Letícia Alves da Cunha

Relatório LAC 1
Imunologia e biologia molecular

Bauru
2024
 SUMÁRIO

1.0 IMUNOLOGIA CLÍNICA

1.1 VDRL e FTA-Abs
1.1.1 Introdução
1.1.2 Metodologia
1.1.3 Resultados e discussão
1.2 Hemaglutinação indireta
1.2.1 Introdução
1.2.2 Metodologia
1.2.3 Resultados e discussão
1.3 ELISA
1.3.1 Introdução
1.3.2 Metodologia
1.3.3 Resultados e discussão
2.0 BIOLOGIA MOLECULAR
2.1 Extração de DNA
2.1.1 Introdução
2.1.2 Metodologia
2.1.3 Resultados e discussão
2.2 Análise de quantidade e qualidade do DNA
2.2.1 Introdução
2.2.2 Metodologia
2.2.3 Resultados e discussão
2.3 PCR
2.3.1 Introdução
2.3.2 Metodologia
3.0 BIBLIOGRAFIA

1.0 IMUNOLOGIA CLÍNICA

1.1 VDRL e FTA-Abs
1.1.1Introdução
A sífilis ainda é frequente, e quando não diagnosticada e tratada corretamente,
poderá causar sequelas irreversíveis. Desta maneira, faz-se necessário saber
quais os exames mais adequados para cada forma da infecção, bem como
interpretar os seus resultados. Atualmente, a pesquisa da doença é realizada
combinando testes específicos e não específicos.
Entre os testes não-específicos, dispomos do VDRL (Venereal Disease
Research Laboratory) que são testes quantitativos, de baixo custo, que ficam
positivos entre as segunda e quarta semanas após aparecimento do cancro de
inoculação e apresentando títulos mais elevados nas formas secundárias,
recente latente e tardia. São testes não específicos, pois detectam anticorpos
antilipídicos que surgem tanto na sífilis como em outras doenças.
Os testes treponêmicos, como o FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody
Absorption) são específicos e qualitativos, nos quais se emprega o antígeno
do Treponema pallidum. Essas reações também se tornam positivas a partir da
segunda semana após o aparecimento do cancro sifilítico, assim se mantendo
em todas as fases evolutivas da sífilis não estando indicadas para o
acompanhamento pós-tratamento da doença.
Em 85% das pessoas tratadas com sucesso, os resultados permanecem
reativos por anos ou até mesmo por toda a vida.1

Figura 1: Sífilis em fase inicial, aparecimento de crancos.

Fonte: Pebmed,2023

1.1.1 Metodologia
a. VDRL
Princípio do método: Quando a suspensão antigênica é misturada com a
amostra que contenham anticorpos, as partículas de antígeno floculam e o
resultado da reação é observado ao microscópio. A ausência de floculação
indica resultado negativo.
Procedimento teste qualitativo:
1. Pipetar 50µl dos soros controles nas cavidades da placa escavada.
2. Pipetar 20µl da suspensão antigênica homogeneizada nas mesmas
cavidades das amostras e soros controles.
3. Agitar a placa durante 4 minutos a 180rpm.
4. Imediatamente após 4 minutos, observar ao microscópio.

Procedimento teste semiquantitativo

1. Fazer diluição de amostra em solução salina a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, e
mais se necessário.
2. Pipetar 50µl de cada diluição em uma cavidade da placa escavada.
3. Pipetar 20µl da suspensão antigênica homogeneizada em cada diluição.
4. Agitar a placa durante 4 minutos a 180rpm.
5. Imediatamente após 4 minutos, observar ao microscópio.
TÍTULO DA AMOSTRA: Será a última diluição onde, ainda, se visualiza a
presença de agregados. 2

Figura 2: Placa de teste VDRL

Fonte: Autor
b. FTA-Abs
Princípio do método: Os anticorpos presentes no soro ligam-se ao antígeno
fixado na lâmina e são revelados por uma antigamaglobulina humana marcada
com isotiocianato de fluoresceína.

Procedimento:
1. Diluir os soros desconhecidos 1/5 com a solução absorvente.
2. Colocar a lâmina em câmara úmida.
3. Pingar 1 gota dos controles positivo e negativo nas áreas 1 e 2 da lâmina, e
do soro desconhecido, nas áreas restantes, evitando transbordar as áreas.
4. Incubar na câmara úmida por 30 minutos, em temperatura ambiente.
5. Lavar com 10ml de tampão PBS. Colocar a lâmina em uma jarra de Coplin e
lavar 3 vezes com PBS, 5 minutos cada vez.
6. Remover a lâmina do Coplin e tirar o excesso de PBS, sacudindo sobre o
papel absorvente.
7. Retornar à câmara úmida. Pingar 1 gota da antigamaglobulina marcada em
cada área da lâmina, tendo o cuidado de recobri-la totalmente.
8. Incubar em câmara úmida por 30 minutos, protegendo do excesso de luz.
9. Repetir a etapa 6.
10. Remover a lâmina do Coplin tirar o excesso de PBS, sacudindo-a sobre
papel absorvente. Secar em torno das áreas reativas e ir para a etapa 12 para
não secar o local da reação.
11. Pingar glicerina tamponada entre as áreas reativas. Cobrir a lâmina com
lamínula, evitando a formação de bolhas. Secar o excesso de glicerina com
papel absorvente. Limpar o dorso da lâmina.
12. Ler em microscópio de fluorescência. 3

Figura 3: placa de teste FTA-Abs

Fonte: Autor
1.1.3 Resultados e discussão
a. VDRL
Dada a metodologia, foi feito teste qualitativo do controle negativo e positivo,
para verificar a confiabilidade do teste, amostra e reagentes, além de analisar o
efeito pró zona.
Chamamos de efeito pró zona quando há um excesso de anticorpos na
amostra, causando uma relação desproporcional entre anticorpo-antígeno,
resultando em um falso negativo.
A partir disso, o controle negativo teve ausência de floculação e o positivo
apresentou floculação, sendo compatíveis com o teste, sem efeito pró zona.
Seguindo os testes, foram realizadas análises semiquantitativas na amostra
pura, diluída 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e 1/32.
Em relação a floculação, foi observado as seguintes reações:

Figura 4: Pura Figura 5: 1/2 Figura 6: 1/4

Figura 7:1/8 Figura 8: 1/16

Figura 9: 1/32

Fonte figuras 4,5,6,7,8 e 9: Autor

Assim pode-se concluir

que a amostra é positiva
até 1/16, já que o poço de
diluição 1/32 não floculou,
pois não houve reação de
antígeno-anticorpo,
apresentando um caráter
negativo para sífilis.
Para concluir esta análise, o indicado é realizar o exame confirmatório para
prosseguir com um diagnóstico, pois o VDRL não é um exame treponêmico, já
que este realiza reação com antígeno cardiolipina, que não é exclusivo da
sífilis, assim sendo, o teste poderia ser positivo para alguma outra doença que
também apresenta destruição celular.
b. FTA-Abs
Seguindo a metodologia indicada, o resultado obtido a partir dessa análise foi
positivo nas amostras 1,2 e 3 para Treponema pallidum, onde pôde ser
observado espiroquetas amarelo-esverdeadas fluorescentes.
Foi testado o controle positivo e negativo, onde é analisado se houve alguma
contaminação ou se os reagentes mantiveram a integridade, para que a
credibilidade do teste se mantenha e ambos estavam corretos.
Durante a leitura da lâmina, foi observado algo semelhante a figura a seguir:

Figura 10: Treponema pallidum

Fonte: CASTILHOS, Giovana, 2015.

Nesta análise, o passo mais importante é a lavagem, que deve ser feita
rigorosamente, para evitar um falso positivo. Na lavagem os anticorpos que não
foram ligados são retirados da lâmina, assim o marcador vai flourescer apenas
os anticorpos de interesse clínico que reagiram com o antígeno apresentado no
teste. Caso a lavagem não seja feita da maneira correta, anticorpos presentes
na amostra, mesmo que não estejam ligados com um antígeno, vão se fixar na
lâmina e durante a leitura o resultado será positivo.

1.2 Hemaglutinação indireta

1.2.1 Introdução
A reação de hemaglutinação pode ser usada para detecção ou identificação
preliminar de vírus isolados, pesquisando quais as hemácias que estes vírus
aglutinam.4
A importância clínica do teste é:
 Diagnóstico de Infecções Virais: Ele é utilizado para confirmar a presença
de infecções e para identificar o tipo específico do vírus.
 Monitoramento da Imunidade: Usado para monitorar a resposta imunológica
do paciente após a vacinação contra vírus. Pode determinar se uma pessoa
desenvolveu anticorpos para protegê-la contra futuras infecções.
 Epidemiologia e Vigilância: Os profissionais de saúde podem monitorar a
propagação de doenças virais em uma população e identificar quais cepas
virais estão circulando em determinada época. Isso é fundamental para o
planejamento de estratégias de saúde pública.5

1.2.2 Metodologia
Princípio do método: Baseia-se na ligação de anticorpos presentes no soro e
hemácias sensibilizadas com antígenos. Os anticorpos presentes no soro ligam
aos antígenos que estão nas hemácias, resultando na hemaglutinação.

Procedimento:
1. Colocar uma gota de 25 ul de Diluente de soro em todas as cavidades da
microplaca.
2. Tomar uma alíquota de cada soro, ensaiar com microdiluidores de 25 ul e
colocar nas cavidades da coluna 1.
3. Realizar diluições a partir da coluna 1 (diluição 1/2), passando os
microdiluidores à coluna 2 (diluição 1/4) e assim sucessivamente até a coluna 6
(diluição 1/64). Se forem processados mais de 8 soros, utilizar as colunas 7 a
12, realizando as diluições da maneira descrita anteriormente.
4. Colocar nas colunas 1 e 2 (diluições 1/2 e 1/4) uma gota (25 ul) de GR não
sensibilizados, para controle de heterofilia. Fazer o mesmo nas colunas 7 e 8
no caso de sejam utilizadas.
5. No resto das cavidades, adicionar uma gota de 25 ul de Antígeno.
6. Agitar a microplaca, golpeando com os dedos nas paredes laterais durante
30 segundos no mínimo.
7. Deixar em repouso, ao abrigo de vibrações, durante 90 minutos.

1.2.3 Resultados e discussão

O kit apresenta hemácias de carneiro, por essa razão foi testado se havia
presença de anticorpos heterofilos na amostra, pois os anticorpos heterofilos
têm afinidade pelas hemácias de carneiro e se ligam, resultando um falso
positivo. Neste teste, o resultado foi negativo para anticorpos heterofilos.
Caso o teste de heterofilia desse positivo, todo o processo teria que ser
dispensado e repetido, onde a amostra teria que ser centrifugada e seria
utilizado o sobrenadante para realizar um novo teste.
Já o teste de hemaglutinação obteve um resultado positivo, onde foi testado em
diluição de até 1/64, desta forma deveria continuar testando até aparecer um
resultado negativo e o laudo seria o último resultado positivo.
Na figura a seguir pode-se analisar os resultados obtidos, onde a análise
macroscópica de botão significa resultado negativo e a formação de manto
significa positivo.
 Figura 11: Microplaca de hemaglutinação

Fonte: Autor

Figura 12: Resultados macroscópicos

Fonte: Gold Analisa, 2015

1.3 ELISA
1.3.1 Introdução
É uma técnica imunoenzimática amplamente utilizada em laboratórios clínicos
e de pesquisa biomédica para a detecção e quantificação de substâncias
biológicas, como antígenos, anticorpos, hormônios, e biomarcadores
específicos. O teste é utilizado para realizar diagnóstico de doenças
autoimunes bem como infecciosas e alérgicas. Isso porque, a fisiopatologia das
causas supracitadas desencadeia a produção de imunoglobulinas que é a base
do teste. Por apresentar baixo custo e alta especificidade e sensibilidade esse
método tornou-se imprescindível. 6
Algumas das principais aplicações clínicas do ELISA incluem:
 Diagnóstico de doenças infecciosas: detectar a presença de agentes
infecciosos, como vírus, bactérias, e parasitas, através da detecção de
anticorpos específicos ou antígenos virais nas amostras dos pacientes. Por
exemplo, diagnóstico de HIV, hepatite, doenças transmitidas por carrapatos.
 Monitoramento de resposta imune: monitorar a resposta imune do paciente
durante a infecção ou após a vacinação. Isso é feito medindo os níveis de
anticorpos específicos produzidos contra o agente infeccioso ou a vacina.
 Diagnóstico de doenças autoimunes: No diagnóstico de doenças
autoimunes, pode ser usado para detectar a presença de autoanticorpos
circulantes no soro dos pacientes. Esses autoanticorpos são marcadores
importantes para várias doenças autoimunes, como lúpus eritematoso
sistêmico, artrite reumatoide, e doença celíaca.
 Triagem de doenças metabólicas: é utilizado na triagem de distúrbios
metabólicos, como fenilcetonúria e hipotireoidismo congênito, detectando a
presença de biomarcadores específicos no sangue do recém-nascido.
 Diagnóstico de alergias: pode ser usado para diagnosticar alergias,
detectando a presença de IgE específica para alérgenos em amostras de
soro dos pacientes.7

Figura 13: Teste ELISA

Fonte: Autor
1.3.2 Metodologia
Princípio da técnica:
Detecção qualitativa de anticorpos específicos através da interação entre
moléculas antigênicas e anticorpos, combinadas com a detecção enzimática.
A execução cuidadosa dessas etapas é essencial para garantir a sensibilidade,
especificidade e precisão da técnica.8

Procedimento:
1- Levar os reagentes e as amostras a temperatura ambiente antes de iniciar a
prova.
2- Preparar o volume necessário de Tampão de Lavagem diluído.
3- Colocar no suporte de tiras, o número de cubetas requeridas para a
quantidade de determinações a realizar, incluindo 2 cubetas para o Controle
Positivo (CP) e 3 para o Controle Negativo (CN).
4- Colocar o Diluente de Amostra e nos controles.
5- Para evitar a evaporação, cobrir a policubeta com a fita autoadesiva
fornecida, e incubar 60 a 37º C. Paralelamente, preparar o conjugado diluído
6- Após da incubação, eliminar completamente o líquido de cada cubeta. Lavar
5 vezes seguindo as instruções de lavagem
7- Acrescentar o Conjugado.
8- Incubar 30 minutos a 37ºC.
9- Lavar 5 vezes segundo as instruções de lavagem.
10- Colocar o Revelador, transvasando a um recipiente limpo apenas o volume
necessário de Revelador. Não voltar o Revelador remanescente ao frasco
original. Evitar o contato do reagente com agentes oxidantes.
11- Incubar 30 minutos a temperatura ambiente (18- 25o C), ao abrigo da luz.
12- Acrescentar o Stopper.9

1.3.3 Resultados e discussão

O teste foi feito de acordo com o roteiro do kit, onde foi feito: 1 controle branco,
2 controles positivos, 3 controles negativos e 2 amostras. Todos os resultados
de controle foram o esperado e as amostras deram positivas. Durante a
análise, pode-se observar a mudança de cor das reações depois de colocar o
substrato, já indicando uma possível reação positiva e após levar a análise
para o espectrofotômetro, o resultado foi confirmado.
Observa-se que o processo de lavagem foi feito metodicamente, para evitar um
resultado falso positivo, pois se houvesse uma má lavagem poderia sobrar
anticorpos que não foram ligados e parte do conjugado que foi adicionado,
assim na hora de colocar o substrato, esse marcaria outros tipos de anticorpos
presente na amostra, e não somente o de interesse clínico.
Apesar do ELISA ser um teste qualitativo, o espectrofotômetro lê a cor
proporcionalmente à quantidade de complexos antígeno-anticorpo formados,
dessa forma, o resultado numérico está relacionado com a absorbância óptica.
Podemos analisar os resultados desta análise na figura a seguir:

Figura: 14: Resultado do ELISA através do espectrofotômetro

Fonte: Autor
2.0 BIOLOGIA MOLECULAR

2.1 Extração de DNA

2.1.1 Introdução
A extração de DNA é o primeiro passo para utilizá-lo em técnicas moleculares.
As técnicas de extração de DNA têm permitido a investigação de diferentes
amostras biológicas mesmo quando o DNA está presente em pequenas
quantidades. Vários campos da ciência são beneficiados com esse
aperfeiçoamento, como a medicina forense, as investigações criminais,
exclusão de paternidade, a busca de marcadores tumorais ou agentes
infecciosos, e o transplante de medula identificando a pega do enxerto. Pontas
de cigarro, saliva, esfregaço bucal, soro, bulbos capilares, entre outros, podem
fornecer informações importantes desde que analisados de forma adequada.10

2.1.2 Metodologia
a. Lise de hemácias
1. Coletar 4ml de sangue em tubo contendo EDTA como anticoagulante;
2. Transferir para Falcon de 15ml e centrifugar durante 8 minutos a 4.400 rpm
3. Descartar o plasma com uma P1000
4. Adicionar 9ml de solução TM1 – 1X
5. Suspender células com Pasteur e centrifugar durante 8 minutos a 4.400 rpm
6. Descartar o sobrenadante por inversão do tubo
7. Adicionar 8,5ml de solução TM1 – 1X
8. Suspender as células com uma Pasteur
9. Centrifugar durante 8 minutos a 4.400 rpm
10. Repetir os passos 5 e 6.11

Figuras 15 e 16: Pallet com DNA

Fonte: Autor
b. Extração
1. Adicionar ao pellet de leucócitos 1,6ml de solução TM2
2. Adicionar 160µl de SDS 10% e vortexar
3. Incubar em banho-maria durante 15 minutos a 56°C
4. Adicionar 480µl de NaCl 5M e vortexar
5. Transferir a solução para um tubo eppendorf de 2ml
6. Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 rpm
7. Retirar o sobrenadante e transferir para um tubo Falcon de 15ml
8. Adicionar 5ml de Etanol absoluto gelado
9. Homogeneizar por inversão até a precipitação do DNA
10. Com a P200 retirar o DNA e transferir para um eppendorf de 1,5ml
11. Secar na estufa a 50°C durante 5 minutos
12. Ressuspender o DNA em 200µl de água DNAs Free
13. Incubar no banho-maria a 56°C durante 10 minutos.12

2.1.3 Resultados e discussão

Neste procedimento foi feito as orientações da bula e como pode ser
observado na figura 16, foi obtido o pallet de DNA, porém foi perdido durante a
pipetagem.
Desta forma, foi recolhido restos de amostras de outras alunas, para fazer um
catado e realizar a análise. Com isso, foi obtido um novo pallet, porém bem
pequeno e com pouquíssimo material genético.

2.2 Análise de quantidade e qualidade do DNA

2.2.1 Introdução
A análise de quantidade, qualidade e integridade do DNA são fundamentais
para o sucesso nas etapas posteriores de um teste de biologia molecular.
Desta forma, deve-se analisar a degradação da amostra, para verificar sua
usabilidade e credibilidade. Um dos aspectos importantes é a quantidade de
DNA necessária, que varia em função da técnica molecular a ser utilizada.
Entre as técnicas disponíveis para estimar a concentração de DNA, as mais
utilizadas são a leitura em espectrofotômetro e a análise de eletroforese em gel
de agarose. 13

2.2.2 Metodologia
1. Preparar 100ml de gel de agarose a 1%. Para isso, pesar 1 g de agarose e
colocar em um Erlenmeyer juntamente com 100ml de TBE
2. Colocar o Erlenmeyer na balança e tarar a fim de posteriormente completar a
água que será perdida durante a evaporação no processo de fervura
3. Cobrir a boca do Erlenmeyer com papel alumínio e colocar na chapa
aquecedora.
4. Colocar novamente o erlenmeyer na balança e acrescentar água deionizada
5. Esfriar o gel colocando Erlenmeyer sob água corrente na torneira,
homogeneizando com movimentos suaves até ficar morno
6. Com uma Pasteur aspirar um pouco do gel e aplicar nas laterais da base de
preparo do gel, a fim de vedá-la
7. Adicionar ao gel, no erlenmeyer, 5µl do DSView Nucleic Acid Stain e
homogeneizar
8. Depositar o gel na cuba e colocar o pente. Aguardar 20 minutos para a
gelificação
9. Preparar as amostras de DNA a serem aplicadas no gel adicionando a um
eppendorf 5µl de DNA + 4µl água DNAs free + 1µl Orange Loading buffer 10x
10. Aplicar as amostras no gel e anotar a sequência determinada
11. Fechar a tampa da cuba, conectar os eletrodos, programar a fonte para
100V e iniciar a corrida
12. Após o término da corrida, retirar o gel e visualizar no transiluminador UV
usando óculos de proteção.14

2.2.3 Resultados e discussão

O DNA das amostras não deve migrar no gel, se fragmentos de DNA ocorrerem
ao longo da linha da canaleta, o DNA está degradado. Normalmente a
degradação ocorre pelo manuseio inadequado, período de armazenamento
muito longo, armazenamento inadequado entre outros fatores. Quanto mais
DNA ocorrer ao longo da linha, maior é a degradação. Amostras de DNA com
razoável degradação devem ser descartadas.
De acordo com a imagem 17 (a seguir) observa-se os resultados obtidos pelas
alunas, onde o resultado individual é lido no poço de número 7, onde podemos
concluir que apesar de pouco material, a amostra se apresentou integra.

Figura 17: Resultados qualitativos e de integridade

Fonte: Autor

Também foi feito análise de quantidade no Nanodrop, onde o gráfico obtido

estava fora da curva padrão, além dos valores estarem extremamente abaixo
do esperado, pois como já dito anteriormente, a presente amostra obtinha
pouco material genético. No Nanodrop, o valor de referência é 230/260, já o
resultado obtido não houve formação de uma curva para fazer a leitura pela
pouca quantidade de material, como podemos observar na leitura numérica
que deu 6,1 ng/ul, sendo o valor esperado entre 2,0 e 2,2 ng/ul.
 Figura 18 e 19: Resultados do Nanodrop

Fontes: Autor

2.3 PCR
2.3.1 Introdução
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica para fazer muitas
cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao
invés de um organismo). A PCR depende de uma DNA polimerase
termoestável, a Taq polimerase, e requer primers de DNA projetados
especificamente para a região de interesse do DNA.
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de
interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de
alguma outra maneira. Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de
uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas
cópias da região de interesse.
A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente
usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de
DNA.15

2.3.2 Metodologia
1. Antes de iniciar a reação, ligue o termociclador.
2. Limpar a workstation com etanol 70% e ligar a luz UV durante 10 minutos
3. Retirar as amostras de DNA e os reagentes para descongelar (exceto a
enzima Taq) e colocá-los protegidos da luz UV
4. Preparar o PCR Mix em um eppendorf de 1,5ml
5. Aliquotar o PCR Mix nos tubos de PCR (200 ul) e identificá-los - Após ter
guardado os reagentes, colocar as amostras de DNA na workstation e adicionar
aos tubos correspondentes
6. Colocar os tubos no termociclador, selecionar o programa de interesse e
iniciar a reação.
7. Guardar as amostras, limpar novamente a workstation e ligar a luz UV
durante 10 minutos.14
3.0 REFERÊNCIAS

1- SCIELO BRASIL. Interpretação das reações sorológicas para diagnóstico e

seguimento pós-terapêutico da sífilis, [s. l.], dez. 2004. Disponível em:
https://doi.org/10.1590/S0101-98802007000400018. Acesso em: 20 fev. 2024.

2- WADA DIAGNÓSTICA. VDRL / SÍFILIS. Bula, [s. l.], ago. 2021. Disponível
em: https://www.wamadiagnostica.com.br/bulas/diversos/vdrl-sifilis-com-
controle-1.pdf. Acesso em: 22 fev. 2024.

3- WADA DIAGNÓSTICA. FTA-Abs Sífilis. Bula, [s. l.], abr. 2019. Disponível
em: https://www.wamadiagnostica.com.br/bulas/imuno-con/fta-abs-sifilis-1.pdf.
Acesso em: 26 fev. 2024.

4- ICB – USP. Reações de hemaglutinação e Inibição da

hemaglutinação. Prática, [s. l.], dez. 2016. Disponível em:
https://microbiologia.icb.usp.br/wp-content/uploads/2016/12/bmm-280-
praticahemaglutinacao.pdf. Acesso em: 27 fev. 2024.

5- Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. Imunologia Celular e Molecular. 9. ed.

Rio de Janeiro: Elsevier, 2018. Acesso em: 04 mar. 2024

6- WIENER LAB. Toxotest. Bula, [s. l.], out. 2019. Disponível em:
https://api.labpedia.com.br/api/uploads/1600200147toxotest_hai_po.pdf.
Acesso em: 2 mar. 2024.

7- BRAZILIAN JOURNAL OF DEVELOPMENT. A técnica de Elisa e a sua

importância para o diagnóstico clínico, [s. l.], ago. 2021. Disponível em:
https://ojs.brazilianjournals.com.br/ojs/index.php/BRJD/article/download/
22021/17577/56541. Acesso em: 1 mar. 2024.

8- BRASIL. Ministério da saúde. Doenças Infecciosas e Parasitárias. 2º. ed. rev.

[S. l.: s. n.], 2000. Disponível em:
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/funasa/GBDIP001_total.pdf.
Acesso em: 5 mar. 2024.

9- WIENER LAB. Chagatest, [s. l.], 10 ago. 2023. Disponível em:

https://webapi.wiener-lab.com/api/file/1776/chagatest_elisa_recombinante_v4_
0_po.pdf. Acesso em: 3 mar. 2024.

10- BUENO, Valquiria. DNA e aperfeiçoamento das técnicas de

extração. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26, p. 233-
234, 2004.

11- OLIVEIRA, MC de S. et al. Fundamentos teóricos-práticos e protocolos de

extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia
de polimerase. 2007.
12- ABRÃO, M. G. et al.. Padronização da técnica de extração de DNA de
células de mucosa oral com NaCl: aplicação no estudo do gene PROP1.
Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, v. 49, n. 6, p. 978–982,
dez. 2005.

13- COSTA, M.R.; MOURA, E.F. Manual de extração de DNA. Embrapa, 24p.
(Embrapa Amazônia Oriental. Documentos, 89). 2001.

14- POZZOBON, Adriane. Biomedicina na prática: da teoria à

bancada. Lajeado: Ed. Da Univates, 2017.

15- Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V.,
and Jackson, R. B. (2011). Forensic evidence and genetic profiles. (10th ed.,
pp. 430-431). San Francisco, CA: Pearson.