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Q 2007 pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular EDUCAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Vol. 35, nº 2, pp. 138–144, 2007

Exercícios de Laboratório

Determinação por HPLC de cafeína e paraxantina na urina

UM ENSAIO PARA ATIVIDADES DO CITOCROMO P450 1A2hS

Recebido para publicação em 8 de setembro de 2006 e revisado em 23 de outubro de 2006

Laura Lowe Furge‡ e Kyle J. Fletke

Do Departamento de Química, Kalamazoo College, Kalamazoo, Michigan 49006-3295

As enzimas do citocromo P450 são uma família de proteínas contendo heme localizadas em todo o corpo com
papéis no metabolismo de compostos endógenos e exógenos. Entre os compostos exógenos, os agentes farmacêuticos clinicamente
relevantes são quase todos metabolizados pelas enzimas P450. No entanto, a atividade
das diferentes enzimas do citocromo P450 varia entre os indivíduos e, portanto, a eficácia do medicamento também
bem como suscetibilidade a efeitos colaterais e toxicidade. Assim, avaliar a atividade do P450 é de grande interesse em
desenvolvimento de medicamentos e farmacologia clínica. Este estudo investiga a fenotipagem de um único P450
atividade analisando amostras de urina usando HPLC isocrática de fase reversa. Especificamente, a atividade de
O P450 1A2 humano, que converte cafeína em paraxantina, pode ser investigado medindo a
mudança nas concentrações de cafeína e paraxantina na urina ao longo do tempo após uma dose única de cafeína. Existe uma relação
observável entre a ingestão de cafeína e a formação de paraxantina que varia
entre indivíduos. Este exercício de laboratório fornece um meio para avaliação simples da atividade metabólica do P450 1A2 usando um
método de HPLC sem etapas adicionais de extração ou purificação e apresenta
alunos às complexidades da medicina individualizada, bem como às técnicas bioquímicas básicas de
preparação de amostras e HPLC quantitativa. Além disso, os alunos podem projetar e testar suas próprias hipóteses usando esses
métodos.

Palavras-chave: Enzima do citocromo P450, metabolismo de drogas, cafeína, P450 1A2, HPLC, farmacocinética.

As enzimas do citocromo P450 são monooxigenases contendo
heme, responsáveis pelo metabolismo de muitos
compostos sintetizados endogenamente, como colesterol, hormônios
esteróides e ácidos graxos. Xenobióticos
como produtos farmacêuticos, aditivos alimentares e agentes
cancerígenos também são substratos conhecidos para a família P450 de
enzimas [1, 2]. Nomeado por sua absorção característica de luz a 450
nm quando reduzida na presença de
monóxido de carbono, P450s consistem em uma família de 57
membros em humanos e estão presentes em organismos desde
bactérias até o homem [2]. A reação básica catalisada por P450s
é uma reação de monooxigenação ou oxidase de função mista
ção, migração de grupo, oxidação de olefinas e acetilenos,
e reações de inativação do heme e muitas outras reações atípicas
reações. Uma introdução às enzimas P450 no contexto do metabolismo
moderno foi recentemente apresentada em
esta revista [2]. O foco deste artigo é apresentar
instrutores e alunos para uma investigação experimental
do metabolismo P450 em humanos, especificamente metabolismo
de cafeína por P450 1A2.
P450 1A2 está presente principalmente no fígado, mas é induzível
no intestino, pele, linfócitos, placenta, pulmão,
trato gastrointestinal, pâncreas e cérebro [3, 4]. Além do mais
cafeína, P450 1A2 está envolvido no metabolismo de vários

NADðPÞH þ Hþ þ O2 þ RH ! NADPþ + H2O + ROH
onde os elétrons são fornecidos do NAD(P)H para o heme
ferro do P450 pela P450-NADPH redutase. No básico
reação, um átomo de oxigênio é adicionado ao substrato
e o outro reduzido a água. No entanto, por causa
reações de rearranjo, as hidroxilações não são as únicas
reações observadas. Os produtos também se formam a partir de
desalquilação, epoxidação, oxigenação de heteroátomos e desalquilação.
hS A versão on-line deste artigo (disponível em http://
www.bambed.org) contém detalhes adicionais sobre o
materiais suplementares.
‡ Para quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail:
lfurge@kzoo.edu.
medicamentos farmacêuticos, bem como de carcinógenos ambientais.
Substratos farmacêuticos para P450 1A2 incluem
paracetamol, estradiol, teofilina, varfarina, imipramina, olanzapina e
outros. P450 1A2 também é responsável pela ativação eletrofílica de
aminas aromáticas e heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos
[5, 6]. Aminas heterocíclicas, produzidas durante o cozimento
de carne vermelha, por exemplo, são metabolizados por P450 1A2
a metabólitos eletrofílicos que demonstraram
causar mutações no DNA e câncer [7, 8]. Hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos, também presentes em altas concentrações
em carnes grelhadas na brasa e também na fumaça do tabaco, sirva
tanto como substratos quanto indutores da atividade P450 1A2
[9]. Assim, indivíduos com dietas ricas em carne grelhada
e/ou os fumantes demonstraram ter aumentado
Atividade do P450 1A2 [9–15].

DOI 10.1002/bambed.28 138 Este artigo está disponível on-line em http://www.bambed.org

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FIGO. 1. 3-Desmetilação da cafeína (1,3,7-trimetilxantina) para formar paraxantina (1,7-dimetilxantina) por P450 1A2.
Vários fatores ambientais foram identificados como
indutores ou inibidores de P450 1A2. Esses incluem
fatores dietéticos e nutricionais, alterações hormonais no
corpo, ingestão de agentes medicinais e exposição a
fatores ambientais [7]. A dieta é um fator ambiental
isso influencia muito a atividade do P450 1A2. Além das carnes
grelhadas mencionadas anteriormente, crucíferas
vegetais (incluindo brócolis e couve-flor) têm um
induzindo efeito na atividade metabólica de P450 1A2 [16,
17]. Legumes apiáceos (endro, aipo, salsa,
pastinaga, cenoura) têm um efeito inibitório, enquanto os vegetais
allium (alho, cebola, cebolinha, alho-poró e cebolinha) têm
nenhum efeito na atividade do P450 1A2 quando comparado com um
dieta de controle sem vegetais [18]. Contraceptivos orais
e a terapia de reposição hormonal com estrogênio também
foram identificados como inibidores da atividade metabólica de
P450 1A2 [11, 15, 19]. Indivíduos que estão expostos a
indutores ou inibidores enzimáticos no local de trabalho, como
anestesiologistas expostos a produtos químicos anestésicos no
sala de cirurgia, frentistas de postos de gasolina expostos a
altos níveis de petróleo e trabalhadores em estufas
expostos a pesticidas, também podem apresentar P450 alterado
Atividade metabólica 1A2 [20–23]. Além desses fatores ambientais, a
idade e o gênero também demonstraram
afetam a atividade metabólica do P450 1A2 em crianças com
maior atividade do que os adultos, e homens com maior atividade
do que as mulheres, embora esta última observação seja contestada
[11, 14, 15, 18, 19].
Além dos fatores ambientais, existem alguns
conexões com a influência genética no metabolismo P450 1A2
atividade. Mais de 85 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)
no locus do gene P450 1A2 foram identificados [4]. Esforços
associar esses genótipos ao metabolismo P4501A2
fenótipos estão em andamento. No entanto, a previsão de
fenótipo metabólico baseado no genótipo com P450 1A2
provou ser um desafio e é uma área de pesquisa
que gera polêmica contínua. Vários estudos
mostraram que o genótipo para P450 1A2 não aparece
para resultar em uma variação ou fenótipo interindividual específico
da atividade metabólica do P450 1A2 [4, 12, 24]. No final, as diferenças
interindividuais na atividade fenotípica do P450 1A2 ainda
permanecem de grande interesse devido à conexão com
metabolismo de drogas e metabolismo carcinogênico. De fato,
compreensão das diferenças interindividuais na farmacocinética (o
estudo da biodisponibilidade de uma substância,
principalmente medicamentos terapêuticos, resultantes de sua depuração por
metabolismo) tem feito parte de um movimento recente no
direção do tratamento medicamentoso personalizado [25]. O objetivo de
esse movimento é fornecer medicamentos aos indivíduos
que relacionam seu fenótipo (ou genótipo quando correlacionado)
à farmacocinética de medicamentos individuais [26].
139
A relação entre o exercício laboratorial aqui apresentado e estes
temas cada vez mais importantes na
medicina e farmacologia devem gerar resultados significativos
interesse do aluno em completar um exercício de laboratório como
aquele descrito aqui. Estas experiências também irão
permitir um alto nível de exploração independente do aluno
e apresentar alunos de graduação de nível médio a superior
à complexidade da medicina individualizada e às bases bioquímicas
para o estudo da farmacocinética. Enquanto o
execução dos experimentos aqui descritos é simples, é a análise e
interpretação dos dados que irá
apresentar aos alunos a oportunidade de explorar métodos científicos
básicos, metabolismo de drogas e questões éticas em
maior detalhe. Ao adicionar uma camada adicional de análise,
estudantes com interesse em bioquímica e análise
a química pode relacionar o metabolismo da cafeína ao metabolismo
de drogas e à farmacocinética no experimento descrito.
Esta experiência também se enquadra bem nas discussões sobre
metabolismo e ênfase em técnicas altamente recomendadas pelas
sociedades profissionais de bioquímica e
currículos de biologia molecular, nomeadamente cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC)1 [27]. Discussão de HPLC como
uma ferramenta poderosa e quantitativa de separação analítica em
bioquímica seria relevante.
O objetivo experimental deste exercício de laboratório
é determinar a atividade fenotípica do P450 1A2 de um indivíduo por
meio da análise HPLC de cafeína e um teste primário
metabólito presente na urina. A cafeína é um alcalóide vegetal não
polar de ocorrência natural. Foi identificado como um
sonda apropriada para medir a atividade de P450 1A2
devido à sua rápida e completa absorção em todo o corpo
a água corporal total, sua baixa ligação às proteínas plasmáticas, sua
biotransformação completa no fígado e excreção renal insignificante
[2, 19, 28, 29]. Na verdade, muitos produtos farmacêuticos foram
analisados para fenotipagem específica de medicamentos de
P450 1A2 junto com cafeína [30]. A cafeína é 3-desmetilada pelo P450
1A2 no fígado para formar paraxantina e
formaldeído (Fig. 1) e o mecanismo para esta reação é bem
compreendido [1]. Nesta experiência laboratorial,
tanto a cafeína quanto a paraxantina presentes na urina são
determinado e usado para estimar a atividade metabólica
de P450 1A2 em diferentes indivíduos [14, 31].
O exercício laboratorial aqui apresentado combina competências
de muitas disciplinas diferentes, tornando-se um apropriado
aula para estudantes de química, biologia ou bioquímica como
bem como programas de pré-medicina ou farmácia. O estudante
Os objetivos de aprendizagem para esta experiência de laboratório incluem:
introdução à família P450 de enzimas e metabolismos
1 As abreviaturas utilizadas são: HPLC, líquido de alto desempenho
cromatografia; P450, enzima do citocromo P450.
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lista de xenobióticos; HPLC como separação bioquímica
ferramenta relacionada a outras formas de cromatografia comum
em laboratório de bioquímica; ambiental e genético
fatores que levam à indução/inibição de um importante
enzima (P450 1A2) envolvida no metabolismo (há uma
vasta literatura nesta área disponível para exploração estudantil); e o
crescente uso da farmacocinética no
diagnóstico clínico e áreas médicas. Este experimento
foi realizado com sucesso com vários alunos
grupos no Kalamazoo College com resposta positiva. A
uma coleção de reações dos alunos é fornecida nos Materiais
Suplementares disponíveis on-line para este artigo.
MÉTODOS EXPERIMENTAIS
O guia detalhado para configuração do laboratório está disponível como
Materiais Suplementares.
Suprimentos - Etanol, acetonitrila (grau HPLC), acetato de amônio, ácido acético
glacial, cafeína e paraxantina foram
obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Foi utilizada água de 18 mega-ohms,
filtrada por sistema de purificação Millipore. Todos
solventes e amostras foram filtrados usando um filtro de 0,45 mm antes
para usar com HPLC.
Equipamento necessário - sistema HPLC (capacidades isocráticas),
conjunto de micropipetas, filtros de 0,45 mm (tamanho de filtragem de 1 mL ou menor),
seringas descartáveis para filtragem de amostras, centrífuga refrigerada,
copos para coleta de urina, tubos de centrífuga descartáveis e medidor de pH ou
papel de pH.
Soluções Padrão - Soluções estoque de paraxantina e cafeína foram preparadas
dissolvendo 2,5 mg e 5,0 mg, respectivamente, de cada uma em 5,00 mL de água-
etanol (50:50, v/v). Diluição
de cada solução estoque em duplicata com solução de acetato de amônio 0,01 M
deu soluções padrão dentro da faixa de 0,5–10
mg/mL. As soluções padrão foram então filtradas usando um filtro de 0,45 mm
filtrar e armazenar a 48C.
Coleta de Amostra — Os participantes deste estudo foram recrutados
entre alunos e professores da faculdade seguindo protocolos aprovados pelo
Conselho de Revisão Institucional de Kalamazoo
Faculdade (modelo de Formulário de Consentimento está incluído no Suplemento
Materiais). Observe que os instrutores devem estar atentos para
obter a aprovação do Conselho de Revisão Institucional em sua instituição para
pesquisas com seres humanos, especialmente se voluntários de fora
da turma são recrutados para participar. As identidades de todos os voluntários
devem ser mantidas confidenciais e um sistema cego de numeração de participantes
deve ser usado.
Foi solicitado aos participantes que se abstivessem do consumo de
alimentos e bebidas com cafeína por um período de 16 horas. Em
além de produtos com cafeína, os participantes foram convidados a
abster-se dos seguintes produtos que podem alterar o P450 1A2
atividade: vegetais crucíferos (brócolis, couve-flor), carnes grelhadas no carvão,
alimentos defumados, agrião e vinho tinto. Após o consumo de dois 12 onças.
Bebidas Mountain Dew1
(total de 110 mg de cafeína), os participantes coletaram a urina em
no momento do consumo (t0) e às 3 e 6 horas após a ingestão de cafeína. As
amostras foram armazenadas a 4°C e preparadas como
descrito posteriormente, dentro de 24 horas após recebê-los. Embora não faça parte
do desenho do estudo, todos os participantes eram não fumantes.
Preparação da amostra – Cada amostra de urina foi ajustada para um
pH de 3,1 com agitação por adição de ácido acético glacial (pH papel pode ser
usado para verificação de acidificação). Para cada amostra,
5 mL foram removidos e centrifugados por 10 min a 3.800 rpm
e 4 8C. Aproximadamente 1 mL do sobrenadante foi então filtrado
BAMBED, vol. 35, nº 2, pp. 138–144, 2007
usando um filtro de 0,45 mm e armazenado a 4°C para análise por
HPLC. Alunos que podem se sentir desconfortáveis trabalhando com
a urina humana pode optar por usar urina sintética enriquecida com paraxantina e
cafeína (//www.dtitesting.com/).
Separação de Compostos - Separação por HPLC de fase reversa
foi realizado utilizando um Módulo de Separações Waters/Alliance 2690 em
conjunto com um detector de absorvência de comprimento de onda duplo Water
2487 (Waters Corp., Milford, MA). Uma Simetria das Águas
A coluna C18, 5 mm (3,9 150 mm2 ) foi utilizada para separação.
A fase móvel consistia em acetato de amônio 90:10
(0,01 M, 2,5% de ácido acético glacial)/solução de acetonitrila e teve
uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. A câmara de amostra do HPLC
o amostrador automático foi ajustado para 4 8C durante o tempo de execução.
A amostra e as injeções padrão foram de 20 mL. Cromatogramas
foram visualizados usando o software Waters Millennium 32 em um computador
Gateway E-3400.
Perigos—Devido ao uso de amostras de urina humana,
os instrutores devem discutir os possíveis perigos de trabalhar com um
fluido biológico. Uso de óculos de proteção, luvas e laboratório
revestimento e é necessário o uso de solução de água sanitária a 5% para limpar
todos os vidros e áreas de bancada afetadas. Embora o presente estudo
utilizou amostras de urina de voluntários do estudo, em ambiente de aula,
os alunos poderiam analisar suas próprias amostras.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste laboratório exercitamos a atividade fenotípica de
P450 1A2 em diferentes indivíduos foi determinado
usando um procedimento confiável e não invasivo. Cafeína e
soluções padrão de paraxantina foram analisadas conforme descrito
nos métodos experimentais. Um gráfico das áreas de pico integradas
versus as concentrações conhecidas de
paraxantina e cafeína produziram curvas de calibração que
foram utilizados no cálculo das concentrações urinárias de
cafeína e paraxantina (Fig. 2A e B). A calibração
as curvas eram cada uma linear com coeficientes de correlação>
0,99 em uma faixa de concentração de 0,5–10 mg/mL. O
tempos médios de retenção para paraxantina e cafeína
foram determinados em 2,5 min e 4,1 min, respectivamente.
Amostras de urina obtidas de dez participantes do estudo
foram analisados por HPLC de acordo com os procedimentos
descrito anteriormente. Cromatogramas inteiros e expandidos das
amostras de urina bruta identificaram múltiplos picos
nas regiões de eluição esperadas de paraxantina e cafeína. Perfis
representativos de eluição de HPLC são mostrados em
Fig. 3. Para confirmar a identidade do pico, cada amostra de urina foi
em seguida, enriquecido com cafeína e paraxantina (cromatógrafo
representativo na Fig. 3C). A paraxantina foi
detectado em todas as amostras de urina coletadas e variado em
concentração de 1,93 a 51,98 mg/mL (Tabela I). A cafeína foi detectada
em 23 das 30 amostras de urina coletadas e variou em concentração
de 0,70 a 77,17.
mg/mL (Tabela I). As concentrações de cafeína detectadas foram
normalmente menores que os da paraxantina e o limite mais baixo de
detecção de cafeína ou paraxantina na urina
amostras foi de 0,5 mg/mL.
A razão metabólica comparando a concentração de
a relação entre paraxantina e cafeína em cada amostra foi determinada
usando a relação MR = [paraxantina]/[cafeína], conforme descrito por
Kadulbar et al. [31] (Fig. 4). O
a faixa dos valores de RM encontrada foi de 0,34 e 26,34 (Tabela I)
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141

FIGO. 2. Curvas padrão. (A) Um ajuste linear dos padrões de cafeína produziu uma curva de calibração com equação: Área de Pico = 53869 mV*mL/mg*s
(concentração) + 440,96 mV/s. (B) Um ajuste linear dos dados produziu uma curva de calibração com equação: Área de Pico = 56582 mV*mL/mg*s (concentração)
+ 5903,1 mV/s.

e esses valores estão dentro das faixas descritas na literatura

por muitos grupos e com amostras muito maiores (valores de
MR entre 0,27 e 21,24 são comuns [30, 32, 33]).

A maior porcentagem de participantes do nosso estudo (4

de 10) foi determinada como tendo o maior valor para RM no
período de 3 horas, consistente com o rápido metabolismo
da cafeína pelo P450 1A2. Para amostras com concentrações
de cafeína abaixo dos níveis de detecção, nenhum valor de
MR foi calculado. Entretanto, espera-se que os valores de RM
para esses indivíduos sejam elevados. Devido ao pequeno
conjunto de amostras deste estudo, nenhuma conclusão
definitiva pôde ser tirada quanto ao efeito do sexo, raça,
idade, dieta ou número médio de bebidas com cafeína por
semana na atividade metabólica do P450 1A2. Além disso,
todos os participantes do estudo eram não fumantes,
impossibilitando qualquer análise de diferenças entre fumantes e não fumantes.
Vários participantes do estudo tiveram concentrações
detectáveis de cafeína na marca de 0 horas e um participante
do estudo teve a maior MR neste ponto, o que sugere não
conformidade com o procedimento experimental. Isso pode
ter sido o resultado de os participantes não seguirem o
protocolo pré-consumo, como consumir bebidas com cafeína,
fumar ou comer alimentos que afetam a atividade metabólica
do P450 1A2. Outra possível razão para esse fenômeno
poderia ser que esses indivíduos são metabolizadores lentos
do P450 1A2 e que 16 horas não foram tempo suficiente para
o metabolismo completo da cafeína, embora esperássemos
um pico de cafeína logo após o consumo de 110 mg de
cafeína. cafeína e não observamos nenhuma. Outra limitação
neste protocolo experimental é o volume de urina e os níveis
de diluição determinados pela quantidade de água consumida
pelos participantes do estudo, bem como pela altura e peso.
Esses fatores afetarão as concentrações de cafeína e
FIGO. 3. Cromatogramas de HPLC representativos de amostras de urina do
paraxantina presentes na amostra, levando assim a diferenças sujeito 15896. A posição esperada da paraxantina é indicada com (*) e da
na RM medida e há exemplos na literatura onde uma coleta cafeína com (8). (A) Um cromatograma completo de uma amostra de urina
muito mais rígida de amostras de urina que leva em conta o obtida no ponto de tempo de 3 horas. (B) Um cromatograma expandido (2–5
volume, bem como a altura e o peso do participante do estudo min) da região contendo paraxantina e cafeína. (C) Sobreposição do
cromatograma mostrado na parte B com um cromatograma expandido da
[32]. No entanto, descobrimos que nossos valores de RM
mesma amostra enriquecida com cafeína e paraxantina.
eram muito semelhantes aos valores da literatura e aos
métodos descritos
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142 BAMBED, vol. 35, nº 2, pp. 138–144, 2007

TABELA I

Razões metabólicas tabuladas para atividade P450 1A2

Concentração no
Assunto Relativo amostra (mg/mL) Metabólico
EU IA tempo razão
Cafeína Paraxantina

15247 (0) 0,08 77,12 26,42 0,34

15247 (3) 3,08 2,86 18,32 6,39
15247 (6) 6,02 3,65 30,88 8,47
19824 (0) 0,12 4,98 14,96 3.01
19824 (3) 2,98 2,38 7,62 3.20
19824 (6) 6,00 5,36 12,78 2,38
12478 (0) 0,50 3,23 51,98 16h10
12478 (3) 2,75 2,73 6,24 2.29
12478 (6) 6,75 7,06 20,54 2,91
0,50 nd* 4,43 –
18652 (0)
18652 (3) 3,00 2,40 1,93 0,81
18652 (6) 5,50 3,39 2,71 0,80
0,08 nd 9,31 –
15896 ( 0)
15896 (3) 2,83 1,46 5,42 3,73
FIGO. 4. Distribuição das proporções metabólicas da cafeína P450 1A2.
15896 (6) 5,38 2,55 12,09 4,75
– A proporção metabólica de cada amostra de urina em cada ponto de tempo
15764 (0) 0,16 nd 26,42
3,12 0,70 18,32 26.34
foi determinado usando a relação MR = [paraxantina]/
15764 (3)
30,88 – [cafeína].
15764 (6) n/D

14789 (0) 0,08 4,56 17,89 3,92

3,20 nd 23,22 –
14789 (3)
14789 (6) 5,98 8,91 21,81 2,45 período de 24 horas antes da ingestão de cafeína. A amostra analisada
19548 (0) 0,08 5,15 26 5.19 também poderia ser transformada em saliva com
3,08 nd 0,73 –
19548 (3)
investigação para a amostra de urina [35]. Os alunos também podem
19548 (6) 6,08 10,99 29,32 15h30
18962 (0) 0,02 nd 36,32 – gerar gráficos farmacocinéticos que relacionem o tempo com as diminuições
18962 (3) 3,80 2,17 4,97 1,94 na concentração de cafeína, coletando mais amostras de urina
18962 (6) 5,92 5,88 4,21 1,94
durante um período de tempo mais longo (24 horas, por exemplo). Conectar
12684 (0) 0,25 2,98 11,39 1,76
3,50 2,34 5,25 3.12
disciplinas de bioquímica e biologia molecular e técnicas analíticas, é
12684 (3)
12684 (6) 6,00 3,00 7,30 15,22 5.07 possível que os alunos possam correlacionar
resultados fenotípicos com os métodos aqui apresentados com
Todos os participantes do estudo eram não fumantes. nd: não detectado.
ensaios de genótipo seguindo comprimento de fragmento de restrição
protocolos de polimorfismo (RFLP) descritos em outras partes deste
aqui são quase idênticos aos usados na pesquisa a literatura para P450 1A2.
estudos do fenótipo P450 1A2 e metabolismo de drogas ou
associações de fenotipagem/genotipagem na literatura primária.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Finalmente, existem dois outros metabólitos menores de
cafeína, teobromina e teofilina, e ambos A tendência para a medicina individualizada exige
esses compostos, assim como a paraxantina, são convertidos conhecimento do perfil metabólico de um indivíduo. Para alguns
em outros metabólitos em reações secundárias. No entanto enzimas metabólicas, isto pode ser previsto pelo genótipo;
esses destinos alternativos da cafeína são, em média, menores, para outros, como P450 1A2, o genótipo não
a produção de outros metabólitos além da paraxantina permitir a previsão do fenótipo [4]. Dado o papel de
pode fazer com que os valores de MR variem [32]. Da mesma forma, enquanto o P450 P450 1A2 no metabolismo de vários medicamentos farmacêuticos
1A2 foi demonstrado extensivamente in vitro com fígado humano importantes e na ativação de carcinógenos químicos,
microssomas e em populações humanas como o principal há grande interesse em métodos para determinar o fenótipo P450 1A2
enzima envolvida no metabolismo da cafeína [13, 33, 34], de um indivíduo. Atividade de fenotipagem do P450 1A2 por estudantes
pode haver pequenas diferenças interindividuais adicionais como parte de um curso de bioquímica ou molecular
no metabolismo da cafeína que pode não ser contabilizado em currículo de biologia é uma oportunidade para os alunos
esta análise. No geral, a discussão das limitações de qualquer familiarizar-se com questões complexas do metabolismo moderno e da
procedimento experimental é útil na graduação medicina, bem como compreender e aplicar
educação de um aluno em todos os campos da ciência. técnicas laboratoriais bioquímicas padrão. Na verdade, os alunos que
Existem várias maneiras de adaptar o protocolo apresentado aqui. Os concluíram este laboratório comentaram
alunos podem optar por explorar mais especificamente sobre os benefícios de projetar seu próprio experimento,
efeitos de fatores ambientais na atividade metabólica preparar um relatório de laboratório no formato de artigo de jornal (as
de P450 1A2. Isto poderia ser conseguido ajustando informações relacionadas à preparação do relatório estão disponíveis
suas dietas ou hábitos de fumar em duas ou mais condições. como Materiais Suplementares), trabalhar com HPLC,
Por exemplo, os alunos poderiam ingerir brócolis antes do interessante seus principais amigos não-científicos na ciência e
ingestão de cafeína e investigar as diferenças metabolismo (muitos dos voluntários do estudo não eram graduados em
Atividade metabólica do P450. Alternativamente, um almoço incluindo uma ciências e eram amigos dos alunos que conduziam a análise) e
hambúrguer ou outras alternativas grelhadas no carvão podem ser exploraram
servido 1 hora antes do consumo de cafeína. Alunos tópicos além do metabolismo tradicional. Deveria ser
que são fumantes poderiam abster-se de fumar por um tempo enfatizado aos alunos antes do início dessas experiências
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observa que os resultados da RM para P450 1A2 não revelam
superioridade ou inferioridade de forma alguma e que todos os
indivíduos apresentam fenótipos enormemente diferentes para
vias metabólicas.
Conforme apresentado aqui, a análise experimental pode ser
concluída em uma aula de laboratório de 3 horas se cada
indivíduo analisar suas próprias amostras coletadas fora do
horário de aula. Se os alunos coletarem e analisarem um grupo
maior de amostras, duas aulas de laboratório de 3 horas deverão
ser reservadas para a conclusão do experimento.
Outros métodos de preparação de amostras exigiram uma etapa
de extração antes que a análise dos metabólitos da urina pudesse
ser realizada [19, 15, 36]. No entanto, descobrimos que a nossa
análise é satisfatória sem a extração conforme descrito aqui,
permitindo assim um compromisso de tempo laboratorial mais
curto e a compra de menos reagentes.
A extração com uma mistura de clorofórmio/isopropanol poderia
ser incluída se for desejado um maior foco nas técnicas analíticas.
Estudos anteriores também avaliaram a RM de
P450 1A2 analisando a paraxantina, bem como seus metabólitos
secundários, levando a um maior comprometimento de tempo de
análise de dados. O procedimento descrito aqui obteve resultados
semelhantes aos apresentados anteriormente e, portanto, é uma
análise confiável da proporção metabólica da cafeína, embora
não leve em conta os outros metabólitos menores da cafeína ou
metabólitos da paraxantina [11, 19, 30, 32].
Em resumo, os dados aqui apresentados demonstram que a
análise por HPLC de amostras de urina utilizando uma sonda de
cafeína é um método confiável para mapear a atividade
metabólica do P450 1A2. O exercício laboratorial e a análise de
dados aqui apresentados foram concluídos com sucesso por
vários grupos de estudantes da nossa instituição como parte de
um curso de tópicos avançados. Devido à vasta literatura nesta
área e à interessante controvérsia sobre fenótipo versus genótipo
para a atividade do P450 1A2, este exercício pode fornecer um
trampolim para discussões críticas da literatura primária e do
progresso na medicina individualizada.
Agradecimentos — Em memória de Sarah Klenow. Agradecemos
aos vários voluntários que participaram neste estudo, bem como
aos estudantes que ajudaram a elaborar as condições e análises
apresentadas neste laboratório, particularmente Sarah Klenow,
Emery Engers, Michael Mequio, Rachel Sherman, Jamie Chun e
Emilie Manz. Reconhecemos com gratidão o valioso suporte
técnico para manutenção de nossos sistemas HPLC fornecido pela
Waters Corporation.
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