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DOI: 10.1111/j.1468-3083.2011.04223.x JEADV

BREVE RELATÓRIO

A exposição repetida de fibroblastos humanos à RUV induz a

secreção do fator de células-tronco e a senescência
J. Shin,†,1 J.-H. Kim,‡,1 EK Kim‡, *
†
Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Inha, e ‡ Departamento de Engenharia Biológica, Universidade de Inha,
Incheon, Coreia do Sul
*Correspondência: EK Kim. E-mail: ekkim@inha.ac.kr

Resumo
Contexto Algumas das doenças hiperpigmentárias crônicas, como o melasma, induzidas por múltiplos fatores, incluindo a exposição solar crônica,
podem recorrer mesmo após a remoção química da epiderme. Fatores dérmicos podem estar envolvidos na patogênese do melasma. Alterações nos
fibroblastos dérmicos decorrentes da exposição crônica ao sol podem levar os melanócitos a sintetizar melanina na epiderme.

Objetivo Este estudo teve como objetivo determinar os efeitos da radiação ultravioleta (UV) repetitiva em fibroblastos cultivados e na secreção de
fatores melanogênicos.
Métodos Fibroblastos humanos cultivados foram expostos ao ultravioleta A (UVA) ou ao ultravioleta B (UVB) por cinco dias consecutivos. Após cada
irradiação, o meio sobrenadante foi isolado de cada placa e medido quanto aos níveis de fator de células-tronco (SCF) e fator de crescimento de
hepatócitos usando um kit de ensaio ELISA. Para avaliar o efeito dos fatores derivados de queratinócitos na secreção de fibroblastos de SCF e fator
de crescimento de hepatócitos, adicionamos sobrenadantes dos queratinócitos irradiados com UV aos fibroblastos não irradiados. Finalmente, os
fibroblastos irradiados foram corados com b-galactosidase associada à senescência para avaliar sua alteração senescente.

Resultados Fibroblastos irradiados com UVA ou UVB por cinco dias consecutivos secretaram SCF em níveis que aumentaram com exposição
repetida a UVA ou UVB. O meio de cultura condicionado de queratinócitos irradiados com UV também induziu a liberação de SCF de fibroblastos,
dependendo do número de exposições aos raios UV. Fibroblastos irradiados com UVA ou UVB apresentaram coloração positiva para b-galactosidase
associada à senescência, e a intensidade da coloração aumentou com a exposição repetida.
Conclusão Esses resultados sugerem que a senescência dos fibroblastos e o aumento da secreção de SCF após irradiação UV repetida podem estar
relacionados à patogênese de distúrbios de hiperpigmentação recorrentes induzidos pelo sol crônico
exposição.
Recebido: 29 de março de 2011; Aceito: 25 de agosto de 2011

Conflito de interesses
Sem conflito de interesse.

Introdução A fator de crescimento (HGF) e fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF).

pigmentação da pele depende em grande parte dos melanócitos, que estão
funcionalmente associados tanto aos queratinócitos quanto aos fibroblastos.
Essas células se comunicam intimamente e afetam as funções umas das
outras.1–3 Várias citocinas, como hormônio estimulante de alfa-melanócito (a-
MSH), fator de células-tronco (SCF) e endotelina-1 (ET-1) foram sugeridas como
sendo derivado de queratinócitos e para regular a proliferação e ÿ ou diferenciação
de melanócitos por meio de vias de sinalização mediadas por receptores.4 A
regulação mediada por queratinócitos da função de melanócitos é bem
conhecida, e os fibroblastos humanos também secretam várias citocinas
melanogênicas,5 incluindo SCF , fator de crescimento de queratinócitos (KGF),
hepatócito
1
Esses autores contribuíram igualmente para essa perspectiva.
Isso sugere que a superexpressão dessas citocinas pelos fibroblastos dérmicos
pode influenciar os melanócitos na epiderme sobrejacente.
Existem alguns exemplos clínicos que suportam tal influência dérmica na
pigmentação epidérmica sobrejacente; tal exemplo é a pele hiperpigmentada da
esclerodermia. Os fibroblastos na esclerodermia produzem abruptamente
colágeno e SCF. O aumento da expressão do SCF aumenta a hiperpigmentação
da pele.6 O melasma, caracterizado por manchas e máculas simétricas
acastanhadas bilaterais em áreas expostas ao sol, é recorrente no mesmo local,
mesmo que a epiderme, onde residem os melanócitos, seja removida por
peelings químicos ou tratamento a laser .7 Embora sua patogênese precisa seja
desconhecida, vários fatores, incluindo influências genéticas, hormônios e

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Shin et ai.
2

danos crônicos à luz solar foram propostos como causadores de melasma.8–
10 Portanto, levantamos a hipótese de que fatores dérmicos podem
influenciar a pigmentação epidérmica, e a exposição crônica à luz solar pode
induzir os fatores dérmicos.
Estudos recentes demonstraram que os fibroblastos dérmicos em
condições fisiológicas inibem a pigmentação de melanócitos por Dickkopf 1
na pele palm plantar,11 ou aumentam a pigmentação por neuregulina-1 em
pele escura.12 O exsudato de fibroblastos e o próprio tecido conjuntivo
dérmico celular influenciam significativamente a proliferação de melanócitos
e distribuição ÿ degradação da melanina.13 No entanto, não se sabe como
a exposição repetitiva à luz ultravioleta (UV) produz alterações nas secreções
dos fibroblastos relacionadas à pigmentação epidérmica.
Resultados
Os níveis de SCF secretados pelos fibroblastos irradiados com UV
aumentaram com o número de exposições aos raios UV (Fig. 1). Embora a
irradiação UVA e UVB tenha aumentado a liberação de SCF, o UVB foi mais
eficaz. O nível de SCF secretado após UVB aumentou significativamente do
primeiro ao quinto dia de irradiação e, por fim, atingiu 550% do controle, e
após a irradiação UVA, o nível aumentou significativamente do terceiro dia
até 300% do controle ( Fig. 1b). Em contraste, os níveis de HGF secretados
não parecem ser afetados pela irradiação UV (dados não mostrados). Esses
dados sugerem que os fibroblastos podem secretar SCF em resposta à
radiação UV. A UVB mostrou-se mais eficaz que a UVA, embora saibamos
que a UVB não consegue atingir os fibroblastos em condições fisiológicas.

Investigamos o efeito da irradiação UV repetitiva na secreção de SCF e

HGF por fibroblastos, os conhecidos fatores derivados de fibroblastos que
induzem a melanogênese. Também exploramos a via indireta induzida por
ultravioleta A (UVA) em queratinócitos-fibroblastos, porque o ultravioleta B (a) 0,08
(UVB) afetou mais os queratinócitos do que os fibroblastos dérmicos. Em UVA
seguida, avaliamos o efeito de queratinócitos irradiados com UVA na UVB
**
0,06
liberação de SCF e HGF por fibroblastos. Também avaliamos a senescência
**
de fibroblastos após irradiação UV repetitiva para explicar o dano celular
**
permanente que pode causar a tendência de hiperpigmentação da pele fibroblastos
SCF
mL)
(pg/
de

0,04
fotoenvelhecida. **

Materiais e métodos 0,02

* **
Células CCD-986sk (linha celular de fibroblastos humanos; Korean Cell Line
*
Bank, Seul, Coreia) cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco
(DMEM) fresco sem soro foram irradiadas diariamente durante 5 dias. 0,00
O sobrenadante da cultura foi amostrado a cada 24 horas após irradiação 012345
UVA ou UVB, e os níveis de SCF e HGF foram determinados usando kits Número de tratamentos UV para fibroblastos

ELISA (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA). Para testar se os fatores
(b) 600
derivados de queratinócitos poderiam afetar a produção de citocinas em
UVA
**
fibroblastos, queratinócitos (células HaCaT) foram repetidamente expostos
UVB
500 **
a UVA ou UVB, e meio de cultura condicionado foi adicionado a fibroblastos
não irradiados. O sobrenadante cinco vezes concentrado foi adicionado a **
400
culturas de células CCD-986sk e os níveis de citocinas secretadas foram **
medidos 24 h depois usando sanduíche ELISA. Finalmente, os fibroblastos 300
**
fibroblastos
controle)
SCF
(%
de
de

irradiados foram corados com b-galactosidase associada à senescência (SA- **

b-gal) para avaliar sua alteração senescente. A intensidade e proporção de 200 * *

coloração positiva foram analisadas usando Image J 1.43U (Nation Institutes
of Health, Bethesda, MD, EUA) para quantificação. 100

O meio de cultura foi substituído por PBS durante a exposição ao UV. A
irradiação UV foi administrada a partir de uma fonte 40 cm acima das células
usando lâmpadas UV (VLX-356, VLX-312, VL-6.LM) e um radiômetro UV
(VLX-3W; Vilber Lourmat, Marne La Valle, França) a 100 mJÿ cm2 e 20 mJÿ
cm2 para UVA (356 nm) e UVB (312 nm), respectivamente. Doses não
tóxicas de UV foram determinadas por experimentos repetitivos com várias
doses de UVB (5–30 mJÿ cm2 ) ou UVA (50–100 mJÿ cm2 ). Os dados são
apresentados como média ± desvio padrão. Os resultados foram analisados
estatisticamente por meio do teste t de Student.
0
012345
Número de tratamentos UV para fibroblastos
Figura 1 Células CCD-986sk cultivadas em DMEM fresco sem soro
foram irradiadas por ultravioleta A (UVA) ou ultravioleta B (UVB)
diariamente por cinco dias consecutivos. O sobrenadante da cultura foi
amostrado a cada 24 h após a irradiação, e os níveis de fator de células-
tronco (SCF) foram determinados usando kits ELISA. O aumento do SCF
foi observado em fibroblastos após irradiação repetitiva de UVA e UVB
(a). Os níveis de SCF são expressos em relação ao controle negativo,
não irradiado (b) (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01.

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Fibroblastos humanos liberam fator de células-tronco por UV 3

Tratamento de 24 horas de KCM irradiado por UVA

0,4 Tratamento de 24 horas de KCM irradiado por UVB

0,35

0,3

0,25

fibroblastos
SCF
mL)
(pg/
de
0,2

0,15

0,1

0,05

0
012345
Número de tratamentos UV
para queranócitos
Figura 2 Queratinócitos (células HaCaT) foram repetidamente expostos
ao ultravioleta A (UVA) ou ultravioleta B (UVB) por cinco dias consecutivos,
e o meio de cultura condicionado foi adicionado a fibroblastos não
irradiados. O sobrenadante cinco vezes concentrado foi adicionado a
culturas de células CCD-986sk, e os níveis de citocinas secretadas
foram medidos 24 h depois usando sanduíche ELISA. Os controles
consistiram no grupo tratado com meio de cultura de queratinócitos não
irradiado (KCM). O fator de células-tronco (SCF) secretado por
fibroblastos aumentou após a adição do meio de cultura de
queratinócitos irradiados com UVA ou UVB (n = 2).
O sobrenadante da cultura dos queratinócitos irradiados induziu os
fibroblastos a secretar SCF, que aumentou com o número de exposições
UVA ou UVB aos queratinócitos (Fig. 2). A quantidade de SCF secretada
pelos fibroblastos aumentou mais quando eles foram tratados com meios
de queratinócitos irradiados com UV do que quando foram irradiados
diretamente. O meio condicionado irradiado com UVA foi o mais eficaz na
indução da secreção de SCF pelos fibroblastos. No entanto, o meio de
cultura de queratinócitos irradiado com UV não afetou significativamente
os níveis de HGF secretado por fibroblastos (dados não mostrados). Esses
dados sugerem que fatores solúveis derivados de queratinócitos
estimulados por UV induzem fibroblastos a liberar SCF mais do que
O próprio UV e a exposição repetida ao UVA mostraram-se mais eficazes
do que o UVB.
A atividade da b-galactosidase associada à senescência dos fibroblastos
foi detectada pela coloração das células com solução de SA-b-gal. Embora
UVA e UVB tenham aumentado a atividade SA-b-gal de fibroblastos em
comparação com controles não irradiados, UVB produziu um aumento
mais rápido (Fig. 3). A atividade SA-b-gal aumentou drasticamente com o
aumento do número de exposições.
Discussão
Histopatologicamente, a pele cronicamente danificada pelo sol mostra
materiais elásticos degenerados na derme chamados elastose solar.14
Fibroblastos dérmicos são reguladores essenciais para a síntese e
degradação de elastina e colágeno na matriz extracelular. Portanto, as
alterações apresentadas na pele cronicamente danificada pelo sol podem
estar relacionadas à função anormal dos fibroblastos. Clinicamente, a pele
cronicamente danificada pelo sol apresenta-se como rugas grossas e hiperpigmentação
Figura 3 Coloração de b-galactosidase associada à senescência de
fibroblastos sem (controle) ou após irradiação ultravioleta (UV) por 1, 3
ou 5 dias. Os dados de análise de imagem são mostrados como valores
relativos em comparação com o controle do dia 1 (1*) e apresentados
entre parênteses.
pontos. Existem muitos estudos sobre a relação entre UVR e fibroblastos
induzindo rugas, mas apenas alguns estudaram os efeitos de UVR e
fibroblastos na pigmentação.15 Uma única dose baixa de UVB (20 mJ)
aumentou a secreção de bFGF e ET-1 de queratinócitos e bFGF, HGF e
fator de crescimento transformante-b1 de fibroblastos, enquanto a secreção
de SCF não foi avaliada.16 Um estudo recente mostrou que a pele do
melasma lesional tinha elastose solar mais proeminente17 e SCF dérmico
superexpresso e seu receptor c-kit em comparação com pele normal
perilesional.18 Neste estudo, demonstramos que a irradiação UV induziu
fibroblastos a secretar SCF diretamente, e o efeito aumentou com UVR
repetida. A UVR também estimulou indiretamente o fibroblasto via
queratinócitos. A UVR estimulou os queratinócitos a secretar fatores
solúveis que estimulam a liberação de SCF dos fibroblastos. Sob condições
fisiológicas, os fibroblastos devem estar sob a influência de UVA em vez
de UVB. A UVA induziu diretamente os fibroblastos a liberar SCF, mas o
efeito foi menor do que o mostrado com a UVB. No entanto, a via indireta
via queratinócitos mostrou-se mais eficaz do que a via direta. Novos
estudos com um modelo de pele artificial ou um sistema de co-cultura com
fibroblastos e melanócitos irradiados podem esclarecer a relevância da
melanogênese induzida por fibroblastos irradiados.
É incerto se os fibroblastos fotoenvelhecidos secretam mais fatores
melanogênicos; no entanto, um grupo japonês relatou que os fibroblastos
da pele humana envelhecida liberaram mais HGF e SCF para estimular
os melanócitos do que aqueles da pele humana mais jovem . mas não
HGF. Embora o mecanismo de secreção do SCF pelos fibroblastos seja
desconhecido, pode ser uma resposta fisiológica; a atividade melanogênica
atua como sensor molecular e transdutor de sinais nocivos e como
regulador da homeostase local.3 Também pode representar o processo
de cicatrização de feridas, pois o SCF é necessário para

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4 Shin et ai.
sobrevivência e proliferação de vários tipos celulares.19 Mais estudos são
necessários para resolver essa questão.
Em conclusão, a UVR repetitiva estimula os fibroblastos a secretar SCF
direta e indiretamente (através dos queratinócitos). Essa secreção aumentada
de SCF está provavelmente associada à senescência dos fibroblastos
causada pela RUV. O SCF é um fator estimulador e de crescimento de
melanócitos bem conhecido. A senescência de fibroblastos e o aumento da
secreção de SCF podem estar relacionados à patogênese de lesões
hiperpigmentadas na pele cronicamente danificada pelo sol.
Agradecimentos Este estudo
foi financiado por uma doação do Projeto de P&D de tecnologia de saúde da
Coréia, Ministério da Saúde e Bem-Estar, República da Coréia (A103017) e,
em parte, pela Universidade de Inha.
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