
sem que se altere o equilíbrio (SIQUEIRA, 2020).
O centro de cada processo bioquímico são as enzimas. Elas são
responsáveis por catalisar cada etapa que transformam e/ou conservam energia
química. Os estudos da catálise biológica iniciaram-se por volta do final dos anos
1700 a partir da digestão de carne. Eduard Buchner em 1897 constatou que a
fermentação de açúcar em álcool podia ocorrer por meio de extratos de leveduras
devido às moléculas que ficavam ativas mesmo depois de serem retiradas das
células (NELSON e COX, 2019). Essa descoberta rendeu para Buchner o Prêmio
Nobel de Química em 1907 (SIQUEIRA, 2020). Essas moléculas identificadas por
Buchner foram denominadas por Frederick W. Kühne como enzimas (NELSON e
COX, 2019). Este termo vem do grego énzymos (o prefixo en: dentro; zymos:
leveduras, fermento), que significa “em leveduras’’ (OLIVEIRA, 2017).
A catálise enzimática é um processo chave para a vida celular, permitindo a
realização de reações bioquímicas de forma altamente eficiente e específica. Na
mitocôndria, uma organela presente em praticamente todas as células eucarióticas,
a catálise enzimática é especialmente importante devido ao papel central da
mitocôndria no metabolismo energético celular (CAMPBELL, 2016).
A estrutura da mitocôndria, demonstrado na Figura 1, é caracterizada por
duas membranas lipídicas, uma externa e outra interna, separadas por um espaço
intermembranar. A membrana interna é altamente dobrada em cristais chamados
cristas mitocondriais, aumentando significativamente a área de superfície
disponível para as reações bioquímicas que ocorrem na mitocôndria. As cristas
mitocondriais são caracterizadas por dobras lamelares e tubulares, aumentando a
área superficial da membrana interna em até dez vezes. Essas dobras fornecem
 4

espaço para as enzimas envolvidas na respiração celular, bem como para outras
proteínas associadas à produção de energia mitocondrial. (ALBERTS, 2002).

Figura 1: Estrutura da mitocôndria.

Fonte: Reproduzido de DE SOUZA, 2019

A mitocôndria contém uma grande quantidade de enzimas envolvidas em

reações de oxidação-redução, tais como as envolvidas no ciclo de Krebs e na
cadeia respiratória. Essas enzimas são altamente específicas para seus substratos
e possuem atividade catalítica extremamente elevada, permitindo à célula obter
energia de forma muito eficiente. Essa organela é responsável por produzir a maior
parte da energia utilizada pelas células eucarióticas (NELSON e COX, 2019).
A produção de energia ocorre no interior da mitocôndria, onde ocorrem as
etapas do Ciclo de Krebs, também conhecido como ciclo do ácido cítrico ou ciclo
dos ácidos tricarboxílicos (ALBERTS, 2002).
O Ciclo de Krebs é uma série de reações bioquímicas que convertem os
produtos finais da glicólise em dióxido de carbono (CO 2), água (H2O) e energia na
forma de adenosina trifosfato (ATP). Esse ciclo ocorre no espaço intermembranar e
na matriz mitocondrial e envolve uma série de reações que resultam na produção
de NADH e FADH2, que são utilizados na cadeia respiratória para produzir ATP
(NELSON e COX, 2019). O Ciclo de Krebs está resumido e ilustrado na Figura 2.
 5

Figura 2: Ciclo de Krebs.

Fonte: Reproduzido de BIOCHEM WI 1362, 2021.

Durante o Ciclo de Krebs, moléculas de NADH e FADH 2 são produzidas a

partir da oxidação de ácidos graxos e outras moléculas orgânicas. Essas moléculas
são então utilizadas pela cadeia transportadora de elétrons para produzir
adenosina trifosfato (ATP), a forma de energia utilizada pelas células (RODWELL,
2011). A cadeia de transporte de elétrons, também conhecida como cadeia
respiratória, é uma reação exotérmica que libera calor e é espontânea, possuindo
um ΔG negativo. Por outro lado, a fosforilação oxidativa é uma reação endotérmica
que necessita de fornecimento de energia para acontecer, possuindo um ΔG
positivo. Por essa razão, esses dois processos estão acoplados e ocorrem de
forma sincronizada. Esse acoplamento garante que a energia liberada pela cadeia
respiratória não seja totalmente perdida, mas sim utilizada para uma série de
outros processos, como a homeostase da temperatura corporal, a fosforilação
oxidativa e o transporte de Ca2+ para o interior da mitocôndria (SIQUEIRA, 2020).
A cadeia transportadora de elétrons é composta por uma série de proteínas
que transportam elétrons de um lado para o outro, liberando energia no processo.
Os elétrons são transportados do NADH e FADH2 por uma série de proteínas
transportadoras, incluindo a coenzima Q e o citocromo C, até chegar no oxigênio.
Durante esse processo, prótons (íons H +) são bombardeados para fora da
matriz mitocondrial, criando um gradiente de prótons que é utilizado para produzir
 6

ATP através da enzima ATP sintase (KIMBALL, 2021). O Ciclo de Krebs e a cadeia
transportadora de elétrons estão intimamente relacionados, já que a produção de
NADH e FADH2 no Ciclo de Krebs é o que fornece os elétrons necessários para a
cadeia transportadora de elétrons. Juntos, esses processos são responsáveis por
gerar a maior parte da energia utilizada pelas células eucarióticas (NELSON e
COX, 2019).
A enzima succinato desidrogenase participa da sexta etapa do ciclo de
Krebs, catalisando a formação do fumarato a partir da oxidação do succinato.
Nesta etapa do ciclo, o aceptor de elétrons é o FAD, conforme ilustrado na Figura
3, que está ligado covalentemente à enzima succinato desidrogenase. Na reação
de oxidação do fumarato, o FAD é reduzido a FADH 2, e o FADH2 concede elétrons
para a cadeia transportadora de elétrons, e seguidamente para o oxigênio, gerando
1,5 de ATP, diferentemente do NADH que gera 2,5 de ATP (CAMPBELL, 2016).
Proteína integrante da membrana mitocondrial interna, a enzima é conhecida
como flavoproteína devido a presença de FAD em sua metade flavina. A mesma
possui em sua estrutura átomos de ferro, mas distintivamente do grupo heme,
devido a isso também é chamada de proteína de ferro não-heme ou proteína ferro-
enxofre, por motivo de possuir em sua estrutura grupos formados por quatro
átomos de ferro e enxofre cada (CAMPBELL, 2016).

Figura 3: Oxidação do Succinato em Fumarato pela enzima succinato desidrogenase.

Fonte: Autoria própria.

As reações bioquímicas catalisadas por enzimas, podem ser impedidas

através da ação de inibidores. Os inibidores são os responsáveis por interferirem
no trabalho da enzima, desacelerando a velocidade de uma reação. A inibição
acontece de formas diferentes e depende de como o inibidor se liga ao sítio ativo
da enzima. Existem os inibidores reversíveis que ligam-se às enzimas e que são
 7

liberados em seguida, e assim a enzima volta ao seu estado inicial, e os inibidores

irreversíveis que reagem com a enzima gerando uma proteína que deixa de ser
ativa enzimaticamente fazendo com que a enzima original não seja regenerada
(CAMPBELL, 2016).
Os inibidores reversíveis são classificados em três tipos diferentes: inibição
competitiva, não-competitiva e mista. A inibição competitiva representada na
Figura 4, faz parte da classe de inibidores reversíveis, onde o inibidor liga-se ao
mesmo sítio ativo da enzima em que se ligaria o substrato bloqueando o acesso,
logo o inibidor compete pelo sítio ativo da enzima (CAMPBELL, 2016).

Figura 4: Inibição competitiva

Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2019.

Já a inibição não-competitiva demonstrada na Figura 5, ocorre quando o

inibidor liga-se a um sítio ativo diferente do sítio do substrato, gerando uma
mudança na estrutura da enzima, porém a enzima não age como catalisadora
devido ao inibidor estar ligado a ela (CAMPBELL, 2016).
Figura 5: Inibição não-competitiva

Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2019.

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Outro tipo de inibição que pode ocorrer em uma enzima é a inibição mista
representada na Figura 6, em que o inibidor pode estar ligado tanto no sítio ativo
do substrato quanto em outros sítios da enzima, mas que impede a atividade
enzimática por estar ligada à proteína (NELSON e COX, 2019).

Figura 6: Inibição mista

Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2019.

Já os inibidores irreversíveis agem ligando-se de forma covalente à enzima

ou destroem um grupo funcional importante da mesma que interfere na atividade
enzimática ou associa-se de uma forma não covalente estável a ela (NELSON e
COX, 2019).

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

A prática teve como objetivo caracterizar a presença da enzima

desidrogenase succínica na fração mitocondrial do fígado bovino.

2.2. Objetivos específicos

● Demonstrar a técnica de isolamento de mitocôndrias;

● Reforçar os conhecimentos sobre propriedades das enzimas;
● Demonstrar a inibição enzimática competitiva.
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3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Materiais e métodos

- Sacarose 0,32 mol.L-1 em tampão fosfato 0,02 mol.L-1 pH 7,3 contendo

EDTA 0,01 mol.L-1;
- Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio a 0,56 g% pH 7,3;
- Succinato de sódio 0,5 mol.L-1 pH 7,3;
- Malonato de sódio 0,5 mol.L-1 pH 7,3;
- 50,0 g de fígado fresco de boi;
- Padrão de proteínas 5 mg.mL-1;
- Água destilada;
- Reagente do biureto;
- Tampão fosfato 0,02 mol.L-1 pH 7,3;
- Tubo de ensaio (11);
- Estante para tubos de ensaio (2);
- Béquer de 50,0 mL (2);
- Pipeta volumétrica de 1,0 mL (1);
- Pipeta volumétrica de 2,0 mL (7);
- Pipeta volumétrica de 5,0 mL (2);
- Pêra de sucção (3);
- Banho termostatizado a 95 ºC;
- Pisseta;
- Papel higiênico;
- Proveta de 50,0 mL (1);
- Balança semi-analítica;
- Almofariz;
- Pistilo;
- Gaze;
- Funil de vidro;
- Erlenmeyer de 125,0 mL (1);
- Banho de gelo;
- Tubos plásticos de centrífuga (4);
- Pipeta de Pasteur;
- Centrífuga 2000 rpm;
 10

- Centrífuga 6000 rpm;

- Bastão de vidro;
- Espectrofotômetro.

3.2. Procedimento experimental

3.2.1 Preparo das mitocôndrias

Inicialmente adicionou-se ao poucos, cerca de 50 mL de meio de extração

gelado, à aproximadamente 50 gramas de fígado de boi picado, previamente
preparado pelos técnicos de laboratório. Enquanto a adição ocorria, o fígado era
triturado em um almofariz com auxílio de um pistilo, com a finalidade de extrair a
enzima a ser estudada no experimento.
Em seguida, a mistura foi filtrada em um funil que continha um pedaço de
gaze, a fim de reter partículas maiores do fígado. O processo de filtração foi
realizado 3 vezes, sendo que em cada uma foi trocada a gaze. O filtrado foi
recolhido em um erlenmeyer de 125 mL que foi deixado previamente em banho de
gelo.
A porção líquida foi transferida para tubos plásticos de centrífuga,
previamente gelados, com auxílio de uma pipeta de pasteur.
Os tubos contendo material, foram equilibrados em uma balança para
verificação do peso, que em seguida foram centrifugados durante 10 minutos a
2000 rpm.
Após a centrifugação, os sobrenadantes dos tubos foram transferidos para
um béquer, que foi colocado em um banho de gelo, e desprezou-se o material
sedimentado.
O sobrenadante que estava em banho de gelo, foi dividido em tubos de
centrífuga que em seguida foram equilibrados, e mantidos novamente em banho de
gelo por mais 5 minutos. Depois, os mesmos foram levados à centrífuga a 4000
rpm por 20 minutos.
Após a segunda centrifugação, o material sedimentado foi recolhido e o
sobrenadante desprezado.
O material sedimentado recolhido, foi solubilizado em um volume total de 3
mL com meio de extração gelado, e assim obteve-se uma suspensão de
mitocôndrias que foi utilizada como fonte de enzimas.
 11

Em seguida, pipetou-se 1 mL da suspensão, colocou-se em um tubo de

ensaio que em seguida foi levado a um banho maria fervente, durante cerca de 5
minutos.

3.2.2 Quantificação da proteína na enzima mitocondrial

Para quantificação da proteína na enzima mitocondrial, primeiramente,

enumerou-se 5 tubos de ensaio. Nos tubos 2, 3 e 4 foram adicionados 0,8 mL de
uma solução de padrão de proteínas 5mg/mL com um pipeta volumétrica de 1,0
mL. Em seguida, com um pipeta volumétrica de 2 mL, em todos os tubos
adicionou-se água destilada nas quantidades de respectivamente 1,0 mL, 0,2, 0,2,
0,2 e 0,8 mL.
Depois, apenas no tubo 5 adicionou-se 0,2 mL da suspensão mitocondrial
(sem ferver) com uma pipeta volumétrica de 2 mL. Posteriormente, transferiu-se 5
mL do reagente de biureto aos tubos, com auxílio de uma pipeta volumétrica de 5
mL.
Após, os tubos foram agitados e deixados em repouso por cerca de 10
minutos. Por último, foram levados ao espectrofotômetro para análise, calibrando o
mesmo em 520 nm para as respectivas leituras.

3.2.3 Determinação da atividade de desidrogenase succínica

Para a determinação da atividade da desidrogenase succínica, inicialmente

foram enumerados 6 tubos de ensaio. Onde o primeiro reagente adicionado foi o
tampão fosfato de concentração 0,02 mol/L de pH 7,3 nos 5 tubos, com as
seguintes quantidades respectivamente, 1,4, 1,2, 1,1 1,3 e 0,9 mL, com auxílio de
uma pipeta volumétrica de 2 mL.
Depois, a solução de succinato Na de concentração 0,5 mol/L de pH 7,3 foi
adicionada no tubo 1, 3, 4, 5 e 6 sendo 1 mL em cada tubo, com uma pipeta
volumétrica de 2 mL. Em seguida, com auxílio de uma pipeta de 2 mL, em todos os
tubos foram adicionados 0,25 mL da solução de tetrazólio.
Seguidamente, uma solução de malonato de sódio 0,5 M de pH 7,3, foi
adicionada com auxílio de uma pipeta de 1 mL, nos tubos 5 e 6, sendo 0,2 mL em
cada.
 12

Logo após, a suspensão de mitocôndrias sem ferver foi adicionada com uma
pipeta volumétrica de 2 mL, nos tubos 2, 3, 5 e 6 com um volume de 0,3 mL em
cada. Depois, ao tubo 4 foi adicionado com uma pipeta volumétrica de 2 mL, 0,1
mL da suspensão de mitocôndrias que estava em banho maria fervente.
Os tubos foram agitados suavemente, e levados em seguida a um banho
maria de aproximadamente 37ºC, onde acompanhou-se visualmente a mudança de
coloração em intervalos de, 10, 20 e 30 minutos.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Quantificação da proteína na enzima mitocondrial

Inicialmente, ocorreu-se o preparo das mitocôndrias a partir da adição do

meio de extração gelado ao fígado. Essa adição procedeu-se à baixa temperatura
para que a atividade enzimática não sofresse interferência. Em altas temperaturas,
verifica-se o processo de desnaturação da conformação da estrutura terciária da
macromolécula, resultando na mudança da atividade enzimática (NELSON; COX,
2019).
O meio de extração contendo sacarose, tampão fosfato e EDTA atua como
uma solução extratora estabilizante pois conferem às enzimas condições
favoráveis e ideias de funcionamento, resistentes a variação brusca de pH. Além
disso, a sacarose protege contra a interferência da extração de outras enzimas
presentes na membrana interna da matriz mitocondrial. A extração da enzima
mitocondrial é ilustrada na Figura 7 (PUNSONI, M. et al, 2017).

Figura 7: Extração da enzima mitocondrial do fígado bovino.

 13

Fonte: Autoria própria.

Em seguida, executou-se a separação do material a partir de uma filtração

por gravidade empregando pedaços de gaze, como demonstrado na Figura 8. A
justificativa fundamenta-se na retenção de pedaços maiores de fígado na gaze a
fim de tornar o filtrado homogêneo contendo a enzima desejada (NELSON; COX,
2019).

Figura 8: Filtração por gravidade da mistura.

Fonte: Autoria própria.

Após a centrifugação, verificou-se a formação de um precipitado no fundo

dos tubos plásticos representados na Figura 8. Para essa primeira etapa da
separação das mitocôndrias em 2000 rpm, possuiu-se como corpo de fundo células
íntegras, núcleos, uma pequena porção de mitocôndrias, entre outros. Diante disso,
os componentes com maior valor de massa compuseram o material sedimentado
(NELSON; COX, 2019).
Figura 8: Filtração por gravidade da mistura.
 14

Fonte: Autoria própria.

Em sequência, transferiu-se o sobrenadante para o banho de gelo a fim de

manter as condições ideais da atividade enzimática. Logo após, centrifugou-se em
um aparelho com ajuste de temperatura em torno de 2 ºC em 6000 rpm (NELSON;
COX, 2019).
Subsequente ao término do tempo, observou-se a formação do precipitado
que indicava as mitocôndrias sedimentadas. Posteriormente, solubilizou-se o
material com o meio de extração gelado (NELSON; COX, 2019).
Seguido do preparo das amostras com o reagente de biureto ilustrado na
Figura 9, realizou-se a medida de absorbância no UV-Vis. Os valores
experimentais para cada medida são organizados na Tabela 1.

Figura 9: Amostras analisadas no espectrofotômetro.

Fonte: Autoria própria.

Tabela 1: Dados experimentais para a absorbância.

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Tubo Absorbância / 540 nm

1 0

2 0,146

3 0,145

4 0,142

5 0,143
Fonte: Autoria própria.

Para quantificação da proteína na enzima mitocondrial, realizou-se a média

das medidas de absorbância para as amostras de soluções padrões dos tubos 2, 3
e 4.

x| | 0,146+ 0,145+0,142
¿= =0,144 ¿
3

Seguidamente, considerou o processo de diluição dos tubos contendo o

padrão de proteína a fim de determinar a concentração do padrão na amostra
diluída onde, necessariamente, seguem-se as considerações para lei de Lambert-
Beer (NELSON; COX, 2019).

C i V i=C f V f
C V 5,0 mg . mL−1 .0,8 mL
Cf = i i = =4,0 mg . mL−1
Vf 1,0 mL

A seguir, utilizou a relação entre a concentração e absorbância do padrão de

proteínas em função da concentração e absorbância da amostra desconhecida
(NELSON; COX, 2019).

Ad Cd A d C p 0,143mg . mL−1 .4,0 mL

= ∴ C d= = =3,97 mg . mL−1
Ap Cp Ac 0,144

Para determinar a concentração da amostra desconhecida, analisou a

concentração diluída da solução padrão. Desta forma, o resultado obtido reflete a
concentração diluída da amostra desconhecida. Para encontrar a concentração
real, considera-se a concentração inicial a partir da diluição 1:5 de 0,2 mL de
analito para 0,8 mL de água destilada (NELSON; COX, 2019).
 16

C f V f 3,97 mg. mL−1 .1,0 mL −1

C i= = =19,9 mg. mL
Vi 0,2mL

Ao comparar o dado obtido com o esperado (entre 40 - 50 mg.mL -1), tem-se

como resultado uma concentração de proteína na enzima mitocondrial inferior
(NELSON; COX, 2019).

4.2. Determinação da atividade de desidrogenase succínica

Para essa etapa do experimento a coloração inicial dos tubos é ilustrada na

Figura 10.
Figura 10: Coloração inicial para determinação da atividade de desidrogenase succínica.

Fonte: Autoria própria.

Após o término do tempo de observação, na Figura 11 são demonstradas

as colorações finais das amostras.

Figura 11: Coloração final para determinação da atividade de desidrogenase succínica.

Fonte: Autoria própria.

Da esquerda para a direita verifica-se o tubo branco contendo o tampão, o

substrato succinato de sódio e o aceitador de elétrons artificial tetrazólio. Porém,
sem a presença da desidrogenase succínica, logo, para esse tubo não prossegue-
se a reação pois não verifica-se a catálise enzimática (CAMPBELL, 2016).
 17

Para o segundo tubo tem-se a presença da suspensão de mitocôndrias,

tetrazólio e tampão, exceto o substrato. Por consequência, a reação é incompleta
para esse tubo resultando na coloração alaranjada possivelmente ocasionada por
outros reativos presentes no tecido animal. Logo, não verifica-se a reação do
substrato com a enzima para formação do complexo enzima-substrato (CES) e, por
consequência, o produto fumarato (CAMPBELL, 2016).
Em relação ao terceiro tubo observa-se a passagem do amarelo pálido para
o vermelho, indicando um teste positivo para a transferência de elétrons do
succinato para o tetrazólio que é reduzido para formazan, como demonstrado na
Figura 12, logo, indica-se uma reação completa (CAMPBELL, 2016).

Figura 12: Reação de redução do tetrazólio a formazan.

Fonte: Adaptado de PUNSONI, 2017

Para o quarto tubo a suspensão de mitocôndrias adicionada permaneceu em

banho fervente o que ocasionou na desnaturação da proteína. Por consequência
desse fenômeno, não observa-se a coloração onde manteve-se o amarelo pálido
pois não houve a transferência de elétrons para o tetrazólio (CAMPBELL, 2016).
Por fim, em relação aos dois últimos tubos, verifica-se o processo de inibição
do malonato. Para o tubo 5 o resultado negativo verifica-se a competição com o
substrato onde não procedeu-se a redução do tetrazólio devido à concentração do
succinato. Em contrapartida, para o tubo 6 a coloração alaranjada justifica-se pela
alta concentração de substrato em relação ao inibidor, ocasionando a transferência
de elétrons devido a presença da enzima e reduzindo o tetrazólio para uma solução
levemente avermelhada, gerando um teste positivo (CAMPBELL, 2016).
Um estudo realizado por Bhat et al. (2016) investigou os efeitos dos
compostos fenólicos obtidos de plantas medicinais indianas na atividade da SDH.
Eles descobriram que o ácido gálico e o ácido elágico mostraram inibição
significativa da SDH, com valores de IC50 de 7,89 μM e 16,34 μM,
 18

respectivamente. Outro estudo conduzido por Lee et al. (2013) demonstrou que o
extrato de frutas da planta Schisandra chinensis inibiu a atividade da SDH em
células hepáticas de ratos. Além disso, o estudo de Kikuchi et al. (2014) mostrou
que o ácido ascórbico pode inibir a SDH em células de câncer de mama. O ácido
ascórbico é um antioxidante natural presente em muitos alimentos, como frutas
cítricas, e tem sido estudado por seus potenciais efeitos anticancerígenos.

5. CONCLUSÕES

A prática permitiu conhecer uma das técnicas de isolamento de

mitocôndrias, a partir da filtração e centrifugação por gradiente de densidade, em
que as partículas da solução se depositam ao fundo do tubo devido a força
centrífuga. Os procedimentos adotados para manter a condição de idealidade da
atividade enzimática, como manter as vidrarias e o meio de extração em baixa
temperatura, contribuíram tanto para quantificação da proteína quanto para análise
da atividade enzimática da succinato desidrogenase.
O resultado de 19,9 mg/mL da concentração obtida experimentalmente,
indica possíveis erros técnicos, já que a concentração esperada fica na faixa entre
40 - 50 mg/mL. Para minimização dos erros experimentais, a maceração do fígado
pode acontecer por um tempo maior, para que seja extraído uma quantidade
eficiente de mitocôndrias e consequentemente de succinato desidrogenase, para
aumentar a concentração em mg/mL e obter melhores resultados.
Para a determinação da atividade da succinato desidrogenase, o emprego
do 2,3,5 trifenil-tetrazólio como aceptor artificial de elétrons, mostrou-se satisfatório
para a técnica executada, pois confirmou que a enzima catalisou a conversão do
succinato a fumarato através da mudança de coloração de amarelo para vermelho,
visto que o aceptor de elétrons é reduzido a formazan quando ocorre a
transferência de elétrons do succinato para o tetrazólio.
Também analisou-se a atuação do inibidor competitivo, nos tubos 5 e 6
contendo malonato. Os dois tubos apresentaram uma coloração parecida, sendo
que a diferença foi uma leve intensidade devido à concentração do substrato
succinato Na. No tubo 5 o volume foi de 0,1 mL de substrato, e a coloração
permaneceu a mesma indicando ação do inibidor. Já no tubo 6 o volume foi de 1,0
 19

mL de substrato e coloração ficou levemente alaranjada, indicando uma atividade

enzimática mínima, devido a presença do inibidor na solução.
Sendo assim é possível concluir que, as técnica empregadas para o
isolamento de mitocôndrias, utilizando fígado de boi macerado, filtrado e
centrifugado, aplicando-se os cuidados em realizar o experimento a baixas
temperaturas, resultou em um bom reagente para quantificação de proteínas, na
presença do reagente de biureto e espectrofotômetro para análise, assim como
também beneficiou na determinação da atividade da succinato desidrogenase, da
mesma forma a utilização do aceptor artificial de elétrons aplicado na última etapa,
atuou para verificação da atividade enzimática.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; et al. Molecular Biology of the Cell. 4. ed.
Garland Science, 2002.

CAMPBELL, M. K.; FARRELL, S. O. Bioquímica - Tradução da 8ª edição norte-

americana. Cengage Learning Brasil, 2016. E-book. ISBN 9788522125005.

HUANG, S.; MILLAR, A. H. Succinate dehydrogenase: the complex roles of a

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KIMBALL, J. W. Biochemistry Online: An Approach Based on Chemical Logic.

Academic Press, 2021.

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Grupo A,

2019. E-book. ISBN 9788582715345.

OLIVEIRA, J. B.s de. Lipases imobilizadas em resíduos têxteis com partículas

magnéticas e aplicação em biocatálise. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso.
Universidade Tecnológica Federal do Paraná.

PUNSONI, M. et al. Succinate dehydrogenase B (SDHB) immunohistochemistry for

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morphology: AIMM, v. 25, n. 9, p. 645, 2017.

RODWELL, V. W. Bioquímica ilustrada de Harper. Porto Alegre, RS: Grupo A, 2021.

SIQUEIRA, L. De O. (org.). Bioquímica aplicada: Volume 1. Passo Fundo, RS:

UPF Editora, 2020. 193 p. v. 1.

DE SOUZA, K. ‌Por qué las mitocondrias son más que simples fábricas de
energía | NPC, 2019. Naturopathiccurrents.com. Disponível em:
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