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Artigo Histo-2
Artigo Histo-2
Introdução
A intoxicação é um dos campos de estudo da medicina legal, e os agrotóxicos são agentes
que levam à intoxicação. Em todo o mundo, os pesticidas são amplamente utilizados na
agricultura para a produção de alimentos. Como resultado deste uso extensivo de
pesticidas, os seres humanos são regularmente expostos a pesticidas e aos seus resíduos.
A ingestão de alimentos e água potável são as principais fontes de contaminação da
população em geral através do acúmulo persistente de resíduos de pesticidas no meio
ambiente1,2.
Métodos
Animais experimentais e desenho do estudo
A pesquisa foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de
Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA em 2011. Todos os
procedimentos realizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de Ética para o
Tratamento de Animais Experimentais (Dicle University , Turquia, número de protocolo:
2021/03). Os ratos foram fornecidos pela Dicle University, Centro de Pesquisa e Aplicação
do Departamento de Ciências Médicas.
Análises bioquímicas
Amostras de sangue foram colocadas nos tubos e em seguida foi feita a centrifugação. Os
valores séricos de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT)
foram determinados em U/L usando o Abbott Architect c16.000 Autoanalyzer.
Método histopatológico
Método imunohistoquímico
Primeiramente, por 5 min e depois por 4 min, o processo de recuperação antigênica foi
conduzido nos cortes que permaneceram em solução tampão citrato (pH=6) fervida em
forno de micro-ondas a 700 W (Bosch®). Posteriormente, foram resfriados até a
temperatura ambiente por 20 minutos e lavados duas vezes por 5 minutos em água
destilada. Durante 10 min, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada em peróxido
de hidrogênio a 0,1% [peróxido de hidrogênio K-40677109,64271 (H2O2), Merck,
Alemanha] (3 mL de peróxido de hidrogênio a 30% (H2O2) + 27 mL de metanol). Antes de
aplicar anticorpos primários, caspase-3 de camundongo monoclonal, 1/100, e fator de
necrose tumoral alfa de camundongo monoclonal, 1/100 para bloqueio ultra V durante a
noite (kit Hisstain-Plus, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos da América) foi realizado
por 8 min. Em seguida, o anticorpo secundário (kit Hisstain-Plus, Invitrogen, Carlsbad, CA,
Estados Unidos da América) foi aplicado por 20 min. A seguir, durante 25 min, foi aplicada
estreptavidina-peroxidase nas lâminas. Para o cromógeno foi utilizada diaminobenzidina
(DAB, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos da América, lote: HD36221).
Com a exclusão dos anticorpos primários, foram preparadas lâminas de controle, conforme
já mencionado. Seguindo os procedimentos de contrastação com hematoxilina (produto
número: HHS32 SIGMA, solução de hematoxilina, Harris Modified, Sigma-Aldrich, Estados
Unidos da América), e lavagem com água da torneira por 3 min e com água destilada por 2
× 3 min, Entellan® (lote: 107961, Sigma-Aldrich, Estados Unidos da América) foi utilizado
para montar as lâminas.
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Statistical Package for
the Social Sciences (SPSS) versão 24.0 (IBM, Estados Unidos da América). Os dados
bioquímicos dos grupos controle e mancozebe foram comparados. O teste de
Kolmogorov-Smirnov foi utilizado como teste de normalidade. Como resultado da análise,
observou-se que os dados não estavam distribuídos normalmente. Por esse motivo, a
avaliação estatística foi realizada com teste não paramétrico U de Mann-Whitney, e p<0,05
foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados foram expressos como mediana
(IQR) e gráficos boxplot foram utilizados para demonstração.
Resultados
Verificou-se que houve diferenças significativas entre os grupos controle e mancozebe em
termos de níveis de AST e ALT, dilatação venosa, inflamação, degeneração de hepatócitos,
escores de expressão de TNF-α e caspase-3 (Tabela 1). Os animais foram analisados
estatisticamente medindo seus pesos antes e depois do experimento. A perda de peso
devido à administração de mancozeb foi significativa (p<0,001).
tabela 1
Os valores de ALT e AST dos grupos controle e mancozebe são mostrados com gráficos
boxplot na Fig. 1. Ambos os valores de ALT e AST do grupo mancozebe são
significativamente maiores que os de controle.
figura 1
Gráfico Boxplot dos valores de AST e ALT nos grupos controle e mancozebe.
Resultados histopatológicos
No corte transversal do grupo controle, a veia central era regular no centro do lóbulo
hepático e os hepatócitos hepáticos estavam dispostos radialmente ao redor do núcleo (fig.
2a). O corte histopatológico do fígado do grupo tratado com mancozebe mostrou dilatação
sinusoidal, necrose focal, obstrução significativa e hemorragia causada por alterações do
parênquima hepático, bem como dano hepatocelular significativo causado por degeneração
hidrópica e oclusão vascular central (fig. 2b).
Figura 2
(a) Veia central regular e células de hepatócitos com aspecto radial no grupo controle,
coloração com hematoxilina-eosina. (b) Dilatação em estruturas sinusoidais (seta fina),
degeneração em células de hepatócitos (seta grossa) no grupo tratado com mancozebe,
coloração com hematoxilina-eosina.
Resultados de imuno-histoquímica
Nas seções do grupo controle, atividade imune de caspase-3, expressão negativa de
caspase-3 foi observada em núcleos de células hepáticas e células de Kupffer. Nos
intervalos periportal e portal, algumas células do tecido conjuntivo apresentaram expressão
positiva de caspase-3 (Fig. 3a). No grupo mancozebe, no centro do lóbulo do fígado, foi
observada intensa expressão de caspase-3 nas células dos hepatócitos ao redor da veia
central (fig. 3b).
Figura 3
(a) Reação positiva ao TNF-α em alguns hepatócitos e células de Kupffer (seta) no grupo
controle, coloração imune ao TNF-α. (b) Aumento significativo na expressão de TNF-α em
hepatócitos e células de Kupffer ao redor da veia central (seta) no grupo tratado com
mancozeb, coloração imune de TNF-α.
Discussão
O presente estudo mostrou que o mancozebe tem efeitos hepatotóxicos por análise
histopatológica, bioquímica e imuno-histoquímica.
O mancozebe foi previamente classificado como produto de baixo risco agudo de toxicidade
em humanos e sem efeito hepatotóxico em ratos29,30. Contudo, em muitos estudos
realizados em humanos e animais, foi demonstrado que o mancozebe causa efeitos
adversos à saúde31. Kistinger e Hardej32 relataram que o mancozebe, uma forma fúngica
de etileno bisditiocarbamato, causou acúmulo de cobre nos rins, mas nenhum acúmulo no
fígado. De acordo com os dados do estudo, eles afirmaram que a estrutura principal do
etileno bisditiocarbamato do mankozebe, e não as porções de zinco ou manganês, foi
responsável pelas alterações no status da glutationa e na homeostase dos metais
essenciais no fígado e nos rins de ratos.
Yahia et al.37 utilizaram 250 mg/kg de mancozebe dissolvido em óleo de milho administrado
duas vezes por semana durante sete semanas e indicaram que a exposição ao mancozebe
causou aumento nos triglicerídeos e o colesterol total também diminuiu os níveis de glicose,
resultando em danos ao DNA no fígado e cólon com alterações patológicas no estômago,
cólon e fígado. À luz deste estudo, utilizamos dose única de 500 mg/kg de mancozebe
dissolvido em óleo de milho. No presente estudo, as alterações na atividade de ALT e AST
entre os marcadores de dano hepático causaram dano oxidativo induzido por lipídios e
aumentaram a degeneração celular. No exame histopatológico do fígado na aplicação de
mancozebe, constatou-se dano hepatocelular significativo devido à dilatação sinusoidal,
necrose focal, obstrução e sangramento significativos, parênquima hepático, bem como
degeneração hidrópica e oclusão vascular central.
Um estudo foi conduzido em timócitos de ratos tratados com mancozebe (0,01 mg/mL) para
uma incubação de 24 horas examinou os níveis de viabilidade celular, apoptose, potencial
de membrana mitocondrial (MMP), Bcl-2, expressão da proteína Bax, caspase-3 e -9 e
envolvimento de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK).
Aumento da toxicidade celular, células hipodiplóides, atividade de caspase-3 e -9,
expressão da proteína Bax, seguida de diminuição da expressão da proteína MMP e Bcl-2,
foram encontrados em células tratadas com mancozeb. Nos timócitos expostos ao
mancozebe, a taxa de apoptose e a atividade da caspase-3 foram significativamente
reduzidas através da inibição da via de sinalização p38 MAPK35. Em nosso estudo,
descobriu-se que a atividade da caspase-3 estava aumentada nas células dos hepatócitos
ao redor da veia central no lóbulo do fígado e nas células do tecido conjuntivo na área
periportal no grupo tratado com mancozeb. Observou-se que a alteração apoptótica
iniciou-se do centro do lóbulo do fígado para a periferia, e a densidade celular degenerativa
ficou evidente ao redor do vaso.
Um estudo sobre o consumo de vegetais tratados com mancozebe e seus efeitos no fígado
de ratos verificou que o mancozebe contribui para a ocorrência de doenças hepáticas39.
Ksheerasagar e Kaliwal40 observaram que o peso do fígado e a quantidade de proteínas
diminuíram quando camundongos foram expostos diariamente ao mancozebe por 30 dias.
Na presença de algumas substâncias naturais (uréia, glicina, ácido oxálico e imidazolina), o
mancozebe se degrada3. No caso da reação com o mancozebe, essas moléculas afetam
enzimas solúveis no sangue e indicadores de condições de estresse, levando a uma
situação de alteração de diversas vias celulares37. Assim, ocorre aumento de parâmetros
inflamatórios que alteram o metabolismo de proteínas e gorduras, incluindo uréia,
creatinina, hipoalbuminemia, distúrbios eletrolíticos e algumas enzimas hepáticas41.
O TNF-α é uma importante citocina pró-inflamatória com uma ampla gama de estudos. Foi
relatado que o TNF-α desempenha um papel como citocina, contribuindo para a formação e
desenvolvimento de danos hepáticos18. Foi relatado que citocinas pró-inflamatórias, como
TNF-α, IL6, IL-1 e quimiocinas, são produzidas e liberadas pelas células de Kupffer
juntamente com células não parenquimatosas adjacentes, como resultado de danos e
necrose . Neste estudo, foi avaliada a atividade do TNF-α na lesão hepática do TNF-α
induzida por mancozebe. Devido ao aumento da apoptose, o aumento da inflamação no
fígado levou a um aumento no nível de TNF-α.
Conclusões
A administração subaguda de mancozebe em ratos com insuficiência hepática aumentou a
inflamação nos tecidos e o aumento da apoptose devido a danos celulares pode levar a
toxicidade elevada no fígado e diminuição da capacidade de regeneração do fígado devido
à congestão e degeneração dos vasos sanguíneos. Como pesticida, especialmente
inconscientemente, altas doses e uso subagudo de mancozebe podem causar sérios danos
ao tecido hepático. Os médicos devem estar cientes da toxicidade do mancozebe nesses
casos de intoxicação.