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ARTIGO ORIGINAL

Fibroblasto Senescente Derivado de GDF15 Induz

Pigmentação da pele
Yeongeun Kim1,2,5 , Bogyeong Kang1,2 , Jin Cheol Kim1 , Tae Jun Park2,3,4,5 e Hee Young Kang1,2
Os fibroblastos senescentes desempenham um papel na pigmentação do envelhecimento. Neste estudo, descobrimos que os níveis
de expressão de GDF15 são aumentados em fibroblastos senescentes irradiados com UV e pele hiperpigmentada fotoenvelhecida.
Para investigar os efeitos do GDF15 na melanogênese, melanócitos humanos normais foram cocultivados com fibroblastos
infectados com o lentivírus GDF15 ou RNA curto em gancho de cabelo GDF15. Verificou-se que GDF15 estimula a melanogênese
em me lanócitos através da regulação positiva de MITF/tirosinase via sinalização de b-catenina. A ação estimuladora do GDF15
durante a pigmentação foi ainda confirmada em pele cultivada ex vivo e em uma amostra de pele humana reconstituída. Esses
resultados sugerem que o GDF15 derivado de fibroblastos senescentes estimula a pigmentação da pele e pode desempenhar um
papel na pigmentação associada ao envelhecimento.
Jornal de Dermatologia Investigativa (2020) -, -e-; doi:10.1016/j.jid.2020.04.016

INTRODUÇÃO O na pigmentação da pele e na biologia dos melanócitos não foram

GDF15, também conhecido como NAG-1, é uma citocina responsiva ao
estresse que também é classificada como pertencente à família GDNF
(Baek e Eling, 2019). A expressão de GDF15 e os níveis séricos
aumentam em resposta a muitos estímulos que iniciam o estresse
celular e como parte de uma ampla variedade de processos de doenças, entre melanócitos e fibroblastos senescentes durante o processo de
incluindo aqueles associados ao câncer e à obesidade. Estudos
implicaram o GDF15 no envelhecimento e em distúrbios relacionados à
idade e demonstraram a possibilidade de GDF15 como um biomarcador
para envelhecimento e comorbidade relacionada à idade (Fujita et al., 2016).envelhecida, como aqueles associados a lentigo senil ou melasma,
Camundongos transgênicos superexpressando GDF15 humano em
vários tecidos, como pele e tecido adiposo, apresentam expectativa de
vida prolongada (Baek et al., 2006; Wang et al., 2014). Recentemente,
descobriu-se que a deficiência de GDF15 promoveu obesidade induzida
por dieta rica em gordura em camundongos transgênicos;
consequentemente, foi sugerido como um importante candidato
terapêutico para distúrbios metabólicos relacionados à idade (Tran et al., 2018).
O envolvimento de GDF15 na biologia da pele foi sugerido
anteriormente (U¨ nal et al., 2015). GDF15 é superexprimido em células
de melanoma e está associado à invasão tumoral e metástase (Boyle
et al., 2009). Os níveis de expressão de GDF15 são aumentados nos
melanócitos em resposta à irradiação UVB ou a um tratamento com
histamina (Lee et al., 2012; Yang et al., 2006). Fibroblastos dérmicos
também expressam GDF15, que pode ser induzido por ROS ou luz
visível (Akiyama et al., 2009).
Embora tenha sido sugerido um papel do GDF15 derivado de fibroblastos
na esclerose sistêmica (Bruzzese et al., 2014), seus papéis
1 Instâncias de coloração citoplasmática e perinuclear de GDF15 foram
Departamento de Dermatologia, Escola de Medicina da Universidade Ajou, Suwon,
Coréia; 2 Departamento de Ciências Biomédicas, The Graduate School, Ajou
3
Universidade, Suwon, Coréia; Departamento de Bioquímica e Molecular
4 Crônica
Biologia, Escola de Medicina da Universidade Ajou, Suwon, Coréia; e
Centro de Pesquisa de Doenças Inflamatórias, Ajou University School of
Medicina, Suwon, Coreia
5
Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.
Correspondência: Hee Young Kang, Departamento de Dermatologia, Ajou University
School of Medicine, Suwon, Coréia. E-mail: hykang@ajou.ac.kr Abreviaturas: FBS, soro
bovino fetal; shGDF15, GDF15 RNA em grampo curto Recebido em 28 de junho de 2019;
revisado em 14 de abril de 2020; aceito em 29 de abril de 2020; manuscrito aceito
publicado online XXX; prova corrigida publicada online
XXX
extensivamente estudados.
Há evidências crescentes de um papel crucial dos fibroblastos
senescentes e do fenótipo secretor associado à senescência na
melanogênese (Kovacs et al., 2010; Salducci et al., 2014). O crosstalk
envelhecimento desempenha um papel importante na estimulação da
melanogênese e na subsequente pigmentação relacionada ao
envelhecimento (Yoon et al., 2018). Tipos de pele com pigmentação
mostram números aumentados de fibroblastos senescentes, e acredita-
se que a mudança de fenótipo nesses fibroblastos contribua para a
pigmentação envelhecida (Kim et al., 2019; Yoon et al., 2018) . Nosso
interesse no GDF15 está relacionado à sua regulação positiva em
fibroblastos senescentes induzidos por UV in vitro. Em nossos dados
de sequenciamento de RNA, o nível de expressão de GDF15 em
fibroblastos senescentes induzidos por UVA aumentou 5,47 vezes em
comparação com fibroblastos jovens (número de acesso Gene
Expression Omnibus GSE109778). Portanto, investigamos o papel do
GDF15 na regulação da pigmentação da pele de acordo com o crosstalk
epidérmico-dérmico entre fibroblastos senescentes e melanócitos.
RESULTADOS A expressão de GDF15 é aumentada em fibroblastos
senescentes e pele hiperpigmentada
fotoenvelhecida A expressão endógena de GDF15 em células de pele
cultivadas foi examinada. O mRNA e a proteína GDF15 foram expressos
em fibroblastos, bem como em melanócitos e queratinócitos (Figura 1a).
observadas (Figura 1b). Células duplamente positivas para vimentina
(verde) e GDF15 (vermelho) foram observadas em pele normal in vivo,
confirmando a expressão de GDF15 principalmente em fibroblastos
(Figura 1c). Para identificar a regulação positiva de GDF15 em
fibroblastos senescentes, a senescência celular foi induzida com
irradiação UVA (5 J/cm2 ). A indução da senescência celular foi
confirmada, demonstrando maior coloração de b-galactosidase
associada à senescência (mais de 70%) nas grandes células achatadas
(Figura 1d). Também analisamos vários marcadores de senescência,
incluindo p16INK4A, p53 e focos de heterocromatina, com esses
resultados mostrando claramente a senescência de fibroblastos

ª 2020 Os Autores. Publicado pela Elsevier, Inc. em nome da Society for Investigative Dermatology. www.jidonline.org 1
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Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação
(Figura 1d). O GDF15 mRNA e os níveis de expressão da proteína
foram gradualmente aumentados com a irradiação UV de uma
maneira dependente do tempo (Figura Suplementar S1). Os
fibroblastos senescentes expressaram muito mais GDF15 do que
as células normais com irradiação simulada, de acordo com
investigações de PCR em tempo real (20 vezes) e ELISA (2,5
vezes) (Figura 1d). Além disso, os níveis de expressão de GDF15
estavam aumentados na pele envelhecida e no melasma, um
distúrbio pigmentar comum associado ao fotoenvelhecimento
(Figura 1e, jovem vs. idoso: área manchada/área da epiderme,
0,015 0,013 vs. 0,06 0,05, P ¼ 0,03; área manchada /área da
derme, 0,0013 0,001 vs. 0,021 0,02, P ¼ 0,02; Figura 1f, normal
vs. melasma: área manchada/área da epiderme, 0,026 0,04 vs.
0,055 0,04, P ¼ 0,07; área manchada/área da derme, 0,002 0,001
vs. 0,008 0,003, P ¼ 0,01). As células fusiformes GDF15-positivas
na derme também foram contadas, sugerindo aumento de
fibroblastos que expressam GDF15 na pele envelhecida e em
lesões de melasma (porcentagem de células fusiformes GDF15-
positivas do total de células fusiformes). Esses achados sugerem
que a regulação positiva de GDF15 está significativamente
associada à senescência de fibroblastos e que esse GDF15
derivado de fibroblastos senescente pode desempenhar um papel no desenvolvimento
O GDF15 derivado de fibroblastos induz a pigmentação
da pele O papel biológico do GDF15 no controle da pigmentação
da pele foi subsequentemente investigado. Para investigar o efeito knockdown de GDF15 reduziu significativamente a fosforilação de
parácrino do GDF15 na pigmentação, fibroblastos jovens ou
senescentes foram infectados com um lentivírus que expressa
GDF15 ou um lentivírus de RNA curto de GDF15 (shGDF15) e
cocultivados com melanócitos primários isolados usando placas
Transwell (Figura 2a ) . Na presença de fibroblastos com
superexpressão de GDF15, o conteúdo de melanina e os níveis de
atividade da tirosinase foram significativamente aumentados nos
melanócitos (Figura 2b). Além disso, os níveis de expressão de
mRNA e proteína de proteínas associadas à melanogênese, MITF
e tirosinase foram significativamente regulados positivamente
(Figura 2d, Figura suplementar S2). Consistentemente, a regulação
negativa de GDF15 em fibroblastos jovens ou senescentes usando
um lentivírus shGDF15 foi associada à diminuição da melanogênese
(Figura 2c e e, Figuras complementares S2 e S3).
A superexpressão ou knockdown de GDF15 não afetou a
proliferação de fibroblastos (Figura complementar S4). Um papel
estimulador de GDF15 na pigmentação foi ainda validado com pele
humana ex vivo. Na presença de fibroblastos com superexpressão
de GDF15, o aumento da pigmentação basal da pele foi
demonstrado pela coloração de Fontana-Masson. Uma análise de
imagem mostrou um aumento na relação área pigmentada/área
epidérmica (Figura 3a, painel superior). A expressão de tirosinase
e MART-1 também aumentou em fibroblastos com superexpressão
de GDF15 da pele ex vivo (Figura complementar S5). Além disso,
observou-se diminuição da pigmentação e expressão de tirosinase
e MART-1 na presença de fibroblastos senescentes GDF15-
knockdown (Figura 3a, painel inferior, Figura suplementar S5). Para
uma explicação mais clara da contribuição do GDF15 para a
pigmentação da pele humana, tratamos um modelo de pele humana
reconstituída contendo melanócitos (MelanoDerm) com diferentes
concentrações de GDF15 humano recombinante (5e100 ng/ml) e
medimos o conteúdo de melanina. Em resposta a um tratamento
contínuo com GDF15 humano recombinante por 14 dias, o
2 Jornal de Dermatologia Investigativa (2020), Volume -
grau de pigmentação foi aumentado e o conteúdo total de melanina
foi significativamente aumentado nos poços tratados com GDF15
em comparação com controles não tratados de uma maneira
dependente da dose (Figura 3b). Esses resultados sugerem que o
GDF15 pode contribuir para a melanogênese em um ambiente in
vivo. Tomados em conjunto, os resultados indicam que o GDF15
derivado de fibroblastos senescentes tem um efeito estimulador na
pigmentação da pele.
GDF15 estimula a melanogênese através da sinalização
da b-
catenina Foi sugerido que a b-catenina desempenha um papel
fundamental na regulação fisiológica da pigmentação cutânea
(Bellei et al., 2011) e em vários distúrbios pigmentares induzidos
por UV (Kim et al., 2016). Embora o receptor específico para GDF15
ainda não tenha sido identificado no tecido periférico, várias vias
de sinalização, incluindo proteína quinase B/b catenina e quinase
regulada por sinal extracelular 1/2, demonstraram ser reguladas
por GDF15 secretado (Kim et al., 2008 ; Li et al., 2018; Xu et al.,
2017). Para elucidar o mecanismo molecular pelo qual o GDF15
estimula a melanogênese, examinamos os efeitos do GDF15 ao
longo da via de da
sinalização da b-catenina.
pigmentação A regulação positiva de
envelhecida.
GDF15 foi associada a níveis aumentados de fosforilação de b-
catenina, resultando em um aumento no nível total de b-catenina e
da fosforilação de GSK3bS9 (Figura 4a). Consistentemente, o
GSK3bS9 e b-catenina (Figura 4b). Além disso, o aumento da
translocação nuclear de b-catenina foi claramente observado em
melanócitos estimulados com GDF15 derivado de fibroblasto
(Figura 4c). Consistentemente, a regulação negativa de GDF15 em
fibroblastos senescentes usando um lentivírus shGDF15 foi
associada à diminuição da translocação nuclear de b-catenina em
melanócitos (Figura 4d). Esses dados sugerem fortemente que o
GDF15 estimula a melanogênese por meio da sinalização da b-
catenina.
DISCUSSÃO
A pele humana, ao contrário de outros órgãos, sofre
fotoenvelhecimento, um processo de envelhecimento natural
sobreposto que leva à pigmentação envelhecida. Após a exposição
aos raios UV, as células da pele vizinhas aos melanócitos secretam
vários fatores parácrinos que regulam a melanogênese (Kim et al.,
2018a; Lee et al., 2017; Yamaguchi et al., 2007). A melanogênese
também é afetada pelo microambiente da pele, e foi demonstrado
que a senescência celular contribui para a pigmentação da pele.
Fibroblastos senescentes se acumulam na pele envelhecida
(Campisi, 1998) e surgem durante doenças pigmentares associadas
ao fotoenvelhecimento, como melasma ou lentigo senil (Kim et al.,
2019; Yoon et al., 2018). Uma das características das células
senescentes é o aumento da expressão e produção do fenótipo
secretor associado à senescência, incluindo vários fatores
relacionados, como citocinas pró-inflamatórias e fatores de
crescimento. Um papel central do fenótipo secretor associado à
senescência de fibroblastos senescentes na determinação do
fenótipo de pigmentação da pele envelhecida foi recentemente
destacado (Kovacs et al., 2010; Salducci et al., 2014; Wang et al.,
2017). Por exemplo, foi demonstrado que o fator de células-tronco,
sFRP2 ou SDF1 derivado de fibroblastos fotoenvelhecidos
influencia o controle da pigmentação (Kim et al., 2018b, 2016;
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Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação

a b c
GDF15 DAPI mesclar GDF15 vimentina DAPI/ mesclar
MC
MC KC FB

GDF15

actina
KC

* : p<0,05 vs. MC
1,5
*
1
facebook

Expressão
GDF15
mRNA
de
(Indução
dobrada
MC)
vs.

0,5 *
(N=3)
0
MC KC FB

d Coloração SA-ÿ-Gal
focos de heterocromatina
Normal Farsa, falso UVA 15
p<0,01 80

10 60
positivas
células

heterocromatina
de
%
40
Expressão
p16INK4A
induction
mRNA
Sham)
(Fold
vs.
de
5
20
(N=4)
0 0
Falso UVA Falso UVA

ELISA
25 p<0,01
400
p<0,05
20
300
UVA Simulado Normal
15
células
1x105
ml)/
(pg/

200
concentração
GDF15
de
p53
Expressão
(indução
dobrada
normal)
GDF15
mRNA
vs.
de
10

100 actina
5
(N=3) (N=3)
0 0
Normal Falso UVA UVA Simulado Normal

e
Jovem Velho

Epiderme Derme

p=0,03 p=0,02 p<0,01

0,2 0,1 60
50
0,15
/dérmica
á rea
40
/epidérmica
á rea

manchada
GDF15
área
0,1 manchada
GDF15
área
0,05 30
20
0,05 fusiformes
fusiformes
GDF15+/
células
células
total
de
de
%

10
(N=8) (N=8) (N=8)
0 0 0
jovem velho jovem velho jovem velho

f Normal Melasma

Epiderme Derme

p=0,07 p=0,01 p<0,01

0,15 0,02 60

50

0,1 /dérmica
á rea
40
/epidérmica
á rea

manchada
GDF15
área
manchada
GDF15
área
0,01 30

0,05 20
fusiformes
fusiformes
GDF15+/
células
células
total
de
de
%

10
(N=7) (N=7) (N=7)
0 0 0
Melasma normal Melasma normal Melasma normal

Figura 1. A expressão de GDF15 é aumentada em fibroblastos senescentes e pele hiperpigmentada fotoenvelhecida. Os níveis de expressão de GDF15 nas células da pele foram
analisados por PCR em tempo real, (a) western blotting e (b) coloração imunocitoquímica. Barra ¼ 10 mm. (c) Análise imuno-histoquímica de GDF15 em pele humana normal.
Barra ¼ 100 mm. (d) Níveis de expressão de GDF15 em fibroblastos normais ou senescentes. Fibroblastos normais foram irradiados com UVA (5 J/cm2 ) e cultivados por 7 dias.
A senescência celular foi analisada de acordo com a coloração SA-b-Gal, expressão de p16INK4A mRNA, expressão da proteína p53 e formação de focos de heterocromatina,
respectivamente. Barra ¼ 5 mm. Os níveis de expressão de proteína e mRNA de GDF15 foram analisados em fibroblastos senescentes normais, simulados e induzidos por UVA por
PCR em tempo real e ELISA, respectivamente. (e, f) Expressão de GDF15 em pele hiperpigmentada fotoenvelhecida. Análise imuno-histoquímica de (e) 8 casos de jovens e idosos e (f) 7

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GDF15 induz a pigmentação

a b
p<0,01
2.5
conteúdo de melanina

co-cultura Com GDF15 2

1,5
Controle, GDF15, tirosinase
Atividade
(indução
dobra
Con)
vs.
de
da

Fibroblastos UVA/shCon, UVA/ 1

shGDF15
(N=3)
melanócitos primários 0,5
1,0 1.44
(N=3)
0
Com GDF15

c
conteúdo de melanina

2 * : p<0,01 (vs. Young shCon) :

Jovem UVA p<0,01 (vs. UVA shCon) #

GDF15 GDF15 1,5

# #
shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2
tirosinase
Atividade
(indução
dobra
Con)
vs.
de
da

1
* *
0,5

(N=4) (N=4)
1,0 0,76 0,78 1,78 1.23 1.21 0
shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2

GDF15 GDF15

Jovem UVA

d e Jovem UVA

Com GDF15 GDF15 GDF15

GDF15 shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2

1,0 20,0 GDF15

MITF 1,0 0,2 0,3 4.5 1.3 1.2

1,0 1.9 MITF

Tirosinase 1,0 0,5 0,5 2.6 1,5 1.4

1,0 2.6 Tirosinase

actina 1,0 0,6 0,7 2.8 2.0 1,5

actina

Figura 2. GDF15 induz melanogênese em melanócitos. (a) Esquema do modelo de cocultura. (b) Os melanócitos foram cocultivados com fibroblastos jovens infectados com um
lentivírus GDF15 e o conteúdo de melanina e a atividade da tirosinase e (d) os níveis de expressão da proteína MITF e tirosinase foram analisados. (c) Os melanócitos foram
cocultivados com fibroblastos jovens ou senescentes (UVA) infectados com um lentivírus shGDF15. O conteúdo de melanina e a atividade da tirosinase e (e) os níveis de expressão
da proteína MITF e tirosinase foram analisados. Con, controle; sh1, RNA 1 em gancho de cabelo curto; sh2, RNA 2 em gancho de cabelo curto; shCon, controle de RNA em
grampo curto; shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto.

Yoon et al., 2018) e o desenvolvimento de doenças pigmentares
associadas ao fotoenvelhecimento (Kim et al., 2019).
Este estudo identificou GDF15 como um importante fenótipo
secretor associado à senescência produzido por fibroblastos
senescentes para contribuir para o desenvolvimento da
pigmentação do envelhecimento. Mostramos que a irradiação
ultravioleta aguda induz GDF15, que aumentou gradualmente ao
longo do tempo, e que GDF15 foi supersecretado por fibroblastos
senescentes em comparação com fibroblastos normais, com
aumento de quase 20 vezes. Estudos anteriores também
mostraram que o GDF15 é superexpresso em células endoteliais senescentes ou células
fibroblastos no cólon, apoiando uma relação entre a senescência
celular e a superexpressão de GDF15 (Guo et al., 2019; Ha et al.,
2019). Além disso, neste estudo, foi demonstrado que os níveis
de expressão de GDF15 estavam aumentados na pele envelhecida
e melasma, sugerindo um papel na fisiopatologia das doenças
hiperpigmentárias. Usando diferentes modelos de células e pele,
mostramos efeitos claros do GDF15 na pigmentação da pele. Um
efeito potencial de aumento da pigmentação foi observado em
melanócitos de fibroblastos cocultivados e explantes de pele ex
vivo. Além disso, o tratamento de equivalentes de pele
tridimensionais senescentes
de espessura total com GDF15 recombinante

=
casos de melasma e pele normal perilesional. Barra ¼ 100 mm. A área manchada por epiderme ou área da derme foi calculada e é apresentada como um gráfico de pontos (painel
do meio). A porcentagem de células fusiformes positivas para GDF15 é apresentada como um gráfico de pontos (painel direito). FB, fibroblasto; KC, queratinócito; MC,
melanócito; SA-b-Gal, b-galactosidase associada à senescência .

4 Jornal de Dermatologia Investigativa (2020), Volume -

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GDF15 induz a pigmentação

Figura 3. GDF15 induz

a *:p<0,05 vs. Con
Com GDF15 pigmentação in ex vivo e em pele humana
0,15 * reconstituída. (a) A pele da biópsia foi incubada
PA/
EA
com fibroblastos jovens infectados com
0,1
um controle ou o lentivírus GDF15 (painel

superior) ou fibroblastos senescentes infectados

0,05
com shCon ou um lentivírus shGDF15
(N=4) (painel inferior) por 3 dias. A pigmentação
0
Com GDF15 da pele humana ex vivo foi visualizada pela
coloração de Fontana-Masson. A relação PA/
UVA
0,15 EA foi medida por análise de imagem. Barra
* :p<0,05 vs. Con
shCon shGDF15-1 shGDF15-2 ¼ 100 mm. (b)
PA/
EA

0,1
* * MelanoDerm foi mantido com

0,05 rhGDF15 (0, 5, 20 ou 100 ng/ml) por 2 semanas.

A pigmentação macroscópica foi
(N=4) visualizada. Os resultados de um
0
shCon sh1 sh2 a análise do densitômetro e os níveis totais
GDF15 de conteúdo de melanina são apresentados
UVA como gráficos de barras. Con, controle; PA/
EA, área pigmentada/área epidérmica;

b rhGDF15 (ng/ml)
rhGDF15, GDF15 humano
recombinante; sh1, RNA 1 em gancho de
Com 5 20 100
cabelo curto; sh2, RNA 2 em gancho de
cabelo curto; shCon, controle de RNA em
grampo curto; shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto.

2 2
* : p<0,05 vs. Con * : p=0,001 vs. Con *
*
1,5 1,5
* *
1 1
melanina
indução
(dobre
Con
Teor
vs.
de
a
Densitometria
(Indução
dobra
Con)
vs.
de

0,5 0,5

(N=3) (N=3)
0 0
Com 5 20 100 Com 5 20 100

rhGDF15 (ng/ml) rhGDF15 (ng/ml)

levou ao aumento da pigmentação. Juntos, esses achados sugerem
que o crosstalk entre melanócitos e fibroblastos senescentes
durante o processo de envelhecimento desempenha um papel
importante na estimulação da melanogênese por meio da
superprodução de GDF15 e subsequente pigmentação relacionada
ao envelhecimento. Também foi observado que um aumento de
GDF15 após irradiação UV aguda também pode desempenhar um
papel na regulação da pigmentação da pele.
Como os fibroblastos envelhecidos estão relacionados com a
regulação positiva de GDF15 não está claro; no entanto, foi
reconhecido que o GDF15 é regulado positivamente por vários
fatores de transcrição, incluindo p53 e CREB, em resposta a vários
estressores celulares (Baek e Eling, 2019). Especificamente, o
promotor GDF15 contém dois sítios de ligação p53 que conferem
indução GDF15 em resposta a vários tipos de estresse celular,
incluindo luz UV (Fujita et al., 2016). p53, conhecido por ser um
biomarcador de senescência, também é regulado positivamente em
fibroblastos da pele após UVR (Chen et al., 2008); isso também foi
observado neste estudo. Deve-se notar que a ativação transcricional
de p53 na pele é conhecida por ser um fator importante na
pigmentação induzida por UV (Murase et al., 2009). GDF15
os níveis de expressão também são aumentados pelas vias PI3K/
proteína ki nase B/GSK3b (Yamaguchi et al., 2004). Demonstramos
que o GDF15 parece atuar nos melanócitos via via de sinalização da
b-catenina. Níveis aumentados da forma ativa da b-catenina e
translocação nuclear foram demonstrados pela expressão de GDF15
nas células. Além disso, GDF15 aumentou significativamente a
expressão de MITF, que é um gene alvo conhecido a jusante da b-
catenina.
Coletivamente, especulamos que a elevação dos níveis de GDF15
em fibroblastos envelhecidos na pele pode ser devido em parte à
ativação da sinalização de p53 e proteína quinase B causada por UV
e estresse oxidativo.
Em nosso estudo, o mRNA e a proteína GDF15 também foram
expressos em melanócitos e queratinócitos, bem como em
fibroblastos. O GDF15 derivado de queratinócitos ou melanócitos
pode ter um papel na ativação de melanócitos, resultando em
aumento da pigmentação da pele. De fato, descobrimos que a
irradiação UVB, não UVA, regula positivamente os níveis de
expressão de GDF15 em melanócitos (Figura complementar S6).
Em queratinócitos, a expressão de GDF15 foi aumentada em um
ponto de tempo de 24 horas, mas recuperou em 48 horas de irradiação UVB, enq

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Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação

a b Jovem UVA

GDF15 GDF15
GDF15
shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2
GDF15
GDF15
1,0 20,0
1,0 0,1 0,4 4.8 1.4 1.2
p-GSK3ÿ
p-GSK3ÿ
1,0 3.0
1,0 0,3 0,2 2.8 2.0 1.4
GSK3ÿ
GSK3ÿ
1,0 1,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
ÿ-catenina
ÿ-catenina
1,0 3.5
1,0 0,2 0,1 2.4 1,0 1,5
p-ÿ-catenina
p-ÿ-catenina
1,0 5.4
Ativo 1,0 0,3 0,2 3.3 2.3 1.2
ÿ-catenina ÿ-
1,0 4.1 catenina ativa
actina 1,0 0,2 0,2 4.0 1.9 1.3
actina

c ÿ-catenina
DAPI mesclar

(N=57) (N=56)
Com
100%

33,9%

77,2%
Núcleo
50%
Citoplasma
66,1%

GDF15
22,8%
0%
GDF15

d ÿ-catenina
DAPI mesclar

(N=56) (N=56) (N=53)

shCon
100%

30,4%

73,2% 73,6%
Núcleo
50%
UVA
Citoplasma

shGDF15-1
69,6%

26,8% 26,4%

0%
shCon sh1 sh2

GDF15
shGDF15-2

UVA

Figura 4. GDF15 estimula a melanogênese por meio da sinalização da b-catenina. Melanócitos foram cocultivados com fibroblastos (jovens ou senescentes) infectados com um
lentivírus (GDF15 ou shGDF15). (a, b) Os níveis de expressão de b-catenina, pb-catenina, GSK3b e p-GSK3b foram analisados por western blotting. (c, d) A translocação nuclear
de b-catenina foi analisada usando um microscópio confocal. Barra ¼ 5 mm. No total, mais de 50 células foram analisadas e as porcentagens de células com coloração nuclear
de b-catenina são apresentadas como gráficos de barras. Con, controle; pb-catenina, b-catenina fosforilada; p-GSK3b, GSK3b fosforilado; sh1, RNA 1 em gancho de cabelo
curto; sh2, RNA 2 em gancho de cabelo curto; shCon, controle de RNA em grampo curto; shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto.

6 Jornal de Dermatologia Investigativa (2020), Volume -

Machine Translated by Google
o tratamento com GDF15 humano recombinante em queratinócitos
humanos primários ou a superexpressão de GDF15 em melanócitos
não afetou a proliferação celular (Figura Suplementar S7).
Além disso, o tratamento com GDF15 em queratinócitos não
influenciou a ativação da b-catenina (Figura complementar S8). O
possível crosstalk de GDF15 derivado de células epidérmicas
vizinhas na ativação de melanócitos precisa ser mais investigado.
Em resumo, o GDF15 derivado de fibroblastos envelhecidos
pode contribuir para a pigmentação da pele por meio de crosstalk
com me lanócitos. Este estudo fornece informações valiosas sobre
o desenvolvimento de proteínas-alvo para estratégias de tratamento,
bem como uma melhor compreensão da fisiopatologia da
pigmentação do envelhecimento.
MATERIAIS E MÉTODOS
Cultura de células
Melanócitos humanos normais, queratinócitos e fibroblastos foram isolados
de biópsias de pele (AJIRB-BMR-SMP-17-438). Os melanócitos nas passagens
2e7 foram incubados em meio F12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS;
Gibco), 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco), 24 mg/ ml 3-isobutil-1-
metilxantina, 13-acetato de 12-O tetradecanoilforbor 80 nM, fator de
crescimento de fibroblasto básico 1,2 ng/ml e toxina da cólera 0,1 mg/ml
(todos da Sigma, St. Louis, MO).
Os queratinócitos nas passagens 2e3 foram cultivados em meio EpiLife
suplementado com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos (Gibco).
Os fibroblastos nas passagens 3e7 foram mantidos em DMEM (Gibco)
suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Durante
a etapa de cocultura, melanócitos e fibroblastos foram mantidos em MCDB-153
(Welgene, Daegu, Coréia) contendo 4% de FBS, 0,6 ng/ml de fator de
crescimento de fibroblasto básico, 5 mg/ml de insulina, 1 mg/ml de vitamina E
e 1 mg/ml de transferrina. Os melanócitos primários isolados foram semeados
no fundo de uma placa de 6 poços e os fibroblastos foram semeados em
câmaras Transwell inseridas em cada caso. Após 24 horas, as câmaras
Transwell foram translocadas para melanócitos semeados em placas de 6
poços e mantidos por 5 dias. A melanogênese foi então analisada nos
melanócitos.
Modelo in vitro de fibroblastos senescentes
Fibroblastos primários foram preparados e mantidos em DMEM (Gibco)
suplementado com 10% FBS (Gibco). Para a indução da senescência, os
fibroblastos foram tratados com 8-metoxi psoraleno (Sigma) a 25 ng/ml com
meio fresco por 16 horas. As células foram então irradiadas com 5 J/cm2 UVA
(comprimento de onda, 320e400 nm; pico máximo, 350 nm) usando um
sistema de fotorreator LZC-1 (Luzchem Research, Ottawa, Ontário, Canadá)
e mantidas em DMEM por 7 dias.
Produção de lentivírus O
cDNA humano GDF15 usado neste estudo foi amplificado por PCR de
fibroblastos em nosso laboratório e então subclonado no vetor de lentivírus
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (System Biosciences, Mountain View, CA). Para
o knockdown da expressão de GDF15, o RNA hairpin curto foi preparado em
um vetor lentiviral pLKO (Sigma) e então amplificado em células 293TN. Os
fibroblastos foram semeados e cultivados em placas de cultura de 6 cm. Após
o cultivo durante a noite, eles foram infectados com o lentivírus e então
selecionados com 3,5 mM de puromicina por 1 semana. As sequências curtas
de RNA em gancho foram as seguintes: shGDF15 50
-CCGGTCTCAGATGCTCCTGGTGTTGCTCGAGCAA #1:
CACCAGGAGCATCTGAGATTTTTG-30 e shGDF15 #2: 50 -
CCGGCCGGATACTCACGCCAGAAGTCTCGAGACTTCTGG
Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação
CGTGAGTATCCGGTTTTTG-30 . Para gerar partículas lentivirais, células
HEK-293TN foram transfectadas com DNA de plasmídeo (pGag-pol, pVSV-G
e pCDH-GDF15 ou shGDF15) usando Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad,
CA). O sobrenadante viral foi coletado após 48 horas e transduzido em sangue
humano normal ou senescente
fibroblastos.
Coleta de biópsia
Sete pacientes com melasma (idade média de 40,5 anos) foram incluídos.
O diagnóstico da doença foi baseado no exame físico e confirmado com
achados histopatológicos. Amostras de biópsia de pele (2 mm) foram
obtidas de pele normal perilesional adjacente e lesional (geralmente
dentro de 1 cm da margem da lesão) de todos os pacientes. O
consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes
da biópsia de pele, e este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão
institucional do Ajou University Hospital (AJIRB-MED DEO-10-152). Pele
humana normal retirada de indivíduos jovens (idade média, 10,4 anos)
ou idosos (idade média, 63,2 anos) foi obtida durante cirurgia
dermatológica. O consentimento informado por escrito foi obtido de cada
paciente antes dos procedimentos de biópsia de pele, e este estudo
também foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Ajou
University Hospital (AJIRB-BMR-SMP-17-438).
Cultura de órgãos da pele ex vivo e ensaio de pigmentação
Os fibroblastos jovens ou senescentes foram semeados no fundo de placas
de 6 poços. Após 24 horas, amostras de pele humana normal obtidas durante
a cirurgia foram colocadas em uma grade de aço inoxidável esterilizada em
placas de 6 poços semeadas com fibroblastos senescentes contendo DMEM
suplementado com 10% de FBS. Após 3 dias de cultivo em incubadora a 37
C com 5% de CO2, os espécimes foram fixados em formol a 10% e incluídos
em cortes de parafina. Os pigmentos de melanina foram detectados com
coloração de Fontana-Masson. Uma análise de imagem foi realizada usando
Image Pro Plus Versão 4.5 (Media Cybernetics, Rockville, MD) e a área
pigmentada por área epidérmica foi medida. Este estudo foi aprovado pelo
conselho de revisão institucional do Ajou University Hospital (AJIRB-BMR-
SMP-17-438).
Ensaio do teor de melanina e da atividade da
tirosinase Os melanócitos foram lisados com um tampão fosfato 0,1 M
(pH 6,8) contendo 1% de Triton X-100 com um coquetel de inibidores de
protease (Roche, Basel, Suíça). Os sobrenadantes foram medidos para
determinar a concentração de proteína usando o sistema de ensaio Lowry.
Os pellets foram solubilizados em 100 ml de NaOH 1 N por 3 horas a 60 C, e
a absorbância foi medida a 490 nm para determinar o teor de melanina em
relação a uma curva padrão usando melanina sintética (Sigma). Para o ensaio
da atividade da tirosinase, cada amostra foi incubada com L-DOPA 2 mM
(Sigma) em um tampão fosfato 0,1 M (pH 6,8) por 90 minutos a 37 C. Após a
incubação, a atividade da tirosinase foi medida a 490 nm com um leitor de
ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA).
Coloração de b-Galactosidase associada à senescência
As células foram fixadas com formol a 4% por 15 minutos e então
incubado com solução de b-galactosidase associada à senescência (X gal, 1
mg/ml; ácido cítrico/fosfato de sódio, pH 5,8, 40 mM; ferrocianeto de potássio,
5 mM; ferricianeto de potássio, 5 mM; NaCl, 150 mM; e MgCl2 , 2 mM) por 12
horas a 37 C. Após lavagem com PBS, células b-galactosidase positivas
associadas à senescência foram analisadas sob microscopia de luz. Mais de
1.000 células foram contadas em cada grupo (normal, 1.380 células; sham,
1.266 células; e UVA, 1.263 células).
www.jidonline.org 7
Machine Translated by Google
Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação
As
células ELISA foram cultivadas durante 48 horas e os meios foram colhidos. (Carl Zeiss).
Os níveis de secreção de GDF15 no meio foram medidos usando kits GDF15
ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do
fabricante.
Análise de PCR em tempo
real O RNA celular total foi extraído usando o kit RNeasy Mini (Qiagen,
Hilden, Alemanha) e o cDNA foi obtido usando um kit SuperScript III Reverse
Transcriptase (Invitrogen). A PCR em tempo real foi realizada com iQ SYBR
Green Supermix (Bio-Rad) nas seguintes condições: ativação inicial a 95 C
por 5 minutos, seguida de 40 ciclos a 95 C por 15 segundos e 60 C por 1
minuto. Os primers utilizados para a PCR em tempo real são os seguintes:
humano 18S: 50 -
CGGCTACCACATCCAAGGAA-30 e 50 -GCTGGAAT
TACCGCGGCT-30 ; GDF15: 50 -CCCATTGGTGCTCATTCAAAAG-30 e 50
-GCTCATATGCAGTGGCAGTCTT-30 ; MITF: 50 -AGAA
CAGCAACGCGCAAAAAGAAC-30 e 50 -TGATGATCCGATTCAC
CAAATCTG-30 ; tirosinase: 50 -CACCACTTGGGCCTCAATTTC-30 e
50 -AAAGCCAAACTTGCAGTTTCCAC-30 ; e p16INK4: 50 -
CCCAACGCACCGAATAGTTA-30 e 5 -ACCACGTGTCCAG 0
GAAG-30 .
Análise de Western blot
As células foram lisadas em tampão RIPA (1% NP-40; 150 mM NaCl; 10 mM
Tris-HCl, pH 8,0; e 1 mM EDTA) com uma protease completa em inibidor
(Sigma). As proteínas foram separadas por gel de SDS-poliacrilamida e
depois transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno
(Millipore, Burlington, MA). O anticorpo contra o MITF foi obtido da Abcam
(Cambridge, Reino Unido); GDF15 e pb catenina eram da Novus Biologicals
(Centennial, CO); p-GSK3b e GSK3b eram da Cell Signaling Technology
(Danvers, MA); a b-catenina ativa era da Millipore; e tirosinase, p53, b-
catenina e actina eram da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
Análise imunocitoquímica e imunohistoquímica Para imunocitoquímica,
as células cultivadas em câmaras Lab-Tek (Nalge Nunc International,
Rochester, NY) foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 15 minutos
à temperatura ambiente e permeadas com Triton X-100 a 0,2%. A ligação
inespecífica do anticorpo foi bloqueada por BSA a 1% por 1 hora. As células
foram então incubadas com anti GDF15 (Novus Biologicals) durante a noite
a 4°C. A coloração imuno-histoquímica foi realizada em seções fixadas em
paraformaldeído a 4% e embebidas em parafina. Os cortes histológicos (4
mm) foram desparafinizados e reidratados em xileno e etanol. Eles foram
incubados em 0,05% de tripsina em solução salina tamponada com Tris por
20 minutos a 37 C para recuperação antigênica. Os anticorpos primários
utilizados foram os seguintes: anti-GDF15 (Novus Biologicals), vimentina
(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) e b-catenina (Millipore). Todas as
fotografias de fluorescência foram tiradas usando um microscópio de
fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e analisadas com o
software Zeiss Axio Imager (Carl Zeiss) à temperatura ambiente. A
translocação nuclear de b-catenina foi analisada usando um microscópio
confocal (microscópio Zeiss LSM 710). No total, 50 células foram analisadas
e as porcentagens de células com coloração nuclear de b-catenina foram
apresentadas na forma de um gráfico de barras.
Análise dos focos de heterocromatina
Para a análise dos focos de heterocromatina, as células foram fixadas
com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente. As
células foram coradas com DAPI por 10 minutos, após o que o
8 Jornal de Dermatologia Investigativa (2020), Volume -
os focos de heterocromatina foram analisados com um microscópio de fluorescência
Equivalente de pele humana
MelanoDerm (MatTek Corp, Ashland, MA) é um equivalente de pele humana
tridimensional reconstituído viável derivado de amostras asiáticas (MEL-A).
Equivalentes de pele foram mantidos no meio NMM-113 e foram tratados
com proteína GDF15 humana recombinante (R&D Systems) em 4 mM de
HCl estéril contendo 0,1% de BSA uma vez em dias alternados por 2
semanas. O conteúdo de melanina foi determinado conforme relatado
anteriormente (Ni-Komatsu et al., 2008). Os tecidos congelados foram
homogeneizados e a mistura foi extraída com 100 ml de clorofórmio e
metanol. Após centrifugação a 12.000 rpm por 30 minutos, a densidade
óptica da fase superior a 490 nm foi medida. A melanina sintética (Sigma) foi
submetida ao mesmo procedimento do controle, e uma curva padrão foi
construída para que o conteúdo de melanina das incógnitas pudesse ser
determinado para cada tecido cultivado. A análise do densitômetro foi
realizada usando o Im age Pro Plus Versão 4.5 (Media Cybernetics).
Análise estatística
Os dados foram apresentados como o DP médio de determinações
independentes e foram analisados usando testes U de Mann-Whitney
com um valor de P < 0,05 considerado significativo. IBM SPSS ver. 25
(IBM, Armonk, NY) foi usado para todas as análises estatísticas.
Declaração de disponibilidade
de dados Os dados de sequenciamento de RNA usados neste estudo são
depositados no banco de dados Gene Expression Omnibus com o número
de acesso GSE109778. Todos os outros dados gerados ou analisados
durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e nos arquivos suplementares.
ORCIDs
Yeongeun Kim: https://orcid.org/0000-0002-6113-1253 Bogyeong
Kang: https://orcid.org/0000-0003-2847-5 Jin Cheol Kim: https://
orcid.org/0000-0003-3820-8 Parque Tae Jun: https://orcid.org/
0000-0002-8862-1 Hee Young Kang: https://orcid.org/
0000-0001-8697-4
CONFLITO DE INTERESSES Os
autores declaram não haver conflito de interesses.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Científica Básica por meio da
Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia, financiada pelo Ministério da Ciência e TIC
(NRF-2017R1A2B4012542, NRF-2019R1A2C2086127), pelo Projeto de P&D de
Tecnologia de Saúde da Coréia, por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria
de Saúde da Coréia, financiado pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar da República da
Coreia (HN14C0094), e o Projeto de Aperfeiçoamento da Capacidade de Pesquisa em
Ciências Básicas por meio do Instituto de Ciências Básicas da Coreia (Centro Nacional
de Instalações e Equipamentos de Pesquisa) na forma de uma doação financiada pelo
Ministério da Educação (2019R1A6C1010003).
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
Conceituação: YK, BK, JCK, TJP, HYK; Análise Formal: YK, TJP, HYK;
Investigação: YK, BK, JCK, HYK; Metodologia: YK, TJP, HYK; Escrita -
Preparação do rascunho original: YK, TJP, HYK
MATERIAL SUPLEMENTAR
O material suplementar está vinculado à versão online do artigo em www. jidonline.org, e
em https://doi.org/10.1016/j.jid.2020.04.016.
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GDF15 induz a pigmentação

25
*
20
* : p<0,01 vs. Con
15
Expressão
GDF15
mRNA
de
de
induction
Con)
(Fold
vs.

*
10

5
*
0
Com UVA UVA UVA
(1 dia) (4 dias) (7 dias)

Figura suplementar S1. Expressão de mRNA de GDF15 após irradiação UVA.

Fibroblastos normais foram irradiados por UVA e mantidos pelos tempos indicados. Os níveis de
expressão de GDF15 mRNA foram analisados por PCR em tempo real. Con, controle.

Figura suplementar S2. GDF15 aumentou

a * : p<0,05 vs. Con
* : p<0,05 vs. Con
a expressão de mRNA de MITF e tirosinase. Os 5 4
melanócitos foram cocultivados com
* *
fibroblastos infectados com (a) um GDF15 4
3
ou (b) um lentivírus shGDF15. Os níveis de
3
expressão de mRNA de MITF e tirosinase foram induction
Con)
(Fold
vs. induction
Con)
(Fold
vs.

2
Expressão
mRNA
MITF
de

analisados por PCR em tempo real. Con, Expressão

tirosinase
mRNA
da
de

2
controle; sh1, RNA 1 em gancho de cabelo
curto; sh2, RNA 2 em gancho de cabelo curto; 1
1
shCon, controle de RNA em grampo curto;
(N=3) (N=3)
shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto. 0 0
Com GDF15 GDF15

b
* : p<0,05 (vs. Young shCon) # : * : p<0,01 (vs. Young shCon) # :
2.5 p<0,05 (vs. UVA shCon) 3 p<0,01 (vs. UVA shCon)

2.5
2

2
1,5 ## ##
induction
Con)
(Fold
vs.
Expressão
(indução
mRNA
dobra
Con)
MITF
vs.
de
de
de

Expressão
tirosinase
mRNA
da
de
1,5
1
1
* *
0,5
* *
0,5

(N=3) (N=3)
0 shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2 0 shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2

GDF15 GDF15 GDF15 GDF15

Jovem UVA Jovem UVA

Figura suplementar S3. Knockdown de

20 * : p<0,05 30 * : p<0,05 (vs. Young shCon) # :
GDF15 usando um lentivírus shGDF15
em fibroblastos senescentes. p <0,05 (vs. UVA shCon)

Fibroblastos senescentes foram infectados 15

*
com dois tipos de lentivírus shGDF15 por 3 20
dias. Os níveis de expressão de GDF15 foram induction
Con)
(Fold
vs. induction
Con)
(Fold
vs.

Expressão
GDF15
mRNA
de

10 Expressão
GDF15
mRNA
de
de

analisados por PCR em tempo real. Con,

controle; sh1, RNA 1 em gancho de cabelo
10 #
curto; sh2, RNA 2 em gancho de cabelo curto; #
5
shCon, controle de RNA em grampo curto;
shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto. (N=3) (N=3)
0 0
* *
Com GDF15 shCon sh1 sh2 shCon sh1 sh2

GDF15 GDF15

Jovem UVA

9.e1 Journal of Investigative Dermatology (2020), Volume -

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Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação

Figura suplementar S4. GDF15 não afetou a

proliferação de fibroblastos. Fibroblastos
jovens foram infectados com lentivírus GDF15
ou shGDF15. As taxas de crescimento celular

foram analisadas pelo método de contagem

de células.
Con, controle; sh1, RNA 1 em gancho de cabelo
curto; sh2, RNA 2 em gancho de cabelo curto;
shCon, controle de RNA em grampo curto;
shGDF15, GDF15 RNA em gancho curto.

Com GDF15 Figura suplementar S5. GDF15 induz

a pigmentação cutânea.
A pele da biópsia foi incubada com fibroblastos
jovens infectados com um controle ou o lentivírus

Tirosinase GDF15 (painel superior) ou fibroblastos

senescentes infectados com shCon ou um
lentivírus shGDF15 (painel inferior) por 3

dias. (a) A expressão de tirosinase e (b) MART-1

UVA em pele humana ex vivo foi analisada por

coloração imuno-histoquímica. Barra
shCon shGDF15-1 shGDF15-2
¼ 100 mm. A cor vermelha indica tirosinase e
expressão de MART-1.

Tirosinase
Con, controle; shCon, controle de RNA em
grampo curto; shGDF15, GDF15 RNA em gancho
curto.

b
Com GDF15

MART-1

UVA

shCon shGDF15-1 shGDF15-2

MART-1

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Y Kim et al.
GDF15 induz a pigmentação

a * : p<0,05 vs. Con

Queratinócitos
20000 3 *
2.5

induction
Con)
(Fold
vs.

10000 1,5
queratinócitos
Celular
de
nº

Expressão
GDF15
mRNA
de
de

0,5
(N=3) (N=3)
0 0
Com 123 4 5 UVA UVB 24h 24h 48h 48h

UVA Com UVA UVB

(J/cm2) (4 J/cm2) (24 mJ/cm2)

b Melanócitos
150000 3 * : p<0,05 vs. Con

2.5 *
*
100000 2

melanócitos
Celular
de
nº
induction
Con)
(Fold
vs.

Expressão
GDF15
mRNA
de
de
1,5

50000 1

0,5

(N=3) (N=3)
0 0
com 1 2 3 4 5 UVA UVB 24h 24h 48h 48h

UVA Com UVA UVB

(J/cm2) (4 J/cm2) (24 mJ/cm2)

Figura suplementar S6. Expressões de mRNA de GDF15 após irradiação UV. (a) Queratinócitos humanos normais e (b) melanócitos foram irradiados com UVA (1e4 J/
cm2 ) ou UVB (25 mJ/cm2 ) e mantidos pelos tempos indicados (24 horas e 48 horas). Os números de células foram contados usando um hemocitômetro. Os níveis de
expressão de GDF15 mRNA foram analisados por PCR em tempo real. Con, controle.

9.e3 Journal of Investigative Dermatology (2020), Volume -

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GDF15 induz a pigmentação

Figura suplementar S7. GDF15 não afetou a proliferação celular. (a)

Os queratinócitos foram tratados com rhGDF15 (5e100 ng/ml) durante 5 dias e depois os
números de células foram analisados. (b) Os melanócitos foram infectados com lentivírus
de controle ou expressando GDF15 e, em seguida, a proliferação celular foi analisada.
Con, controle; rhGDF15, GDF15 humano recombinante.

Queratinócitos
rhGDF15
Com
(100 ng/ml)

ÿ-catenina

p-ÿ-catenina

ÿ-
catenina ativa

actina

Figura suplementar S8. GDF15 não influenciou na ativação da b-catenina nos

queratinócitos. Os queratinócitos foram tratados com rhGDF15 (100 ng/ml) durante 5
dias. Os níveis de expressão de b-catenina, pb-catenina e b-catenina ativa foram
analisados por western blotting. Con, controle; pb-catenina, b- catenina fosforilada ;
rhGDF15, GDF15 humano recombinante.

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