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American Journal of Pathology, Vol. 168, nº 6, junho de 2006
Lesão celular, reparação, envelhecimento e apoptose
Diminuição da Produção de Colágeno em Cronologicamente
Pele envelhecida
Papéis da alteração dependente da idade na função dos fibroblastos e
Estimulação Mecânica Defeituosa
James Varani, * Michael K. Dame, * Laure Rittie, †
Suzanne EG Fligiel,* Sewon Kang,†
Gary J. Fisher† e John J. Voorhees†
Dos Departamentos de Patologia * e Dermatologia,† O
Universidade de Michigan, Ann Arbor, Michigan
A redução da síntese de colágeno tipo I e III é característica da pele
envelhecida cronologicamente. O presente
relatório fornece evidências de que tanto o fibroblasto celular
envelhecimento e estimulação mecânica defeituosa no
tecido envelhecido contribuem para a redução da síntese de colágeno.
A redução na síntese de colágeno devido aos fibroblastos
o envelhecimento foi demonstrado por uma menor produção in vitro
de procolágeno tipo I por fibroblastos dérmicos isolados da pele
de jovens (18 a 29 anos) versus idosos
(80 anos) indivíduos (82 16 versus 56 8 ng/ml;
P < 0,05). Uma redução na estimulação mecânica em
pele cronologicamente envelhecida foi inferida a partir de
microscopia morfológica, ultraestrutural e de fluorescência.
estudos. Esses estudos, comparando seções dérmicas
de indivíduos jovens e idosos, demonstrou uma
maior porcentagem da superfície celular ligada às fibras de
colágeno (78 6 versus 58 8%; P <0,01) e
espalhamento celular mais extenso (1,0 0,3 vs. 0,5 0,3;
P < 0,05) na pele jovem em comparação com a pele velha.
Esses recursos são consistentes com um nível mais baixo de
estimulação mecânica nas células em velhos versus
pele jovem. Com base nos achados aqui apresentados,
concluem que a redução da síntese de colágeno em peles
cronologicamente envelhecidas reflete pelo menos dois mecanismos
subjacentes diferentes: envelhecimento dos fibroblastos celulares e
menor nível de estimulação mecânica. (Am J Pathol
2006, 168:1861-1868; DOI: 10.2353/ ajpath.2006.051302)
A redução do colágeno fibrilar (tipos I e III) é uma característica da pele
envelhecida cronologicamente e é
Copyright © Sociedade Americana de Patologia Investigativa
DOI: 10.2353/ ajpath.2006.051302
melhorada em fotodano. Isso foi bem descrito
usando abordagens histológicas e ultraestruturais na
passado,1-5 e nossos próprios estudos recentes documentaram
isso bioquimicamente no envelhecimento cronológico6 e
fotoenvelhecimento.7 Metaloproteinases de matriz de degradação de colágeno
(MMPs) são reguladas positivamente na pele pela radiação UV.8,9 A
indução repetida dessas enzimas pela exposição à radiação solar
radiação ao longo de anos ou décadas é provavelmente responsável por
produzindo fragmentação de colágeno na pele danificada pelo sol.
Durante o envelhecimento natural ou cronológico da pele, o
mesmas MMPs que são reguladas agudamente em resposta a
A radiação UV aumenta gradualmente. Isso foi observado em cultura
em monocamada com células obtidas de
versus sujeitos jovens, 10-14 e nossos próprios estudos
mostrou regulação ascendente gradual de MMPs em pele intacta (velha
versus jovem).15
Embora a destruição do colágeno existente seja, sem dúvida, central
para as alterações deletérias observadas na
pele envelhecida/fotoenvelhecida, a falha em substituir o colágeno
danificado por material recém-sintetizado também é fundamental para o
fisiopatologia geral. Há uma diminuição sustentada na síntese de
colágeno na pele fotoenvelhecida em relação ao que ocorre na pele
saudável protegida do sol16 e na
pele cronologicamente envelhecida e protegida do sol em comparação com
o que se vê na pele jovem.15
Mecanismos subjacentes à perda da síntese de colágeno
em pele fotoenvelhecida e pele envelhecida cronologicamente
não foram totalmente delineados. Em uma série recente de
estudos, demonstramos que em pele severamente fotoenvelhecida, a
presença de colágeno fragmentado na
derme inibiu a síntese de colágeno. Com base nos resultados
a partir de uma variedade de abordagens in vitro e in vivo ,
Apoiado em parte pelas concessões do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos DK59169
e AG013964.
Aceito para publicação em 13 de março de 2006.
Envie solicitações de reimpressão a James Varani, Ph.D., Departamento de
Patologia, Universidade de Michigan, 1301 Catherine Rd./Box 0602, Ann
Arbor, MI 48109 EUA. E-mail: varani@umich.edu.
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1862 Varani et al
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concluiu que o colágeno danificado não suportava um nível
de tensão mecânica em fibroblastos residentes necessários
para a síntese eficiente de colágeno.6,7,17,18 Se um
O mecanismo contribui para a diminuição da produção de colágeno na
pele cronologicamente envelhecida e, em caso afirmativo, até que ponto
é responsável pela redução geral de colágeno observada na pele
envelhecida, não é conhecido. Essas questões são
abordados no presente estudo.
Materiais e métodos
Biópsias de pele
Para este estudo, indivíduos com idades entre 18 e 29 anos
anos (coorte jovem) e indivíduos com 80 anos ou mais
(antiga coorte) foram recrutados. Replicar 2 e/ou 4 mm
biópsias de punção da pele do quadril protegida do sol foram obtidas
de cada indivíduo. Os punções de 4 mm foram usados para
análise microscópica e ultraestrutural de fluorescência
e para avaliação dos níveis de procolágeno tipo I. Na rival do laboratório,
uma das biópsias de 4 mm foi
imediatamente congelada em temperatura ótima de corte (OCT), e a
outra peça foi fixada em hyde glutaralde. As biópsias com punch de 2
mm foram usadas para exames de rotina.
histologia no nível microscópico de luz e como um tecido
fonte para o isolamento de fibroblastos dérmicos. Para rotina
histologia, as biópsias foram fixadas em forma 10% tamponada. O
isolamento de fibroblastos foi realizado conforme indicado
abaixo de. Todos os procedimentos envolvendo seres humanos foram
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa e biópsias
foram obtidos após o consentimento informado.
Fibroblastos Dérmicos Humanos em Cultura de Monocamada
Os fibroblastos foram isolados de biópsias de pele conforme descrito
anteriormente.15 Resumidamente, a biópsia foi picada com tesoura e
fórceps, e fragmentos de tecido foram transferidos
a poços individuais de uma placa de 24 poços. Dulbecco modificado
meio essencial mínimo suplementado com aminoácidos não essenciais
e 10% de soro fetal bovino (DMEM FBS) foi usado como meio de
cultura. Apenas um mínimo
quantidade de meio foi incluída para que pedaços de tecido
adeririam à superfície plástica. Os pratos foram
mantida a 37°C em uma atmosfera de 95% de ar e 5%
CO2. Eventualmente, a proliferação de fibroblastos ao redor da borda
de alguns dos fragmentos de tecido foi observada. Quando
células em número suficiente estavam disponíveis, elas foram colhidas
com ácido tripsina/etilenodiamina tetraacético
(EDTA) e cultivadas em cultura de monocamada usando DMEM FBS.
As células foram subcultivadas por exposição a tripsina/EDTA
uma ou duas vezes e depois usado em experimentos.
Procolágeno tipo I
Seções congeladas em série foram preparadas a partir de biópsias de
pele embutidas em OCT como se segue: 7, 200 e 7 m. Depois
coloração de hematoxilina e eosina, as áreas dos cortes
de ambas as extremidades da amostra de 200 m foram medidos
usando o software Image ProPlus para calcular o volume de
a amostra de 200 m. Os extratos de proteínas solúveis foram pré-
das amostras de 200 m, que foram homogeneizadas em tampão de
extração gelado (50 mmol/L Tris-HCl,
pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl, 1% Triton X-100 e protease
inibidores [Complete Mini, Hoffmann-LaRoche, Nutley,
NJ]), e vortexado na presença de contas de vidro (Bio spec, Bartlesville,
OK). Após centrifugação por 10 minutos
a 10.000 g e 4°C, os sobrenadantes foram testados para
procolágeno I usando um kit comercial de ensaio imunossorvente ligado
a enzima (Panvera, Madison, WI) conforme descrito
anteriormente.15 O ensaio de procolágeno usa um anticorpo para
a região do propeptídeo C-terminal que faz parte da molécula de
colágeno à medida que é sintetizada e secretada (antes
sendo clivada proteoliticamente). Como tal, este ensaio é um
medida de colágeno recém-sintetizado. As concentrações de procolágeno
tipo I foram normalizadas para o volume de
tecido utilizado para a preparação de cada amostra.
A produção de procolágeno tipo I também foi avaliada em
fibroblastos dérmicos em cultura em monocamada. Os fibroblastos foram
semeado em 4 104 células por poço em placas de 24 poços usando
DMEM-FBS como meio de cultura. As células foram autorizadas a
anexar durante a noite. No dia seguinte, foram lavados e
depois incubados em meio de crescimento de queratinócitos (Cambrex
Bioscience, Walkersville, MD) suplementado com 1,4
mmol/L Ca2. O meio de crescimento de queratinócitos é uma modificação
do meio MCDB-153 livre de soro, com baixo teor de Ca2, suplementado
com fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina,
hidrocortisona e extrato hipofisário. Os números das células foram
determinado 2 dias depois, liberando as células com tryp sin/EDTA e
enumerando-as usando um contador de partículas
(Coulter Electronics, Hialeah, FL). Na época da colheita,
os fluidos de cultura isentos de soro foram coletados e avaliados quanto
ao procolágeno tipo I usando o mesmo procedimento de ensaio
imunossorvente ligado à enzima e depois normalizados para o número
de células.
Imunocoloração e Microscopia Confocal
Um anticorpo monoclonal de camundongo para vinculina foi obtido
da Chemicon (Temicula, CA). O anticorpo primário
foi visualizado com anticorpo IgG anti-rato de coelho
ligado a Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e
amplificado ainda mais com Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho
IgG. Alexa Fluor 546-faloidina (Invitrogen) foi usada como
uma sonda para actina. Os núcleos foram contracorados com o
corante nuclear 4,6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloreto (DAPI) (Prolong
Gold; Invitrogen). (Observe que Alexa
O flúor 488 é espectralmente semelhante à fluoresceína, enquanto
Alexa Fluor 546 é espectralmente semelhante à rodamina.)
Biópsias de pele congelada em OCT de jovens
e indivíduos velhos foram usados para coloração. Resumidamente, o
cortes de tecido congelado foram fixados com 4% de formaldeído por
20 minutos. Após a fixação, os cortes de tecido
foram lavados duas vezes com tampão de lavagem (0,05% Tween 20
em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco), seguido por
permeabilização com 0,1% de Triton X-100 por 10 minutos.
Os cortes de tecido foram novamente lavados e expostos
a uma solução de bloqueio composta por 1% de soro bovino
albumina em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco para
30 minutos. Em seguida, os cortes foram tratados com anticorpo
antivinculina em solução bloqueadora por 1 hora. Depois
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Colágeno na Pele Envelhecida 1863

AJP Junho de 2006, Vol. 168, Nº 6

três etapas de lavagem subsequentes (5 minutos cada),

cada amostra foi tratada com anticorpo secundário conjugado Alexa
Fluor 488 em solução de bloqueio e
incubado por 45 minutos. As seções foram coradas simultaneamente
para expressão de actina usando Alexa Fluor
546-faloidina juntamente com o anticorpo secundário. Após três etapas
de lavagem adicionais (5 minutos cada),
cortes de tecido foram tratados por 30 minutos com o
anticorpo de amplificação (Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho
IgG). Isto foi seguido por duas lavagens adicionais
etapas e tratamento com DAPI (contracoloração de núcleos) para
3 minutos. Após três etapas de lavagem finais, as seções de tecido
foram enxaguadas uma vez com água. As lamínulas eram
montado nas lâminas de microscópio com Prolong Anti Fade
(Invitrogen). Secções de tecido coradas foram examinadas por
microscopia de fluorescência. A microscopia foi
realizado em um microscópio confocal Zeiss LSM 510
usando uma objetiva de imersão em água 63 (C-Apochr)
lente (abertura numérica (NA) 1.2). Excitação a laser Figura 1. Produção de procolágeno tipo I em pele jovem e velha. Valores
comprimentos de onda incluídos 364, 488 e 543 nm digitalizados mostradas são médias SEM, com base em seis indivíduos jovens e seis idosos.
A significância estatística das diferenças entre pele jovem e velha foi
em sequência pelo método da linha. determinado usando o teste t de Student. *Significação no nível P 0,05.

Microscópico de Luz e Elétron de Transmissão teste (software analítico Microsoft Excel e SAS). Os dados resumidos
Estudos microscópicos são expressos como médias SEM. Todos os valores P
são bicaudais.
As biópsias de pele foram fixadas durante a noite em glutaraldeído a 2%
em tampão cacodilato 0,1 mmol/L (Sigma, St. Louis, MO) em
pH 7,4. As amostras fixadas com glutaraldeído foram tratadas Resultados
com 2% de tetróxido de ósmio tamponado em 0,1 mmol/L de tampão
cacodilato. As amostras foram desidratadas com Síntese de Procolágeno Tipo I na Pele de
etanol para 2 100% de etanol e 2 óxido de propileno Indivíduos Jovens e Velhos
(EM Ciências). As amostras foram embebidas em puro
resina epon. Cortes de tecido de um micrômetro foram cortados, Na primeira série de experimentos, o conteúdo de procolágeno tipo I
corada com azul de toluidina e examinada à luz foi medido na pele de indivíduos jovens e idosos. conteúdo de
nível microscópico. Superfície ocupada por indivíduos procolágeno tipo I, um marcador de
as células foram avaliadas quantitativamente usando o software NIH síntese de colágeno, foi diminuída em 68% na pele velha
Image em seções de 1 m obtidas de tecido fixado em glutaraldeído e versus pele jovem (Figura 1).
embebido em plástico.
Os mesmos cortes de tecido usados para quantificação de
área de superfície ao nível microscópico de luz também foram usados
Síntese de Procolágeno Tipo I por Fibroblasto
identificar áreas de interesse para microscopia eletrônica de Isolados da pele jovem e velha
transmissão. Cortes ultrafinos foram cortados das áreas de interesse,
Em seguida, meio condicionado de culturas de jovens e velhos
corados com citrato de chumbo e acetato de uranila (ambos
fibroblastos foi avaliado quanto à produção de procolágeno tipo I.
da EM Sciences), e observado usando um Phillips 400
Isolados da coorte de indivíduos jovens sintetizaram mais procolágeno
microscopia eletrônica de transmissão. As fotografias eram
tipo I do que o fibroblasto
feitas a partir de várias áreas de cada espécime. Usando o
isolados da coorte de idosos (Figura 2). Células
fotografias de alta resolução, as células intersticiais foram avaliadas
isoladas de pele jovem também proliferaram em maior
quantitativamente quanto à porcentagem do limite celular em
extensão (Figura 2).
contato com fibrilas de colágeno individuais ou fibrilas de colágeno
Pacotes. Embora seja difícil identificar fibroblastos intersticiais com
100% de precisão, contaminantes óbvios (mastro Estrutura de colágeno, fibroblasto-colágeno
células, células em estruturas vasculares, células epiteliais glandulares
Interações e Formato Celular in Vivo:
e glóbulos vermelhos) não foram avaliados.
Comparação de pele jovem e velha

Análise estatística Uma série de análises microscópicas histológicas, ultraestruturais e de

Proliferação, produção de procolágeno tipo I, medidas de área de
superfície bidimensional e dados de fixação de colágeno foram
comparados entre pele jovem e velha.
Os dados foram analisados usando o t de duas amostras de Student
fluorescência relacionadas foram realizadas para determinar a relação
entre a estrutura do colágeno, células
forma e distribuição de proteínas no local de adesão. Diferenças
no conteúdo do feixe de fibras foram observados entre jovens
e pele velha. Os feixes de fibras eram mais espessos e havia
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1864 Varani et al
AJP Junho de 2006, Vol. 168, Nº 6
Figura 2. Proliferação celular e produção de procolágeno tipo I em cultura em
monocamada. Proliferação (A) e produção de procolágeno tipo I (B) por
fibroblastos isolados de pele jovem e velha. Os valores mostrados são
médias SEM, com base em 26 isolados de fibroblastos de oito indivíduos jovens e 37
isolados de oito indivíduos idosos. Significado estatístico das diferenças
entre isolados de pele jovem e velha foi determinada usando
teste t. *Significação no nível P 0,05.
menos espaço aberto dentro e entre os feixes na derme papilar dos
indivíduos de 18 a 29 anos do que em
o tecido correspondente dos sujeitos de 80 anos
(Figura 3). Em seções de pele jovem, as células intersticiais podem
ser visto orientado no plano do polímero de colágeno
(Figura 3, detalhe). Na pele velha, a derme papilar era
caracterizada pela presença de espaço aberto entremeado de fibras
finas, emaranhadas e entrecruzadas. Lá
havia pouca evidência de orientação do feixe de fibras. Abrir
espaço ao redor das células intersticiais era aparente (Figura 3B,
setas), e havia pouca evidência de orientação celular
(Figura 3, detalhe).
Forma da célula (área de seção transversal bidimensional de
células em seções de 1 m de espessura de tecido embebido em
plástico) foi quantitativamente examinada. Células de jovens indi
os indivíduos estavam mais espalhados do que as células correspondentes
de indivíduos idosos (Figura 4). Os dados quantitativos
mostrados na Figura 4 foram obtidos a partir de cortes da derme
superficial (papilar). Quando as mesmas análises foram
feito nas camadas mais profundas da derme (reticular), resulta
eram semelhantes (não mostrados).
As características ultraestruturais da matriz foram comparadas em
seções de pele jovem e velha. No geral, não houve
grandes diferenças na aparência dos polímeros de colágeno que
podem ser usados para distinguir jovens e idosos
pele. Havia, no entanto, áreas em seções de pele velha
onde a densidade do colágeno foi reduzida. Tais áreas
foram principalmente (embora nem sempre) confinados à derme
papilar. Fibras lisas ocasionais estavam presentes em
algumas das seções das amostras de pele antigas, mas nós
nunca detectou o material elástico característico de
pele muito danificada pelo sol.2,3,5
Como parte da análise, a interação entre as células intersticiais e o
colágeno circundante foi examinada.
Para esses estudos, evitamos mastócitos, células epiteliais
nas estruturas glandulares, células associadas à microvasculatura e
qualquer célula inflamatória que possa estar
presente. Assim, a maioria das células caracterizadas foram
fibroblastos intersticiais. A Figura 5 demonstra e quantifica a interação
dessas células com o ambiente circundante
colágeno em cortes de indivíduos jovens e idosos. Dentro
seções de pele da coorte de 18 a 29 anos, células
estiveram em contato com fibrilas de colágeno intactas por um período maior
proporção de sua superfície (imagem bidimensional) do que
eram células em cortes de pele velha.
Expressão de Proteína do Local de Adesão: Comparação
de Células na Pele Jovem e Velha
Em um conjunto final de experimentos, o anticorpo anti-vinculina foi
usado para identificar locais de adesão focal por fluorescência
microscopia (Figura 6). Em células de jovens e velhos
pele, a coloração antivinculina era evidente. Coloração na pele
cortes de indivíduos jovens foi associado com fibras
feixes, que eram evidentes por sua aparência laranja fosca nas seções
coradas. Em seções de pele velha, há
havia menos aderências focais, e grande parte da coloração
estava intimamente associado com os núcleos (cor azul). O padrão
diferencial de expressão da proteína do sítio de adesão
mostrado na Figura 6 correlacionado com diferenças na célula
espalhando, como observado no nível microscópico de luz
(Figura 4), e com interações célula-colágeno, observadas no nível
microscópico eletrônico de transmissão
(Figura 5). Alternativamente, a fluorescência associada ao núcleo
poderia indicar um intracelular (presumivelmente, funcionalmente
inativo) pool de vinculina.
Discussão
Existe uma grande quantidade de literatura demonstrando uma relação
entre a tensão mecânica nas células in vitro e
respostas biológicas das células ao estresse.19 –23 Quando há
um nível suficiente de tensão mecânica nos fibroblastos,
produção de colágeno e outros componentes do ex
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Colágeno na Pele Envelhecida 1865

AJP Junho de 2006, Vol. 168, Nº 6

Figura 3. Características histológicas da pele protegida do sol de indivíduos jovens e idosos, observadas em cortes corados com hematoxilina e eosina de 5 m de
tecido fixado em formalina (quadros principais) e em cortes corados com azul de toluidina de 1 m de tecido fixado em glutaraldeído e embebido em plástico (inserções). Feixes de fibra grossa
estão presentes em toda a derme superior da pele jovem protegida do sol. Detalhe: Alguns fibroblastos podem ser vistos orientados no plano dos feixes de fibras. No antigo
amostra de pele, os feixes foram substituídos por fibras finas e desorganizadas. Há mais espaço aberto na derme. As células intersticiais são redondas ou oblongas, e
alguns são cercados por espaço aberto (setas). Detalhe: a orientação dos fibroblastos (seta) não é evidente. Secções coradas com hematoxilina e eosina, 490; toluidina
seções manchadas de azul (inserções) 980.

matriz extracelular é alta. Quando a tensão é reduzida, a matriz
a produção cai e a elaboração de enzimas degradadoras de matriz é
estimulada concomitantemente.24 –30 Lapiere e colegas31 mediram
diretamente as
forças mecânicas geradas por fibroblastos em treliças tridimensionais
de colágeno.
Em uma série de estudos, eles demonstraram que a redução na síntese
de colágeno ocorre como consequência da
tensão mecânica reduzida refletiu transcrição diminuída de genes para
colágenos intersticiais, efeitos sobre
enzimas envolvidas no processamento pós-traducional de
peptídeos de procolágeno e maior elaboração de MMPs degradantes de
colágeno. Mostrou-se, ainda, que
múltiplas vias de sinalização foram responsáveis por
transcrição de genes.32,33 De interesse, as alterações na produção de
MMP resultantes de uma perda de tensão mecânica podem
ser claramente separado das alterações resultantes da estimulação da
interleucina-1.34
Consistente com essas observações anteriores, estudos de
nosso laboratório demonstrou que quando a pele humana
fibroblastos foram mantidos em telas tridimensionais nativas
retículos de colágeno, essas células produziram procollagen tipo I.
Quando o colágeno na rede foi fragmentado por
exposição à MMP-1 (colagenase intersticial) ou a enzimas elaboradas
pela pele exposta aos raios UV (principalmente MMP 1), ocorreu uma
queda na produção de colágeno. Concomitante com a diminuição da
produção de colágeno no
retículos de colágeno fragmentados foi uma redução na tensão mecânica,
como evidenciado pela redução do espalhamento celular,
diminuição das adesões focais e dissolução da actina
fibras de estresse.6,7,17,18 Estudos paralelos mostraram que em pele
gravemente fotodanificada (com sua extensa
degradação), os fibroblastos residentes foram caracterizados por
morfológicos, ultraestruturais e de fluorescência semelhantes
achados microscópicos observados in vitro em fragmentos
colágeno.18 Nossa interpretação desses achados é que
degradação do colágeno em fotodanos graves produz um ambiente que
é incapaz de suportar um nível de
tensão mecânica necessária para uma atividade de síntese de colágeno
eficiente.
Fragmentação do colágeno, redução do colágeno total,
e a diminuição das interações célula-fibra de colágeno também
caracterizam a pele cronologicamente envelhecida.1–3,5 As enzimas
responsáveis pela degradação do colágeno aumentam gradualmente
ao longo do tempo na pele.15 A síntese de colágeno também pode
diminuir gradualmente, mas a queda na produção de novo colágeno
é mais evidente quando o dano à pele é clinicamente evidente.15
O presente estudo foi realizado para determinar o que
fatores contribuem para a perda da atividade sintética do colágeno
no envelhecimento cronológico. Com base nos resultados apresentados
aqui, sugerimos pelo menos dois mecanismos. Estudos in vitro indicam
que a redução da síntese de colágeno na pele velha
reflete, pelo menos em parte, uma redução relacionada à idade na
atividade de síntese de colágeno na população residente de fibroblastos.
Fibroblastos obtidos de pele protegida do sol de
adultos jovens (18 a 29 anos) sintetizaram um
média de 82 ng de procolágeno tipo I por 5.104 células,
enquanto células de indivíduos idosos (80 anos de idade)
sintetizado 56 ng por 5 condições 104 células sob idênticas em
in vitro . Aliado a isso está o fato de existirem
menos fibroblastos intersticiais na pele envelhecida em comparação com
pele jovem,15 contribuindo para a redução da capacidade de crescimento
(Figura 2). Assim, mesmo quando todos os fatores ambientais que
podem contribuir para que as diferenças in vivo sejam removidas, há
ainda uma diferença dependente da idade no colágeno-sintético
capacidade que explica pelo menos parte da redução previamente
documentada no conteúdo de colágeno da pele envelhecida.6
Se ocorrer uma diminuição na capacidade de síntese de colágeno
uma função do envelhecimento dos fibroblastos (celular), então qual o papel
faz uma redução na tensão mecânica jogar? Apesar disso
pode ser difícil estimar com precisão a porcentagem de
a diminuição geral na produção de colágeno (na pele velha
relativa à pele jovem) explicada pela diminuição da tensão mecânica, a
seguinte análise serve de base
para comparação. Nossos estudos anteriores15 indicam que o colágeno
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1866 Varani et al
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Figura 4. Forma dos fibroblastos na derme papilar da pele do quadril protegida do sol
de indivíduos jovens e idosos (secções coradas com azul de toluidina de 1 m de tecido
fixado com glutaraldeído e incorporado em plástico). Painel superior: As células da
pele jovem são achatadas e o citoplasma e o núcleo são visíveis (seta).
As células são incorporadas na matriz. As células da pele velha aparecem redondas,
e apenas o núcleo e uma pequena quantidade de citoplasma são visíveis (setas).
Painel inferior: As medições da área de superfície foram feitas quantitativamente
conforme descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam a área de
superfície transversal média SEM, com base em 160 células na pele protegida do sol
de seis indivíduos jovens e 57 células na pele protegida do sol de seis indivíduos
idosos. A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student (bicaudal). *P 0,01fato de que, embora a perda de tensão mecânica pareça ser o
240).
a produção na pele protegida do sol de indivíduos idosos (80
anos) é diminuída em aproximadamente 75% em relação à
produção na pele correspondente de adultos jovens (18 a 29
anos). Tanto o Western blotting de extratos de pele quanto a
imunocoloração para o procolágeno tipo I são consistentes a
esse respeito. Esses achados anteriores também são consistentes
com as medições diretas do procolágeno tipo I em pele jovem e
velha apresentadas aqui (ou seja, redução de 68% na pele velha
versus pele jovem; Figura 1). Se o número de fibroblastos na
pele de indivíduos de 80 anos for reduzido em aproximadamente
35% em relação ao número na pele de indivíduos de 18 a 29
anos, conforme indicado pela análise morfométrica15 e se a
síntese de procolágeno tipo I for reduzida em uma média de 30%
em fibroblastos de pele velha como
Figura 5. Aparência ultraestrutural de fibroblastos dérmicos em pele saudável do
quadril protegida do sol de indivíduos jovens e idosos. A e B: A célula da seção de
pele jovem (A) é achatada e bem espalhada. A célula está em contato com as fibras
de colágeno em uma alta porcentagem de sua superfície. A célula na amostra de pele
antiga (B) é redonda e está em contato com o polímero de colágeno em uma porção
menor de sua superfície. Há mais espaço aberto ao redor da célula.
(A coloração das células gerada por computador foi feita para auxiliar na demarcação
das células do material extracelular [ampliação 2050]). C: Uma grande ampliação
(3500) da pele velha mostrando as estrias nas fibras (típicas do colágeno). D:
Quantificação do contato entre células e fibras colágenas. Os valores representam a
porcentagem do limite celular em contato com as fibras de colágeno SEM (P 0,01;
teste t de Student bicaudal). As medições são baseadas em 33 células em cortes de
pele saudável de seis indivíduos jovens e 38 células em cortes de seis indivíduos
idosos.
indicado na Figura 2 do presente estudo, então é razoável sugerir
que as diferenças dependentes da idade na atividade biossintética
dos fibroblastos são responsáveis por aproximadamente 45% da
diminuição total. Outros fatores (incluindo a perda de tensão
mecânica) são responsáveis pelos 30% restantes. Essa
separação é mostrada esquematicamente na Figura 7. Como a
precisão final da divisão 45%/30% é menos importante do que o
(ampliação,
principal fator subjacente à diminuição da síntese de colágeno na
pele fotodanificada,18 em pele cronologicamente envelhecida, é
um dos dois mecanismos contribuintes.
De interesse, as alterações dependentes da idade na
atividade biossintética dos fibroblastos e a redução da tensão
mecânica externa nas células da derme da pele envelhecida
podem não ser independentes. A mesma redução na tensão
mecânica que diminui a produção de colágeno pelos fibroblastos
residentes também pode contribuir indiretamente para alterações
permanentes na função dos fibroblastos. É geralmente aceito
que as alterações fenotípicas observadas em fibroblastos
envelhecidos são amplamente mediadas por danos radicais de
oxigênio.35 Isso está potencialmente relacionado ao problema
em questão, porque entre as alterações que ocorrem sob
condições de tensão mecânica reduzida está o aumento do estresse oxidativo co
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Colágeno na Pele Envelhecida 1867

AJP Junho de 2006, Vol. 168, Nº 6

Figura 6. Expressão de proteína no local de adesão em seções de pele saudável do quadril

protegida do sol de indivíduos jovens e idosos. As seções de tecido (congeladas em OCT
incorporadas) foram coradas usando anticorpo para vinculina e concomitantemente com
faloidina (coloração de actina) e DAPI (coloração nuclear) conforme descrito em
Figura 7. Representação esquemática dos mecanismos subjacentes à síntese reduzida de
Materiais e métodos. Após a coloração, as células foram examinadas por
colágeno na pele envelhecida.
Microscópio Fluorescente. As células são identificadas por sua coloração azul (DAPI)
núcleos. A fluorescência pontuada verde-clara identifica a vinculina. Nos dias 18 a
Amostras de pele de 29 anos, a vinculina pode ser vista à distância do núcleo,
e em muitas áreas, a vinculina parece estar em estreita aposição ao colágeno
fibras. Na pele de 80 anos, os núcleos manchados de azul são aparentes, mas há
é menos vinculina do que nas amostras de pele jovem. Onde a coloração focal intensa
é evidente, está circundando o núcleo (setas). Longe do núcleo,
Em resumo, a capacidade de síntese de colágeno é baixa em idosos
a coloração é mais difusa do que a observada nas células da pele jovem. As seções (protegida do sol) em relação à pele jovem e saudável protegida do
apresentados são representativos de peles jovens e idosas protegidas do sol de seis
sol. Com base nas descobertas aqui apresentadas
indivíduos, respectivamente. Tanto na pele jovem quanto na velha, as fibras de colágeno são
aparente por sua fluorescência laranja opaca (ampliação, 1200). e por analogia com modelos in vitro e as descobertas de
estudos de fotoenvelhecimento, hipotetizamos que fibroblastos antigos
têm uma redução dependente da idade na capacidade de
síntese de colágeno e simultaneamente experimentam uma perda
aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e alterações de estimulação mecânica resultante da diminuição
expressão de enzimas antioxidantes (GJ Fisher, observações não fibras de colágeno.
publicadas). Pode-se inferir disso que
dano ambiental precede causalmente as mudanças na
função dos fibroblastos que são observados no estado envelhecido ou
se nescente.
Agradecimentos
A diminuição relacionada à idade na atividade sintética do colágeno
pode ser, pelo menos em parte, reversível. Foi demonstrado que Agradecemos a Suzan Rehbine pela ajuda no recrutamento de
agentes como o ácido all-trans retinóico podem voluntários, Robin Kunkel e Lisa Riggs pela ajuda com
estimular a produção de colágeno na pele envelhecida.16,36 –38 Não microscopia eletrônica, Ted Hamilton pela ajuda com análise estatística,
surpreendentemente, o uso de retinóides tópicos melhora a aparência Bruce Donohoe pela ajuda com fluorescência
da pele envelhecida39 e da pele fotoenvelhecida.40 microscopia e Laura Vangoor pela ajuda na preparação de materiais
gráficos.
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1868 Varani et al
AJP Junho de 2006, Vol. 168, nº. 6
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