Processo seletivo para Mestrado PPGCS – Edital 535/2023

Binge alcoólico em zebrafish (Danio rerio): possível efeito neuroprotetor da cafeína?

Candidato: Marcel Marcos Machado

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Pacheco Rico

Caraterização do problema: O etanol é uma droga amplamente utilizada, sendo que seu consumo excessivo é um
problema mundial de saúde publica, resultando em 2,5 milhões de mortes a cada ano, segundo dados da Organização
Mundial da Saúde (2011). É considerada a terceira maior causa de morte evitável (Mokdad et al., 2004). O álcool tem
efeitos nocivos sobre o sistema nervoso central (SNC), sendo seu consumo excessivo associado aos distúrbios nas funções
de múltiplos órgãos e do sistema endócrino, tendo impacto na saúde do indivíduo, no comportamento e na capacidade de
interagir com outras pessoas (NIAAA, 2013). O etanol exerce suas ações por meio de modificações nas vias de transdução
de sinal, o qual influencia diversos sistemas de neurotransmissão, como o glutamatérgico, o GABAérgico e o
adenosinérgico, por exemplo (Deitrich, 2004; Quertemont et al., 2005; Sharma et al., 2010).
Dois padrões associados ao consumo excessivo de etanol são o consumo crônico e o binge alcoólico. O binge
alcoólico é uma forma distinta de consumo excessivo, pois envolve o consumo eventual de doses relativamente altas de
álcool, mas que também resultam em alterações neurológicas e psicológicas, incluindo comprometimento das funções
cognitivas (Ward et al., 2009) e diminuição da qualidade de vida (Wen et al., 2012). Os trabalhos experimentais com
roedores têm demonstrado que o binge alcoólico prejudica a extinção de respostas ao medo através de mudanças
morfológicas nos neurônios piramidais do córtex pré-frontal medial (Holmes et al., 2012), compromete a plasticidade
sináptica nas áreas pré-frontais do encéfalo (Kroener et al., 2012) e promove alterações nos níveis de proteína sinápticas e
mielina, além de disfunções cognitivas a longo prazo (Montesinos et al., 2014).
O binge alcoólico tem sido associado a problemas de dependência futura e esse quadro é agravado pela
propensão que jovens e adolescentes apresentam para esse tipo de consumo (Dawson et al., 2004; Presley e Karmos,
1994; Wechsler et al., 2000), além de normalmente estar associado a utilização de outras substâncias psicoativas durante
ou após o episódio. Nesse sentido, um exemplo é o uso cada vez maior da cafeína (1,3,7-trimetilxantina), um alcaloide
pertencente ao grupo das xantinas, considerada a substância psicoestimulante mais consumida no mundo. Segundo a FDA
- Food and Drug Administration, a cafeína é um ingrediente considerado de consumo seguro, com a ressalva de ser um
aditivo de alimento prejudicial quando combinado com álcool (FDA, 2010). Estudos relatam que esse consumo combinado
aumenta os riscos dos jovens desenvolverem dependência (Droste et al., 2014; Emond et al., 2014; Marczinski, 2014).
Embora a combinação de álcool e cafeína seja antiga, nos últimos anos o aumento no consumo dessas duas
substâncias vem sendo considerável sobretudo pelo crescente aumento do uso de energéticos combinados com bebidas
alcoólicas (Franklin et al., 2013; Marczinski et al., 2011; Marczinski e Filmore, 2014). Um dos efeitos relacionados ao uso
concomitante de álcool e cafeína que inclui o risco de os consumidores subestimarem seu estado de intoxicação, apesar da
cafeína não alterar os níveis de etanol no sangue, não reduzindo, dessa forma, os riscos decorrentes da ingesta de álcool
(Ferreira et al., 2006; Fritz et al., 2014; Marczinski e Fillmore, 2003; Marczinski e Fillmore, 2006). Adicionalmente, os
estudos relatam que o consumo de álcool com bebidas energéticas eleva a quantidade de álcool a ser ingerido durante um
único episódio quando comparado ao consumo de álcool sozinho (Peacock et al., 2013a,b; Price et al., 2010; Thombs et al.,
2011; Velazquez et al., 2012).
A cafeína e o etanol afetam a neurotransmissão dopaminérgica e adenosinérgica. A adenosina é um nucleosídeo
endógeno que atua como um neuromodulador exercendo um papel importante na regulação da transmissão sináptica e
excitabilidade neuronal do SNC e que está envolvido com a sensação de sono e sedação (Chen et al., 2014). Os dois
principais receptores adenosinérgicos expressos no SNC são A1 e A2A, os quais atuam em processos inibitórios e
facilitatórios, respectivamente. Quando o álcool é ingerido, ele bloqueia a recaptação da adenosina, elevando assim sua
atividade e aumentando a sensação de sonolência e sedação (Asatryan et al., 2011; Nagy et al., 1990; Sharma et al., 2010).
A cafeína é um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina A 1 e A2A, que atenua esses sintomas pelos seus
efeitos psicoestimulantes (Fredholm et al., 1999) e, como consequência, a sensação de fadiga que o consumo de etanol
promove são atenuados pela sua ingesta. Ambas substâncias também exercem ações sobre a neurotransmissão
dopaminérgica, pois a dopamina sabidamente é o neurotransmissor que desempenha um papel fundamental no potencial
de abuso da maioria das drogas. Uma vez que a ativação dos receptores A 2A de adenosina inibe a transmissão
dopaminérgica (Ferré e O'Brien, 2011; Shook e Jackson, 2011) e a atividade elevada de dopamina está relacionada com o
consumo frequente de álcool, possivelmente um aumento na atividade do sistema adenosinérgico poderia influenciar o
consumo de etanol pela interação com o sistema dopaminérgico (Arolfo et al., 2004; Yao et al., 2002). Com a ação
antagônica da cafeína sobre os receptores de adenosina, há um aumento na atividade da dopamina, promovendo um
aumento no consumo de álcool (Garrett e Griffiths, 1997; Nam et al., 2013). Quando a atividade de adenosina é diminuída
repetidamente, a ingesta de álcool pode aumentar, a ponto de desenvolver a dependência. Isso faz com que o consumo
frequente de bebidas combinando álcool e energéticos seja mais preocupante do que o consumo repetido da mesma
quantidade apenas de álcool (Marczinski e Fillmore, 2013).
Os papéis da cafeína e do etanol sobre alguns sistemas de neurotransmissão, bem como sobre eventos
associados à plasticidade sináptica e memória estão relativamente bem documentados na literatura científica. O BDNF
(brain derived neurotrophic factor) é a neurotrofina mais expressa no SNC de vertebrados (Conner et al., 1997; Schmidt-
Kastner et al., 1996) e está envolvido na regulação da plasticidade sináptica (Leal et al., 2014; Lu, 2003), além de facilitar a
potenciação de longa duração (Park et al., 2014). O comprometimento da sinalização operada pelo BDNF é um dos fatores
determinantes para o prejuízo da consolidação e persistência da memória (Bekinschtein et al., 2008) e já foi descrito que os
receptores A2A controlam a ativação dos receptores TrkB de BDNF (Diógenes et al., 2004). Já a neurodegeneração induzida
pelo etanol pode estar relacionada a uma atividade neurotrófica diminuída e isso pode ocorrer através da diminuição da
expressão de BDNF ou através da incapacidade de transdução do receptor TrkB na presença de etanol (Davis, 2008;
Moonat et al., 2010; Vetreno et al., 2011).
O “zebrafish” (Danio rerio) é um pequeno peixe que pode ser facilmente mantido em laboratório, sendo um grande
atrativo para estudos devido ao baixo custo e rápido ciclo de vida (Echevarria et al., 2011). Seu genoma já foi seqüenciado,
seus genes são evolutivamente conservados e possuem grande similaridade com genes humanos (Barbazuk et al., 2000;
Grunwald e Eisen, 2002). Essas características fazem com que o zebrafish seja considerado um vertebrado ideal em
modelos de estudos de numerosas doenças humanas (Lieschke e Currie, 2007). Portanto, esta espécie tem sido utilizada
para pesquisas nas áreas de biologia do desenvolvimento, toxicologia, evolução do genoma de vertebrados, teratologia,
neurociência e comportamento (Goldsmith, 2004; Crollius e Weissenbach, 2006; Gerlai et al., 2006; Blaser et al., 2010;
Cachat et al., 2010). Estudos recentes têm demonstrado que o zebrafish apresenta um amplo repertório comportamental, o
qual pode ser alterado pela exposição a diferentes drogas de abuso, bem como por substâncias moduladoras da ansiedade
(Cachat et al., 2010; Maximino et al., 2011). A análise comportamental da exploração vertical, preferência claro-escuro,
interação social e agressividade para esta espécie já foi descrita em diversos estudos (Gerlai et al., 2000; Levin et al., 2007;
Egan et al., 2009; Blaser et al., 2010; Cachat et al., 2010; Maximino et al., 2010; Maximino et al., 2011; Cachat et al., 2011).
Evidências têm demonstrado alterações comportamentais no zebrafish após exposição ao etanol em diferentes linhagens
(Dlugos e Rabin 2003), o que sugere que esta espécie é um excelente modelo para investigar os determinantes genéticos
envolvidos na regulação das respostas ao etanol (Pan et al., 2011). A exposição aguda a diferentes concentrações de
etanol já foi investigada, demonstrando que esta espécie é bastante adequada para estudos de neuroquímica, pois os
mecanismos de respostas comportamentais à intoxicação por etanol são bastante complexos (Gerlai et al., 2000). As
respostas diferenciais observadas após os tratamentos agudo e crônico ao álcool sugerem que a exposição ao etanol pode
exercer uma modulação em parâmetros relacionados à ansiedade em zebrafish (Mathur e Guo, 2011), sendo que uma
única exposição a esta droga de abuso pode exercer uma forte influência no comportamento condicionado dessa espécie
(Mathur et al., 2011). Dentre os efeitos neuroquímicos promovidos pelo etanol já detectados em zebrafish que poderiam
estar relacionados com as alterações comportamentais observadas podem ser citadas modificações nos níveis de
dopamina e serotonina (Chatterjee e Gerlai, 2009), regulação dos níveis de AMP cíclico e da via de sinalização das cinases
reguladas por sinal extracelular (ERKs) (Peng et al., 2009).
Com relação às tarefas comportamentais, evidências sugerem que o paradigma do open tank pode fornecer
informações relevantes sobre o comportamento espaço-temporal e habituação do zebrafish ao aparato, não somente com
relação à locomoção e atividade natatória vertical, mas sobre do perfil exploratório através de etogramas (Rosemberg et al.,
2011). Diversos parâmetros relacionados à neurotransmissão glutamatérgica já foram identificados em zebrafish, os quais
contribuem para a acuidade da percepção visual (Edwards & Michel, 2002; Smear et al., 2007). A identificação, expressão e
funcionalidade dos transportadores de glutamato já foi recentemente estudada em zebrafish (Rico et al., 2010), sendo que
uma nomenclatura comum para esses transportadores foi proposta (Neuhauss et al., 2010). Parâmetros relacionados ao
estresse oxidativo em amostras de cérebro, tais como a quantificação dos níveis de tióis reduzidos, potencial antioxidante
reativo total e reatividade antioxidante total (TRAP/TAR), dano lipídico (TBARS) e protéico (técnica do carbonil) bem como a
atividade de enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx, e Na +-K+-ATPase), serão realizados conforme as metodologias
descritas previamente (Klamt et al., 2002; Lissi et al., 1995; Wyse et al., 1995). Todos os protocolos já foram utilizados com
sucesso em estudos realizados em zebrafish (Hammes et al., 2012; Rosemberg et al., 2010b; Seibt et al., 2012).
Objetivo Geral: avaliar as alterações neuroquímicas, moleculares e comportamentais em animais submetidos ao
protocolo de binge alcoólico bem como o efeito da co-cafeína frente aos parâmetros mencionados.
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Objetivos específicos:
Determinar as possíveis alterações promovidas pela exposição ao protocolo de binge alcoólico sobre parâmetros
comportamentais em zebrafish adultos;
Avaliar a influência de diferentes concentrações de cafeína co-administradas com o protocolo de binge alcoólico
sobre parâmentros comportamentais de zebrafish adultos;
Determinar e quantificar os níveis de etanol, acetaldeído, cafeína e purinas em cérebro de zebrafish adultos
expostos ao binge alcoólico e cafeína;
Avaliar o efeito do binge alcoólico e da co-administração de diferentes doses de cafeína sobre parâmetros
relacionados ao estresse oxidativo e atividade mitocondrial em cérebro de zebrafish;
Analisar o efeito do binge alcoólico e da co-administração de diferentes doses de cafeína sobre os níveis de BDNF
e TrkB, bem como sobre a viabilidade celular em cérebro de zebrafish.

Metodologia e Estratégia de Ação:

Animais: Serão utilizados zebrafish adultos (com aproximadamente 4 meses de idade) de ambos os sexos da linhagem
heterogênea do fenótipo short-fin (SF). Os animais serão obtidos do Departamento de Bioquímica, da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul (UFRGS) e mantidos no Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC) em aquários
de 50 L com água declorada e continuamente aerada, em um número de 25 animais por aquário. A temperatura da água
será regulada em 28,5 ± 1° C e os peixes serão mantidos em ciclo de claro-escuro de 14h/10h controlado por fotoperíodo
(luzes acesas às 7h; luzes apagadas às 21h). Os animais serão alimentados quatro vezes por dia com artêmias. Nenhum
procedimento experimental será realizado no espaço destinado à manutenção dos animais, a fim de evitar qualquer tipo de
estresse comportamental.
Modelo de binge alcoólico: Neste projeto, será utilizado o protocolo de exposição excessiva ao etanol modificado de
Holcombe e colaboradores (2013). Nesse modelo, os animais serão expostos ao etanol (1,4% v/v) por 30 min, uma vez por
semana, durante o período de 15 dias.
Tratamento com cafeína: Neste projeto, será realizada a co-administração de cafeína no aquário junto com o binge alcoólico
em três diferentes concentrações: 1, 10, e 100 mg/L. As doses escolhidas são similares as já descritas para estudos com
zebrafish (Egan et al., 2009; Maximino et al., 2011; Wong et al., 2010).
Grupos: Os animais serão divididos em cinco grupos, sendo estes: grupo controle (água), grupo binge (etanol), grupo binge
co-administrado com 1mg/L de cafeína, grupo binge co-administrado com 10mg/L de cafeína e grupo binge co-administrado
com 100mg/L de cafeína.
Testes comportamentais: De maneira geral, as tarefas descritas abaixo se propõem avaliar parâmetros relacionados à
locomoção/exploração, ansiedade e memória.
Paradigma do open tank: Esta tarefa se propõe em avaliar basicamente a locomoção/exploração vertical do zebrafish, bem
como comportamentos de medo/ansiedade relacionados à resposta à novidade (Blaser e Rosemberg, 2012; Cachat et al.,
2010; Levin et al., 2007). Serão avaliados parâmetros relacionados à locomoção e à posição vertical que o zebrafish ocupa
no aparato de teste durante o período de habituação de 6 minutos, gerando um padrão de perfil exploratório espaço-
temporal (Rosemberg et al., 2011; Rosemberg et al., 2012).
Determinação e quantificação de compostos: A quantificação de etanol e de acetaldeído será realizada pela técnica de
microextração em fase sólida seguida por CG com detector de ionização de chama (GC-FID/ Varian 3300) já padronizada
para zebrafish (Rosemberg et al., 2012). Tanto os níveis de cafeína quanto os níveis de purinas serão determinados pela
técnica de HPLC adaptados de estudos com roedores e trabalhos prévios do grupo (Vuaden et al., 2012).
Parâmetros relacionados ao estresse oxidativo: A determinação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo em
amostras de cérebro, tais como a quantificação dos níveis de tióis reduzidos, potencial antioxidante reativo total e
reatividade antioxidante total (TRAP/TAR), dano lipídico (TBARS) e protéico (técnica do carbonil) bem como a atividade de
enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx, e Na+-K+-ATPase), serão realizados conforme as metodologias descritas
previamente (Klamt et al., 2002; Lissi et al., 1995; Wyse et al., 1995). Todos os protocolos já foram utilizados com sucesso
em estudos realizados em zebrafish (Hammes et al., 2012; Rosemberg et al., 2010b; Seibt et al., 2012).
Atividade mitocondrial: O padrão de respiração basal e as atividades dos complexos da cadeia respiratória I-III, II e IV serão
determinados em preparações biológicas de cérebro utilizando um oxígrafo de alta resolução (Oroboros Oxygraph 2k) e a
produção de peróxido de hidrogênio será determinada através da técnica do Amplex Red (Benani et al., 2009; Muller et al.,
2013).
Análise dos níveis de BDNF e TrkB: A expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e de seu receptor, TrkB,
será realizada de acordo com o método previamente descrito (Germanà et al., 2010), no qual os níveis de proteína
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cerebrais são detectados através das técnicas de western blotting. Todos os resultados serão analisados por densitometria
utilizando o software Image J 1.37 for Windows®, empregando a β-actina como marcador constitutivo.

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