Sugerencias para el uso de equipos

de CLAE

Geison Modesti Costa

Escola de Vero em Farmacognosia
Fevereiro, 2010
Florianpolis

ESQUEMA DE FUNCIONAMENTO
HPLC
Injetor
Bomba

Coluna
Reservatrio

Registrador

Detector

Reservatrio Fase mvel

Cerca de 50% de todos os
problemas de anlise e com o
equipamento tm origem na
Fase Mvel problemas de
diagnstico lento
Reagentes inadequados a
coluna e o equipamento so
sempre os culpados.

Fase mvel: orgnica

Solventes devem ser grau de pureza HPLC
ou HPLC/UV
Graus tcnico, para sntese, resduos de
X pesticidas, para anlise (P.A.), UV no
servem.

Isto tem implicaes sobre a garantia do

sistema e das colunas.

Fase mvel: gua

So inadequadas
gua mono-destilada: contaminao de orgnicos
volteis
gua deionizada comum: contaminao alta de
orgnicos devida resina aromtica
gua de osmose reversa: presena de ons e
orgnicos de baixo peso molecular
gua de osmose reversa + eletro-deionizao:
orgnicos de baixo peso molecular.

Fase mvel: gua

gua deve ser grau HPLC (Milli-Q)
Usar gua destilada ou osmose reversa para
alimentar o sistema Milli-Q
Livre de bactrias (esterilizada por membrana
0,22 m)
Resistividade >> 18 megohm (< 1ppb de
ons) Resistividade indica somente o teor de ons
Teor de orgnicos < 20 ppb para anlises
normais
Milli-Q: carvo ativado / 2 cartuchos de troca inica / resina

Fase mvel:
Partculas em suspenso
Partculas maiores que 1/8 do dimetro da partcula da
Fase Estacionria pode entupir os caminhos internos do

leito
Dimetro 5 m dimetro de passagem = 0,625 m.

Dimetro da FE = 5 m
Dimetro da passagem = 0,625 m

Fase mvel: filtrao

Para evitar entupimento do filtro de entrada da coluna (2
m) basta a membrana de 0,45 m
Para colunas com recheios de partcula 4 m basta
0,45 m.
Para recheios < 4 m interessante
considerar o uso de membranas de
porosidade 0,22 m.

Membranas:
compatibilidade qumica
Membrana de steres de celulose: usadas na
microbiologia s servem para gua, gua + tampo,
gua + cido fraco.
Teflon TFE serve para tudo, mas no permite passar
gua e acetonitrila sem ser molhado antes com outro
orgnico (MeOH, THF, EtOH, etc.)
Nylon permite uso de gua e solventes em geral, exceto
clorofrmio, teres (THF), diclorometano e cidos fortes

Fase mvel: Preparo

O correto preparar diariamente a fase mvel
Re-filtrar fase com tampo todos os dias (tendncia a

haver precipitao, crescimento de mofo).

Cuidado com o pH da fase:
Slica comum: faixa de pH = 2-8
CHCl3, testar sempre o pH, pois pode se transformar em HCl.

Acertar o pH do tampo aquoso antes de misturar com a

parte orgnica

Fase mvel: Preparo

Adicionar componentes volteis (amnia, trietilamina,
etc.) depois de filtrar com vcuo.

Medir os componentes separadamente e depois

misturar, antes da filtrao.
No juntar um componente com outro, avolumando
para o volume final.

Preparo da fase
mvel

Fase mvel: desgaseificao

Desgaseificao (remoo de O2 e N2)
indispensvel para o bom funcionamento do
sistema
Reprodutibilidade do fluxo (bolhas na bomba
e ar dissolvido na fase)
Estabilidade da linha de base (bolhas no
detector)
Transparncia na faixa de baixa UV.
O2 absorve < 215nm. rudo da linha de base

Fase mvel: desgaseificao

Ultra-som: muito lento, pouco eficiente,

requer agitao

Vcuo: lento (mnimo 20 minutos), requer

agitao.

Fase mvel: desgaseificao

Vcuo + ultra-som: total de ~10 minutos
Reaplicar de 12 em 12 horas (ou 24h)
Principalmente para misturas MeOH:H2O
Purga com He: contnuo, hlio +caro, vazamentos
aumentaro custo operacional, pouco conveniente.

Degasser: contnuo, remove o ar logo antes de entrar

na bomba; alto investimento inicial. Melhor opo a
longo prazo.

BOMBAS
Velocidade fluxo
0,1-3,0 mL/min para colunas analticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativa

Influencia no modelo da bomba!

Presso operao: at 2500-3500 psi para

separaes analticas

INJEO:
Preparao da amostra
Clean up da amostra:

filtrao e/ou centrifugao

extrao fase lquida (solventes)
extrao fase slida (SPE)
Usar uma soluo diluda

Injeo:
Preparao da amostra
Dissolver a amostra na fase mvel;
Evitar dissolver a amostra apenas em solventes
orgnicos, principalmente se for mais forte que a FM;

Amostra dissolvida em solvente mais forte que a fase

mvel N e k

Injeo:
Preparao da amostra
Correto:
FM: 30% MeOH; coluna RP-C18
Amostra dissolvida em 0-30% MeOH
Errado:
FM: 30% MeOH; coluna RP-C18

Amostra dissolvida em 100% MeOH

Amostra dissolvida em 30% ACN

Injeo:
Preparao da amostra
Errado:
FM: 60% ACN
Amostra dissolvida em CH2Cl2
5 L N = 10493
10 L N = 4088

Sempre que possvel dissolver a amostra na

Fase Mvel ou em solventes mais fraco
(menor % de orgnico fase reversa)

1000
100

Injeo:
Preparao da amostra
FM: ACN:H2O (08:92)
FE: C18 (250 x 4,6mm)
Deteco: UV (210 nm)

Volume mximo de injeo

O volume mximo de injeo para qualquer
coluna deve ser, no mximo, 1% do volume
interno da coluna vazia
Volume interno da coluna

Vmx = ( x r2 x C) (0,01)
r = raio interno em mm, C = comprimento em mm

3 perguntas bsicas antes da injeo:

A soluo da amostra miscvel

com a fase mvel?

Qual o volume mximo de injeo

para minha coluna?
Qual o V0 (volume de coluna ou
volume morto) da coluna sendo usada
(em mL ou em min)?

Volume da coluna
V0 = Volume (tempo) de eluio de um pico
no retido pela coluna.
Normalmente a 1 perturbao da linha de base.
Volume mnimo que a bomba precisa bombear para
qualquer amostra chegar at o detector.
Volume de fase mvel contido no sistema entre o
injetor e o detector, inclusive dentro dos poros.
A coluna responsvel por 90-95% deste volume.

Volume da coluna
Determinar V0 por:
Fase reversa: injeo de hidrocarboneto
saturado ou aromtico (tolueno).

Fase normal: Injeo de gua ou acetona.

Clculo aproximado:

Erro de 10-20% (3-10m)

V0 = ( x r2 x C) (0,5)
r = raio interno em mm, C = comprimento em mm

V0 = significado
Quaisquer picos ou grupo de picos que eluem
junto ao V0:
No interagiram com a coluna e, contm provveis
impurezas (picos escondidos)
No podem ser reconhecidos pelo tempo de
reteno: afinal no houve reteno!
No podem ser quantificados. No haver exatido
nem preciso na integrao.

COLUNAS
Tamanho da partcula
Usar tamanho de partcula e comprimento da
coluna suficientes para para separar a
amostra de interesse
10 m

5 m

2x
PARTCULA

4P!!!
PRESSO2

Tamanho da partcula

FE: Limites de fluxo

Fluxos altos resultam em:
Destruio do suporte do recheio
(velocidade = moagem, quebra)
Presso de trabalho alta e choques de
presso
degradao do leito
desgaste dos selos da bomba e do
injetor
Fluxo timo depende do dimetro de partcula e
do dimetro da coluna

FE: Limites de presso

Presso de operao:
~150 vezes a Atm.

As colunas so empacotadas numa nica direo sob uma

presso de 9000

psi.

Para uso contnuo, limite colunas de slica 3500 4000 psi.

Flutuaes de presso
PRESSO MUITO ALTA!

Coluna suja
Bloqueios (sistema filtro, pr-coluna,
tubulao, vlvula/seringa injetor, clula
fluxo do detector)
Solvente muito viscoso
Checar fluxo

Flutuaes de presso
PRESSO MUITO BAIXA!

Vazamentos (selos, coneces)

Mal funcionamento da bomba (vlvulas,
pisto)
Ar excessivo no sistema
Sinker do solvente entupido
Checar fluxo

Flutuaes de presso
PRESSO VARIVEL!
Mal funcionamento da bomba (bolhas nas linhas
de solventes ou vlvulas)
Bloqueios parciais no sistema

SEM PRESSO!
Reservatrio solvente vazio
Mal funcionamento da bomba (falha eletrnica ou
na vlvula de proporo)

Flutuaes de presso
Como minimizar?

Realizar a desgaseificao da FM DIARIAMENTE

Realizar a purga das bombas antes do incio das
anlises
Se possvel, realizar uma mistura prvia entre os

componentes da fase mvel

Sempre que possvel, utilizar sistemas isocrticos

Contaminao da coluna
Contaminao ocorre principalmente na entrada
do leito

Limpeza de coluna
Solventes eficientes para limpeza devem: dissolvem bem a sujeira

(no necessariamente os componentes ativos da amostra);

competir bem com o recheio da coluna para a sujeira.
Procedimentos de limpeza de colunas podem:

Precipitar contaminantes / tampes

Desnaturar protenas
Acabar removendo um pouco da fase qumica ligada (hidrlise)
melhor usar SPE (extrao em fase slida) para limpar a amostra
antes de injetar

Limpeza de colunas:
Fase normal

Coluna de slica: passar uma sequncia de

solventes (30-50 mL cada) pela coluna indo de
apolar para polar e voltando para a fase mvel:
Hexano /octano / heptano
Diclorometano
Isopropanol / acetato de etila / THF
Metanol
Fase mvel

Limpeza de colunas:
Fase reversa

Colunas de fase reversa ligada (C18, C8, fenil, CN)

Para limpar somente tampes, sais: passar H2O

Milli-Q (10xV0) a 40-50C

Para material orgnico: ACN:H2O 80:20 como

fase mvel e fazer injees grandes (100-200uL)

de solventes fortes como THF, acetato de etila.
Pode-se aquecer a coluna a 40-50C.

Limpeza de colunas:
Fase reversa

Para a remoo de material orgnico o melhor

solvente em geral THF, devido a:
Sua grande fora de eluio (polaridade)
Sua gama larga de dissoluo das substncias
mais variadas
Sua miscibilidade com todos as fases
Metanol mesmo puro no um solvente forte para
limpeza de material orgnico lipoflico devido a sua
alta polaridade

DETECTORES:
Manuteno
Lembre-se: lmpadas tm tempo de vida limitado

* Lmpada Deutrio: 500-2.000 horas

No dar flush nas colunas passando pelo detector

Problemas na linha de base podem ser eltricos

(Assistncia Tcnica) ou mecnicos (bolha de ar,
lmpada velha, sujeira na clula de fluxo)

Problemas??
Mudanas no tempo de reteno so geralmente
devidas a problemas na bomba ou vazamento
Mudanas

na

rea

do

pico

esto

geralmente

associadas com injetor, autosampler ou sistema de

tratamento dos dados

Problemas Pico
Resoluo ruim: coluna inadequada, fase mvel
muito forte
Pico largo: coluna inadequada, alargamento banda,
fluxo inadequado.

Pico dividido: co-eluio, problemas entrada coluna

Sem pico: lmpada desligada/ruim, problema injetor,
analito adsorvido

Problemas Pico
Picos com cauda: interao forte com coluna, coluna

suja, coluna inadequada

Pico com cauda frontal: overloading

Picos extras: coluna/solventes/injetor contaminados,

carry over

Problemas Linha de Base

Rudo:

fonte

(lmpada)

detector

velha,

solventes sujos, O2 no sistema

Background alto: contaminao solvente, cut
off solvente UV

Estratgia para Resoluo de

Problemas em HPLC
BOAS PRTICAS DE OPERAO !!!!
Isolar a rea do problema
Mudar um componente de cada vez
Consertar voc mesmo (?)
ou chamar Assistncia Tcnica

Consultar manuais operao/servio

Manuteno preventiva

Si

El equipo funciona?
Si

No

No

Alguien sabe
que usted lo
hice?

No

s um
tonto!

Si

Si

Escondalo

LA CAG!
No

Usted
lo dao?

Puede poner la
culpa en alguien?
Si

NO HAY PROBLEMA

Alguien
puede
culparle?

No
Qudase
contento!

Geison Modesti Costa, MSc.

(geison_costa@yahoo.com.br)
Laboratrio de Qumica Farmacutica
Depto. Cincias Farmacuticas
Universidade Federal de Santa Catarina