Slide - Validação de Métodos Analíticos Físico-Químicos

Validação de métodos analíticos
físico-químicos
Por que devemos validar?
Reflexões por Tamara Almeida

Tamara Almeida
https://www.linkedin.com/in/tamara-de-almeida/
tamaraalmeida.aulas@gmail.com
Farmácia Industrial – UFOP

MBA Projetos – FGV
Mestrado: Gestão e P&D na Indústria
Farmacêutica - Fiocruz
P&D – Desenvolvimento Analítico

• EQFAR, desenvolvimento de métodos de
IFA e produto acabado, validação
analítica e estudos de estabilidade
• Neo Química, Hypofarma, Globo Pharma,
Medley, Abbott...
Gestão de Projetos - FIOCRUZ

Objetivos
❑ O que é validação de métodos?
❖ Qual a sua importância?
❑ Quais documentos uma validação gera?
❑ Quais são os parâmetros avaliados em uma validação analítica?

❖ Quando e como devo utilizá-los?
❑ Qual a diferença entre validação e verificação?
❑ Quando devo fazer uma transferência de métodos?

Conteúdo Programático
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Histórico, Técnicas
conceito e Parâmetros de validação analíticas x
Como validar? Abordagens
importância Validação
Seletividade Exatidão Linearidade
Planejamento Robustez Precisão Faixa de Validação Cromatografia
RDC 166/2017 trabalho
ICH Q2, Q2/R2, Documentação Verificação Titulação
Q14... LOD e LOQ Transferência Entre outros
Boas práticas
Farmacopeias
Bloco 1 Bloco 2
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Boas práticas
Farmacopeias
Validação de métodos
Breve histórico internacional
Publicações do ICH
1994 1996 2005 2022

Aprovação do Aprovação do Publicação do Guia Q2(R1)
Guia Q2A Guia Q2B Guia Q2(R1) que entra em revisão
unifica os dois para alinhamento
primeiros com o Guia Q14
Fonte: Adaptado de https://www.linkedin.com/pulse/validação-analítica-na-indústria-farmacêutica-breve-josiane-/?originalSubdomain=pt

Validação de métodos
Como tudo começou no Brasil?
Legislações - breve histórico
1999 2002 2003 2017 2022

RE nº391: RDC nº475 RE nº899 RDC nº166 Participação da
Anvisa na revisão do
Dispunha sobre a Define quando os Atualiza critérios e Guia ICH Q2 (R2)
validação de Normatiza a métodos analíticos parâmetros para
métodos e processos Validação de devem ser validação de métodos
de fabricação, Metodologia validados e quais analíticos
critérios para registro Analítica, por meio parâmetros devem
e controle da da publicação do ser empregados
qualidade de Guia para
medicamentos Validação Analítica
genéricos.
Fonte: Adaptado de Ferreira, Caio Cavalcanti de Oliveira

Desenvolvimento de Métodos
Condições
metodológicas
Ativo
Cuidados a
Objetivo serem Equipamentos
tomados
Técnica Método
Procedimento
Reagentes
a ser seguido
P&D Preparo e
estabilidade
das soluções
Método Analítico
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É possível dormir tranquilo!?

Validar ou não validar? Eis a questão...
Avaliação sistemática de um método por meio de ensaios experimentais
de modo a confirmar e fornecer evidências objetivas de que os
requisitos específicos para seu uso pretendido são atendidos
Fonte: RDC 166/2017
O objetivo da validação
de um procedimento analítico Ação ou efeito
é demonstrar que é adequado de validar, tornar
para o fim a que se destina válido, legitimar
Fonte: ICH Q2 R1
Fonte: Dicionário
Trata-se de desafiar
o método
desenvolvido, com
o objetivo de
atestar a sua
adequabilidade!
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A validação é a
garantia de que o
método funciona
bem e pode ser
utilizado por
todos!
Foto de Javardh na Unsplash

Assim sendo, tenho uma dúvida...
Validação
ação de provar, Qualificação
de acordo com os ação de provar que quaisquer Ex.: Qualifica-se
princípios das BPF, que instalações, equipamentos, uma autoclave,
qualquer procedimento, utilidades e sistemas funcionam valida-se um
processo, equipamento, corretamente e realmente levam processo de
material, atividade ou aos resultados esperados esterilização”
sistema realmente leva aos
resultados esperados
Fonte: RDC Nº 658/2022

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Boas práticas
Farmacopeias
Qual seria o norte?
Documento geral que estabelece as diretrizes
de validação adotadas pelo fabricante
Plano O PMV é mais do que um plano de
Mestre de execução das validações!
Validação
Consiste no compromisso
da organização de garantir que os
sistemas validados satisfaçam as
expectativas regulatórias
Programa de trabalho de validação
Definição detalhes
Responsabilidades
cronograma
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Por onde começar a validação analítica?
▪ Substância Química de Referência

Relatório de (Farmacopeica, caracterizada)
Desenvolvimento
▪ Reagentes
▪ Equipamentos qualificados/calibrados
▪ Área laboratorial adequada
Método de
Análise ▪ Vidrarias no montante adequado
▪ Planilhas/softwares de quantificação
Especificação
Como prosseguir?
Entendimento
Plano de
do escopo / Elaboração do
condução do
aplicação do protocolo
estudo
método
Revisão /
Tratamento dos Condução das
Aprovação do
dados gerados análises
protocolo
Revisão / Publicação do
Elaboração do
Aprovação do método de
Relatório
relatório análise
Quais documentos precisam ser elaborados?
❖Relatório de desenvolvimento de método

❖Protocolo de validação
❖Folhas de acompanhamento (dados brutos)
❖Evidência da avaliação estatística dos dados gerados
❖Relatório de validação
❖Método de análise
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Protocolo x Relatório
Informações importantes
❖ Elaboradores/Revisores/Aprovadores
❖ Objetivo do método
❖ Escopo da validação:
Molécula, produto, compostos relacionados
❖ POPs relacionados:
Equipamentos e procedimentos operacionais
❖ Descrição do método de análise
❖ Equipamentos/Softwares
❖ Reagentes
❖ Substâncias químicas de referência
❖ Parâmetros de validação com
planejamento detalhado de execução
❖ Tabela com resumo dos testes
Quais métodos devem ser validados?
• Identidade • Quantidade
do analito de impurezas
presente na
• Ex.: CCD, amostra
Reatividade • Ex.: HPLC,
química CG...
Impurezas
Identificação
Quantitativo
Quantificação Ensaio Limite
• Doseamento
do analito • Ex.: Teste
• Ex.: Teor, colorimétrico
dissolução
Fonte: RDC 166/2017
Quais métodos devem ser validados?
• Identidade • Quantidade
do analito de impurezas
presente na
• Ex.: CCD, amostra
Reatividade • Ex.: HPLC,
química CG...
Identificação Impurezas
Quantitativo Categoria 3
Categoria 4
Testes de performance
Categoria 2 Ex.: Dissolução
Categoria 1
Quantificação Ensaio Limite
• Doseamento
do analito • Ex.: Teste
• Ex.: Teor, colorimétrico
dissolução
Fonte: RDC 166/2017 X USP 1225
Como desafiar um método?
Exatidão
Linearidade
Precisão
e faixa
O emprego dos parâmetros de

Parâmetros
de validação variam conforme
Validação
finalidade do método de
LOD e LOQ Robustez análise!!
Seletividade
Fonte: USP 1225

Quais parâmetros devem ser avaliados?
Categoria 2
Categoria 1 Categoria 3 Categoria 4
Parâmetro Impurezas
Doseamento Ensaio Performance Identificação
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Robustez Durante o desenvolvimento do método

Fonte: USP 1225
Quais métodos não carecem de validação?
• Métodos gerais compendiais básicos:

❖ Medida de pH
❖ Perda por secagem
❖ Cinzas sulfatadas
❖ Umidade
❖ Desintegração...
• Métodos descritos em monografias individuais

compendiais de insumos farmacêuticos não ativos.
Fonte: RDC 166/2017

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Histórico, Parâmetros de validação Técnicas
conceito e Como validar? Abordagens analíticas x
Boas práticas
Farmacopeias
Seletividade - Especificidade
Seletivo
Que escolhe, seleciona
tendo em conta preceitos
ou objetivos determinados;
exigente, rigoroso.
Fonte: Dicionário
Específico
Que se destina ou
pertence exclusivamente a
algo ou alguém; exclusivo.
Fonte: Dicionário
Seletividade - Especificidade
A seletividade deve ser

demonstrada por meio da
capacidade do método de
identificar ou quantificar o
analito de interesse,
inequivocamente, na
presença de componentes
que podem estar
presentes na amostra,
como impurezas, diluentes
e componentes da matriz.
Fonte: https://mapadelondres.org/onde-esta-o-wally-origem-e-curiosidades/
Fonte: RDC 166/2017
Fonte: https://www.garotasgeeks.com/onde-esta-wally-ganhara-desenho-animado-com-diversas-viagens-ao-redor-do-mundo/
Quando avaliar a seletividade?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP 1225

Estratégia analítica
Avaliar Contaminar as Demonstrar
Cat. 1 = Quantificação
Cat. 4 = Identificação compostos amostras com que o teor não
relacionados impurezas, é afetado pela
Cat. 2 = Impurezas
passíveis de subst. presença de
estarem relacionadas e impurezas e
presentes na produtos de excipientes
amostra: degradação
Método
+ = padrão Quantificar cromatográfico
+ = amostra impurezas com = avaliar a
- = comp. exatidão e pureza dos
relacionado precisão picos
Resolução!
Nota: Cat. 3 = Performance: Seguir conforme Cat. 1 = Quantificação

Padrão Amostra
Condições
Diluentes Reagentes metodológicas
Distinção do ativo de interesse dos

Impurezas Produtos demais componentes
de
degradação
Abordagem acadêmica (HPLC_Ex. 1)
Fonte: O. Galanopoulou et al.; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48 (2008) 70–77
Abordagem acadêmica (HPLC – Ex. 2)
Fonte: Baker MM, et al. Validated stability-indicating HPLC-DAD method for determination of the recently approved hepatitis C antiviral agent daclatasvir. Ann
Pharm Fr (2017)
Estudo de degradação
Cromatograma Padrão
Fonte: Baker MM, et al. Validated stability-indicating HPLC-DAD method for determination of the recently approved hepatitis C antiviral agent daclatasvir. Ann
Pharm Fr (2017)
Avaliação da Pureza de Pico

Fonte: T. V. Raghava Raju et al.; Development and Validation of a Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Estimation of Diacerein Impurities
in API and Pharmaceutical Formulation, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 37:4, 498-515
Fonte: T. V. Raghava Raju et al.; Development and Validation of a Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Estimation of Diacerein Impurities
in API and Pharmaceutical Formulation, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 37:4, 498-515
Ficou difícil?
O que devo fazer?
Nem sempre é possível demonstrar que um procedimento analítico

é específico para um determinado analito (discriminação completa)
Neste caso, uma combinação de dois ou mais

procedimentos analíticos é recomendada para atingir o nível
necessário de discriminação!
Critério de aceitação
Métodos cromatográficos Métodos não-cromatográficos
❖ Resolução entre os picos ❖ Sinal + para o ativo e – para

❖ Pureza de picos (Detector DAD): demais soluções e compostos
Comparação espectral similares
❖ Ausência de interferentes no
mesmo tempo de retenção do
ativo de interesse
Robustez
Robusto
Vigoroso; que possui força; de
estrutura física muito forte,
resistente.
Inabalável; que não desiste
facilmente.
Fonte: Dicionário Robustez
característica do que é
sólido; solidez.
resistência;
Fonte: Dicionário
Robustez
A robustez
é um parâmetro
tipicamente realizado
no desenvolvimento
do método analítico
que indica a sua
capacidade em
resistir a pequenas e
deliberadas variações
das condições
analíticas.
Fonte: RDC 166/2017
Foto de Matt Bowden na Unsplash

Foto de Matt Bowden na Unsplash
Robustez
Pequenas e
deliberadas
=
que podem
acontecer
na rotina analítica
Quando avaliar a robustez?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP
Preparo das amostras Espectrofotometria Cromatografia Líquida Cromatografia Gasosa Outras técnicas analíticas
Estabilidade das Diferentes lotes ou

Variação do pH Temperatura Definir criticamente
soluções analíticas fabricantes de colunas
Diferentes lotes ou
Tempo de extração Variação do pH da FM Temperatura
fabricantes de solventes
Compatibilidade de Variação na composição Velocidade do gás de
filtros da FM arraste
Fluxo da fase móvel
Diferentes lotes ou
fabricantes de colunas
Caso haja susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas,

estas deverão ser controladas por meio de precauções descritas no método.
Preparo da amostra
Quais são os
atributos
críticos do
seu método?
Padrão Amostra Padrão Amostra Padrão Amostra
Variação no tempo Compatibilidade de Reagentes

de extração: filtros Marca, lote,
Padrão Amostra Diferentes PVDF, Nylon, Papel concentração
técnicas/velocidade/
associação
Condições
metodológicas
originais
Padrão Amostra Padrão Amostra
pH das soluções Procedimento de

Quais tampões preparo
utilizar? Ordem de execução
Avaliação comparativa

Condições Variação no tempo

Condições Compatibilidade de
metodológicas de extração:
metodológicas filtros
originais Diferentes
originais PVDF, Nylon, Papel
técnicas/velocidade/
associação
O que se deve avaliar? Planejamento!

Recuperação N° de réplicas
Adequabilidade do sistema Condição original x Alteração = mesmo dia
Como calcular – Condições gerais
Como calcular – estabilidade de soluções
No caso de métodos quantitativos, o impacto das variações

propostas nos resultados obtidos deverá ser avaliado com os
mesmos critérios utilizados para a exatidão.
No caso de métodos qualitativos, deve ser verificado se as

variações propostas interferem na resposta analítica.
Importante!
Faz-se necessário submeter
padrão e amostra às mesmas
condições analíticas!
Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements
A discussão do impacto das alterações no perfil cromatográfico é

especialmente importante!!
Abordagem acadêmica (HPLC)
Fonte: O. Galanopoulou et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48 (2008) 70–77
Método Original Variações

❖ Coluna: X-Terra C18, 4,6 x 100 mm, 5µm
❖ Coluna: 3 colunas (lote ou
❖ Temperatura da coluna: 30°C
fabricante?)
❖ Fase móvel: ACN: Tampão fosfato pH 2,5
❖ Fase móvel: ACN: Tampão fosfato
(40:60 v/v)
pH 2,5 (42:58 v/v) e (38:62 v/v)
❖ Fluxo: 0,8 mL/min
❖ Fluxo: 0,6 mL/min e 1,2 mL/min
❖ Comprimento de onda: 240 nm
❖ Volume de injeção: 10 µL
Diferentes colunas e variação na composição da fase móvel (± 2%) =

Ausência de impacto
Abordagem acadêmica (Titulação)
Fonte: L. Suntornsuk et al. / J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 849–855
Método Original
L. Suntornsuk et al. / J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 849–855
Variações
Sumarizando...
Muito obrigada!!
Foto de Markus Winkler na Unsplash

Histórico da Importância
Conceito de de validar
validação no
validação métodos de
Brasil
análise
Como começar? Parâmetros

Planejamento de
Documentação validação
Boas práticas
Seletividade
Especificidade Robustez
Recapitulando... Foto de Kelly Sikkema na Unsplash

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Boas práticas
Farmacopeias
Exatidão
Perfeição, cumprimento
rigoroso, diferença entre o
valor verdadeiro e o valor
observado de uma grandeza
Fonte: Dicionário
A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de

concordância entre os resultados individuais do método em estudo em
relação a um valor aceito como verdadeiro
Fonte: RDC 166/2017
Exatidão
Avaliação da
capacidade do
método de recuperar
exatamente a
quantidade de ativo
presente na
amostra!
Foto de Afif Ramdhasuma na Unsplash

Quando avaliar a exatidão?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP
9 pesagens independentes
Teor – 80%
Uniformidade – 70%
Impurezas - LOQ
Amostra – Nível baixo
Padrão 3 soluções estoque

100%
Amostra – Nível Médio
Padrão Teor – 120%

check Uniformidade – 130%
Impurezas – 120%
Amostra – Nível Alto
Mimetização da amostra
Padrão + placebo
Teor – 80%
Impurezas - LOQ
Padrão
100% Quantificação das amostras
Avaliação da recuperação em
Padrão Teor – 120% relação ao valor teórico
Impurezas – 120%
Padrão + placebo

Critério de aceitação – como definir?
Exemplo 1: Exemplo 2: Exemplo 3:

Teor do analito de interesse no 10 mg de IFA e peso médio de 0,1% impurezas, produto com 10
IFA 250 mg mg de IFA e peso médio de 250 mg
% Ativo = 100% % Ativo = 10/250 = 4% % Impureza

Recuperação = 98 a 102 Recuperação = 98 a 102% = 0,1% x 10 mg = 0,01 mg
= 0,01/250 = 0,004%
Recuperação = 90 a 107%
Alternativas
Comparar os resultados
obtidos no novo método com
um método previamente
estabelecido e devidamente
validado.
Inferência através da
determinação da precisão,
linearidade e especificidade.
Concentrações
crescentes
Ativo
Concentrações
de 2,5 a 7,5 µm
Mesma
concentração
Excipientes
Fonte: O. L. Suntornsuk et al. / J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 849–855
Solução estoque
de ácido ascórbico
Suco de goiaba
100% 200% 300%
400% 500% Suco
Solução fortificada – suco =

recuperação
Precisão
Reprodutibilidade dos
valores obtidos em medições
sucessivas da mesma
grandeza
Fonte: Dicionário
A precisão deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos

por meio de ensaios com amostras preparadas conforme descrito
no método analítico a ser validado
Fonte: RDC 166/2017
Foto de engin
akyurt na Unsplash
Precisão
Capacidade do
método de
apresentar
resultados
próximos uns dos
outros
Precisão
Avalia-se a dispersão
dos resultados obtidos
experimentalmente por
meio do DPR
Foto de Afif Ramdhasuma na Unsplash

Quando avaliar a precisão?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP
Teor – 80%
Impurezas - LOQ
Padrão
100%

OU
Padrão Teor – 120% Amostra – Nível Médio
Impurezas – 120%
Padrão + placebo Preparos individualizados
Mesmo analista
Repetibilidade Mesmas condições de operação
Mesma instrumentação
Corrida única
Mesma amostra e laboratório Precisão

que a repetibilidade
Dias e analistas distintos Laboratórios distintos
Precisão
Reprodutibilidade
intermediária
Padrão Padrão Padrão Padrão

check check
Amostra Amostra
Nível Médio 100% Nível Médio 100%
Repetibilidade Precisão intermediária

Analista 1 - João Analista 2 - Maria
Dia 1: 26/01/2023 Dia 2: 27/01/2023
Laboratório: Lab A Laboratório: Lab A
Método: XYZ Método: XYZ
Como calcular - Repetibilidade x Precisão
intermediária
Critério de aceitação – Repetibilidade e PI
Depende de:
I - objetivo do método
II - variabilidade intrínseca do método
III - concentração de trabalho
IV - concentração do analito na amostra

Teor do analito de interesse no IFA 10 mg de IFA e peso médio de 250 0,1% impurezas, produto com 10
mg mg de IFA e peso médio de 250 mg
% Ativo = 100%
DPR = 1,3% % Ativo = 10/250 = 4% % Impureza
DPR = 1,9% = 0,1% x 10 mg = 0,01 mg
= 0,01/250 = 0,004%
DPR = 5,3%
Critério de aceitação – Reprodutibilidade


Teor do analito de interesse no IFA 10 mg de IFA e peso médio de 250 0,1% impurezas, produto com 10
mg mg de IFA e peso médio de 250 mg
% Ativo = 100%
DPR = 2% % Ativo = 10/250 = 4% % Impureza
DPR = 3% = 0,1% x 10 mg = 0,01 mg
= 0,01/250 = 0,004%
DPR = 8%
Fonte: T. V. Raghava Raju et al.; DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A STABILITY-INDICATING RPHPLC METHOD FOR THE ESTIMATION OF
DIACEREIN IMPURITIES IN API AND PHARMACEUTICAL FORMULATION, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 37:4, 498-515
Cadê a avaliação
estatística da
precisão
intermediária?
Fonte: Baldut et al.; AIR, 5(5): 1-8, 2015; Article no.AIR.19843
Estratégia Analítica Resultados

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Boas práticas
Farmacopeias
Limite de Detecção e Quantificação
Detecção
Constatação; percepção de
algo através de seus indícios
ou sinais
Fonte: Dicionário
Quantificação
Ato ou efeito de determinar a
quantidade de qualquer coisa
Fonte: Dicionário
Foto de Steven Wright na Unsplash
Limite de
Detecção
Menor quantidade do
analito presente em uma
amostra que pode ser
detectado, porém, não
necessariamente
quantificado, sob as
condições experimentais
estabelecidas.
Fonte: RDC 166/2017
Limite de
Quantificação
LOQ = menor quantidade

do analito em uma
amostra que pode ser
determinada com precisão
e exatidão aceitáveis sob
as condições experimentais
estabelecidas.
Fonte: RDC 166/2017
Foto de patricia serna na Unsplash

Quando avaliar o LOD e LOQ?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP
Menor concentração para
Visual a qual é possível constatar
o efeito visual esperado
LOD Métodos instrumentais

Ruído obtido em amostras diluídas x branco
Razão S/R ≥ 2:1
Sinal/ruído
Cálculo
Estimativa através
da curva analítica
Métodos instrumentais
Ruído obtido em amostras diluídas x branco
Razão S/R ≥ 10:1
Sinal/ruído
LOQ Estimativa através da curva analítica
Cálculo
Avaliação
experimental
Precisão e exatidão devem ser testadas nas
concentrações correspondentes ao limite de quantificação
Relação
LOD sinal/ruído
≥ 2:1
Relação
Concentração decrescente de analito LOQ sinal/ruído
≥ 10:1
Precisão = DPR
Exatidão = Recuperação
Critério de aceitação - LOQ
Abordagem acadêmica
Fonte: Baker MM, et al. Validated stability-indicating HPLC-DAD method for determination of the recently approved
hepatitis C antiviral agent daclatasvir. Ann Pharm Fr (2017)
Cadê a comprovação da exatidão e

precisão no LOQ?
Linearidade
Linear
Que se apresenta como
uma linha ou a ela se
pode referir Linearidade
Fonte: Dicionário Condição do que segue
uma lógica, segue em linha
Fonte: Dicionário
Linearidade
Deve ser demonstrada por

meio da sua
capacidade de obter
respostas analíticas
diretamente proporcionais
à concentração de
um analito em uma
amostra.
Fonte: RDC 166/2017
Foto de Zoe na Unsplash

Quando avaliar a linearidade?
Categoria 2
Quantitativo
Limite
Exatidão
Precisão
Seletividade
LOD
LOQ
Linearidade
Intervalo
Fonte: USP
Linearidade
Resposta analítica
10
1 2 3 4 5
Concentração (mg/mL)
Solução
Padrão
Solução padrão diluída
estoque
Distribuição uniforme
Como calcular
1. Análise visual: A curva possui relação linear aparente?
2. Avaliação estatística: y = a +bx,

em que a = coeficiente linear e b = coeficiente angular
Método dos mínimos quadrados (MMQ)

• Método dos mínimos quadrados ponderados (MMQP)
• Método dos mínimos quadrados ordinários (MMQO): fator de ponderação = 1
MMQP x MMQO: Depende da variância dos resultados de y para cada x

Utilizar o teste de Cochran
• Variância constante = homoscedasticidade = MMQO
• Alterações de variância = heterocedasticidade = MMQP
Como calcular
3. Avaliação dos coeficientes
• Significância do coeficiente angular = Anova
Avalia se determinada reta de regressão estimada explica satisfatoriamente a
relação existente entre a concentração e o sinal
• Coeficiente linear = Teste t
4. Avaliação da correlação linear: coeficiente de correlação de Pearson (r)

Quanto maior o valor de r, mais forte é a correlação entre as duas variáveis e
mais realista é o modelo (equação) proposto.
O valor mínimo aceito para r é de 0,990,
5. Análise dos resíduos

Resíduo é a diferença entre o valor encontrado de y e o valor estimado pelo modelo
(equação) em um determinado ponto - quantifica a distância entre o valor real e o
estimado
Como calcular - Resumo
GUIA Nº 10/2017 – Versão 1 -Guia para Tratamento Estatístico da Validação Analítica

Como calcular - Resumo
GUIA Nº 10/2017 – Versão 1 -Guia para Tratamento Estatístico da Validação Analítica

❖ Representação gráfica das respostas em função da concentração do analito

❖ Gráfico de dispersão dos resíduos, acompanhado de sua avaliação estatística
❖ Equação da reta de regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos
quadrados
❖ Avaliação da associação linear entre as variáveis por meio do coeficientes de
correlação (r) e de determinação (r²)
❖ Avaliação da significância do coeficiente angular
• O coeficiente de correlação deve estar acima de 0,990
• O coeficiente angular deve ser significativamente diferente de zero
Abordagem acadêmica – Ex. 1
Pereira, Valquíria Rodrigues, Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE para quantificação de ácido vanílico em emulsão cosmética
Brazilian Journal of Development, Curitiba, v.7, n.12, p.112060-102072 dec. 2021
Faixa de trabalho
É o intervalo entre a
menor concentração
e a maior
concentração de
analito na amostra
Fonte: DOQ-CGCRE-008
Foto de Lennart Heim na Unsplash

Faixa de trabalho
Deve ser estabelecida

a partir dos estudos Teor = 80 a 120%
de linearidade, Uniformidade = 70 a 130%
juntamente com os Dissolução = Menor valor obtido em
resultados de perfil até 120%
precisão e exatidão, Impurezas = LOQ a 120%
sendo dependente da
aplicação pretendida. Fonte: RDC 166/2017
Fonte: RDC 166/2017

1 2 3 4 5 6 7
Boas práticas
Farmacopeias
Validação x Verificação
Verificação =
Validação Parcial
Validação = Rotina Demonstrar

adequabilidade em
condições laboratoriais
Métodos desenvolvidos específicas
internamente
Precisão,
Exatidão, Seletividade
e LOQ
Transferência de métodos
Estratégias analíticas: Etapas:
❖ Validação Parcial ❖ Planejar
❖ Reprodutibilidade ❖ Definir a estratégia analítica
e os critérios de aceitação
❖ Análise de risco:
❖ Elaborar protocolo
• experiência prévia
• conhecimento da unidade ❖ Treinar os analistas
receptora ❖ Conduzir as análises
• complexidade do produto
• complexidade do método ❖ Avaliar os dados obtidos
• especificações ❖ Elaborar relatório
❖ Publicar método de análise
no lab. recebedor
Revalidação
Uma revalidação de método analítico

pode ser necessária nas seguintes
circunstâncias:
❖ Alterações na síntese ou obtenção do IFA

❖ Alterações na composição do produto
❖ Alterações no método analítico
❖ outras alterações que possam impactar
significativamente no método validado
1 2 3 4 5 6 7
Boas práticas
Farmacopeias
Todos os parâmetros estão
conectados!
Exatidão
Ativo
Linearidade
e faixa
Precisão Objetivo
Parâmetros
de
Validação
Técnica
LOD e LOQ Robustez
Seletividade
O planejamento é essencial
previamente à experimentação Estratégia de validação
“Plano de condução do estudo”
Fonte: USP
Foto de Ana Municio na Unsplash
Como posso
ajudar
https://www.linkedin.com/in/tamara-de-almeida/
tamaraalmeida.aulas@gmail.com
Muito obrigada!!
Foto de Lina Trochez na Unsplash

Referência bibliográficas
• RDC 166/2017 - Resolução Da Diretoria Colegiada - RDC Nº
166, de 24 de julho de 2017
• ICH Q2 R1 - Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology
• USP 1225 - Validation of Compendial Procedures
• AOAC 2016 - Appendix F: Guidelines for Standard Method
Performance Requirements - AOAC Official Methods of
Analysis (2019)
• DOQ-CGCRE-008 - Orientação Sobre Validação De Métodos
Analíticos, Revisão 08 – Abr/2020
• GUIA Nº 10/2017, Versão 1 - Guia para Tratamento
Estatístico da Validação Analítica
• Dicionário - https://www.dicio.com.br/robusto/
• O. Galanopoulou et al.; Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis 48 (2008) 70–77
• Baker MM, et al. Validated stability-indicating HPLC-DAD
method for determination of the recently approved hepatitis C
antiviral agent daclatasvir. Ann Pharm Fr (2017)
• T. V. Raghava Raju et al.; Development and Validation of a
Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Estimation of
Diacerein Impurities in API and Pharmaceutical Formulation,
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,
37:4, 498-515
• L. Suntornsuk et al; Quantitation of vitamin C content in herbal
juice using direct titration / Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis; 28 (2002) 849–855
• Baldut et al.; Development and Validation of a
Complexometric Titration Method for the Determination of
Rosuvastatin Calcium in Raw Material; Advances in Research;
5(5): 1-8, 2015
• Pereira, Valquíria Rodrigues, Desenvolvimento e validação
de metodologia analítica por CLAE para quantificação de
ácido vanílico em emulsão cosmética
• Laurentino, L. S. et al; Desenvolvimento e validação
intralaboratorial de metodologia analítica para determinação
do teor de álcool etílico nas formulações antissépticas líquidas
e em gel por cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção por índice de refração (clae-ir); Brazilian Journal of
Development, Curitiba, v.7, n.12, p.112060-102072 dec. 2021
• Ferreira, Caio Cavalcanti de Oliveira. "Validação de
metodologia analítica: elaboração de um guia prático para os
laboratórios de pesquisa acadêmicos." (2018).

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Validação de métodos analíticos

Reflexões por Tamara Almeida

Farmácia Industrial – UFOP

P&D – Desenvolvimento Analítico

Gestão de Projetos - FIOCRUZ

❑ Quais documentos uma validação gera?

❑ Quais são os parâmetros avaliados em uma validação analítica?

❑ Qual a diferença entre validação e verificação?

❑ Quando devo fazer uma transferência de métodos?

1994 1996 2005 2022

Fonte: Adaptado de https://www.linkedin.com/pulse/validação-analítica-na-indústria-farmacêutica-breve-josiane-/?originalSubdomain=pt

1999 2002 2003 2017 2022

Fonte: Adaptado de Ferreira, Caio Cavalcanti de Oliveira

É possível dormir tranquilo!?

Foto de Donald Tran na Unsplash

Foto de Javardh na Unsplash

Fonte: RDC Nº 658/2022

▪ Substância Química de Referência

❖Relatório de desenvolvimento de método

Quantificação Ensaio Limite

O emprego dos parâmetros de

Fonte: USP 1225

Robustez Durante o desenvolvimento do método

• Métodos gerais compendiais básicos:

• Métodos descritos em monografias individuais

Fonte: RDC 166/2017

A seletividade deve ser

Robustez Durante o desenvolvimento do método

Fonte: USP 1225

Avaliar Contaminar as Demonstrar

Nota: Cat. 3 = Performance: Seguir conforme Cat. 1 = Quantificação

Distinção do ativo de interesse dos

Avaliação da Pureza de Pico

Nem sempre é possível demonstrar que um procedimento analítico

Neste caso, uma combinação de dois ou mais

Métodos cromatográficos Métodos não-cromatográficos

❖ Resolução entre os picos ❖ Sinal + para o ativo e – para

Foto de Matt Bowden na Unsplash

Estabilidade das Diferentes lotes ou

Caso haja susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas,

Variação no tempo Compatibilidade de Reagentes

Padrão Amostra Padrão Amostra

pH das soluções Procedimento de

Padrão Amostra Padrão Amostra

Condições Variação no tempo

O que se deve avaliar? Planejamento!

No caso de métodos quantitativos, o impacto das variações

No caso de métodos qualitativos, deve ser verificado se as

Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements

A discussão do impacto das alterações no perfil cromatográfico é

Método Original Variações

Diferentes colunas e variação na composição da fase móvel (± 2%) =

Foto de Markus Winkler na Unsplash

Como começar? Parâmetros

Recapitulando... Foto de Kelly Sikkema na Unsplash

A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de

Foto de Afif Ramdhasuma na Unsplash

Padrão 3 soluções estoque

Amostra – Nível Médio

Padrão Teor – 120%

Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements

Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements

Exemplo 1: Exemplo 2: Exemplo 3: