Biossegurança, Técnicas de Coleta, Transporte

e Conservação

Conteudista: Prof.ª Dra. Giovana Massarotto

Revisão Textual: Maria Thereza Carvalho Rodriguez Guisande

Objetivo da Unidade:

Realizar a coleta de amostras de sangue total, de esfregaço do trato genital

feminino e de líquidos biológicos, de forma adequada, com aplicação de
métodos de biossegurança e com conservação das amostras durante o
transporte e o armazenamento.

ʪ Material Teórico

ʪ Aula Prática

ʪ Orientações para Leitura Obrigatória

ʪ Referências
1/4

ʪ Material Teórico

Biossegurança, Técnicas de Coleta, Transporte e

Conservação de Amostras de Sangue, Líquidos
Biológicos e Esfregaços do Trato Genital Feminino

Biossegurança em Serviços de Saúde

Os protocolos de biossegurança previnem os riscos inerentes às atividades laboratoriais
envolvendo materiais biológicos, portanto referem-se a ações e cuidados que garantem a
proteção dos pro ssionais, dos pacientes e do meio ambiente. Esses protocolos devem ser
seguidos para realização das atividades práticas que envolvem materiais biológicos.

A Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) determina os níveis de biossegurança para

estabelecimentos de acordo com a gravidades de danos que as atividades realizadas podem
ocasionar:

Nível de biossegurança 1: neste nível, não há o risco de contaminação com um

agente grave. A análise de material biológico não precisa ser realizada em uma sala
separada das demais atividades. O uso de EPIs e boas práticas de manuseio dos
equipamentos e materiais são indispensáveis para manter a segurança dos
pro ssionais envolvidos nas atividades;

Nível de biossegurança 2: neste nível, o risco é maior que no primeiro, mas ainda
está associado a um baixo grau de contaminação biológica. Antes que ocorra o
descarte, é necessária a esterilização de todo material biológico. O processo de
centrifugação somente pode ser realizado de maneira isolada e vedada. Além
disso, enquanto estão sendo analisadas as amostras, o acesso é restrito;
 Nível de biossegurança 3: neste nível, há manipulação de agentes biológicos que
podem provocar doenças graves em seres humanos e, por isso, a manipulação dos
agentes biológicos deve ocorrer por meio de cabines de biossegurança e roupas
adequadas;

Nível de biossegurança 4: é o nível mais alto de biossegurança e está associado à

manipulação de agentes que são altamente contagiosos e que podem levar à
morte. Como a contaminação ocorre por meio do ar, o local de manipulação deve
ser isolado e com acesso restrito. Além disso, todas as precauções adotadas nos
níveis anteriores devem ser seguidas para a manipulação dos agentes.

Uso de EPI´s
Os Equipamentos de Proteção Individual (EPI`s) devem ser utilizados de forma obrigatória nas
atividades laboratoriais. Isso inclui o uso de luvas descartáveis ou luvas especiais para frio e
calor, avental ou jaleco, touca, sapatos fechados, óculos e máscaras. Os sapatos e a proteção
dos sapatos devem ser considerados necessários em atividades realizadas em ambientes a
partir do Nível de Biossegurança 2 (NB II).

É importante destacar também o uso de sistemas de puri cação de ar ou cabines com ar

pressurizado para redução do risco de inalação de materiais infecciosos ou tóxicos. Ademais,
substâncias neurotóxicas e citotóxicas devem ser manipuladas com protetor respiratório e
ocular, além das luvas.

Uso de EPC`s
Os Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC`s) se destinam à proteção dos trabalhadores. Em
ambientes laboratoriais, por exemplo, encontramos: capelas de exaustão; capelas ou cabines
de uxo laminar; lavador de olhos e de face, portátil e xo; chuveiro de emergência, portátil
e xo; kits de tratamento para acidentes com químicos ácidos, cáusticos e solventes; sistema
de limpeza de sala a vácuo; contenedores de plástico duro com pedal de diversos tamanhos e
capacidades, para descarte de resíduos infectantes; contenedores de plástico duro com pedal
de diversos tamanhos e capacidades, para descarte de resíduos de risco; tapete de membrana
de polietileno limpadora de sapatos, de entrada de ambientes; termômetro; e medidor de
umidade de área.

Riscos em Ambiente Laboratorial

Existem cinco categorias de riscos de biossegurança em laboratórios:

Riscos físicos: fatores que causam danos físicos às pessoas ou ao ambiente. Os

principais exemplos são os ruídos, os gases, a exposição à radiação ou à variação
acentuada da temperatura, entre outros;

Riscos químicos: contaminação que pode ocorrer devido ao contato com

substâncias diversas, como os agentes químicos, que podem penetrar no
organismo através da pele, vias aéreas ou cortes;

Riscos biológicos: está associado à contaminação por vírus, bactérias ou outros

micro-organismos. Nesse sentido, deve ser avaliado o grau de propagação do
agente e seu poder de transmissão;

Riscos ergonômicos: está relacionado ao conforto proporcionado pelo ambiente

de trabalho, que inclui desde os móveis até a con guração dos equipamentos dos
pro ssionais, que podem gerar danos às articulações e à coluna dos
colaboradores, além de dores persistentes ao longo do dia e alterações
denominadas Lesões por Esforço Repetitivo (LER);

Riscos acidentais: são, de forma geral, todos os tipos de riscos aos quais os
pro ssionais estão expostos e que podem ser prevenidos com o uso de
equipamentos de segurança como EPI’s e EPC’s.

Limpeza, Desinfecção e Esterilização

As superfícies xas e todas as áreas onde são realizadas as atividades laboratoriais devem ser
limpas com água e agentes detergentes com o intuito de remover a sujeira e reduzir a
população microbiana nas áreas do estabelecimento.
Como agentes antissépticos, são recomendadas soluções alcoólicas, que têm a capacidade de
atuar contra os agentes biológicos por meio da desnaturação de proteínas, e soluções
contendo clorexidina, que geram a ruptura da parede celular.

Durante o processo de desinfecção, há destruição de micro-organismos mediante a aplicação

de agentes físicos ou químicos. Os processos físicos mais aplicados e descritos para a
desinfecção incluem:

Imersão em água em ebulição por no mínimo trinta minutos, associada a

processos como calor ou ação mecânica ou adição de detergentes;

Para superfícies xas, em ambientes de serviços de saúde, é indicado o uso de

álcoois, agentes fenólicos, iodo e derivados, liberadores de cloro ativo e
quaternários de amônio.

O processo de esterilização é empregado com intuito de destruir os micro-organismos vivos,

os esporos e as formas vegetativas através da aplicação de agentes físicos e químicos. Com
essa nalidade, são utilizadas as autoclaves, que esterilizam através do vapor saturado. Em
caso de artigos sensíveis à umidade, recomendamos o uso de calor seco, através de estufas.
Como agentes químicos para a esterilização, recomenda-se o uso de glutaraldeído e óxido de
etileno.

Coleta de Sangue
Para coleta de amostras de sangue, devem ser observadas as informações relacionadas à
requisição do material, à identi cação das amostras, à identi cação completa do paciente
(com nome completo, idade, sexo, endereço, telefones, número do registro, uso
medicamentoso, presença de anomalias preexistentes etc.) e ao médico solicitante.

É coletada uma amostra de sangue total na quantidade necessária para realização dos exames
solicitados. Dependendo do exame, é necessária a coleta em tubo com anticoagulante, como
para realização do hemograma, em que o anticoagulante de escolha é o EDTA (tubo tampa
roxa).
As amostras biológicas que apresentarem hemólise, lipemia e presença acentuada de
bilirrubina, deverão ser recoletadas, pois podem ser ine cientes nos processos e nos
resultados. Devem ser seguidos critérios de conservação e transporte das amostras para que
não haja alterações nos constituintes sanguíneos. Por m, o descarte das amostras deve
seguir os protocolos estabelecidos pelas Normas Brasileiras de Biossegurança.

Técnica de Coleta de Sangue

Veri car quais são os exames a serem realizados;

Lavar e secar as mãos;

Calçar luvas;

Posicionamento do braço: o braço do paciente deve ser posicionado em uma linha

reta do ombro ao punho, de maneira que as veias quem mais acessíveis e o
paciente o mais confortável possível;

Fazer antissepsia do local da punção: primeiro, do centro do local de perfuração

para fora, em sentido espiral; após, de baixo para cima, forçando uma
vascularização. Nunca tocar o local da punção após antissepsia, exceto com luvas
estéreis;

A coleta do sangue pode ser realizada com seringa ou com material de coleta à
vácuo;

Para coleta com seringa, deve-se conectar a agulha à seringa. A agulha deve estar
rme para assegurar que não solte durante o uso. Deve ser removida a capa da
agulha e a coleta deve ser realizada com bisel voltado para cima. Além disso, deve-
se realizar o garroteamento;

Garroteamento: o garrote é utilizado no início da coleta de sangue para facilitar a

localização das veias, tornando-as proeminentes. Portanto, deve ser colocado no
braço do paciente próximo ao local da punção. O garrote não deve ser deixado no
braço do paciente por mais de um minuto. Deve-se retirar ou afrouxar o garrote
 logo após a punção, pois o garroteamento prolongado pode acarretar alterações
nas análises;

Seleção da região de punção: as características individuais do paciente devem ser

avaliadas mediante exame visual e palpação das veias se necessário. O local de
escolha deve ser o braço ou a mão, onde encontram-se as veias de maior calibre;

Aspirar o sangue até o volume desejado;

Para coleta à vácuo, segure rme o sistema agulha-adaptador com uma das mãos
e, com a outra, pegue o tubo de coleta a ser utilizado, conectando-o ao adaptador.
Com o tubo de coleta dentro do adaptador, pressione-o com o polegar, até que a
tampa tenha sido penetrada. Assim, o sangue começará a uir para dentro do
tubo. Quando o tubo estiver cheio e o uxo sanguíneo cessar, remova-o do
adaptador, trocando-o pelo tubo seguinte. O tubo subsequente deverá ser acoplado
em ordem especí ca a cada um dos exames solicitados, sempre seguindo a
sequência correta de coleta.

Importante!
Escolher uma região de punção envolve algumas considerações, como:
não selecionar um local no braço do mesmo lado onde ocorreu
mastectomia; não selecionar um local no braço em que o paciente foi
submetido a uma infusão intravenosa; não selecionar um local com
hematoma, edema ou contusão; e não selecionar um local com
múltiplas punções.
Importante!
Hematomas podem ser gerados no paciente quando o procedimento de
coleta não é realizado de forma adequada, geralmente quando a veia é
perfurada e o sangue extravasa.

Ordem de Coleta dos Tubos

A ordem de coleta recomendada, segundo a CLSI (Clinical Laboratory Standard International), é a
seguinte:

1º Tubo para hemocultura (quando houver);

2º Tubo sem aditivo (soro);

3º Tubo com citrato (coagulação);

4º Tubo com heparina (para plasma);

5º Tubo com EDTA-K3 (hematologia);

6º Tubo com uoreto de sódio (glicemia).

Sangue e suas Frações

O sangue é um tecido conjuntivo constituído por diferentes células, dispersas na matriz
extracelular denominada plasma. Ele tem como funções as trocas gasosas, o transporte de
oxigênio e gás carbônico e o transporte de nutrientes, além de desempenhar papel
fundamental nos processos imunológicos e na cascata de coagulação.

O plasma corresponde a 55% do volume sanguíneo total. Na sua fração acelular, encontram-
se vitaminas, hormônios e anticorpos, que serão distribuídos para diversos tecidos e órgãos.
Já os leucócitos e as plaquetas constituem os elementos gurados do sangue. A Figura 1
demonstra a estrutura sanguínea em suas subdivisões.

Figura 1
Fonte: Adaptado de ANTUNES, 2020
Hemácias
Hemácias (ou eritrócitos) são células produzidas pela medula óssea durante o processo de
eritropoiese. Não possuem núcleo e apresentam formato bicôncavo, com diâmetro de
aproximadamente oito micrômetros. É através de uma célula-tronco hematopoiética, que o
processo eritropoiético inicia. O proeritroblasto, célula precursora, vai perdendo seu conteúdo
nuclear, rico em RNA mensageiro, e dá origem à molécula de hemoglobina na hemácia
madura, que tem a função de transporte de oxigênio e gás carbônico. A hemoglobina contida
no interior das hemácias é uma metaloproteína composta de quatro moléculas proteicas de
estrutura terciária (cadeias de globina) e quatro grupamentos heme que contêm ferro.

Leucócitos
Os leucócitos, também denominados glóbulos brancos, compreendem um grande grupo de
células, que se apresentam com formas, tamanhos, números e funções diferentes no
organismo, mas que, em geral, participam da resposta imunológica para defesa do
organismo.

Os leucócitos são originados de células-tronco linfoides ou mieloide da medula óssea. Após

sofrerem a maturação na própria medula óssea ou em outros órgãos, são liberados na
corrente sanguínea, cando em circulação para exercerem suas funções.

A classi cação dos leucócitos ocorre com base na presença de grânulos no citoplasma ou com
base na morfologia dos seus núcleos:

Leucócitos agranulócitos: quando os grânulos estão ausentes;

Leucócitos granulócitos: quando há presença de grânulos;

Leucócitos mononucleares: são os leucócitos em que o núcleo tende a ser regular

sem se segmentar;
 Leucócitos polimorfonucleares: são os leucócitos em que o núcleo tende a ser
irregular e com presença de lóbulos segmentados.

Seguindo essa classi cação, temos os monócitos e os linfócitos, que são leucócitos
agranulares e mononucleares; e os neutró los, os basó los e os eosinó los, que são células
granulocíticas e polimorfonucleares, conforme ilustra a Figura 2.

Figura 2
Fonte: Adaptado de ANTUNES, 2020

Os leucócitos participam de respostas in amatórias e alérgicas contra diversos micro-

organismos invasores e da identi cação e destruição de células tumorais.

Os linfócitos são células pequenas, com o núcleo ocupando praticamente todo o espaço do
citoplasma, e se diferenciam em linfócitos B, linfócitos T CD4, linfócitos TCD8 e células NK,
também conhecidas como células natural killers.

Os monócitos apresentam núcleo grande, em formato de rim ou feijão, e grande quantidade de

citoplasma. Estão associados ao processo de fagocitose de agentes patógenos.
Os neutró los representam uma forma celular encontrada em grande número na corrente
sanguínea, sendo responsáveis pela manutenção das defesas do hospedeiro contra diversos
agentes estranhos ao organismo. Nesse sentido, realizam a fagocitose por meio dos grânulos
primários e secundários. Diferentemente dos anteriores, os neutró los apresentam núcleo
segmentado, com lóbulos conectados por lamentos. A sua cromatina nuclear é condensada.

Os basó los estão presentes em menor quantidade na corrente sanguínea. Possuem grande
quantidade de grânulos densos que se coram com o corante básico azul púrpura. O núcleo é
grande e com formato irregular, porém de difícil visualização devido à presença dos grânulos.

Os eosinó los possuem grânulos que se coram com o corante ácido eosina, assumindo
coloração vermelha. O núcleo é bilobulado, com os lobos conectados por um lamento. Os
eosinó los estão envolvidos principalmente em respostas contra parasitas helmintos e em
processos alérgicos.

Plaquetas
As plaquetas são células incompletas, geradas a partir da fragmentação dos megacariócitos.
Elas cam em circulação por aproximadamente oito a nove dias, até serem removidas por
fagócitos do baço. Sua superfície externa é rica em polissacarídeos e glicoproteínas, que
apresentam papel essencial na adesão e agregação plaquetária, participando do processo de
coagulação.

Eritrograma
O eritrograma tem a função de avaliar a quantidade de hemácias presentes na amostra do
paciente e identi car possíveis alterações através da avaliação da morfologia celular.

A contagem de hemácias é utilizada para diagnosticar ou monitorar alterações que afetam a

produção ou a sobrevida das hemácias. As alterações ocorrem tanto por uma diminuição na
quantidade produzida, quanto por alteração na eliminação, podendo, dessa forma, ocorrer um
aumento ou uma diminuição da sua contagem. A diminuição provoca anemia, que está
associada a diversos fatores, desde carências nutricionais até genéticos.
Os valores de referência considerados normais para a contagem de hemácias em adulto são:

Para homens: 4,60 a 6,20 milhões/mm3;

Para mulher: 4,20 a 5,40 milhões/mm3;

Para crianças e gestantes, os valores são diferentes.

Os índices hematimétricos são cálculos gerados considerando-se o número de hemácias, a

quantidade de hemoglobina e o hematócrito. Esses índices geram informações importantes
para o entendimento do estado de anemia do paciente e a forma de tratamento mais adequada.
São considerados índices hematimétricos:

VCM: Volume Corpuscular Médio, que se refere ao tamanho da hemácia;

HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, que se refere ao tamanho da hemácia;

CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, que se refere à cor da

hemácia;

RDW: Red cell Distribution Width, que se refere à presença de anisocitose, ou seja, à
diferença de tamanho;

Ht: Hematócrito, que representa a porcentagem de hemácias em um volume de

sangue.

O Quadro 1 apresenta as alterações morfológicas que podem estar presentes nos eritrócitos
quando avaliados no microscópio. Elas podem ser agrupadas segundo as variações de
tamanho (anisocitose), de forma (poiquilocitose) e de cor (anisocromia).

Quadro 1 – Classi cação de Alterações Morfológicas dos Eritrócitos

 Tipos de Alterações Termos Utilizados na Descrição das
Avaliadas Alterações

Micrócitos (redução no tamanho).

Alterações no Tamanho
Celular (anisocitose)
Macrócitos (aumento de tamanho).

Células-alvo, leptócitos, dacritócitos,

esquisócitos, esferócitos, eliptócitos,
Alteração na Forma
hemácias falciformes ou drepanócitos,
Celular (poiquilocitose)
estomatócitos, esquinócitos,
acantócitos.

Hipocrômica (reduzida concentração de

Hb)
Alterações na
Hipercrômica (aumentada concentração
Coloração Celular
de Hb)
Normocrômica (sem alteração).

Alterações por Pontilhados basó los, Howell-Jolly,

Inclusões anel de Cabot, reticulócitos, parasitas
Intracelulares (malária).

Fonte: ANTUNES, 2020

Leucograma
O leucograma é o exame realizado com intuito de apresentar as alterações encontradas nos
leucócitos sanguíneos. As células são avaliadas por meio da contagem do número total de
leucócitos presentes na amostra. Além disso, deve ser realizada a contagem diferencial para
identi car os diferentes tipos de leucócitos.

Os valores de referência para o número total de leucócitos estão entre 4.000 a 11.000/mm3.
Quadros com alterações no número de leucócitos estão associados a leucopenia (redução) ou
leucocitose (aumento).

A microscopia revela alterações morfológicas presentes nos leucócitos, que são importantes
para auxiliar no quadro diagnóstico. Essas alterações são encontradas no núcleo e no
citoplasma das células, conforme mostra o Quadro 2 a seguir.

Quadro 2 – Alterações Morfológicas em Leucócitos

Alterações Alterações
Leucócito
Nucleares Citoplasmáticas

Neutró los Peter-Huet Não apresenta

Neutró los Não apresenta Váculos

Neutró los Hipersegmentação Não apresenta

Neutró los Macropolicitos Não apresenta

Neutró los Não apresenta Granulação tóxica

Linfócitos Atipias Atipias

Linfócitos (células de
Não apresenta Lipídios
Mott)
Fonte: ANTUNES, 2020

Plaquetograma
O plaquetograma se refere à análise da série plaquetária no sangue, em que são avaliados o
número de plaquetas presentes na amostra. O PDW (platelet distribution width) fornece o
resultado da amplitude da superfície das plaquetas quanti cadas, enquanto o MPV (mean
platelet volume) indica o volume médio plaquetário.

Os valores de referência para contagem de plaquetas em indivíduos adultos estão entre

140.000 e 400.000/mm3. As trombocitopenias ocorrem quando há redução no número de

plaquetas e trombocitose quando há aumento no número.

Exames Citológicos

Fixação do Espécime
O processo de xação é realizado por meio de substâncias químicas que interagem com os
componentes moleculares dos próprios tecidos e tem como objetivos inibir a autólise e o
sobrecrescimento bacteriano, prevenir a solubilidade dos componentes celulares e manter
intacta a citoarquitetura e a ultraestrutura. O etanol a 95%, por exemplo, é utilizado como
agente de xação. Também podem ser utilizados o isopropanol a 80%, o metanol a 100%, o
propanol a 80% e o glutaraldeído a 3% para microscopia eletrônica.

Em relação a isso, esfregaços diretos podem ser realizados a partir da imersão em solução
xadora. Os materiais biológicos podem ser espécimes ginecológicos, escovados ou biópsia
por aspiração, que permanecem em etanol a 95%.

Quando o espécime não for ginecológico, o material deve ser entregue fresco, logo após a
coleta. Caso isso não seja possível, ele deve ser mantido sob refrigeração. Nesses casos,
soluções xadoras, como o álcool, interferem na aderência das células à lâmina e na
penetração dos corantes nas células.
Aos materiais biológicos obtidos por expectoração é possível acrescentar uma solução
xadora, como o álcool etílico para conservação, caso não possam ser enviados a fresco.

Tipos de Espécimes, Técnicas de Coleta de Material e

Técnicas de Citopreparação

Citologia cervical e vaginal

O material é obtido com espátula e/ou escova endocervical e estendido sobre a lâmina. Deve
ser xado no momento da coleta, antes de chegar ao laboratório. Caso a lâmina não seja
confeccionada no momento da coleta, o material deve ser enviado em meio de transporte para
base líquida.

A amostra deve ser obtida por coleta endocervical e vaginal, não deve ser coletada durante
período menstrual e a paciente não deve ter feito duchas vaginais, não deve ter tido relações
sexuais, nem ter utilizado absorventes internos, cremes, espermicidas ou medicamentos pela
via vaginal. Além disso, também não podem ter sido realizados procedimentos ginecológicos,
como colposcopia, ecogra a transvaginal, endoscopia ginecológica ou histeroscopia. Por m,
se a paciente realizou biópsia de colo uterino, é preciso esperar pelo menos 20 dias para
realizar a coleta.

Procedimento para coletar o espécime

As lâminas devem ser identi cadas;

A paciente deve estar em posição ginecológica, para que possa ser colocado o
espéculo;

Não devem ser utilizados lubri cantes.

Se a amostra é do tipo convencional, recomenda-se utilizar a espátula sobre o ectocérvice. A
amostra obtida da espátula deverá ser depositada na lâmina com um único movimento
uniforme, assim como deve-se girar a escova também em um único movimento. A amostra
deve ser imersa em álcool a 96°.

Caso a amostra esteja em base líquida, deve-se utilizar a escova do fabricante Rovers®, a

Cervex-Brush®, que é colocada no orifício cervical e, fazendo pressão sobre o cérvix, deve-se
girar cinco voltas em sentido horário.

Ao chegarem ao laboratório, os esfregaços devem ser imediatamente corados pelo método de

coloração de Papanicolaou. A preparação dos espécimes em base líquida é automatizada ou
semiautomatizada, seguindo as instruções do fabricante. Esse material conserva-se de
maneira adequada por até 6 meses, a uma temperatura de 2 a 10°C.

Figura 3
Fonte: GAMBONI, 2013

Outras formas de coletas de espécimes são:

Expectoração: a amostra ideal para avaliação citológica é a primeira da manhã,
através de expectoração profunda, espontânea e devendo-se enxaguar a boca com
água em várias ocasiões, para diminuir a contaminação com alimentos e bactérias.
A amostra a fresco é enviada imediatamente para o laboratório ou pode ser
conservada sob refrigeração por no máximo 24 horas. O esfregaço é realizado a
partir das áreas mais purulentas, hemorrágicas e com partículas densas. A camada
estendida deve ser na e xada em álcool a 96° por no mínimo 30 minutos.
Posteriormente, faz-se a coloração. Recomenda-se preparar quatro esfregaços;

Lavado brônquico e bronquíolo-alveolar: realizado somente pelo médico, com uso

de broncoscópio exível, através da aspiração de solução salina. O lavado
brônquico é utilizado principalmente para o diagnóstico de neoplasias, com a
vantagem de que a amostra provém da região anatômica em que a lesão se
encontra. O material deve ser centrifugado em citocentrífuga a 1.500 rpm, durante
15 minutos. O sedimento é estendido em lâminas, que, em seguida, são xadas em
álcool 95° e coradas. Deve ser realizada mais de uma lâmina para cada material
coletado;

Escovado brônquico e traqueal: coleta, esfregaço e xação são realizados pelo

endoscopista. Os líquidos provenientes de aspirados brônquicos e traqueais são
obtidos injetando-se soro siológico com o broscópio no local lesionado. Em
seguida, o líquido é aspirado com seringa e depositado em um recipiente com soro
siológico. O material resultante é centrifugado para a realização dos esfregaços;

Líquidos de derrames cavitários: deve ser coletada uma quantidade mínima de

300mL, mas enviado ao laboratório apenas 10% do volume. A amostra é
centrifugada para obter-se um botão, do qual se extraem esfregaços,
citocentrifugados ou preparações em base líquida;

Líquido cefalorraquidiano: material coletado da medula espinhal. Normalmente,

trata-se de uma quantidade pequena de material. A técnica que permite obter o
maior número de células é a citocentrifugação.
 Figura 4
Fonte: GAMBONI, 2013

Coloração de Papanicolaou
É um método de coloração policrômico, que consiste em uma coloração nuclear e um
contraste citoplasmático, com a vantagem de proporcionar de nição nuclear ótima e
transparência citoplasmática.

A coloração nuclear é basó la, enquanto a citoplasmática pode ser azul, verde-azulado, cor-
de-rosa ou laranja, dependendo do tipo de célula.

Contagem de Células em Câmara de Neubauer

A câmara de Neubauer continua sendo o método mais comum para a contagem de células em
todo o mundo. Consiste em uma lâmina de cristal grosso com o tamanho de uma lâmina de
vidro (com dimensão de 30x70mm e 4mm de espessura). A área central é a zona projetada
para a contagem celular e é delimitada por uma ranhura de 1mm, que se encontra dividida em
duas câmaras de contagem, separadas por uma ranhura transversal. Esta possui nove grandes

quadrados, com dimensões de 1x1 mm, o que perfaz uma área total de 3x3 mm ou 9 mm2 de
área de contagem.

Os quatro quadrados dos cantos, da área dividida, possuem dezesseis quadrados menores, que
são utilizados para contagem de leucócitos. O quadrado central está dividido em quatrocentos
quadrados menores, divididos em 25 grupos de dezesseis quadrados cada, tipicamente
utilizados para a contagem de eritrócitos e plaquetas. Assim, as células são adicionadas na
câmara e difundem-se por capilaridade até atingirem uma altura máxima de 0,1mm.

Para a contagem, deve ser ajustada a objetiva do microscópio para 10x, de forma a focar num
dos nove quadrados, e para 40x, de forma a permitir a contagem. Em seguida, efetua-se a
contagem em relação a uma área delimitada por três linhas. As células que se encontram
dentro da área limitada e em contato com o limite esquerdo e superior são contabilizadas,
enquanto que as que se encontram em contato com o limite direito e inferior não são
contabilizadas.
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ʪ Aula Prática

Recomendações para Aula Prática

Para a realização das aulas práticas, devem ser seguidas as normas de biossegurança para
manipulação de material biológico. Além disso, é indispensável o uso de luvas descartáveis,
óculos de proteção, máscara descartável, avental e uso de calçado fechado durante a realização
das atividades. Essas atividades devem ser realizadas conforme os roteiros descritos a seguir.

Roteiros para Aula Prática

Aula prática n. 01: Técnica do Esfregaço ou Distensão Sanguínea

para Realização da Coloração de May-Grunwald-Giemsa
O objetivo da realização do esfregaço de sangue em hematologia é possibilitar a contagem e a
identi cação de alterações presentes nas células do sangue. Sempre que for solicitado o
exame de hemograma, realizamos, já no momento da coleta da amostra, o esfregaço
sanguíneo.

A lâmina é confeccionada com uma na camada de sangue que posteriormente é corada e

analisada no microscópio.

Além da contagem numérica das células e de suas alterações morfológicas, a distensão

sanguínea fornece informações importantes, como a possibilidade de relacionar os elementos
encontrados com algumas patologias, como anemias, infecções e leucemias.
Material Necessário

Lâmina de microscopia;

Lâmina extensora;

Pipeta automática com capacidade para 20 µL;

Amostra de sangue total.

Procedimento Técnico

Identi car a lâmina de microscopia. Nessa etapa, sempre utilizar uma lâmina de
boa qualidade, limpa e seca. A presença de vestígios de gordura inviabiliza a
realização da distensão sanguínea

Apoiar a lâmina de microscopia sobre a bancada limpa e seca;

Colocar uma pequena gota de sangue (20 µL) próxima a uma das extremidades da
lâmina;

Com o auxílio de outra lâmina extensora, colocar a gota de sangue em contato

com sua borda;

Puxar a lâmina extensora em movimento para trás, tocando a gota com o dorso,
em um ângulo 45° (observe as Figuras 5 e 6 a seguir);
Figura 5 – Procedimento para confecção de extensões
sanguíneas
Fonte: Adaptada de SILVA, 2015
Figura 6 – Sequência para preparo do esfregaço
hematológico
Fonte: Adaptada de MARTY, 2015

O sangue da gota deve se espalhar pela borda da lâmina extensora, por

capilaridade;

Deslizar suavemente a lâmina extensora em direção à borda oposta em que foi

colocada a gota de sangue;

Depois de completamente estendido, o sangue forma uma película sobre a lâmina

de vidro;
 Deixar secar em temperatura ambiente para, en m, realizar a coloração e a
visualização das células.

Resultado Esperado
Espera-se uma lâmina com esfregaço sanguíneo uniforme e com presença de cauda, para
posterior coloração e visualização da morfologia das células sanguíneas. A seguir, veja uma
imagem de esfregaço satisfatório e da área da lâmina adequada para realização da leitura.

Figura 7 – Extensão sanguínea adequada e sequência

correta para a leitura da lâmina hematológica
Fonte: Adaptada de SILVA, 2015
Aula prática n. 02: Técnica para Realização da Coloração de May-
Grunwald-Giemsa
Os corantes de May-Grunwald-Giemsa são usualmente comuns nas técnicas de coloração
hematológica, podendo ser utilizados juntos ou separadamente. Apesar de existirem
colorações rápidas em hematologia, a coloração completa é a mais recomendada devido à
qualidade gerada, possibilitando uma melhor visualização dos elementos celulares.

Material Necessário

Lâminas de microscopia;

Amostra de sangue total;

Corante May-Grunwald;

Corante Giemsa;

Cronômetro;

Microscópio.

Procedimento Técnico

Realizar o esfregaço sanguíneo conforme a aula prática n. 01;

Deixar secar completamente a lâmina com esfregaço sanguíneo;

Cobrir a lâmina com o corante de May-Grunwald e deixar atuar por dois minutos;
 Acrescentar 20 gotas (1 mL) de água destilada tamponada, com pH 7,0-7,2, deixar
atuar por um minuto e homogeneizar;

Escorrer sem lavar;

Cobrir com a solução de Giemsa diluída (1 gota de corante Giemsa para cada 1 mL
de água destilada) e deixar atuar por 13-15 minutos. O tempo de permanência
dependerá da espessura do esfregaço sanguíneo;

Lavar com água destilada e deixar secar em posição vertical.

Resultado Esperado
A lâmina corada deve apresentar uma tonalidade rosa uniforme. Na visualização ao
microscópio, as plaquetas apresentam-se com coloração púrpura. As células eosinofílicas têm
cor alaranjada, as basofílicas têm tonalidade azul-escuro e as neutrofílicas podem apresentar
cor rosa ou lilás. É importante observar que lâminas muito avermelhadas são um indicativo de
acidez excessiva, enquanto lâminas azuladas indicam alcalinidade excessiva.

A visualização ao microscópio deve seguir a indicação demonstrada na Figura 7.

Aula Prática n. 03: Contagem Manual de Eritrócitos em Câmara de

Neubauer
Os equipamentos automatizados são usualmente empregados para realização das contagens
de eritrócitos (hemácias), porém a contagem também pode ser realizada por técnica manual,
com uso da câmara de Neubauer, após uma diluição prévia do sangue.

Material Necessário

Tubo de ensaio;
 Câmara de Neubauer;

Lamínula;

Pipeta automática;

Sangue total.

Procedimento Técnico

Em um tubo de ensaio, pipetar 4,0 mL do líquido diluidor;

Adicionar ao líquido diluidor 20 µL de sangue total;

Homogeneizar e aguardar aproximadamente 5 minutos;

Fixar a lamínula sobre a câmara de Neubauer;

Preencher a câmara de Neubauer com a solução, tendo o cuidado de homogeneizar

novamente antes da pipetagem;

Focalizar com a objetiva de 10x e fazer a contagem com a objetiva de 40x,

utilizando o retículo central da câmara de Neubauer;

Contar os eritrócitos presentes nos cinco campos (quatro laterais e um central) do

quadrado central (Figura 8);

Somar todos os eritrócitos encontrados e multiplicar por 10 mil.

Figura 8
Fonte: Adaptada de VIEIRA et al., 2021

Câmara de Neubauer: as áreas indicadas com “R”

representam os locais de contagem dos eritrócitos,
enquanto as áreas indicadas com “W” representam os
locais de contagem de leucócitos.
Resultado Esperado e Interpretação
A partir da técnica realizada, é possível fazer a contagem de eritrócitos em amostras de sangue
total. Com isso, pode-se identi car a presença de policitemias, ou seja, quando o número de
eritrócitos está aumentado, como nos casos de: diarreia, desidratação, queimaduras,
policitemia vera, cardiopatia crônica, intoxicações com álcool etílico ou outras drogas, vômitos
profusos e acidose metabólica. Por outro lado, também é possível identi car a redução nos
valores de eritrócitos devido à presença de patologias, como anemias, leucemias, hemorragias
e infecções graves.

Valores de Referência para Eritrócitos

Mulheres: 4,5 a 5,5 milhões/mm3;

Homens: 4,0 a 5,0 milhões/mm3;

Recém-nascidos: 5,5 a 7,0 milhões/mm3;

Aula Prática n. 04: Contagem de Leucócitos em Câmara

de Neubauer
A contagem de leucócitos em câmara de Neubeuer emprega técnica que utiliza sangue total e
solução diluidora com o intuito de destruir as hemácias e permitir a visualização dos
leucócitos.

Material Necessário

Tubo de ensaio;

Câmara de Neubauer;
 Lamínula;

Pipeta automática;

Sangue total.

Procedimento Técnico

Em um tubo de ensaio, pipetar 40 µL do líquido diluidor;

Adicionar ao líquido diluidor 20 µL de sangue total;

Homogeneizar e aguardar aproximadamente 5 minutos;

Fixar a lamínula sobre a câmara de Neubauer;

Preencher a câmara de Neubauer com a solução, tendo o cuidado de homogeneizar

novamente antes da pipetagem;

Focalizar com a objetiva de 10x e fazer a contagem com a objetiva de 40x,

utilizando os quatro retículos laterais da câmara de Neubauer;

Contar os leucócitos dos quatro retículos laterais e realizar a soma das contagens
de cada um;

Somar todos os eritrócitos encontrados e multiplicar por 50 para obter o número

de leucócitos/mm3 de sangue (Figura 10)

Resultado Esperado e Interpretação

Através da realização da técnica de contagem dos leucócitos em câmara, espera-se obter o
número total de leucócitos. Valores aumentados levam à leucocitose e ocorrem nos processos
in amatórios, infecciosos e leucemias. Já a leucopenia é a redução no número de leucócitos e
ocorre devido a alguns fatores, como de ciência de vitamina A, depressão dos tecidos
leucopoéticos, por infecção ou intoxicação, uso de medicamentos e aumento da destruição
celular, provavelmente por anticorpos.

Valores de Referência

Adultos: 4.000 a 10.000/mm3;

Crianças até 7 anos: 5.000 a 15.000/mm3;

Recém-nascidos: 10.000 a 26.000/mm3.

Aula Prática n. 05: Coloração de Reticulócitos: Sangue + Corante

supravital (Azul de Cresil Brilhante – ACB)

Material Necessário

Pipeta automática;

Lâmina de microscopia;

Corante azul de cresil brilhante;

Amostra de sangue total.

Procedimento Técnico
 Pipetar 200 µL de corante Azul de Cresil Brilhante (ACB) em um tubo de ensaio
pequeno;

Adicionar 200 µL de sangue total e homogeneizar;

Levar ao banho-maria a 37°C, durante 20 minutos;

Homogeneizar e fazer um esfregaço, conforme técnica de esfregaço descrita na

aula prática n. 01, em lâmina limpa e seca;

Fazer a contagem de mil hemácias com lente objetiva de imersão, anotando os

reticulócitos encontrados em cada campo;

O resultado pode ser expresso em % e /mm3.

Resultado Esperado e Interpretação

A coloração deve permitir a visualização do número de hemácias imaturas em estágio de
reticulócito, que é de fundamental importância para diferenciar anemias hemolíticas de
anemias não-hemolíticas e para acompanhamento do tratamento das anemias carenciais. A
redução da percentagem em circulação está associada a anemias carenciais, a aplasias
medulares e a anemias não-hemolíticas; enquanto o aumento está associado a anemias
hemolíticas, à hiperplasia medular, à doença hemolítica do recém-nascido, a hemorragias
intensas após acidentes e a cirurgias.

Valores de Referência

Adultos: 1 a 3%;

Recém-nascidos: 2,5 – 6,5%.

Aula Prática n. 06: Técnica de Hemossedimentação
O teste da Velocidade de Hemossedimentação (VHS) pode ser útil na documentação de
processos infecciosos, in amatórios ou neoplásicos, na avaliação do grau de atividade ou de
extensão de uma doença de base e, em alguns casos, da resposta à terapêutica instituída.

Apesar de inespecí co, o VHS é indispensável na investigação e no acompanhamento de casos

de arterite temporal ou de polimialgia reumática, orientando o tratamento mesmo antes do
resultado de eventual biópsia.

Material Necessário

Pipeta de Westergren;

Suporte para pipeta de Westergren;

Sangue total em citrato de sódio;

Cronômetro.

Procedimento Técnico

Para realização da técnica, utilizamos uma pipeta de Westergren, graduada de 0 a

200 mm;

A pipeta é preenchida com sangue oxalatado até a marca zero;

Devemos xar a pipeta no suporte vertical próprio;

 Aguardar o período de uma hora e fazer a leitura da quantidade em milímetro de
sangue, que corresponde à deposição das hemácias;

A leitura deve ser feita na primeira e na segunda hora.

Valores de Referência

Homens:

VSG 1ª hora: 3 a 10 mm;

VSG 2ª hora: 7 a 15 mm.

Mulheres:

VSG 1ª hora: 4 a 11 mm;

VSG 2ª hora: 8 a 17 mm.

Aula prática n. 07: Coloração de Papanicolaou

A coloração de Papanicolaou é considerada como padrão internacional de coloração cérvico-
vaginal, permitindo avaliar padrões in amatórios, hormonais e oncológicos.

Material Necessário

Amostra cérvico-vaginal xada em álcool etílico a 70-90%;

Lâminas e lamínulas;
 Cubas de Coplin ou similares;

Etanol absoluto, 96 e 70%;

Xilol ou similar;

Água amoniacal (5 gotas de amoníaco para cada 500 mL de água deionizada);

Água destilada ou deionizada com condutividade inferior a 0,5 mS/cm;

Xilol fenicado (10 mL de fenol para cada litro de xilol) ou xiloletanol absoluto em
proporção de 1:1;

Bálsamo do Canadá ou resina sintética similar;

Microscópio.

Procedimento técnico

Lâmina com material cérvico-vaginal deve ser xada em

álcool etílico a 95%;

Álcool absoluto: dez imersões;

Álcool a 95%: dez imersões;

Álcool a 70%: dez imersões;

Água destilada: dez imersões;

Hematoxilina: 2 minutos;

Água destilada: trinta imersões;

Álcool amoniacal: cinco imersões;

 Água corrente: trinta imersões;

Álcool a 70%: dez imersões;

Álcool a 95%: dez imersões;

Álcool absoluto: dez imersões;

OG-06: 1 minuto;

Álcool absoluto: dez imersões;

Álcool absoluto: dez imersões;

EA-36: 2 minutos;

Álcool absoluto: dez imersões;

Álcool absoluto: dez imersões;

Xilol: 1 minuto;

Xilol: 1 minuto;

Xilol: 1 minuto.

Montar as lâminas com bálsamo do Canadá ou resina sintética para xar a

lamínula, procurando evitar a formação de bolhas de ar entre lâmina e lamínula.

Resultado Esperado
Lâminas com material cérvico-vaginal impregnadas em para na para visualização de
alterações citopatológicas.

Aula Prática n. 08: Técnica do Espermograma

Realização do exame microscópico:
Deve ser executado uma hora após a colheita em liquefação a 37°C em banho-maria.
Motilidade Espermática

Após homogeneização do líquido seminal, coloca-se uma gota numa lâmina,

cobrindo-a posteriormente com lamínula;

Leva-se ao microscópio e focaliza-se primeiramente com a objetiva de 10x e

posteriormente com a objetiva de 40x;

Examina-se e xa-se em um espermatozoide, observando o seu movimento.

A motilidade espermática é fundamental para a fecundação. Portanto, devemos observar a

direção na qual os espermatozoides movem-se na lâmina:

Tipo I: lateral – movimento ondulante;

Tipo II: progressivo lento – movimento quase ondulante (lento);

Tipo III: progressivo – movimento rápido com direção especí ca;

Tipo IV: ativo – movimento rápido mas sem direção especí ca.

Os tipos I e II são considerados anormais. Quando presente esses tipos de motilidade, a

possibilidade de fertilização é pouca ou praticamente nula. Devido à pouca movimentação, o
espermatozoide não alcança o útero, sendo destruído pela acidez vaginal.

Os tipos predominantes são: II, III, IV.

Observação: A recuperação de motilidade pode ser obtida com a administração de hormônios.

Contagem Global de Espermatozoides
Durante a contagem global, pode-se observar as células normais e anormais.

Fazer uma diluição de 1:20 com líquido diluidor de leucócitos ou solução isotônica
de NaCl ou água destilada;

Usar 0,4 ml de líquido diluidor;

Utilizar uma câmara de Neubauer no retículo usado para a contagem de eritrócitos;

Contar cinco grupos de quadrados, que correspondem a oitenta quadrinhos (5x16

= 80);

Os oitenta quadrinhos correspondem a 1/5 de 0,1mm³ de líquido, devendo-se

multiplicar por cinco (quatrocentos quadrinhos);

A diluição é 1:20, o resultado é expresso em nº de células por cm³ e deve-se

multiplicado por 20 mil;

Valores normais: 70.000.000 a 200.000.000 p/ml de plasma seminal.

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ʪ Orientações para Leitura Obrigatória

Livros

Hemograma: Manual de Interpretação

FAILACE, R. FERNANDES, F. Hemograma: manual de interpretação. 6ª ed. São Paulo: Artmed,
2015.

Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica

LORENZI, T. F. Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica. 4ª ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2006.

Vídeo

Coloração de Papanicolaou

COLORAÇÃO DE PAPANICOLAU
Instrução Prática para Coleta de Papanicolaou

Instrução Prática Para Coleta de Papanicolaou

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ʪ Referências

BAIN, B. J. Células sanguíneas: um guia prático. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016.

GAMBONI, M.; MIZIARA, E. F. Manual de Citopatologia Diagnóstica. São Paulo: Manole, 2013.

GUERRA, C. C. C.; GUERRA, J. C. Trombocitopenias e trombocitopatias. In: JUNQUEIRA, P. C.;

HAMERSCHLAK, N.; ROSENBLIT, J. (org.). Hemoterapia clínica. 1. ed. São Paulo: Roca, 2009.
v. 1.

HOFFBRAND, A. V.; MOSS, P. A. H. Fundamentos em hematologia de Ho brand. 7. ed. Porto

Alegre: Artmed, 2018.

JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 11. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2007.

MARTY, E.; MARTY, R. M. Hematologia Laboratorial. 1. ed. São Paulo: Editora Érica , 2015.

VIEIRA, A. D. C. et al. Bioquímica clínica: líquidos corporais. 1. ed. Porto Alegre: Grupo A, 2021

ZAGO, M. A. et al. Hematologia – Fundamentos e Prática. 1. ed. São Paulo: Atheneu, 2001.