Ministrio da Sade

Instituto Nacional de Sade

Dr. Ricardo Jorge

Programa Nacional de Controlo de Infeco

2004

PNCI

AUTORES
-

Ana Bruschy Fonseca (Centro Hospitalar de Cascais)

Clotilde Sebastio (Hospital Distrital de Abrantes)
Filomena Jos Cardoso Martins (Hospital de S. Francisco Xavier)
Maria da Graa V. Carvalho Ribeiro (Hospitais da Universidade de Coimbra)
Ismlia Calheiros (Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia)
Lus Marques Lito (Hospital de Santa Maria)
Margarida Bivar Abecassis (Hospital de Pulido Valente)
Margarida Isabel Feij Pinto (Hospital de Santa Marta)
Maria Odete Chantre Spencer (Hospital de So Jos)
Maria Paula S. Falco M. Pinheiro (Hospital Dr. Jos Maria Grande - Portalegre)
Maria Teresa M. Pina M. Costa (Hospital Curry Cabral)
Rosa Maria Barros (Hospital de Dona Estefnia)
Rosa Fula Bento (Hospital Jos Joaquim Fernandes - Beja)

Colaboraes
-

Elaine Pina (Programa Nacional de Controlo da Infeco - PNCI e Hospital de

S.Antnio dos Capuchos)
Helena Ramos (Hospital Geral de Santo Antnio Porto)

Redaco Final e Uniformizao

-

Ana Bruschy Fonseca

Lus Marques Lito
Maria Teresa M. Pina M. Costa

Formatao
-

Ana Bruschy Fonseca

Reviso
-

Maria Jos Salgado (Hospital de Santa Maria)

Elaine Pina, Coordenadora do PNCI
Maria Goreti Silva, Enfermeira do PNCI

Publicao
-

Programa Nacional de Controlo da Infeco (PNCI)

Instituto Nacional de Sade, Dr. Ricardo Jorge, Observatrio Nacional da Sade
(ONSA)

INTRODUO
O presente trabalho resulta do empenho de um grupo de Microbiologistas Clnicos que, durante
alguns anos, se reuniu periodicamente sob a gide do Programa Nacional de Controlo de
Infeco. Para o seu desenvolvimento, os autores recorreram bibliografia da especialidade,
mas introduziram tambm uma forte componente da experincia adquirida pelo seu trabalho
dirio.
As ORIENTAES PARA A ELABORAO DE UM MANUAL DE BOAS PRTICAS EM
BACTERIOLOGIA, tal como o nome indica, tem como objectivo permitir aos responsveis
pelos Laboratrios de Microbiologia a elaborao do seu proprio Manual de Boas Prticas.
Assim, neste trabalho, so colocados disposio meios que os podero ajudar a melhor
desenvolver esta desejvel tarefa.
Neste documento so exclusivamentte tratados temas relacionados com a Bacteriologia, no
estando portanto includas reas igualmente importantes como a Micobacteriologia, a
Micologia, a Virologia ou a Parasitologia.

Agradecimentos:
O grupo de trabalho que elaborou este Manual de Boas Prticas agradece a todos quantos
contribuiram de forma directa ou indirecta para a sua elaborao e divulgao. Agradecemos
de modo especial, Exm. Sr. Dr. Elaine Pina, Coordenadora do PNCI, Exm. Sr. Dr.
Maria Jos Salgado, Microbiologista do Hospital de Santa Maria pela disponibilidade, apoio,
sugestes e ensinamentos e Exm. Sr. Enf. Maria Goreti Silva do PNCI pelo trabalho de
reviso do Manual.

NDICE
1. GENERALIDADES
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
1.7.

Tcnicas Laboratoriais usadas no estudo das bactrias

Uso do Microscpio
Desenvolvimento das bactrias em meios de Cultura
Identificao das bactrias
Conservao e Transporte de produtos biolgicos e estirpes bacterianas
Esterilizao e Desinfeco
Tratamento de Resduos Slidos

2. NORMAS de COLHEITA e TRANSPORTE de PRODUTOS

5
5
8
12
19
21
25
26

3. PROCESSAMENTO dos PRODUTOS para EXAME BACTERIOLGICO

3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.

Urina
Hemocultura
Lquido Cfalo-raquidiano
Lquidos de Serosas
Aparelho Respiratrio Superior
Aparelho Respiratrio Inferior
Exsudados Oculares
Exsudados Purulentos
3.8.1.Bipsias cirrgicas e Cateteres Vasculares
3.9. Fezes
3.10. Aparelho Genital
3.11. Amostras para Pesquisa de Anaerbios

40
44
50
52
54
59
65
72
75
78
82
89

4. IDENTIFICAO de MICRORGANISMOS
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
4.8.

Identificao de COCOS Gram Positivo

Identificao de BACILOS Gram Positivo
Identificao de COCOBACILOS Gram Negativo
Identificao de ENTEROBACTERIACEAE
Identificao de BACILOS Gram Negativo no-fermentadores
Identificao de BRUCELLA spp.
Identificao de MICRORGANISMOS EXIGENTES
Identificao das VIBRIONACEAE spp.

100
105
111
118
122
127
129
135

3. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIMICROBIANOS

138

4. QUALIDADE em MICROBIOLOGIA

159

5. LABORATRIO de MICROBIOLOGIA e INFECO HOSPITALAR

178

GENERALIDADES

1. TCNICAS LABORATORIAIS USADAS NO ESTUDO DE BACTRIAS

1.1 - USO DO MICROSCPIO

1.1.1 TCNICA DO ESFREGAO

Amostras biolgicas lquidas e culturas de caldo colocar o produto numa lmina e

estender em camada fina. Secar a preparao e fixar (calor ou metanol).

Amostras biolgicas slidas e culturas de meios slidos colocar sobre a lmina uma
gota de gua destilada e juntar uma pequena poro do produto, emulsion-la na gota,
estendendo de seguida. Secar e fixar como anteriormente.

Amostras espessas ou purulentas (ex.: expectorao) utilizar a tcnica de

estiramento colocar uma poro de produto numa lmina e pressionando com outra
lmina, fazer deslizar as duas lminas ao longo uma da outra, vrias vezes

Preparao do esfregao por tcnica de estiramento

1.1.2. EXAME A FRESCO

Colocar o produto numa lmina, cobrir com uma lamela e observar ao microscpio com
objectiva de 40x. Permite apreciar a presena de:
-

Elementos celulares
Microrganismos (bactrias, fungos e parasitas)

1.1.3. COLORAES
O exame microscpico de preparaes coradas permite precisar as caractersticas
morfolgicas das bactrias (forma e afinidade para os corantes):

Colorao SIMPLES - AZUL de METILENO

Reagentes
Soluo de azul de metileno:
- Soluo alcolica, saturada, de azul de metileno 300 ml
- Soluo aquosa, a 0,01% de hidrxido de potssio 1000 ml

Cobrir o esfregao, correctamente fixado, com soluo de azul de metileno durante 3

minutos.
Lavar com gua corrente e secar

Colorao DIFERENCIAL - Mtodo de GRAM

Reagentes
Soluo de violeta cristal:
- violeta de cristal - 2 g
- lcool etlico a 95% - 20 ml
- oxalato de NH4 - 0.8 g
- gua destilada - 100 ml
Lugol:
- iodeto de potssio 2 g
- cristais de iodo 1 g
- gua destilada 100 ml

Descorante (lcool-acetona):
- acetona - 50 ml
- lcool etlico a 95% - 50 ml
Contra-colorao:
- safranina O - 2.5 g
- lcool etlico a 95% - 100 ml
-Juntar 10 ml desta soluo a 100 ml de gua
destilada

Cobrir o esfregao j fixado, com soluo de violeta de cristal durante 1 minuto.

Lavar com lugol e deixar actuar durante 1 minuto.
Lavar com gua corrente.
Descorar com lcool acetona at que no saia mais cor violeta do esfregao.
Lavar com gua corrente
Cobrir a superfcie com soluo de contra-colorao (safranina, fucsina diluda etc.)
durante 1 minuto.
Lavar com gua corrente e deixar secar.
As bactrias Gram positivo coram de roxo escuro e as Gram negativo de vermelho

Colorao para deteco de CIDO LCOOL RESISTNCIA

1. Colorao de ZIEHL- NEELSEN
Reagentes
Fucsina de Ziehl:
- fucsina bsica em p 5 g
- fenol cristalizado 25 g
- lcool absoluto 50 ml
- gua destilada 500 ml
Colocar a fucsina e o fenol num balo e aquecer em banho de gua fervente durante 5 min, com agitao frequente.
Depois de completa dissoluo, adicionar lcool e agitar bem. Juntar, por fim, a gua destilada e filtrar antes de usar.
Descorante:
- lcool etlico 95% - 97 ml
- cido clordrico concentrado (37%) 3 ml
Azul de metileno (j descrito)

Cobrir a lmina com soluo de fucsina e aquecer at emisso de vapores. Deixar

actuar durante 10 minutos.
Lavar com gua
Cobrir com soluo descorante (lccol-cido) cerca de 1 minuto.
Lavar com gua
Corar com azul de metileno durante 15- 20 Seg.
Lavar e deixar secar

2. Colorao de KINYOUN
Reagentes
Carbolfucsina de Kinyoun:
- Soluo 1: dissolver 4 g de fucsina bsica em 20 ml de etanol a 95%
- Soluo 2: dissolver 8 g de cristais de fenol em 100 ml de gua destilada. necessrio aquecimento.
- Soluo de trabalho: Combinar as solues 1 e 2
lcool- cido a 3% : Juntar cuidadosamente 3 ml de cido clordrico concentrado (37%) a 97 ml de etanol a 95%

Cobrir a lmina com a soluo de carbolfucsina de Kinyoun e deixar actuar 5 minutos

Lavar com gua
Cobrir a lmina com lcool-cido a 3% e deixar actuar 2 minutos
Lavar com gua e retirar o excesso
Cobrir a lmina com contra-colorao ( ex. azul de metileno) e deixar actuar 1-2 min.
Lavar com gua e deixar secar

3. Colorao da AURAMINA
Reagentes
Soluo corante:
- Auramina O - 0.3 g
- Fenol - 3 g
- gua destilada 97 ml
Dissolver o fenol na gua morna; juntar a auramina pouco a pouco agitando vigorosamente at dissoluo; filtrar e
conservar em frasco de vidro escuro bem vedado.
cido- lcool a 3%
Soluo de permanganato de potssio:
- permanganato de potssio 1 g
- gua destilada 1000 ml

Cobrir o esfregao fixado com soluo de auramina, durante 15 minutos.

Lavar com gua corrente.
Descorar, durante 5 min, com o lcool- cido e lavar com gua corrente.
Tratar com permanganato durante 30 segundos.
Lavar de novo e deixar secar.

1.1.4. MORFOLOGIA BACTERIANA

As bactrias tm 4 formas principais:
-

redonda (cocos)
alongadas ou em bastonete (bacilos)
curva (vibrio)
espiralada (espirilo)

1.2- DESENVOLVIMENTO DE BACTRIAS EM CULTURA

1.2.1. MEIOS DE CULTURA

Classificao dos Meios de cultura

Os meios podem ser:

- Lquidos
- Slidos (com 1,5% de agar)
- Semi- slidos (com 0,5% de agar)
Tipos de Meios de cultura
-

Meios SELECTIVOS (ex.: MacConkey, Hektoen).

Meios NO SELECTIVOS (ex.: Gelose com sangue)
Meios DIFERENCIAIS (MacConkey)

A tcnica utilizada para preparar os meios muito importante para obter um meio de boa
qualidade (devem ser seguidas escrupulosamente as indicaes de cada fabricante).

1. Meio BRAIN-HEART

Classificao meio no selectivo

Princpio:
- A adio de sangue permite o isolamento de bactrias exigentes.
- Utiliza-se geralmente como meio de enriquecimento ou meio base para hemoculturas.
- A adio de 5-10% de sangue, antibiticos como cloranfenicol e gentamicina,
tornam o meio selectivo para fungos.

2. GELOSE COLUMBIA

Classificao - meio no selectivo

Princpio - meio base que com a adio de substncias especficas, sangue ou agentes
selectivos, origina meios de cultura especiais para multiplicao, isolamento ou
identificao de microrganismos

2.1. Gelose COLUMBIA com SANGUE

Gelose Columbia qual se junta sangue desfibrinado de carneiro ou cavalo, a uma
temperatura de 45 C. Pode tornar-se selectivo quando adicionados agentes inibidores. Permite
a observao da presena ou no de hemlise e o tipo de hemlise.
2.2. Gelose COLUMBIA com sangue, colistina e cido nalidxico (CNA)
A colistina e o cido nalidxico inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e Pseudomonas
spp. o que torna o meio selectivo para bactrias Gram positivo, contudo algumas bactrias
Gram negativo como Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp. tambm se desenvolvem.

2.3. Gelose CHOCOLATE

Meio enriquecido, no selectivo obtido a partir da gelose Columbia, pelo aquecimento da
mistura com sangue a 80C (hemlise dos eritrcitos). Favorece o crescimento de Neisseria
spp. e Haemophilus spp.

Agentes selectivos:
1. Gelose chocolate com V.C.A.T. (vancomicina, colistina, anfotericina e
trimetropim) com incubao a 35C em atmosfera enriquecida com 5% de CO2,
permite o isolamento de Neisseria gonorrhoeae em amostras com flora indgena.
2. Gelose chocolate com bacitracina favorece o crescimento de Haemophilus
spp. nos produtos com flora mista devido inibio das bactrias Gram positivo e
maioria das Neisseriaceae.

3. Meio de CHAPMAN( MANITOL SALGADO)

Classificao - meio selectivo para o isolamento de Staphylococcus spp., e identificao

presuntiva de S. aureus.

Princpio - A elevada concentrao de NaCl inibe a maior parte dos Gram negativo
permitindo o isolamento de Staphylococcus spp. A fermentao do manitol permite o
diagnstico presuntivo de S. aureus.

4. C.L.E.D. (Cistina- Lactose - Deficiente de Electrlitos)

Classificao - meio no selectivo, diferencial, habitualmente utilizado para cultura de

amostras de urina, que permite o isolamento dos agentes mais frequentes de infeco
urinria e quantificao de colnias.

Princpio - a deficincia de electrlitos inibe o swarming dos Proteus spp. e a lactose

permite diferenciar os fermentadores dos no fermentadores.

5. GELOSE HEKTOEN

Classificao - meio selectivo diferencial para o isolamento de Salmonella spp. e Shigella

spp.

Princpio - os sais biliares inibem os Gram positivo e retardam o crescimento de

algumas Enterobacteriaceae.

6. MEIO de MacCONKEY

Classificao - meio selectivo e diferencial para isolamento de bacilos Gram negativo

(Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. etc.)

Princpio Os sais biliares inibem o crescimento da maioria das bactrias Gram positivo.
A presena de lactose permite diferenciar as bactrias fermentadoras das no
fermentadoras.

7. MEIO SS (Salmonella Shigella)

Classificao - meio selectivo e diferencial de isolamento para Salmonella spp. e Shigella

spp.

Princpio - Inibio dos coliformes pelo verde brilhante e sais biliares. A presena de sais
de ferro permite a deteco das estirpes produtoras de SH2.

8. MEIO de SELENITO

Classificao - meio lquido de enriquecimento para Salmonella spp.

Princpio:
- O selenito de sdio inibe a maioria das Enterobacteriaceae, incluindo algumas estirpes
de Shigella spp.
- Utilizado para pesquisa nas fezes (coprocultura): - A subcultura para meio slido deve
ocorrer entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes,
tal como o Proteus spp.

9. CALDO GN

Classificao - meio lquido de enriquecimento para Enterobacteriaceae, especialmente

Shigella spp e Salmonella spp.

Princpio:
- O citrato e o deoxicolato actuam como agentes selectivos e inibem o crescimento da
maioria das Enterobacteriaceae da flora indgena habitual do intestino e todos os tipos
de bacilos formadores de esporos.
- O manitol promove selectivamente o crescimento de Salmonella spp. e Shigella spp.
que o metabolizam.
- Utilizado para pesquisa nas fezes (coprocultura): - A subcultura para meio slido deve
ocorrer entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes,
tal como o Proteus spp.

10. MEIO de MULLER - HINTON

Classificao - meio no selectivo usado principalmente para o estudo da susceptibilidade

aos antimicrobianos.

10

1.2.2. TCNICAS DE SEMENTEIRA

Devem utilizar-se meios no desidratados, mas cuja superfcie esteja seca e sem gotculas de
condensao na tampa.

Meio SLIDO em PLACA

Por quadrantes ou em roseta - Colocar uma pequena poro de produto (inoculo)

num quadrante e proceder sementeira com a ansa.

Por inundao, com pipeta (mtodo no recomendado devido a produo de

aerossis; quando utilizado deve ser realizado em cmara de segurana biolgica).

Por espalhamento com zaragatoa - utilizar para execuo de TSA por difuso em
placa (ver tcnica no captulo sobre testes de susceptibilidade).

Para quantificao de colnias (urina) utilizar ansa calibrada (de 10 l).

Meio SLIDO em TUBO

Pode-se inocular:
S em superfcie
Ou em superfcie e em profundidade

Tcnica para inoculao em superfcie e em profundidade

em tubo com rampa de gelose (A
B)

Em meio LQUIDO

1.2.3

Produto lquido - semeado com auxlio de seringa ou pipeta

Produto slido - mergulhado directamente no meio

CONDIES DE INCUBAO

Atmosfera

Esto disponveis comercialmente geradores que permitem obter as diferentes atmosferas

necessrias para a cultura de microrganismos patognicos em laboratrio:
-

CO2
Microaeroflia
Anaerobiose

Existem geradores para jarras ou para sacos (de 2 placas de Petri).

Se no houver este tipo de geradores pode-se obter atmosfera de CO2 colocando uma vela
acesa dentro de uma jarra de vidro fechada, juntamente com as placas.

11

Temperatura

Existe uma temperatura ptima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos,

que ronda os 35-37C.

Alguns podem desenvolver-se a temperaturas mais baixas, como a Listeria spp. (4C), e
outros a temperaturas mais elevadas, como o Campylobacter spp. (42C).

Provavelmente mais importante que a temperatura de incubao a preveno de

grandes flutuaes na mesma.

Humidade

A maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma humidade igual
ou superior a 70%.

Os meios de cultura tm de se manter hidratados durante o perodo de incubao.

Para manter a humidade numa estufa normal, pode colocar-se um recipiente com gua no
seu interior que permita a sua evaporao.

1.3. IDENTIFICAO DAS BACTRIAS

1.3.1. CONSIDERAES GERAIS

A deciso do modo de processamento do exame cultural e valorizao clnica das estirpes

isoladas, baseia-se na compreenso da patogenia da infeco nos diferentes locais
anatmicos.

S se deve realizar a identificao e TSA de colnias isoladas.

Isolamento da mesma espcie de microrganismo em amostras idnticas colhidas em dias

sucessivos, no necessrio proceder sua identificao e TSA.
Se a segunda amostra tem um intervalo de cinco ou mais dias necessrio identificao e
antibioGrama, pois pode ter havido alterao da flora ou do padro de susceptibilidade.

1.3.2. Aspecto MACROSCPICO das COLNIAS

Forma
Dimenso
Elevao
Margem ( bordo da colnia )
Superfcie
Consistncia
Produo de pigmento

12

1.3.3. IDENTIFICAO BASEADA EM CARACTERSTICAS METABLICAS

1. TESTE da POTASSA
Reagentes
- Hidrxido de potssio 3 g
- Agua destilada para 100 ml

Princpio A parede das bactrias Gram negativo facilmente rompida por uma soluo
alcalina diluda e os restos de DNA libertados permanecem agregados na suspenso,
apresentando a formao de um filamento. Nas bactrias Gram positivo, por a parede
celular ser mais resistente, no apresentam este aspecto.

Procedimento
-

Coloca-se uma gota de KOH a 3% numa lmina e faz-se uma suspenso, bem
homogeneizada, com uma ansa, elevando-se vrias vezes 1- 2 cm.
Se, ao elevar a ansa, se observa a formao de um fio a reaco positiva, indicando
a presena de um microrganismo Gram negativo. (Reaco positiva)

2. TESTE da CATALASE
Reagentes

- perxido de hidrognio a 3% (conservar temperatura ambiente e no escuro)

Princpio O enzima catalase desdobra o perxido de hidrognio (3%) em gua e

oxignio (2H2O2 2H2O + O2)

Procedimento
-

Com a ponta de uma pipeta de Pasteur ou com palito, transferir a colnia em estudo
para a lmina de vidro.
Adicionar uma gota de perxido de hidrognio a 3% e observar imediatamente se
existe ou no formao de bolhas de ar (Reaco positiva). possvel tambm fazer
esta prova pela ordem inversa.

Limites e Precaues:
-

Culturas com mais de 24h podem dar falsos negativos.

Devido existncia de catalase nos eritrcitos, a prova deve ser interpretada com
muito cuidado quando efectuada a partir de colnias retiradas de meios contendo
sangue (possibilidade de falso positivo).

13

3. TESTE da COAGULASE
A coagulase uma enzima termoestvel produzida principalmente pelas estirpes de S. aureus.
Existem duas formas de coagulase: uma ligada parede celular ou Factor clumping e outra
libertada pela clula bacteriana que a coagulase livre.
3.1. Teste da Coagulase em LMINA
Reagentes
- Plasma de coelho citratado ou com EDTA (fornecido comercialmente desidratado).
- Aps reconstitudo deve ser refrigerado

Princpio A coagulase ligada ou Factor clumping actua directamente no fibrinognio

plasmtico e causa aglutinao das bactrias em agregados visveis.

Procedimento:
-

Preparar uma suspenso de colnias densa e bem emulsionada em gua destilada.

Agitar no vortex e colocar uma gota de suspenso na lmina.
Adicionar uma gota do plasma de coelho.
Observar a existncia ou no de aglutinao nos 10 a 15 segundos imediatos sem
agitar a lmina. (Reaco positiva)

Limites e precaues:
-

Um teste da coagulase em lmina positivo s vlido para estirpes de

Staphylococcus spp. que no apresentem autoaglutinao. A autoaglutinao
pesquisada efectuando uma suspenso de colnia numa gota de NaCl a 0,85%
colocada numa lmina de vidro. A existncia de aglutinao considerada uma
reaco positiva de autoaglutinao e invalida a interpretao do teste da coagulase
em lmina. Perante esta situao utilizar teste alternativo.
No utilizar colnias provenientes de meios com alto teor em NaCl.

3.2. Teste da Coagulase em TUBO

Reagentes
- Plasma de coelho citratado ou com EDTA (fornecido comercialmente desidratado).
- Pode ser refrigerado durante 10 dias ou congelado em tubos individuais durante vrios meses

Princpio - a coagulase livre (libertada pelas clulas) actua na protrombina originando uma
substncia semelhante trombina, trombina livre que actua no fibrinognio formando um
cogulo de fibrina

Procedimento:
-

Num tubo com 0,5 ml do plasma de coelho inocular uma colnia isolada da cultura em
estudo.
Incubar a 35- 37 C.
Ao fim de 4h de incubao e sem agitar o tubo, verificar se existe formao de cogulo.
(Reaco positiva)
A ausncia de cogulo s 4h implica a reincubao do tubo com leitura s 24h.

14

Limites e precaues:
-

Pode ocorrer lise do cogulo antes da sua observao por produo de enzimas
fibrinolticos pela estirpe em estudo. (Falso negativo)

3.3. Protena A (Staphaurex

):
A maioria dos S. aureus produzem protena A que tem afinidade especfica para o
fragmento Fc da imunoglobulina G. A pesquisa de protena A um mtodo alternativo ao
teste da coagulase em lmina.

Princpio:
- Partculas de latex revestidas de plasma humano contendo imunoglobulina G e
fibrinognio reagem quer com o factor de aglutinao (factor clumping) quer com a
protena A originando aglutinao.
- Existem vrios testes comercializados.

Procedimento - efectuar a tcnica segundo instrues do fabricante.

Limitaes e precaues:
-

S. hycus e S. intermedius podem dar uma reaco positiva mas so raramente

isolados como agentes de infeco no ser humano.
S. saprophyticus podem dar uma reaco positiva, pelo que quando se trata de estirpe
isolada de urina tem de ser identificada por outro mtodo.
Espcies de Micrococcus spp., E. coli, C. albicans, Streptococcus spp. e Enterococcus
spp. podem tambm originar aglutinao.
Algumas estirpes de S. aureus resistentes meticilina podem no aglutinar.

4. TESTES da DEOXIRRIBONUCLEASE (DNase)

Princpio - O S. aureus, como outras bactrias como p. ex. Moraxella catarrhalis ou

Serratia marcescens, produzem a enzima Dnase.

Procedimento:
-

O microrganismo a testar semeado em estria central no agar DNase

Aps uma incubao de 18 a 24h, a placa coberta com HCl 1M para precipitar o DNA
no hidrolizado
Um resultado positivo indicado pela transparentizao do agar em volta das colnias.
O DNA no hidrolizado aparece mais opaco (pela precipitao causada pelo cido)

15

5. CITOCROMO OXIDASE
Reagentes
- tetrametil-p- fenilenediamina dihidrocloreto 1% (reagente de Kovac)

Princpio:
-

Procedimento:
-

Tcnica directa em placa - colocar 2-3 gotas de reagente sobre colnias isoladas da
bactria a testar.

Tcnica indirecta sobre tira de papel - utilizam-se tiras comerciais ou um papel de

filtro onde se colocam algumas gotas de reagente. Com uma ansa (no metlica)
retira-se uma colnia a testar que colocada sobre o papel.

Interpretao:
-

As citocromo-oxidases so hemoprotenas que actuam como elo final na cadeia de

respirao aerbia transferindo electres (hidrognio) para o oxignio, com formao
de gua.
O teste utiliza um corante que substitui o oxignio como aceitador de hidrognio
(aparecimento de cor).

As colnias com bactrias que contenham a actividade da enzima desenvolvem uma

cor azul-roxo escura em mais ou menos 10 segundos.

Limitao:
-

No devem ser usadas ansas de metal pois os produtos de oxidao do metal, que se
formam aquando do aquecimento da ansa, podem provocar falsa reaco positiva.

6. TESTE da SOLUBILIDADE na BLIS

Reagentes

- Soluo de desoxicolato de sdio

Princpio - os sais biliares tm a capacidade de lisar selectivamente o S. pneumoniae.

Procedimento - colocar algumas gotas de reagente em colnias suspeitas.

Interpretao - o resultado positivo (S. pneumoniae) se houver lise completa das

colnias e seu desaparecimento em 30 min.

Limitao:
-

Se for utilizada gelose sangue, aparece uma zona pronunciada de hemlise em volta
da gota de reagente que no deve ser confundida com lise bacteriana.

16

7. TESTE do INDOL DIRECTO

Reagentes
Reagente de Kovac:
- paradimetilaminobenzaldedo (PDABA) 5 g
- lcool isoamlico 75 g
- cido clordrico (37%) 25 ml
- Aquecer o PDABA com lcool isoamlico a 50 60 C at dissolver
- Arrefecer e adicionar o cido clordrico lentamente e sempre em banho de gua fria (no pode mudar a cor para
rosa)

Princpio:
-

Procedimento:
-

O indol um dos produtos de degradao metablica do aminocido triptofano. As

bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolizar e desaminar o
triptofano com a produo de indol, cido pirvico e amnia.
O teste baseado na formao de uma cor vermelha quando o indol reage com o
grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo. Este o qumico activo dos reagentes de
Kovac e Ehrlich. Deve ser usado um meio rico em triptofano

Impregnar uma tira de papel de filtro com o reagente

Com uma ansa retirar uma colnia da bactria a testar e coloc-la sobre o papel

Interpretao:
-

Desenvolvimento imediato de cor vermelha teste positivo

PROVAS BIOQUMICAS
O seu estudo reduz-se a alguns aspectos principais:

Assimilao dos nutrientes: os nutrientes assimilveis podem variar consideravelmente

de uma espcie bacteriana para outra, indo de substncias mais simples s molculas
orgnicas mais complexas.

Reaces que levam sntese dos constituintes da clula bacteriana: prtidos, glcidos,
lpidos.

Reaces que fornecem a energia necessria ao metabolismo.

Enzimas deteco da sua produo. (Sem os importantes sistemas de exo e

endoenzimas as reaces de catabolismo e anabolismo no seriam compatveis com a
vida).

Para efeitos prticos de identificao, actualmente, o estudo repousa nos efeitos globais ou
pontuais do catabolismo e sobretudo sobre a caracterizao de enzimas diversos.
Estes testes encontram-se disponveis isoladamente ou integrados em sistemas
comercializados de identificao microbiana. Nomeadamente, alguns dos mais comuns e mais
utilizados:

17

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

REDUO dos NITRATOS

ORTONITROFENIL-GALACTOSIDASE (ONPG)
TESTE do INDOL
TESTE do VERMELHO de METIL
TESTE de VOGES - PROSKAUER
Utilizao do CITRATO
TESTE da UREASE
DESCARBOXILASES
FENILALANINA DESAMINASE
TESTE FERMENTATIVO OXIDATIVO / Prova de Hugh e Leifson
TESTE da HIDRLISE do HIPURATO
TESTE da BILE-ESCULINA

OUTROS MTODOS DE IDENTIFICAO

1. TESTE da OPTOQUINA:
Reagentes
- Placa de gelose com 5% de sangue
- Disco de 5 g de optoquina

Princpio - A optoquina uma substncia que inibe o crescimento de Streptococcus

pneumoniae, provocando um halo de inibio da cultura em placa.

Procedimento:
-

Usando uma ansa, seleccionar 1 colnia bem isolada do microrganismo a ser testado e
semear numa placa de gelose sangue em duas ou mais direces perpendiculares
numa rea de 3 cm de dimetro.
Colocar o disco de optoquina no centro da rea semeada.
Incubar 18 a 24h a 35 C em CO2.

Interpretao - O crescimento do S. pneumoniae caracteristicamente inibido pelo disco

de optoquina produzindo um halo 19 mm.

2. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE NOVOBIOCINA

Princpio - O S. saprophyticus resistente novobiocina (disco de 5 g); outras estirpes de

Staphylococcus coagulase negativa com significado clnico so susceptveis.

Procedimento:
-

Efectuar uma suspenso ( 0,5 MacFarland) da colnia em estudo em NaCl a 0,85%, e

inocular em placa de Muller-Hinton (ver procedimento para teste de susceptibilidade
aos antimicrobianos)
Colocar o disco de novobiocina na placa.
Incubar 16 a 18h a 35 C em aerobiose.
Examinar e medir o halo de inibio em volta do disco.

18

Interpretao uma zona de inibio

presuntivamente S. saprophyticus.

16 mm indica resistncia e identifica

3. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE BACITRACINA

Reagentes
- Disco de Bacitracina a 0,04 U
- Placa de gelose sangue

Princpio - O Streptococcus hemoltico do grupo A inibido na gelose sangue quando

em presena dum disco de Bacitracina a 0,04 U. um teste de diagnstico presuntivo.

Procedimento:
-

Semear com ansa em duas ou mais direces perpendiculares uma placa de gelose
sangue a partir de colnia hemoltica.
Aplicar o disco de Bacitracina.
Incubar 16- 18h a 35 C.
Verificar a existncia de halo de inibio.

Interpretao:
Qualquer halo de inibio indica identificao presuntiva de Streptococcus
hemoltico do grupo A. A ausncia de halo de inibio interpretada como Streptococcus
hemoltico no grupo A

Limitaes:
-

O teste s deve ser efectuado em colnias de Streptococcus com -hemlise. Os

Streptococcus que apresentam , ou hemlise podem ser inibidos pela bacitracina.
H estirpes de Streptococcus -hemlitico do grupo A que so resistentes
bacitracina.

2. CONSERVAO E TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLGICOS E ESTIRPES

BACTERIANAS

MEIOS DE TRANSPORTE de PRODUTOS BIOLGICOS

A sua utilizao tem como objectivo permitir a viabilidade dos microrganismos nos produtos
biolgicos quando no podem ser processados imediatamente aps a colheita. Devem ser
utilizados de acordo com o produto e os microrganismos que se pretendem pesquisar.

Meio de Stuart, meio de Amies com ou sem carvo, Meio de Cary-Blair, etc. - meios de
transporte, no nutriente, que visam manter intactos os microrganismos at, geralmente, s
24 horas. A sua seleco depende do produto biolgico. Algumas caractersticas destes
meios:
-

A ausncia de compostos nitrogenados impede o crescimento de microrganismos.

19

Os hidratos de carbono fornecem energia, permitindo a sobrevida dos microrganismos.

Os meios de transporte para a pesquisa de bactrias anaerbias tm um indicador de

anaerobiose - o azul de metileno (se houver entrada de ar o meio fica azul nos 2/3
inferiores).

Se houver suspeita de N. gonorrhoeae devem ser usadas meios contendo carvo, com
o objectivo de neutralizar substncias inibidoras.

CONSERVAO de ESTIRPES BACTERIANAS

1- Perodos CURTOS
A maior parte das bactrias de crescimento rpido podem ser conservadas durante 1 a 2
semanas em placas de agar simples hermeticamente fechadas, invertidas e a 4C, ou em tubos
de agar inclinado.
2- Perodos LONGOS
a- Meios de conservao

A maior parte das bactrias de crescimento rpido podem ser mantidas em tubos de
conservao durante muito tempo temperatura ambiente e ao abrigo da luz (depende
da estirpe, do meio utilizado, do grau de humidade, etc.). O meio de conservao
inoculado por picada profunda, podendo ou no necessitar de prvia incubao antes
do armazenamento. Conservar hermeticamente fechado.

Pode usar-se Meio de gelose peptonada:

- Extracto de carne
5g
- Peptona
10 g
- NaCl
3g
- (Na)2HPO4.2H2O
2g
- Agar- 10 g
- H2O -1000 ml
- Acertar o pH a 7,4.
Esterilizar a 121C durante 20 minutos

b- Congelao

A - 70C em TSB (meio de tripticase-soja) ou outro caldo nutritivo (p.ex.: Brain Heart
Infusion) adicionado de 15 a 18% de glicerol.

c- Liofilizao

A maior parte das estirpes podem ser liofilizadas, tendo em considerao que este
procedimento pode alterar algumas caractersticas dos microrganimos (p.ex.
resistncia a antimicrobianos).
As estirpes esporuladas no podem ser sujeitas a liofilizao

20

EMBALAGEM DE
BACTERIANAS

TRANSPORTE

DE

PRODUTO

BIOLGICO

OU

ESTIRPES

1. Recipiente primrio - recipiente de polipropileno ou polietileno (no se recomenda o

vidro), fechado hermeticamente.
2. Recipiente secundrio - com as mesmas caractersticas do primrio.
3. Material absorvente - entre o recipiente primrio e secundrio. Pode utilizar-se algodo
hidrfilo. A quantidade deve ser suficiente para absorver o dobro do contedo completo do
recipiente primrio.
4. Recipiente exterior - deve ter resistncia suficiente de acordo com a sua capacidade,
massa e uso desejado e dever ser capaz de suportar pesos e golpes, que frequentemente
tm lugar durante a sua manipulao e transporte. No devem utilizar-se envelopes
acolchoados para o envio de amostras.

Sinalizao, etiquetagem e documentao

-

O pacote exterior dever ter o nome do remetente, a informao de que se trata de

substncia infecciosa com risco humano e o nome e direco do destinatrio.

A informao sobre o material (como p. ex. os dados clnicos ou bacteriolgicos)

devero ser colocados entre a embalagem secundria e a exterior.

No deve ser colocada informao entre as embalagens primria e secundria.

conveniente que a informao que acompanha o produto contenha o nome e nmero

de telefone da pessoa responsvel a quem se possa contactar em caso de
emergncia.

Indicao da constituio de uma

embalagem apropriada ao envio
de material com risco biolgico

21

3. LIMPEZA, DESINFECO E ESTERILIZAO

Definies

Limpeza implica a remoo de sujidade e dos microrganismos. A lavagem com gua e

sabo remove a maior parte dos microrganismos e ainda as protenas e outra matria
orgnica a qual, para alm de constituir fonte de nutrientes para os microrganismos,
protege-os contra a secagem e impede a aco de desinfectantes.

Desinfeco o processo que destri ou inactiva microrganismos na forma vegetativa mas

geralmente no afecta os esporos bacterianos. Os mtodos utilizados podem ser fsicos ou
qumicos.

Esterilizao consiste na destruio e eliminao de todos os microrganismos na forma

vegetativa e esporulada. Tambm aqui os mtodos utilizados podem ser fsicos e/ou
qumicos.

Descontaminao o tratamento dado ao material para tornar seguro o seu

manuseamento posterior. O processo tem em conta a contaminao consequente
utilizao que foi dada ao material e portanto inclui a limpeza e pode ir at esterilizao
(p.ex. para pries).

Para facilitar a aplicao destes conceitos ao procedimento antimicrobiano a utlizar, segundo

Spaulding, o material a ser tratado classificado em trs categorias, de acordo com o risco
que representa para o doente:
Classificao de risco infeccioso associado com os dispositivos mdicos
Risco
Elevado
Material Crtico

Intermdio
Material semiCrtico

Baixo
Material no
Crtico

Aplicao do dispositivo
contacto prximo com soluo de
continuidade da pele ou mucosas
introduzido em locais estreis do
organismo

contacto com mucosas ou,

contaminado com agentes
virulentos ou de fcil transmisso
cruzada ou,
antes de uso em doentes
imunodeprimidos
contacto pele intacta
no entra em contacto com o
doente

Recomendao
Esterilizao
A desinfeco geralmente
suficiente, embora a
esterilizao possa ser
prefervel
Limpeza pode ser suficiente
em situaes especificadas

Limpeza

Limpeza

A limpeza o pr-requisito essencial da descontaminao e pode constituir um mtodo

suficiente para artigos noinvasivos (baixo risco) mas no deve ser utilizado como o nico
processo para artigos de risco intermdio ou elevado onde haja indicao para desinfeco
ou esterilizao.

22

As indicaes da limpeza passam pela descontaminao do ambiente (paredes,

pavimentos, mobilirio) e superfcies de trabalho e equipamentos incluindo os dispositivos
mdicos e outros objectos que entram em contacto com a pele intacta.

Sempre que possvel deve-se preferir os mtodos mecnicos j que permitem o controlo e
validao do processo. Os processos manuais requerem treino especfico e elevado
consumo de tempo. Pode ainda haver um risco associado ao manuseamento de material
contaminado.

Desinfeco

Para a desinfeco podem ser utilizados mtodos fsicos (calor) e qumicos

(desinfectantes qumicos).

A desinfeco pelo calor inactiva todos os microrganismos com excepo dos esporos
bacterianos, alguns vrus resistentes ao calor e o Cryptosporidium. Est indicado para os
dispositivos que tolerem a exposio repetida ao calor hmido a temperaturas de cerca de
80-90C. Processa-se em mquinas de lavagem/desinfeco e tm a vantagem de
permitir o controlo e validao do processo.

Um desinfectante qumico um produto que capaz de destruir microrganismos por meios

qumicos ou fsico-qumicos. Pode ser txico, inflamvel, corrosivo ou apresentar outras
incompatibilidades com os materiais.

Os factores que podem levar ao insucesso da desinfeco qumica incluem a resistncia

inata dos microrganismos, inactivao devido diluio ou contacto com outras
substncias (ex. matria orgnica), armazenamento inapropriado.
Actividade microbicida dos desinfectantes qumicos

Desinfectante
lcool
Glutaraldedo
Ortoftalaldedo
Outros aldedos***
Dixido de cloro
cido peractico***
Comp. peroxigenados***
Amnios quaternrios***
Soro fisiolgico superoxidado
0 = nenhuma

+ = fraca

Esporos
0
+*
+*
+*
+++
+++
0
0
+++

++ = moderada

Micobactrias
++
+++**
+++
+++
+++
+++
+
++
+++

Bactrias
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+++

Vrus
++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
+++

+++ = boa

* a actividade esporicida dos aldedos necessita de contacto prolongado (>3 horas)

** h dvidas sobre a actividade do glutaraldedo sobre algumas micobactrias atpicas
*** a actividade de outros aldedos, compostos peroxigenados e amnios quaternrios varia com a concentrao

No laboratrio o uso de desinfectantes est indicado para descontaminao de superfcies de

trabalho (lcool a 70 ou hipoclorito 1.000 ppm) , nos recipientes para colocao de material
contaminado pipetas, ansas, etc. (discard jars) (hipoclorito 5.000 ppm) e para remoo
de matria orgnica vertida (hipoclorito 10.000 ppm).

23

ESTERILIZAO

Esterilizao pelo CALOR HMIDO (vapor saturado sob presso)

o meio mais seguro para a destruio de todas as formas microbianas atravs do contacto
directo com o vapor dando origem a uma desnaturao proteica da clula. O seu poder de
aco est baseado em dois factores: humidade e calor numa cmara de concepo adequada
(autoclave ou esterilizador).
Temperatura
134C
121C

Tempo
3 minutos
15 minutos

Humidade relativa
100 %
100 %

Os esterilizadores utilizados para os meios de culturas so programados para uma sada lenta
do vapor da cmara.Os frascos devem ser encerrados de modo a permitir a entrada do vapor
e evitar a condensao. Os frascos/bales so colocados em prateleiras ou cestos de rede ou
contentores perfurados para permitir a sada de ar por deslocao para baixo. Para ser eficaz
devem ser utilizados pequenos volumes de lquido. Para as culturas deve-se proceder a um
arrefecimento lento para evitar a fervura e o extravasamento. A porta do esterilizador no deve
ser aberta antes de ser atingida a temperatura de 90 ou 80 conforme se trate de embalagens
flexveis ou de vidro.

Esterilizao pelo CALOR SECO

ESTUFA

O calor seco utilizado para materiais de vidro, agulhas, instrumentos delicados de

corte, artigos metlicos que no so de ao inoxidvel.

Fontes de calor - ar quente, chama directa, incinerao, microondas, infravermelhos.

Temperaturas
160
170
180

Tempo
120 minutos
60 minutos
30 minutos

As vantagens deste mtodo so a boa capacidade de penetrao (slidos, lquidos no

aquosos e cavidades fechadas, substncias em p, ceras) e a no corroso dos materiais.
So desvantagens a necessidade de temperaturas elevadas, exposio prolongada e a
penetrao heteregnea.
CHAMA

Limitada s ansas de inoculao de culturas bacterianas (actualmente utilizam-se

sistemas elctricos de esterilizao ou ansas descartveis).

As prticas de passar chama instrumentos, rolhas, bocais dos frascos ou tubos de

cultura no assegura a sua esterilizao ou proteco contra contaminantes ambientais
porque no se atinge uma temperatura suficientemente elevada e o tempo de exposio

24

demasiado curto. Estas limitaes mantm-se mesmo quando o artigo previamente

mergulhado em lcool.
FILTRAO
-

A filtrao difere dos outros mtodos de esterilizao porque no envolve a destruio de

microrganismos mas a sua remoo atravs da passagem por filtros sintticos, granulares
ou fibrosos.

Os lquidos podem ser filtrados para obter esterilidade (p.ex. meios de cultura), avaliar a
esterilidade (alguns produtos farmacuticos) ou colheita de amostra para estudo
microbiolgico (guas).

OUTROS MTODOS DE ESTERILIZAO

Esta uma rea que tem visto grandes desenvolvimentos nos ltimos anos. Para alm
das radiaes muito utilizadas na Indstria para esterilizao de material plstico utilizado
no laboratrio, os mtodos de microondas e de infravermelhos tm sido utilizados
experimentalmente na esterilizao de meios embora a sua utilidade ainda no esteja
comprovada para esse fim.

Na rea dos dispositivos mdicos, os mtodos de esterilizao pelo plasma de perxido de

hidrognio e pelo formaldedo a 2% a baixa temperatura apresentam a vantagem da
rapidez em relao ao mtodo mais antigo de esterilizao pelo xido de etileno, porque
tem a vantagem de no necessitar do perodo de arejamento exigido com este ltimo
mtodo. Tambm a esterilizao pelo cido paractico em equipamento fechado uma
opo aceitvel para certos equipamentos como os endoscpios flexveis. Contudo,
nenhum destes mtodos tem aplicao no Laboratrio.

4. TRATAMENTO DE RESDUOS SLIDOS

Introduo
Segundo DL 310/95 de 22/11 Resduos Hospitalares (RH): Resduos produzidos em
unidades de prestao de cuidados de sade, incluindo as actividades mdicas de diagnstico,
tratamento e preveno da doena em seres humanos ou animais e ainda as actividades de
investigao relacionadas.
Legislao - Despacho 242/96 de 13/8 que classifica os RH em grupos
Objectivos do tratamento de resduos:
-

Reduo do seu volume, de maneira a reduzir o espao necessrio sua eliminao

Desinfeco ou esterilizao, por forma a deixarem de ser fonte de organismos
patognicos e permitir, portanto, a sua manipulao com maior segurana
Reduo e alterao das grandes peas anatmicas de modo a tornarem-se
irreconhecveis e mais estticamente aceitveis

25

Processos de tratamento:
Descontaminao trmica (autoclavagem)
-

Pode ser complementado com uma triturao posterior, e/ou com compactao,
necessitando sempre de tratamento dos efluentes lquidos e gasosos.

Utilizado principalmente:
- Descontaminao de resduos de laboratrios de microbiologia
- Resduos com sangue e lquidos orgnicos
- Cortantes e perfurantes

26

NORMAS de COLHEITA e TRANSPORTE de PRODUTOS para

EXAME BACTERIOLGICO

1. INTRODUO
O Laboratrio de Microbiologia pode fornecer informao crucial para o diagnstico e
tratamento das doenas infecciosas suspeitas ou confirmadas. No entanto, s o poder fazer
se as amostras forem de boa qualidade, em quantidade suficiente, colhidas adequadamente e
acompanhadas por informao clnica pertinente. As informaes que se descrevem a seguir
pretendem servir de orientao para a colheita e transporte de produtos para exame
microbiolgico.

2. CONSIDERAES GERAIS
2.1. Segurana

Seguir as recomendaes bsicas de segurana - tratar todos os produtos como

potencialmente perigosos.

No acto da colheita ou manuseamento do produto, usar luvas, bata, avental e se h risco

de produo de salpicos necessrio utilizar viseira protectora e/ou mscara.

No contaminar a superfcie exterior do recipiente e/ou da requisio acompanhante.

Minimizar o manuseamento directo dos produtos a enviar ao laboratrio. Enviar os

produtos em cestos de transporte.

Os produtos colhidos por aspirao com agulha devem ser transferidos para um recipiente
esterilizado. Caso envie o produto em seringa retirar sempre a agulha. Fechar a seringa
devidamente e identific-la.

Por medida de segurana, os recipientes e/ou requisies visivelmente conspurcados com

matria orgnica no devem ser aceites pelo laboratrio.

Sempre que possvel, efectuar o processamento do produto em cmara de fluxo laminar.

2.2. Normas Gerais de Colheita

Se possvel, efectuar as colheitas, antes de iniciar a teraputica antibitica.

Evitar a contaminao da amostra com a flora saprfita do doente e/ou bactrias do

ambiente, de modo a que a amostra seja representativa do local da infeco.

Utilizar material de colheita e de transporte apropriados e esterilizados.

Identificar claramente os recipientes e no o invlucro de papel ou plstico com o nome do

doente, servio, n. de processo, data e hora da colheita e origem do produto biolgico.

27

Colher o produto em quantidade suficiente para o(s) exame(s) requisitado(s). Quantidade

insuficiente pode originar resultados falsamente negativos. Os recipientes para a recolha
de produtos lquidos no devem encher-se para alm dos seus 2/3 de capacidade. Utilizar
recipientes inquebrveis, esterilizados e de encerramento hermtico e que no
permitam ao abrir a formao de aerossis.

Deve ser especificada a natureza do exame pretendido. Sempre que o exame

pretendido no fizer parte da rotina laboratorial, deve ser contactado o Laboratrio de
Microbiologia.

Se o produto for colhido atravs da pele intacta, desinfectar a pele primeiro, de acordo
com a poltica de anti-spticos do hospital. Prevenir a queimadura pela tintura de iodo
removendo o excesso aps a colheita.

2.3. Normas Gerais de Transporte

Transportar rapidamente todos os produtos para o laboratrio.

Alternativas ao transporte rpido:

- Lquor manter na estufa a 35C
- Hemocultura manter temperatura ambiente
- Restantes produtos refrigerar a 2-8 C
- Utilizao de Meios de transporte:
1. Para pesquisa de microrganismos muito sensveis, tais como a Neisseria spp,
devem ser colhidos para meio de transporte apropriado (com carvo para pesquisa
de N. gonorrhoae) e mantidos temperatura ambiente.
2. Para pesquisa de anaerbios usar o meio de transporte adequado.
3. Fezes - para exame cultural, enviar em meio de transporte especfico (ex.: meio de
Cary Blair)
4. Em todos os produtos sempre que o processamento laboratorial no possa ser
efectuado dentro do perodo de tempo adequado para cada produto.

3. NORMAS DE COLHEITA por LOCAL ANATMICO / PRODUTO

3.1. HEMOCULTURA
3.1.1. Tcnica de Colheita, Acondicionamento e Transporte
-

O sangue deve ser colhido por puno duma veia perifrica. incorrecta a colheita
atravs de catter I.V.

Desinfectar o local da puno com lcool a 70% de modo circular e do interior para a
periferia.

Repetir a operao com soluo alcolica iodada a 1%, ou seguir a poltica de antispticos do hospital.

Deixar o anti-sptico secar.

28

IMPORTANTE - No palpar a veia aps a desinfeco da pele e antes de inserir a agulha.

Se isto acontecer repetir todo o processo de desinfeco.
-

Desinfectar a rolha de borracha do frasco com lcool. Aspirar o sangue e inocular o(s)
frasco(s), sem mudar de agulha, no ultrapassando a proporo recomendada pelo
fabricante.

Aps a colheita, limpar a pele com lcool, para prevenir reaces adversas ao iodo.

Nunca refrigerar as hemoculturas aps a colheita. Conservar o frasco em estufa

a 37C at ser enviada ao laboratrio (ou temperatura ambiente nos mtodos
automticos se assim fr recomendado pelo fabricante).

3.1.2. Volume de sangue

O volume de sangue crtico, porque a concentrao de microrganismos na maioria das

bacterimias baixa, especialmente se o doente j est com antibioticoterapia. Nas
crianas a concentrao de microrganismos durante as bacterimias maior que nos
adultos pelo que necessrio menos sangue. O volume de sangue recomendado , em
geral:
Crianas 1 a 5 ml por puno venosa
Adultos 10 a 30 ml por puno venosa

O volume de sangue colhido dever ser repartido pelo n. de frascos necessrios de modo
a que a diluio final seja de 1: 5 a 1:10, respeitando as indicaes do fabricante.

3.1.3. Nmero e Momento de execuo das Hemoculturas

Habitualmente so suficientes 3 hemoculturas em 24 horas, colhidas separadamente,

sendo o intervalo entre as colheitas varivel conforme a situao do doente ou a urgncia
do incio de administrao de antibiticos.

Uma s hemocultura pode levar a que uma bacterimia intermitente no seja diagnosticada
assim como pode dificultar a interpretao do significado clnico do isolamento de certos
microrganismos.

Geralmente a informao adicional obtida com mais de 3 hemoculturas mnima.

Para outras informaes consultar captulo respectivo.

3.2. CATETERES INTRAVASCULARES

O envio de catter para exame bacteriolgico s aconselhado se existirem sinais de

infeco relacionadas com o catter.

29

Antes de retirar o catter, colher sangue para hemocultura de uma veia perifrica, pois
s assim ser possvel valorizar o exame cultural do catter.

Desinfectar a pele em redor do catter, utilizando um anti-sptico de acordo com a poltica

de anti-spticos do hospital.

Retirar o catter; e cortar asspticamente cerca de 3 a 5 cm da poro terminal e coloclo em recipiente esterilizado.

Nunca enviar pontas de catter em meio lquido ou de transporte.

3.3. BIPSIAS CIRRGICAS e MATERIAL PROTSICO

A colheita da exclusiva responsabilidade do cirurgio e enviado em recipiente esterilizado
seco ou em meio de cultura lquido, consoante as situaes (vid captulo respectivo).

3.4. LCR
3.4.1. Volumes mnimos recomendados
3.4.2.

1 ml para exame bacteriolgico

2 ml para cultura de fungos
3 ml para cultura de micobactrias
Puno Lombar

Desinfectar o local de colheita com uma soluo anti-sptica com lcool, de acordo com a
poltica de anti-spticos do hospital.

Colher o lquor para tubo esterilizado, inquebrvel, transparente de fundo cnico com
encerramento hermtico. recomendada a colheita em trs tubos, que devem ser
numerados, sendo o ltimo, utilizado para exame bacteriolgico.

Enviar o lquor de imediato ao laboratrio aps a colheita.

Nunca refrigerar o lquor.

Nota: Devem realizar-se simultaneamente hemoculturas.

3.5. EXSUDADOS PURULENTOS

3.5.1

CONSIDERAES GERAIS
Os exsudados de escaras de decbito e de contedo intestinal (ex.: fstulas enterocutneas) so amostras que contm habitualmente uma populao bacteriana mista
que impede o exame microbiolgico fivel, pelo que no devem ser processados, salvo
casos especiais.

30

3.5.2. Leses (Exsudados) PROFUNDA(O)S

Descontaminar a pele com soluo anti-sptica de acordo com a poltica de anti-spticos

do hospital.

Puncionar e aspirar directamente com seringa.

Colocar a amostra no recipiente esterilizado ou enviar a prpria seringa sem agulha, mas
devidamente fechada.

3.5.3. Leses (Exsudados) SUPERFICIAIS

Limpar a superfcie da leso com gua destilada ou soro fisiolgico esterilizado e realizar o
desbridamento dos tecidos necrosados.

Biopsar a base e bordo da leso e colocar em recipiente esterilizado, de preferncia com

prolas de vidro.
ou
Introduzir uma agulha fina por baixo da camada superficial da leso e aspirar com a
seringa e colocando a amostra no recipiente esterilizado ou enviar a prpria seringa sem
agulha, mas devidamente fechada.
ou
Com uma zaragatoa esterilizada esfregar toda a base da leso e coloc-la no meio de
transporte adequado.

3.6. URINA
3.6.1. Consideraes Gerais

Nunca colher urina de arrastadeira, urinol ou saco de alglia.

No processar pontas de alglia.

3.6.2.

Mtodos de colheita
-

Jacto mdio
Puno de catter urinrio
Puno supra-pbica
Saco colector em crianas
Drenagem de nefrostomia /ureterostomia

a) Colheita do jacto mdio - Mulher

Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higinica das mos.

Com compressas embebidas em gua e sabo (no utilizar anti-spticos, pois

podem inibir o crescimento dos microrganismos), proceder lavagem dos rgos
genitais da frente para trs, com uma compressa de cada vez, repetir a operao trs
vezes.

31

Usando o mesmo processo, lavar s com gua esterilizada e secar.

Iniciar a mico, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm para recipiente

esterilizado de boca larga.

b) Colheita do jacto mdio Homem

Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higinica das mos.

Afastar o prepcio e manter essa posio durante toda a colheita.

Limpar a glande com compressas embebidas em gua e sabo.

Usando o mesmo processo, lavar agora s com gua esterilizada e secar.

Iniciar a mico, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm para recipiente

esterilizado de boca larga.

c) Puno de catter urinrio - Doente algaliado

Clampar a alglia durante 10-15 minutos, acima da derivao, na zona de borracha.

Desinfectar com lcool a 70 o local a puncionar.

Com agulha e seringa esterilizada aspirar a urina (5 a 20 ml).

Transferir a urina para recipiente esterilizado, ou usar seringa prpria para transporte
de urina.

d) Puno supra-pbica

O doente deve ter a bexiga cheia.

Desinfectar a pele da regio supra-pbica com a soluo anti-sptica segundo a

poltica de anti-spticos do hospital.

Com agulha e seringa esterilizada, puncionar a pele e bexiga ao nvel do 1/3 inferior da
linha que une o umbigo snfise pbica.

Aspirar a urina e coloc-la em recipiente esterilizado ou enviar na prpria seringa aps

remoo da agulha.

e) Saco colector ( utilizado na criana sem controlo dos esfncteres )

Lavar com gua e sabo a rea genital, limpar com gua esterilizada e secar com
compressa esterilizada.

Aplicar um saco autocolante estril.

Se, ao fim de 30 minutos no tiver urinado, retirar o saco e repetir todo o procedimento
anterior;

32

Transferir a urina para recipiente esterilizado.

3.7. APARELHO GASTROINTESTINAL

3.7.1. FEZES
3.7.1.1. Exame BACTERIOLGICO

Despiste por rotina de Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter jejunii/coli.

Em certos casos e aps contacto com o Laboratrio: Yersinia enterocoltica, Vibrio spp.,
E.coli enterotoxignica e Aeromonas hidrophyla.

O despiste de C. difficile s deve ser efectuado quando solicitado, sendo as fezes colhidas
sem meio de transporte.

Embora tradicionalmente seja aconselhado a colheita at um total de 3 amostras de

dejeces diferentes, nos casos agudos uma amostra quase sempre suficiente.

Colheita de fezes - colher para um recipiente limpo e seco e transferir as fezes para
recipiente com meio de transporte apropriado (ex. meio de Cary-Blair), escolhendo a
poro com ps, muco ou sangue do tamanho de uma noz.
No usar papel higinico para colher as fezes, pois pode conter sais de brio, que so
inibitrios
.
3.7.1.2. Exame PARASITOLGICO

Colher 3 amostras em dias sucessivos, de preferncia em dias alternados.

Colher as amostras de fezes para recipiente limpo e seco.

A pesquisa de Cryptosporidium spp s se justifica em doentes imunocomprometidos e

crianas em casos de diarreia comprovada.

33

3.7.2. Exsudados rectais

Utilizado s para a deteco de Neisseria gonorrhoeae e na deteco de portadores, para

fins epidemiolgicos, de Streptococcus -hemoltico do grupo A, Staphyloccocus aureus
meticilina-resistente e Enterococcus vancomicina-resistente.

Introduzir uma zaragatoa estril 2,5 cm para alm do esfncter anal. Cuidadosamente,
rodar a zaragatoa de modo a recolher amostra das criptas anais.

Enviar a zaragatoa em meio de transporte com carvo quando se trate de pesquisa de

Neisseria gonorrhoeae.

3.7.3. Bipsias Gstricas

Usadas para a deteco de Helicobacter pylori.

A colheita realizada por endoscopia.

Colocar o fragmento de bipsia no meio de transporte apropriado.

3.7.4. Aspirado duodenal

Para a deteco de formas vegetativas de Giardia intestinalis, larvas de Strongyloides

stercoralis e Ascaris lumbricoides.

Para pesquisar Giardia intestinalis, a colheita deve ser realizada na segunda poro do
duodeno.

3.8. APARELHO GENITAL

3.8.1. APARELHO GENITAL FEMININO
3.8.1.1 Exsudado vaginal / endocervical

Colher com espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril.

Com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron colher a amostra do fundo de saco vaginal
posterior e endocolo.

Colocar a zaragatoa em meio de transporte com carvo, que se deve manter

temperatura ambiente.

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para a realizao de esfregaos.

34

3.8.1.2 Exsudado uretral

Se possvel antes da 1 mico. Se no possvel esperar pelo menos uma hora aps a
ltima mico.

Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gase esterilizada.

Introduzir na uretra cerca de 2 cm uma zaragatoa fina e flexvel, e com um movimento de

rotao recolher o exsudado.

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa, para a realizao de esfregaos.

Restantes procedimentos idnticos aos do exsudado vaginal.

3.8.1.4. Endomtrio

Enviar a amostra em recipiente esterilizado.

No caso de suspeita de anaerbios, colocar em meio de transporte adequado.

recomendvel realizar simultaneamente hemoculturas.

3.8.1.5. Abcessos (Fundos de saco, Trompas, Gl.Bartholin)

Colheita por aspirao (no caso da Glndula de Bartholin, descontaminar a pele com antisptico no alcolico).

Enviar de imediato amostra at 5 ml em recipiente esterilizado. Se suspeitar de anaerbios

utilizar meio de transporte adequado.

3.8.1.6. lceras genitais

O Laboratrio de Microbiologia deve ser contactado previamente.

Treponema pallidum - Limpar a superfcie da leso com gaze humedecida em soro

fisiolgico. Remover a crosta se presente, evitando sangrar. Pressionar a base da leso
at surgir um fluido claro e colher com uma pipeta Pasteur ou capilar. Colocar uma gota
numa lmina, cobrir com lamela e examinar imediatamente em microscpio de fundo
escuro.

Haemophilus ducrey - Limpar a superfcie da leso e fazer a colheita por aspirao com
uma pipeta Pasteur ou com zaragatoa esterilizada. Semear imediatamente em gelose
chocolate enriquecida com suplementos antibiticos.

35

3.8.1.7. Lquido amnitico

Enviar rapidamente ao laboratrio at 5 ml de amostra em tubo esterilizado e/ou meio de

transporte para anaerbios.

(NOTA No realizar exame microbiolgico dos dispositivos intra uterinos, D.I.U.)

3.8.2. APARELHO GENITAL MASCULINO

3.8.2.1. Exsudado uretral

A amostra deve colher-se antes da 1 mico da manh. Se no for possvel, esperar pelo
menos uma hora aps a ltima mico.

Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada. Fazer a expresso

uretral e introduzir uma zaragatoa fina e flexvel at 2 cm dentro da uretra. Recolher o
exsudado com um movimento de rotao para o exame directo a realizar no acto da
colheita. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para o exame cultural, que se deve
colocar em meio de transporte com carvo e manter temperatura ambiente at ao
envio para o laborattio.

3.8.2.2. Exsudado rectal

Procedimento idntico ao do aparelho genital feminino.

3.8.2.3. Abcessos (Epiddimo, Prstata, Testculos)

Colheita cirrgica.

Introduzir o aspirado, at 5 ml, no meio de transporte apropriado.

3.8.2.4. lceras genitais

Procedimento idntico ao do aparelho genital feminino.

3.8.3. AMOSTRAS PARA O ESTUDO DE CHLAMYDIA E DE MYCOPLASMA

Para o estudo da Chlamydia trachomatis e Mycoplasma devem seguir-se as indicaes de

cada fabricante, j que a colheita de amostras, meios de transporte e conservao dependem
da tcnica utilizada.
3.8.3.1. Chlamydia trachomatis

Os mtodos culturais so mais sensveis e especficos, mas devido sua complexidade e

custo no so efectuados na rotina da maior parte dos laboratrios.

36

Os mtodos no culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antignios, c.

nucleicos, por tcnicas de imunofluorescncia directa, EIA ou sondas de c. nucleicos. Nas
tcnicas de imunofluorescncia, os esfregaos so realizados no momento da colheita.

As amostras adequadas no so as secrees vaginais, mas sim os raspados, j que a

Chlamydia trachomatis se encontra nas clulas do epitlio cilndrico.

Esfregao endocervical e uretral

-

Remover o excesso de muco.

Inserir uma zaragatoa prpria no canal endocervical ou uretral e rodar.
Evitar contacto com a mucosa vaginal.
Transportar e conservar a amostra de acordo com a informao do fabricante.
Para a colheita uretral, o doente no deve urinar pelo menos 1 hora antes da
colheita.

3.8.3.2. Mycoplasma / Ureaplasma

Exsudado vaginal, cervical ou uretral

Colher a amostra com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron e proceder de acordo com
as indicaes do fabricante

3.9. EXSUDADO OCULAR

3.9.1. Consideraes gerais

Enviar sempre e em separado amostra dos dois olhos, indicando na requisio o lado da
infeco.

Nos recm-nascidos, efectuar sempre esfregao em lminas.

3.9.2. Colheita

Com uma zaragatoa de algodo ou de alginato de clcio na conjuntiva tarsal inferior e no

fornix do olho e coloc-la no meio de transporte apropriado.

3.9.3. Pesquisa de C. trachomatis

Solicitar ao Laboratrio o material de colheita e seguir as instrues do fabricante. Colher

antes de instilar qualquer anestsico.

3.10. APARELHO RESPIRATRIO

Consideraes gerais

Para o exame bacteriolgico suficiente 1 nica amostra de boa qualidade, apenas para a
pesquisa de micobactrias se aconselham 3 amostras em dias consecutivos.

37

Se suspeitar de C. diphteriae. B. pertussis, N. gonorrhoeae, antes de efectuar a colheita,

contactar o Laboratrio de Microbiologia.

3.10.1. Vias areas SUPERIORES

3.10.1.1. Exsudado Farngeo

Usado para a deteco de Streptococcus -hemoltico do grupo A. Se solicitado, poder

ser efectuado para pesquisa de N. gonorrhoeae, N. meningitidis (despiste de portadores),
Angina de Vincent, Bordetella pertussis e Corynebacterium diphfteriae.

No obter amostra se existir inflamao da epiglote, pois pode causar espasmos com
consequente obstruo respiratria.

Baixar a lngua com esptula.

Colher com zaragatoa entre os pilares e por detrs da vula faringe posterior, amgdalas
e qualquer rea inflamada ou ulcerada evitando tocar na mucosa bucal e lngua.

Enviar no meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

3.10.1.2. Exsudado Nasal

Usado essencialmente para fins epidemiolgicos, na deteco de portadores de

Staphylococcus aureus meticilina resistente.

Inserir uma zaragatoa estril em cada narina at encontrar resistncia (mais ou menos a
nvel dos cornetos).

Rodar a zaragatoa contra a mucosa nasal.

Colocar, eventualmente em meio de transporte, e enviar rapidamente ao laboratrio.

3.10.1.3. Exsudado nasofarngeo

Para diagnstico de B. pertussis e deteco de portadores de Streptococcus -hemoltico

do grupo A, e N. meningitidis.

Cuidadosamente introduzir uma zaragatoa flexvel de alginato de clcio atravs do nariz e

coloc-la em recipiente esterilizado com o meio de transporte adequado.

3.10.1.4. Aspirado de seio perinasal

Colheita a efectuar pela O.R.L. Aspirao com agulha de seio maxilar, frontal ou outros
seios.

Colocar em meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

38

3.10.1.5. Lquido de timpanocentese

Produto indicado no diagnstico da otite mdia aguda.

Limpar o canal auditivo externo com soro fisiolgico estril.

Aspirar com agulha e seringa e enviar em meio de transporte apropriado.

Se o tmpano estiver perfurado, o exsudado pode ser colhido com zaragatoa.

3.10.2. Vias respiratrias INFERIORES

3.10.2.1. Expectorao

Preferir a 1 amostra da manh em jejum. Lavar a boca e gargarejar s com gua antes de
iniciar a colheita.

Instruir o doente para colher expectorao por tosse profunda.

Colher o produto em recipiente esterilizado, de boca larga de encerramento hermtico.

3.10.2.2. Expectorao induzida

Se o doente no conseguir expectorar esta pode ser induzida por:

-

Cinesioterapia respiratria.
Nebulizao efectuada apenas com NaCl 0,85% (inalar 20 a 30 ml de uma soluo de
3 a 10% de NaCl 0,85% em H2O).

Restantes procedimentos iguais aos da expectorao

Procedimento no recomendado em caso de suspeita de tuberculose.

3.10.3.3. Secrees brnquicas por aspirao endotraqueal

Aspirar as secrees e colocar em recipiente esterilizado com tampa de rosca ou tubo de

Luken.

3.10.3.4. Amostras colhidas por broncoscopia

Lavado brnquico ou Lavado broncoalveolar

-

Enviar as amostras em recipiente esterilizado com tampa de rosca e hermtico,

marcando a ordem da colheita (1, 2, 3 ).

Escovado com catter duplamente protegido

-

Depois de retirar o catter exteriorizar a escova da colheita;

39

Cortar assepticamente a escova para dentro do recipiente esterilizado com 1 ml de

lactato de Ringer.

Bipsia brnquica
-

Colocar em recipiente esterilizado com uma pequena quantidade de gua destilada

esterilizada (evitar a secagem).

3.10.3.5. Aspirado transtraqueal

Desinfeco correcta da pele no local da puno de acordo com a poltica de anti-spticos

do hospital.

Anestesia local e colheita por aspirao.

Colocar a amostra em recipiente esterilizado ou em meio de transporte apropriado se

pretendida cultura para anaerbios.

3.10.3.6. Aspirado pulmonar transtorcico

Desinfeco correcta da pele no local da puno de acordo com a poltica de anti-spticos

do hospital.

Colheita cirrgica controlada por TAC.

Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla colher vrias amostras.

Enviar de imediato ao laboratrio a amostra na seringa sem agulha devidamente tapada

com dispositivo esterilizado.

3.10.3.7. Bipsia pulmonar (toracotomia)

3

Se possvel colher 1- 3 mm de tecido pulmonar;

Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla colher vrias amostras

Colocar em recipiente esterilizado.

3.11. LQUIDOS de SEROSAS

Volumes mnimos recomendados:

-

Exame bacteriolgico .............1 ml

Exame micolgico ..................2 ml
Exame micobacteriolgico......2 ml

Desinfectar o local da puno com a soluo anti-sptica segundo a poltica de antispticos do hospital.

Aspirar com agulha e seringa.

40

Colocar a amostra em recipiente seco, esterilizado com tampa de rosca.

Na pesquisa de anaerbios, expelir as bolhas da seringa ou colocar o contedo em meio

de transporte apropriado.

Eventualmente, quando indicado e protocolado com o laboratrio, podem os produtos ser

inoculados em frascos para hemocultura (segundo procedimento idntico ao das
hemoculturas).

41

URINA
1. INTRODUO

As infeces do aparelho urinrio so uma das infeces mais frequentes no Homem. A

infeco urinria aguda geralmente causada por bactrias da flora intestinal saprfita, que
invade o aparelho urinrio por via ascendente atravs da uretra.
Os agentes etiolgicos mais frequentes nas crianas e adultos, sem outras doenas
associadas, so as Enterobactereceas com grande destaque para a Escherichia coli.
Em doentes internados e com factores de risco como algaliao permanente, tubos de
nefrostomia, clculos urinrios e outras patologias do aparelho urinrio, o leque de agentes
etiolgicos alarga-se a outros microrganismos, como Pseudomonas spp, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus spp e fungos, estes ltimos
particularmente em doentes que esto sob teraputica antibitica.

2. AMOSTRAS
2.2 COLHEITA
A urina habitualmente um lquido biolgico estril, mas a sua passagem atravs da uretra
durante a mico arrasta os microrganismos que a colonizam, podendo induzir erros na
interpretao da urocultura.
Para o diagnstico de infeco do aparelho urinrio so vlidas as seguintes amostras de urina
(ver captulo NORMAS de COLHEITA)
1.
2.
3.
4.
5.

Mico jacto mdio

Puno de cateter urinrio
Puno supra-pbica
Drenagem de nefrostomia / ureterostomia
Saco colector em crianas

Urina colhida por mico jacto mdio

-

O doente dever colher a primeira urina da manh, ou se impossvel, colher urina aps
ter estado pelo menos duas horas sem urinar.

Afastamento dos grandes lbios ou prepcio.

Limpeza metdica do meato uretral com gaze embebida em gua e sabo.

Usando o mesmo processo, lavar s com gua esterilizada e secar.

Recolha do jacto intermdio directamente para recipiente esterilizado aps desperdiar

a primeira poro do jacto urinrio.

42

Urina colhida por puno de catter urinrio ( Foley )

-

Clampagem da alglia

Desinfeco do local de puno com soluto anti-sptico

Aspirao da urina com agulha e seringa

A urina pode ser enviada na prpria seringa, fechada com tampa esterilizada (aps
remoo da agulha).

Nota - nunca colher urina do saco da alglia

Urina colhida por puno supra- pbica

-

Desinfeco cirrgica da pele

Puno

Envio da urina na prpria seringa

Este mtodo de colheita est particularmente indicado em doentes algaliados nos quais a
interpretao de resultados de exames anteriores foi impossvel e em crianas nas quais
foi tambm impossvel colher urina pelos outros mtodos.

Urina colhida por drenagem de nefrostomia / ureterostomia

Quando h um cateter inserido atravs do flanco do paciente directamente na plvis renal
ou no ureter, a colheita feita directamente do cateter para recipiente esterilizado.

Urina colhida com saco colector em crianas

-

Lavagem dos genitais externos com gua e sabo

Colocar o saco bem adaptado.

Envio da urina no prprio saco.

2.3. TRANSPORTE

Aps a colheita, a urina deve ser transportada ao laboratrio o mais rapidamente possvel,
uma vez que dever ser semeada at uma HORA aps a colheita. Se no for possvel,
dever ser refrigerada a 4 C e processada at s 24 horas aps a colheita.

Quando a refrigerao imediata no possvel, a urina dever ser colhida para recipiente
com preservante (ex: cido brico) e colocada temperatura ambiente. Poder ser
processada at 24 horas aps a colheita. Neste caso deve ter-se particular ateno ao
volume da urina / preservante (possibilidade de falsos negativos quando o volume de urina
muito pequeno).

43

3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL

3.1. Exame DIRECTO

Exame do esfregao de urina corado pelo GRAM

-

Colocar 10 l de urina no centrifugada e bem homogeneizada, numa lmina de

vidro.

Secar ao ar, fixar e corar pelo GRAM.

Determinar o nmero de microrganismos por campo, com objectiva de imerso (100 x) a presena de 1 ou mais bactrias por campo pode ser correlacionada com uma
5
contagem de colnias de 10 U.F.C./ ml

Exame directo a fresco do sedimento urinrio observao de elementos celulares

como clulas epiteliais, leuccitos, eritrocitos, fungos ou parasitas no sedimento da urina
centrifugada.

3.2. Exame CULTURAL

Meios de cultura - Gelose sangue e MacConkey ou Meio de CLED
-

Homogeneizar a urina

Emergir verticalmente na urina no centrifugada uma ansa calibrada de 1l

Semear nos meios apropriados

Incubar em atmosfera de aerobiose a 35 C, 18 a 24 horas.

Aps a incubao, leitura do n. de colnias:

1 colnia
10 colnias
100 colnias

10 UFC / ml
4
10 UFC / ml
5
10 UFC / ml

4. INTERPRETAO dos RESULTADOS

Urina colhida por mico jacto intermdio , por puno de catter urinrio
-

A valorizao dos resultados dever ter em conta uma srie de parmetros tais como:
mtodo de colheita da urina, tipo de doente (por ex.: urolgico, geritrico, etc.),
sintomatologia, observao microscpica do sedimento urinrio e resultados de
exames bacteriolgicos anteriores.

Se colheita por mico, geralmente quando h crescimento de duas ou mais estirpes

bacterianas, considerar que houve uma m tcnica de colheita da urina ou um atraso

44

no transporte e/ou no processamento laboratorial da mesma requisitar nova colheita

de urina.
-

Segundo os critrios de Kass, uma contagem de colnias

de infeco urinria.

10 significativo

Urina colhida por saco colector em crianas

O exame bacteriolgico da urina colhida por este mtodo pode dar resultados falso
positivos, por provvel contaminao com a flora do perneo. Se necessrio, estes
resultados podem ser confirmados, repetindo a colheita de urina por outro mtodo ( ex:
puno supra-pbica)

Urina colhida por puno supra-pbica

Excluindo a contaminao por bactrias comensais da pele, devero ser valorizadas
quaisquer espcies de bactrias isoladas, independentemente da sua quantificao.

45

HEMOCULTURAS
1. INTRODUO
A grande maioria das doenas infecciosas podem decorrer com bacterimia transitria,
intermitente, ou persistente (ex. endocardite).
Como o sangue um produto biolgico estril, o isolamento de um microrganismo a partir
duma hemocultura geralmente o agente etiolgico da infeco.

2. AMOSTRAS

2.1 LOCAL de COLHEITA

A colheita do sangue para hemocultura efectuada por puno venosa de qualquer das
veias perifricas.

Quando so realizadas mais do que uma hemocultura sequencialmente, devem efectuar-se

as colheitas em diferentes veias perifricas.

No recomendada a colheita de sangue por puno de cateter I.V., excepto quando

no possvel a puno de veia perifrica (o laboratrio dever ser informado deste facto,
essencial para a interpretao do resultado).

O volume de sangue colhido por frasco deve respeitar a proporo recomendada pelo
fabricante em relao ao meio de cultura.

2.2. TCNICA de COLHEITA - ACONDICIONAMENTO e TRANSPORTE

DESINFECO da PELE

Desinfectar o local da puno com lcool a 70% de modo circular e do interior para a
periferia.

Repetir a operao com soluo alcolica iodada a 1%, ou seguir a poltica de antispticos do hospital.

Deixar o anti-sptico secar.

IMPORTANTE - No palpar a veia aps a desinfeco da pele e antes de inserir a agulha,

se isto acontecer repetir todo o processo de desinfeco.

Desinfectar a rolha de borracha do frasco com lcool. Aspirar o sangue e inocular o(s)
frasco(s), sem mudar de agulha, no ultrapassando a proporo recomendada pelo
fabricante

46

Aps a colheita, limpar a pele com lcool, para prevenir reaces adversas ao iodo.

Nunca refrigerar as hemoculturas aps a colheita. Conservar o frasco em estufa a

37C at ser enviada ao laboratrio (ou temperatura ambiente nos mtodos
automticos se assim fr recomendado pelo fabricante).

VOLUME de SANGUE
O volume de sangue crtico porque a concentrao dos microrganismos baixa na maioria
das bacterimias, principalmente se o doente est sob teraputica antibitica. Nas crianas, a
concentrao dos microrganismos durante o perodo de bacterimia muito mais alta do que
nos adultos, por isso so necessrios menores volumes de sangue.
Volumes recomendados
Crianas - 1 a 5 ml por puno venosa
Adultos - 10 a 30 ml por puno venosa

2. 3. NMERO e MOMENTO de EXECUO das HEMOCULTURAS

No colher sangue para hemocultura no pico febril.

O nmero e o intervalo entre as colheitas depende da situao clnica e da urgncia que

exista para iniciar a antibioticoterapia. Como indicador apresentam-se algumas situaes
clnicas:
Colher sequencialmente em locais diferentes 2 a 3
hemoculturas
Colher inicialmente 2 a 3 hemoculturas.
Febre de origem desconhecida (SFI) Se negativas entre as 24h e as 36h, efectuar mais 2
hemoculturas.
Efectuar 3 hemoculturas no 1 dia. Se negativas s
Endocardite infecciosa
24h, repetir colheita de 3 hemoculturas
Sepsis, meningite, pneumonia

Doentes com teraputica

antimicrobiana

A colheita deve ser feita imediatamente antes da

toma do antibitico

3. MEIOS de CULTURA
Os meios utilizados devem conter 0,025 a 0,05% de polianetolsulfato (SPS). O SPS um
anticoagulante que inibe a actividade bactericida do soro, a fagocitose, inactiva o complemento,
neutraliza lisozimas e ainda alguns antibiticos da grupo dos aminoglicosdeos. Note-se que h
espcies de Neisseria que podem ser inibidas pelo SPS.
3.1. Meios de cultura ou sistemas para isolamento de microrganismos aerbios e
anaerbios facultativos

Meios lquidos Brain heart infusion, Brucella, Columbia, TSB

Meios bifsicos - meio de Castaeda
Sistema de Lise - centrifugao ( Isolator)
Meios lquidos para aerbios de sistemas automticos

47

3.2. Meios de cultura especficos para anaerbios

Meios lquidos - Thioglicolato

Meios lquidos para anaerbios de sistemas automticos

4. PROCEDIMENTOS GERAIS
Recomendaes GERAIS - devem ser sempre cumpridas todas as normas de precaues
universais quando se manipula o sangue:
1. Utilizar luvas aquando da manipulao de qualquer lquido orgnico.
2. Sempre que possvel, efectuar o processamento do produto em cmara de fluxo
laminar.
3. Colocar o material contaminado, seringas e agulhas em contentor prprio no
perfurvel.
4.1. Meios de Cultura e Sistemas NO- AUTOMTICOS
4.1.1 Meios de cultura lquidos baseados nos meios convencionais

Ventilar o frasco para aerbios (havendo assim uma melhor recuperao dos
microrganismos aerbios estritos, p. ex. Pseudomonas spp. e fungos leveduriformes):
- Descontaminar a tampa do frasco com lcool a 70%.
- Deixar secar 1 a 2 min.
- Em cmara de fluxo laminar, inserir uma agulha de ventilao para retirar o vcuo.

Incubar o frasco da hemocultura em atmosfera de aerobiose a 35C durante 7 dias ou at

28 dias quando suspeita de diagnstico de Brucella.

4.1.2. Meios de cultura Bifsicos

O meio utilizado o Meio de Castaeda (fase lquida - TSB e fase slida - TSA).

Incubao em atmosfera de aerobiose a 35C durante 7 dias ou at 28 dias quando

suspeita de diagnstico de Brucella.

Exame macroscpico duas vezes por dia nos primeiros 2 dias e depois diariamente com
inverso do frasco para contacto do meio lquido com a gelose.

4.1.3. Sistema de Lise-Centrifugao

Colheita de 10 ml ou 1,5 ml de sangue consoante a capacidade do tubo (Isolator).

Inverter o tubo para misturar o sangue com o lquido de lise.

Processar nas 8 h seguintes colheita.

As amostras colhidas em tubos de 10ml devem ser centrifugadas, a fim de permitir

concentrao dos microrganismos (no centrifugar os tubos que contm 1,5ml de sangue).

48

Centrifugar a 3000 g durante 30 minutos.

Efectuar todos os procedimentos seguintes em cmara de fluxo laminar:

-

Retirar o sobrenadante e concentrar o sedimento em agitador durante 20 seg.

Inocular em meios de cultura especficos consoante o pedido do exame.
Incubao em diferentes atmosferas, dependendo dos microrganismos a pesquisar.

4.2. Sistemas AUTOMTICOS

Existem vrios sistemas automticos comercializados. Todos utilizam para a cultura de sangue,
meios lquidos para aerbios (ou para anaerbios). A deteco do crescimento bacteriano
efectuada automaticamente (medio do CO2 produzido e modificaes do pH).
Critrios de Avaliao de um Sistema Automtico
1.
2.
3.
4.

Incubao no aparelho temperatura de 35C com ou sem agitao contnua

Tempo de incubao proGramvel pelo utilizador
Avaliao de falsos positivos
Avaliao de falsos negativos

Nota: Nalguns sistemas (equipamentos), aconselhada a realizao de subculturas sempre

que haja suspeita de microrganismo de crescimento lento (p. ex. Brucella) ou suspeita de
infeco por fungos.

5. Processamento laboratorial das HEMOCULTURAS POSITIVAS

5.1. Mtodo MANUAL

Exame macroscpico observao visual diria do crescimento microbiano e subcultura

da hemocultura em meio slido, geralmente gelose sangue quando apresenta turvao,
hemlise, formao de gs, formao de pelcula ou colnias visveis na transio entre o
sedimento eritrocitrio e o meio de cultura.

Em alternativa, fazer passagens cegas s 24 horas, 48 horas e 7 dias de incubao

(mtodo actualmente o menos recomendado).

Efectuar subculturas dos frascos que no apresentem crescimento visvel s 72 h:

-

Gelose sangue e gelose chocolate com incubao em 5% CO2 a 35C at s 48 h.

No recomendada subcultura em anaerobiose.

Subculturas ao 7 dia consideram-se de pouca utilidade clnica.

49

5.2. Mtodo AUTOMTICO

Quando o equipamento detecta positividade, realizar subcultura em meio slido,

geralmente em gelose com sangue.

Possibilidade de efectuar esfregao da hemocultura com suspeita de positividade e corar

pelo mtodo de Gram (observao microscpica).

Possibilidade de realizao de subculturas em diferentes meios e atmosferas de incubao

de acordo com a informao obtida pelo exame microscpico, quando realizado.

Incubao em atmosfera de aerobiose, com 5% CO2 ou em anaerobiose a 35C durante

24h a 48h, consoante o microrganismo a pesquisar.

Leitura macroscpica das culturas e realizao da identificao e testes de sensibilidade

segundo metodologia existente no laboratrio.

6. PROCESSAMENTO DE HEMOCULTURAS QUE REQUEREM TRATAMENTO

ESPECFICO
6.1. Culturas de sangue para deteco de Brucella spp.
Toda a manipulao das culturas para deteco deste agente tem de obrigatoriamente
ser efectuada em cmara de fluxo laminar.

Devem ser utilizados preferencialmente os meios Bifsicos ou sistema de Lise

centrifugao.

Incubar o meio em estufa com 10% de CO2 temperatura de 37C.

Se for utilizado um meio bifsico, deve-se proceder ao arejamento do frasco, que deve ser
invertido diariamente e observar a presena de crescimento bacteriano.

Se utilizado meio lquido manual ou sistema automtico, devem ser efectuadas subculturas
semanalmente, durante 4 semanas para Gelose sangue Brucella, Gelose sangue BHI,
triptose simples ou outro especfico para a pesquisa deste agente.

Em culturas positivas proceder realizao de esfregao da cultura, corar pelo Gram e

proceder identificao.

6.2. Cultura para deteco de Leptospira

A Leptospira requer meios especficos para o seu crescimento, como o meio de Fletcher
com adio de soro de coelho a 14% (vol./vol.) ou meio de Leptospira com albumina e
cido gordo. Estes meios devem estar contidos em tubos de 5 ml.

Inocular 6 tubos do meio a usar

- Em 2 tubos adicionar uma gota de sangue
- Em 2 tubos adicionar 2 gotas de sangue
- Em 2 tubos adicionar 1 gota de sangue previamente diludo 1:10 em tampo salino de
fosfato estril.

50

Incubar os tubos no escuro entre 28 C e 30C durante 6 semanas.

Semanalmente remover uma gota do meio 1 a 3 cm abaixo da superfcie e examinar em

microscpio de fundo escuro.

6.3. Neutralizao ou Inactivao dos Agentes Antimicrobianos

Nos doentes que recebem altas doses de -lactmicos, podem ser usados os seguintes
procedimentos:
1. Frascos com resinas para remoo dos agentes antimicrobianos
2. Adio de penicilinase - assepticamente adicionar a penicilinase nas propores
recomendadas pelo fabricante.
(Realizar o teste de esterilidade da penicilinase, inoculando 3 a 5 gotas em TSB e
incubar durante 5 dias).

51

LQUIDO CFALO - RAQUIDIANO

1. INTRODUO

A Meningite Bacteriana uma Emergncia Mdica pois a infeco das meninges uma
situao clnica grave e potencialmente mortal se no tratada atempadamente.
O diagnstico laboratorial uma urgncia que requer processamento imediato do produto
para determinar o agente etiolgico. Geralmente so as bactrias aerbias que causam esta
infeco, mas na presena de abcesso cerebral o agente etiolgico pode ser uma bactria
anaerbia.
Agentes Etiolgicos das Meningites Agudas
Idade ou Condio

Microrganismos

Recm-nascido

Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Herpes

simplex virus 2

< 2 meses

S. agalactiae, L. monocytogenes, E. coli

< 10 anos

Virus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria

meningitidis

Adultos Jovens
Adultos
Idosos
Doentes
Imunodeprimidos

Virus, N. meningitidis
S. pneumoniae, N. meningitidis
S. pneumoniae, Bacilos Gram negativo, L .monocytogenes
Cryptococcus neoformans

2. AMOSTRAS

A colheita deve ser feita antes do incio da teraputica antimicrobiana.

A colheita feita por puno lombar e o LCR deve ser colhido em tubos inquebrveis,
transparentes, com tampa de rosca e fundo cnico para concentrao do produto, uma vez
que pode conter muito poucas bactrias.

Deve ser enviado ao Laboratrio imediatamente aps a colheita, e mantido

temperatura ambiente (ou na estufa a 35C) e nunca refrigerado antes do
processamento, a no ser que sejam pedidos estudos virais. Apenas o LCR para estudos
virais deve ser refrigerado ou congelado.

So necessrios 3 tubos: 2 para exame citolgico e bioqumico e outro para exame

microbiolgico (ltimo tubo).

52

So necessrios pelo menos os seguintes volumes mnimos:

- 1 ml para a cultura bacteriana
- 2 ml para a cultura de fungos
- 3 ml para a cultura de micobactrias

A observao de esfregao corado pelo mtodo de Gram importante, e qualquer

resultado positivo deve ser comunicado imediatamente ao clnico.

3. MEIOS de CULTURA e REAGENTES

Gelose chocolate com suplemento polivitamnico

Gelose sangue
Caldo crebro-corao (BHI), ou meio de Tioglicolato na suspeita de anaerbios.

4. PROCESSAMENTO LABORATORIAL

Avaliar o volume da amostra de LCR e descrever a sua aparncia microscpica.

Se o volume for superior a 1 ml centrifugar durante 20 minutos (1.500 a 3.000 g), se for
inferior utilizar s o agitador para homogeneizar a amostra.

Aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando aproximadamente 0,5 a 1 ml

de sedimento e guardar aquele para estudos adicionais, durante uma semana.

Ressuspender o sedimento agitando vigorosamente durante 30 segundos.

Preparar o esfregao colocando uma ou duas gotas sem espalhar do sedimento numa
lmina de vidro nova limpa com lcool e seca. Fixar com metanol e corar pelo mtodo de
GRAM e AZUL de METILENO. A citocentrfuga um mtodo alternativo para a preparao
do esfregao.

Com uma pipeta esterilizada, inocular os meios a partir do sedimento incubar a 35C em
atmosfera de 5 % CO2 at s 72 horas, observando as placas diariamente.

Fazer a passagem dos meios lquidos de enriquecimento s 24 e/ou 48 horas

Antignios capsulares bacterianos

Pode ser feita pesquisa de antignios bacterianos (Haemophilus influenzae tipo b,
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae) sempre que
clinicamente se justifique, nunca dispensando a sua correlao com o exame
bacteriolgico directo e cultural. Seguir as instrues do fabricante. Um resultado positivo
depende do nvel de antignios detectveis e no substitui a CULTURA.
A sensibilidade dos testes de ltex varivel, e cada laboratrio deve avaliar a
sensibilidade e especificidade para o mtodo utilizado.

53

LQUIDOS de SEROSAS (ORGNICOS)

1. INTRODUO
Os lquidos orgnicos so normalmente estreis e qualquer microrganismo encontrado deve
ser investigado. A interpretao final deve ter em conta o estado clnico do doente e o
microrganismo isolado.
2. AMOSTRAS

Lquido pleural
Lquido peritoneal
Lquido pericrdico
Lquido sinovial

3. COLHEITA E TRANSPORTE

A colheita depende do local anatmico, mas deve seguir-se sempre uma tcnica
assptica.

Para o estudo bacteriano recomendado um volume mnimo de amostra de 1 ml. Para a

pesquisa de micobactrias ou fungos necessrio, quando possvel, um volume superior
(10 a 20 ml).

Colher para recipiente esterilizado seco com tampa de rosca.

Para pesquisa de anaerbios, utilizar meio de transporte prprio.

Enviar de imediato ao laboratrio.

Adicionalmente, quando indicado e protocolado com o laboratrio, podem fazer-se

colheitas com inoculao em frasco para Hemocultura, o que no dispensa o envio de
produto para exame directo ou outros estudos laboratoriais.

4. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES

Gelose sangue
Meio selectivo para bactrias Gram negativo
Meio lquido de enriquecimento (por ex. BHI ou thioglicolato)
Quando indicado, utilizar outros meios para pesquisa de outros microrganismos (ex.:
gelose chocolate no lquido sinovial)

54

5. PROCEDIMENTOS
5.1. Processamento inicial da amostra

Observar / Descrever o aspecto macroscpico da amostra

Os lquidos lmpidos devem ser concentrados por centrifugao, enquanto as

amostras purulentas podem ser inoculadas directamente nos meios de cultura:
- Centrifugar durante 15 a 30 minutos a 1500 g.
- Aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando cerca de 1 ml de
lquido no qual se ressuspende o sedimento.

Os lquidos que apresentem cogulos devem ser homogeneizados.

5.2. Exame DIRECTO

Preparar um esfregao do sedimento e corar pelo GRAM.

5.3. Exame CULTURAL

Com uma pipeta esterilizada transferir 2 gotas do sedimento para cada placa dos
meios de cultura e semear com ansa esterilizada.

Incubar as placas de gelose sangue e gelose chocolate em atmosfera de 5% de CO2 a

35C, durante 18 a 24 horas.

Incubar o meio selectivo para Gram negativo e os meios lquidos a 35C, em

aerobiose.

Fazer a passagem dos meios lquidos de acordo com o diagnstico, exame directo e a
cultura primria.

55

FluxoGrama do exame bacteriolgico dos Lquidos de Serosas

Colheita de Amostra
Concentrao

Esfregao Corado Gram

e Ziehl-Neelsen

Aerbia

Culturas Primrias

Incubao

Anaerbia

35C CO2 18-24horas

35C 48horas

Observao Placas

Observao Placas

No Crescimento

Crescimento

Crescimento

No Crescimento

B. Aerbias

Reincubao
Anaerbia 35C 2448 horas

Bactrias Aerbias
Reincubao e
Observao Diria
do Meio Lquido no
mnimo 48 horas

B. Anaerbias
ID e TSA

Colorao Gram

Beta-Lactamase

Crescimento

No
Crescimento

Resultado
Final

ID

Resultado Final

56

APARELHO RESPIRATRIO SUPERIOR

1. INTRODUO
As infeces das vias respiratrias superiores so muito frequentes, sendo a maior parte de
etiologia viral. O diagnstico bacteriolgico dessas situaes representa uma tentativa de
identificar, entre uma flora indgena abundante, o(s) agente(s) implicado(s) na infeco.
Flora microbiana indgena do aparelho respiratrio superior
Existe uma flora mista abundante, constituda por aerbios e anaerbios. Vrios agentes
patognicos tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, N. meningitidis, leveduras
e membros das Enterobacteriaceae, podem constituir uma flora transitria ou estar presente
em pequeno nmero na orofaringe de indivduos saudveis. Nos seios paranasais e ouvido
mdio no h flora microbiana nos indivduos saudveis.

2. FARINGITE
A principal causa de faringite viral. Na faringite bacteriana a principal causa o
Streptococcus -hemoltico do grupo A. Outras causas de faringite so a Neisseria
gonorrhoeae, Bordetella pertussis e Corynebacterium diphtheriae, devendo a pesquisa destes
agentes ser feita exclusivamente quando existe suspeita clnica e por solicitao especfica do
mdico.
2.1. Faringite ESTREPTOCCICA

Agente patognico - Streptococcus pyogenes (S. -hemoltico do grupo A)

Colheita e Transporte

Deprimir a lngua com uma esptula e utilizar uma zaragatoa de algodo, alginato de
clcio ou dacron. Colher a amostra passando vigorosamente a zaragatoa ao nvel das
amgdalas e poro posterior da faringe, evitando tocar a lngua e a vula.

No necessrio a utilizao de meio de transporte se o processamento laboratorial

ocorrer dentro de 3 horas aps a colheita. Noutras situaes, deve ser utilizado meio
de Stuart ou Amies.

Exame DIRECTO
No se recomenda no diagnstico da faringite estreptoccica, devido existncia de uma
flora mista e de um grande nmero de outros Streptococcus na orofaringe, sendo por isso
difcil a sua interpretao.

57

Exame CULTURAL
-

Gelose sangue
Meio de Todd-Hewitt suplementado com sangue a subcultura s 24 horas pode
facilitar a deteco do Streptococcus hemoltico do grupo A quando ele se encontra
presente em pequeno nmero.

Incubar o meio durante 18-24 h a 35 C em atmosfera de aerobiose (eventualmente em

anaerobiose que favorece a hemlise uma vez que a Streptolisina O oxignio-lbil).
2.2. Faringite GONOCCICA

Agente patognico - Neisseria gonorrhoeae

Colheita e Transporte
A nvel das amgdalas e faringe posterior com colocao em meio de transporte com
carvo (ex.: Meio de Amies com carvo).

Exame DIRECTO - no deve ser efectuado, devido existncia de neisserias saprftas

que fazem parte da flora farngea.

Exame CULTURAL
-

Meio selectivo para N. gonorrhoeae (meio GC, Thayer-Martin modificado ou New

York City)

Incubao durante 48-72 horas a 35C em atmosfera de 5-10% de CO2 .

2.3. Faringite na TOSSE CONVULSA

Agente patognico - Bordetella pertussis

Colheita e Transporte

Com zaragatoa flexvel de alginato de clcio, colher muco da nasofaringe por via
pernasal ou efectuar colheita por aspirao nasofarngea.

O agente muito sensvel desidratao, devendo a amostra ser semeada

cabeceira do doente e imediatamente enviada ao Laboratrio. Se isso no for possvel,
utilizar meio de transporte e de enriquecimento que contm na sua constituio,
cefalexina, sangue desfibrinado de cavalo e agar semi - slido.

Exame CULTURAL
Em meio de Bordet-Gengou ou outro meio selectivo, com incubao a 35C em atmosfera
hmida durante 5-7 dias em aerobiose.

58

2.4. Faringite DIFTRICA

Agente patognico - Corynebacterium diphtheriae

Colheita e Transporte
Colher exsudado a nvel da orofaringe e da nasofaringe com zaragatoa. Se no for
processado imediatamente, colocar em meio de transporte.

Exame CULTURAL
-

Semear em meio de Loeffler e incubar 18 horas em aerobiose a 35C.

Diagnstico presuntivo da cultura, realizar esfregao e corar com azul de metileno

para observao da presena de bacilos em paliada ou caracteres chineses
apresentando grnulos metacromticos.

Diagnstico definitivo ver captulo respectivo.

Se as culturas forem positivas, necessrio para a confirmao clnica de difteria, a

pesquisa da toxina (Teste de Elek verificar que se trata de estirpe toxignica).

2.5. Angina de VINCENT

um tipo de infeco da faringe devido a dois anaerbios - Borrelia vincentii e

Fusobacterium spp.

O diagnstico laboratorial feito por exame directo do esfregao de material da faringe

colhido com zaragatoa e corado com carbolfucsina diluda (fucsina de Ziehl diluda a 1:10).

A observao de muitas espiroquetas e bacilos fusiformes com muitos polimorfonucleares

confirma o diagnstico.

3. LARINGITE
Quase sempre de etiologia viral, o exame bacteriolgico no est indicado nestas situaes,
excepto para a excluso da difteria ou infeco por Streptococcus -hemoltico do grupo A.

4. EPIGLOTITE

Geralmente de etiologia bacteriana, sendo na sua maioria provocada pelo Haemophilus

influenzae tipo B.

O diagnstico essencialmente clnico e atravs de hemoculturas (positivas em cerca

de 50% dos casos). Est contra-indicada a colheita de amostras da epiglote devido ao risco
de poder originar uma obstruo aguda das vias areas .

59

5. SINUSITE
Frequentemente de origem endgena, a partir de microrganismos presentes nas vias areas
superiores .
Agentes mais frequentes

Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis
Streptococcus spp
Staphylococcus aureus
Bacilos Gram negativo
Eventualmente, Anaerbios

Colheita e Transporte
Realizada pelo especialista, a NICA amostra vlida para exame bacteriolgico a obtida
por puno do seio perinasal, com envio ao Laboratrio em meio de transporte para
aerbios e eventualmente para anaerbios.

Exame DIRECTO
Fazer esfregao para colorao pelo GRAM.

Exame CULTURAL

Meios slidos
- Gelose sangue
- Gelose chocolate
Meios lquidos
- BHI ou Todd-Hewitt, suplementado com sangue
- Meio de carne cozida (para pesquisa de anaerbios)

Incubao durante 18 a 24 h em atmosfera de 5% de CO2.

Sub-cultura dos meios lquidos para meios slidos de acordo com culturas iniciais.

Quando indicado processar para pesquisa de anaerbios.

6. OTITE MDIA
A otite mdia uma infeco muito frequente em bebs e crianas
Agentes mais frequentes
-

Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Haemophilus influenzae

60

Como agentes menos frequentes - S. aureus , M. catarrhalis, Enterobacteriaceae e anaerbios

Colheita e Transporte

A melhor amostra a colhida por timpanocentese com transporte ao Laboratrio em meio de

transporte para aerbios e para anaerbios. Se tiver havido ruptura do tmpano, utilizar um
espculo auricular e colher o exsudado com zaragatoa. Enviar em meio de transporte para
aerbios.

Exame DIRECTO - fazer esfregao para colorao pelo GRAM .

Exame CULTURAL - proceder como em 5.

7. OTITE EXTERNA
No uma infeco das vias respiratrias superiores mas importante fazer a distino entre
as zaragatoas auriculares para colheita de pus com origem no ouvido mdio por ruptura do
tmpano, e as zaragatoas para diagnstico de infeces bacterianas da pele do canal auditivo
externo, sendo a Pseudomonas aeruginosa uma causa frequente de otite externa .

8. COLHEITA DE AMOSTRAS COM FINS EPIDEMIOLGICOS

A colheita de amostras das vias respiratrias superiores ocorre por vezes com a finalidade de
se fazer a deteco de portadores de S. aureus e de N. meningitidis.

Despiste de portadores na nasofaringe de S. aureus - para vigilncia e controlo de

surtos de infeco nosocomial.
Colheita da amostra - colher com zaragatoa a nvel das narinas e faringe e semear em
meio selectivo (manitol salgado). Incubar em aerobiose a 35C durante 18-24h.

Despiste de portadores de N. meningitidis - para controlo de disseminao da infeco

a partir de um caso de doena meningoccica.
Colheita da amostra - a partir da orofaringe e nasofaringe com colocao em meio de
transporte apropriado. Efectuar a sementeira das zaragatoas em meio selectivo (ThayerMartin modificado ou New York City ou VCAT) e incubar durante 48-72h a 35C em
atmosfera de 5% de CO2.

61

APARELHO RESPIRATRIO INFERIOR

1. INTRODUO
O diagnstico das infeces respiratrias inferiores frequentemente dificultado pela
contaminao das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita. O laboratrio
deve processar apenas as amostras de boa qualidade.

2. AMOSTRAS

Expectorao
Secrees brnquicas (aspirao endotraqueal)
Lavado brnquico
Lavado bronco-alveolar
Escovado brnquico
Bipsia brnquica
Aspirado transtraqueal
Aspirado pulmonar (transtorcico)
Bipsia pulmonar (toracotomia)

3. COLHEITA e TRANSPORTE

3.1. Expectorao

Se possvel, colher a primeira expectorao da manh.

Lavar a boca e gargarejar s com gua antes da colheita.

Instruir o doente para colher expectorao por tosse profunda (desprezar amostras de
saliva ou rinorreia posterior).

Colocar a amostra em recipiente estril, seco, de boca larga e tampa de rosca.

3.2. Expectorao Induzida

Se a expectorao for escassa, proceder induo da mesma por nebulizao com soro
fisiolgico (20 a 30 ml de uma soluo de 3 a 10% de NaCl 0,85% em H2O).

A induo da expectorao tambm pode ser feita por cinesiterapia respiratria.

Restantes procedimentos idnticos aos da expectorao.

Nota: este procedimento no recomendado em caso de suspeita de tuberculose.

62

3.3. Secrees brnquicas por Aspirao Endotraqueal

Aspirar as secrees e colocar em recipiente seco, estril com tampa de rosca ou tubo de
Luken.

3.4. Amostras colhidas por Broncoscopia

3.4.1. Lavado brnquico ou Lavado bronco-alveolar

Enviar as amostras ao laboratrio em recipientes secos, estreis, com tampa de rosca

devidamente marcados por ordem de colheita (1, 2 e 3).

3.4.2. Escovado brnquico

Colocar o escovado em recipiente esterilizado com 1ml de gua destilada esterilizada

ou 1ml de Lactato de Ringer.

3.4.3. Bipsia brnquica e pulmonar transbrnquica

Colocar em recipiente esterilizado com uma pequena quantidade de gua esterilizada .

3.5. Aspirado transtraqueal

Desinfeco correcta da pele no local de puno

Anestesia local e colheita por aspirao

Colocar a amostra em recipiente esterilizado ou em meio de transporte apropriado se

pretendida cultura para anaerbios

3.6. Aspirado pulmonar (transtorcico)

Colheita cirrgica controlada por TAC

Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla, colher vrias amostras.

Enviar ao laboratrio a amostra na seringa devidamente tapada por borracha esterilizada.

3.7. Bipsia pulmonar (toracotomia)

3

Se possvel colher 1 a 3 mm de tecido pulmonar.

Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla, colher vrias amostras.

Colocar em recipiente seco e esterilizado

As amostras devem ser enviadas ao laboratrio no prazo mximo de 30 minutos.

63

4. MEIOS de CULTURA e REAGENTES

-

Gelose sangue
Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
Meio de MacConkey (opcional)
Meios para anaerbios, quando indicado

5. PROCEDIMENTOS
5.1. EXPECTORAO e SECREES BRNQUICAS
Exame DIRECTO

Seleccionar uma poro purulenta da amostra, efectuar um esfregao por estiramento e

corar pelo mtodo de Gram.

Observar ao microscpio ptico com objectiva 10 x (cerca de 10 campos) para avaliar a

qualidade da amostra tendo em conta a presena de clulas epiteliais pavimentosas (da
orofaringe) e leuccitos.

Classificar as amostras segundo o critrio de Murray e Washington ou equivalente.

Tabela de Murray e Washington

Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5

Clulas epiteliais /
Pequena ampliao (10 X)
25
25
25
10-25
< 10

Leuccitos /
Pequena ampliao (10 X)
10
10-25
25
25
25

Segundo este critrio, processar as amostras que se englobem nos grupos 4 e 5. So as

de boa qualidade para o exame bacteriolgico habitual.

No dever ser aplicado este critrio em doentes neutropnicos e na pesquisa de outros

agentes especficos, tais como Mycobacterium sp, Legionella sp, Mycoplasma sp, etc.
(agentes que no fazem parte da flora normal da orofaringe e no a colonizam).

Exame CULTURAL

De poro purulenta seleccionada, semear com ansa esterilizada segundo o mtodo dos
quatro quadrantes, nos seguintes meios de cultura:
- Gelose sangue
- Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
- MacConkey (opcional)

Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 a 35 C durante 18 a 24 horas.

Valorizar as culturas de acordo com a observao do Gram e informao clinica.
Reisolar e identificar a estirpe valorizada.

64

5.2. ESCOVADO BRNQUICO

Exame CULTURAL

Agitar no vortex o tubo que contm o escovado e o lquido de transporte.

Semear com ansa calibrada ou com pipeta 10 l nos meios de cultura:

-

Gelose sangue
Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
MacConkey (opcional)

Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 a 35 C durante 18 a 24 horas.

Quantificar o crescimento correspondendo cada colnia a 10 U.F.C./ml.

1 Col =
10 Col =
100 Col =

10 U.F.C./ml
3
10 U.F.C./ml
4
10 U.F.C./ml
3

Valorizar as estirpes isoladas em quantidade >10

O volume de secrees colhidas pelo escovado aproximadamente de 0,001 ml e diludo

em 1 ml de lquido de transporte, resulta numa diluio final de 1/1000; assim, um
3
6
crescimento > 10 U.F.C./ml indica uma concentrao de bactrias de 10 U.F.C./ml nas
secrees, valor normalmente considerado significativo de infeco.

Reisolar e identificar as estirpes valorizadas.

5.3. LAVADO BRONCO-ALVEOLAR

O lavado broncoalveolar obtido por instilao e aspirao de uma soluo no

bacteriosttica de NaCl 0,85% atravs do broncoscpio encravado num segmento
brnquico.

A quantidade de soluto instilado no est padronizada, mas considera-se que pelo menos
120 ml so necessrios para obter uma boa amostragem das secrees alveolares.

A primeira amostra (fraco brnquica) deve ser processada separadamente para

colorao e culturas de determinados microrganismos (Micobactrias, Legionella e
Fungos).

As outras duas amostras podem ser misturadas e usadas para exame microscpico e
culturas quantitativas.

O volume mnimo aceitvel para exame directo e cultural de 5 ml para cada.

65

Exame DIRECTO

Contagem celular
-

Contagem de clulas na amostra no fraccionada nem centrifugada, usando um

hematocitmetro.
Devem fazer-se duas contagens e a mdia das duas ser registada como o nmero de
clulas/ml de LBA (excluem-se os eritrocitos).

Os esfregaos devem ser efectuados aps citocentrifugao do LBA (600 a 1000 rpm
durante 10 a 20 minutos). Se no existir citocentrfuga podero ser realizados a partir de
um sedimento obtido em centrfuga normal.

Colorao GIEMSA
-

Colorao de GRAM
-

Contagem diferencial de leuccitos

Clulas epiteliais pavimentosas (>1%, sugere contaminao com flora da orofaringe).
Observao da existncia de clulas epiteliais brnquicas

Semiquantificao e caracterizao morfolgica e tinturial dos microrganismos

presentes.
Referir a % de neutrfilos com microrganismos intracelulares (ICO).

Pesquisa de fibras de Elastina

-

Uma gota de LBA + uma gota KONa 40%.

Incubar temperatura ambiente durante 1 a 4 horas ou aquecer chama.
Observao microscpica com objectiva 100 x.

Exame CULTURAL

Agitar no vortex durante 30 a 60 segundos e semear com ansa 10 l nos meios de

cultura:
- Gelose sangue
- Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
- MacConkey (opcional)

Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 em estufa a 35 C durante 24 horas.

Se ocorrer crescimento quantificar as colnias segundo o seguinte quadro:

1 Col =
10 Col =
100 Col =

10 U.F.C./ml
3
10 .F.C./ml
4
10 .F.C./ml
4

Valorizar os microrganismos isolados em quantidade > 10 U.F.C./ml.

66

O lquido de retorno corresponde a uma diluio de 1/100 do fludo de revestimento

4
6
alveolar: um crescimento > 10 U.F.C./ml indica uma concentrao de bactrias > 10
U.F.C./ml no fluido de revestimento alveolar, valor normalmente considerado significativo
de infeco.
4

Em doentes no ventilados, 10 a 10
diferenciar colonizao de infeco.

Em doentes ventilados e sob antibioticoterapia prvia estes valores so imprecisos.

U.F.C./ml um valor apropriado para

5.4. ASPIRADO TRANSTRAQUEAL, PULMONAR e BIPSIA PULMONAR

Exame DIRECTO

Aspirado transtraqueal - efectuar esfregao de modo idntico expectorao ou

secrees brnquicas.

Aspirado pulmonar - efectuar um esfregao fino.

Bipsia pulmonar - esfregao efectuado directamente por touchpress ou a partir de

homogeneizado.

Exame CULTURAL

Aspirado transtraqueal - idntico ao da expectorao e secrees brnquicas.

Aspirado pulmonar - semear directamente nos meios de cultura.

Bipsia pulmonar - cultura do homogeneizado efectuado por macerao.

Meios de cultura:
- Gelose sangue
- Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
- MacConkey (opcional)
- Meio lquido para anaerbios (quando solicitada cultura para anaerbios e se a
amostra tiver sido colhida e transportada em condies adequadas).

Incubar as placas em atmosfera 5 % de CO2 em estufa de 35 C durante 24 horas.

Identificar todos os microrganismos isolados.

Incubar o meio lquido para anaerbios a 35 C e observar diariamente durante 5 dias.

Quando apresentar turvao efectuar um esfregao do mesmo e corar pelo Gram.
Subcultivar em meios slidos para aerbios e anaerbios.

Identificar todos os microrganismos isolados.

67

EXSUDADOS OCULARES
1. INTRODUO
As infeces oculares podem ser divididas em :
Infeces das estruturas externas do olho
- blefarites
- conjuntivites
- queratites
Infeces das estruturas internas do olho
- endoftalmites
Infeces do sistema lacrimal
- canaliculites
- dacriocistites
- dacrioadenites
A nvel do saco conjuntival existe uma flora saprfita constituda principalmente por
Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp, Propionibacterium acnes, Staphylococcus
aureus. Mais raramente podem ser encontrados o Haemophilus influenzae,
Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Moraxella catarrhalis e fungos.

2. COLHEITA E TRANSPORTE

As indicaes e tcnicas para investigao bacteriolgica so determinadas pela localizao

da infeco (ocular ou peri-ocular), sua gravidade e rapidez de instalao e pelo conhecimento
dos principais agentes implicados.
MATERIAL DE COLHEITA
1. Esptula de platina de Kimura - para a obteno de amostras da conjuntiva e da
crnea.
2. Lminas e agulhas descartveis.
3. Zaragatoas de algodo ou de alginato de clcio, com ou sem meio de transporte,
de acordo com o tipo de exame que se pretende realizar.
4. Soluo anestsica.

68

3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL
Devido constante aco de lavagem das lgrimas, o nmero de bactrias isoladas de
algumas infeces oculares geralmente baixo, pelo que se recomenda a utilizao de um
grande inculo e a sementeira em vrios meios de cultura. Habitualmente, semeia-se um meio
lquido (TSB ou BHI) e meios slidos (gelose-sangue, gelose-chocolate). Aos meios referidos
poder-se-o associar outros, de acordo com a suspeita clnica.

3.1. BLEFARITE
Infeco aguda ou crnica da margem da plpebra envolvendo a pele e pestanas.

Principais agentes
-

Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis

Colheita da amostra
Molhar uma zaragatoa de algodo ou de alginato de clcio em soro fisiolgico
esterilizado e pass-la ao longo das margens superior e inferior da plpebra. Com outra
zaragatoa, repetir o mesmo procedimento para o outro olho.

Exame DIRECTO - no til, pelo que no deve ser efectuado.

Exame CULTURAL
-

Gelose sangue
Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp.
Meio para fungos (nas blefarites crnicas)
Incubao em 5 % CO2 at s 48 horas

3.2. CONJUNTIVITE
A conjuntivite bacteriana representa o tipo mais frequente de infeco ocular e pode ocorrer
por inoculao directa ou exgena, ou por disseminao hematognica a partir dum foco
infeccioso.

Principais agentes de conjuntivite da comunidade

-

Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Neisseria gonorrhoeae
Moraxella catarrhalis

69

Principais agentes de conjuntivite no recm nascido

-

Principais agentes em doentes imunocomprometidos

-

Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus aureus
Bacilos Gram negativo

Enterobacteriaceae
Pseudomonas aeruginosa

Colheita da amostra
-

Com zaragatoa - Deve ser feita antes da aplicao de um anestsico tpico ou

antimicrobiano, pois estes agentes podem interferir no isolamento das bactrias.
Utilizar uma zaragatoa de alginato de clcio e pass-la ao longo da conjuntiva tarsal
inferior. Colher amostras de ambos os olhos .

Com esptula de Kimura.

Nota: na suspeita de infeco por Chlamydia trachomatis, efectuar colheita para tcnica de
imunofluorescncia directa, de acordo com as instrues do fabricante.

Exame DIRECTO
Quando efectuado realizar o esfregao na altura da colheita e corar pelo mtodo de
Gram.

Exame CULTURAL - semear a amostra nos seguintes meios :

Meios slidos
-

Gelose-sangue
Gelose-chocolate selectiva para Haemophilus spp.
Meio selectivo para N. gonorrhoeae - no recm nascido

Meio lquido
-

BHI ou outro - facultativo

3.3. QUERATITE
Infeco da crnea que pode apresentar variadas etiologias. As bactrias so responsveis por
65 - 90% dos casos. Dever ser encarada como uma situao de emergncia porque a perda
do olho afectado pode ocorrer em 24h quando bactrias como a Pseudomonas aeruginosa ou
o Staphylococcus aureus esto envolvidas.

70

Principais agentes de infeco

-

Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Moraxella catarrhalis
Haemophilus spp
Acanthamoeba spp.

Colheita da amostra
a. Com zaragatoa de alginato de clcio - o risco de contaminao com a flora indgena
maior.
b. Com esptula de Kimura - so efectuadas pelo oftalmologista vrias raspagens,
sendo cada uma utilizada para inocular um nico meio de cultura e realizao de esfregao
para exame directo.
c. Bipsia da crnea - mtodo de colheita utilizado pelo oftalmologista quando no
existe supurao da crnea. O tecido crneo transportado ao Laboratrio em meio lquido
estril ou soro fisiolgico estril. Aps a bipsia, pode ser obtido material adicional por
raspagem da base da mesma.

Exame DIRECTO
Se possvel devem ser feitos esfregaos para colorao de Gram a partir do material
colhido pelos diferentes mtodos, sendo o Gram feito a partir da suspenso ou aps
esmagamento do tecido crneo.

Exame CULTURAL - a amostra colhida deve ser semeada em:

Meios slidos
- Gelose sangue
- Gelose chocolate
- Outros, de acordo com a suspeita clnica
Meio lquido
- BHI ou Todd-Hewitt

Os pequenos fragmentos de bipsia podem ser semeados directamente em meio lquido.

Incubao a 35 C em aerobiose durante 18-24 h.
Sub-cultura dos meios lquidos de acordo com os agentes isolados nas culturas primrias.

71

3.4. ENDOFTALMITE
a mais grave infeco do olho. uma inflamao da cavidade ocular e tecido intraocular e
pode ocorrer por via exgena, endgena ou por contiguidade.

Principais agentes de infeco

Endoftalmites ps cirrgicas
-

Staphylococcus aureus
Staphylococcus coagulase-negativo
Streptococcus pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacteriaceae

Endoftalmites ps traumticas
-

Bacillus spp
Clostridium spp

Endoftalmites endgenas

Colheita da amostra
-

Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis

Devido dificuldade da colheita, o laboratrio deve ser previamente contactado

A colheita cirrgica, efectuada pelo oftalmologista.
As seringas contendo o produto aspirado devero ser fechadas e enviadas de imediato
ao Laboratrio de Microbiologia.

Exame DIRECTO
Se o volume da amostra for suficiente, efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL
Em meios lquidos e slidos como em 3.3 e efectuar tambm cultura em anaerobiose,
quando indicado.

Nota - no diagnstico das infeces oculares graves como as queratites e endoftalmites,

devem ser feitas hemoculturas.

72

3.5. CELULITE ORBITRIA

uma infeco sistmica e grave que envolve o tecido orbitrio resultante de trauma, cirurgia,
extenso de infeco a partir do etmide ou seios perinasais ou disseminao hematognea.

Principais agentes de infeco

Infeco ps cirrgica
-

Staphylococcus aureus

Infeco ps trauma - Infeco mista por aerbios e anaerbios

Infeco associada a sinusite

Colheita da amostra
-

Haemophylus influenzae
Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Bacilos Gram negativo

Deve ser feita pelo oftalmologista

Desinfectar a pele com soluo alcolica iodada.
Nas leses fechadas, se possvel colher o material purulento com agulha e seringa.
Se existir ferida cirrgica ou traumtica, limpar a ferida com soro fisiolgico esterilizado
e colher a amostra com zaragatoa. Enviar a amostra ao Laboratrio em meio de
transporte para aerbios.

Exame DIRECTO
Efectuar esfregao a partir do material colhido para colorao de Gram.

Exame CULTURAL
Efectuar em meios lquidos e slidos como em 3.3., e tambm cultura em anaerobiose
quando indicado.

3.6. INFECES do APARELHO LACRIMAL

3.6.1. DACRIOADENITE / DACRIOCISTITE

A dacrioadenite uma infeco das glndulas lacrimais em que os principais agentes so:
-

Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae

73

A dacriocistite uma infeco do saco lacrimal, que ocorre habitualmente por obstruo do
canal lacrimal. Os principais agentes so :

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Haemophylus influenzae

Colheita da amostra
No deve ser efectuada atravs de puno da glndula lacrimal. Colher exsudado com
zaragatoa de algodo ou alginato de clcio .

Exame DIRECTO
Efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL como em 3.3

3.6.2. CANALICULITE
Inflamao do canal lacrimal, frequentemente associada a obstruo do mesmo. A maior parte
das infeces so devidas a anaerbios, embora possam ocorrer infeces mistas por aerbios
e anaerbios. Os principais agentes so:

Actinomyces israelii
Propionibacterium propionicus
Moraxella catarrhalis
Difteroides
Streptococcus viridans

Colheita da amostra
Por compresso da plpebra e canalculos. Grnulos sulfurosos podem ser esmagados
numa lmina para colorao.

Exame DIRECTO
Efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL
-

Gelose sangue
Gelose-chocolate
Meio para fungos
Meio de carne cozida ou de Thioglicolato

74

EXSUDADOS PURULENTOS

1. INTRODUO

Muitas so as situaes clnicas e muitos so os respectivos microrganismos

responsveis por infeces localizadas que conduzem formao de exsudados
purulentos, colectados ou no.

No Quadro n. 1 exemplificam-se alguns microrganismos e respectivas potenciais

localizaes da infeco.

Assim, devido s mltiplas variveis envolvidas, a metodologia para o estudo

microbiolgico de qualquer exsudado purulento tem de ter em considerao:
1.
2.
3.
4.

Local da infeco
Histria clnica, nomeadamente dados epidemiolgicos.
Tipo de infeco (abcedada ou no)
Modo de colheita

Perante a variedade de situaes clnicas e de agentes microbianos implicados, os

procedimentos que se desenvolvem a seguir dizem respeito metodologia geralmente
aplicada para a maioria das situaes. No se pode excluir portanto a necessidade de
mtodos especficos quando a situao nosolgica indique a probabilidade de se tratar
de agente especfico, por ex. pesquisa de bactrias anaerbias, devendo ento
reportarmo-nos seco respectiva. A pesquisa de micobactrias ou fungos tm
metodologia prpria que no est includa neste manual .

2. COLHEITA e TRANSPORTE das AMOSTRAS

2.1. Normas GERAIS

Todas as amostras tm de ser identificadas com os dados demogrficos do doente, data

e hora da colheita, identificao do produto, local anatmico da colheita (quando no
seja implcito na denominao do produto biolgico). Estes dados condicionam a
metodologia laboratorial a utilizar.

Toda a amostra tem de se colocar em contentor esterilizado. Eventualmente o produto

pode ser enviado ao laboratrio na prpria seringa com que foi colhido, SEMPRE APS
RETIRAR A AGULHA e desde que exista forma de fechar a seringa com tampa estril no
perfurante ou cortante.

O transporte ao laboratrio e respectivo processamento deve ser o mais rpido possvel,

no mximo at duas horas aps a colheita.

As amostras que no so transportadas rapidamente ao laboratrio, que estejam

contaminadas com flora mista da pele, ou ainda que contenham microrganismos de

75

colonizao, conduzem a falsos resultados com o consequente diagnstico clnico e

respectiva teraputica incorrectos.

Os melhores produtos para o isolamento do agente etiolgico so os exsudados

colectados ou bipsias tecidulares.

2.2. Exsudados de leses fechadas:

A colheita dos exsudados profundos deve ser realizada por puno e aspirao com
agulha e seringa. NO devem ser usadas zaragatoas para a colheita de amostras
provenientes deste tipo de leses.

Quando se realiza por puno, a pele deve ser desinfectada com mistura anti-sptica
alcolica (para evitar a contaminao com flora extrnseca ou indgena).

2.3. Exsudados de leses abertas:

Quando no h alternativa e se tem de colher com zaragatoa, esta deve ser colocada em
meio de transporte (Stuart ou Amies). NO USAR ZARAGATOAS SECAS.

2.4. Material tecidular / Bipsia

Colher de forma assptica uma pequena quantidade de tecido (no superior a cerca de 0,5
cm de dimetro).

Leses abertas - lavar com lquido estril (gua destilada ou soro fisiolgico), remover o
tecido necrosado e fazer a bipsia das leses mais profundas e com sinais de infeco.

Leses fechadas - realizar de acordo com o procedimento cirrgico.

Colocar a amostra num tubo esterilizado seco e enviar imediatamente ao laboratrio.

Estabelecer de acordo com o laboratrio, metodologia diferente de colheita e transporte

em produtos particulares.

2.5. Exsudado de lceras de presso (escaras) ou vasculares (lceras varicosas)

Estas amostras tm em si uma grande quantidade de tecidos necrosados o que favorece a

colonizao com mltiplas estirpes bacterianas, com a consequente dificuldade de
determinar o agente etiolgico.

Este exame s tem interesse se conduzir a informao clnica relevante no mais curto
espao de tempo.

O laboratrio tem de fornecer normas de colheita com o objectivo de evitar a contaminao

com flora indgena da pele.

Distinguir, na valorizao das culturas, microrganismos da pele ou contaminantes, dos

agentes potencialmente patognicos.

76

S realizar a identificao e teste de sensibilidade aos antimicrobianos dos agentes

isolados em amostras colhidas correctamente e em bactrias consideradas como agentes
etiolgicos de infeco.

Sempre que possvel fazer colheita de biopsia tecidular, aps ter feito a limpeza da ferida
como indicado em 2.4.

Quando no possvel fazer bipsia colher o exsudado superficial com auxlio de

zaragatoa, colocar em meio de transporte e enviar rapidamente ao laboratrio

3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL
3.1. Material colhido por ASPIRAO
3.1.1. Exame DIRECTO
-

Colorao de Gram
Colorao de Ziehl-Neelsen - eventual
Colorao simples (azul de metileno) - eventual

3.1.2. Exame CULTURAL

Meios slidos
- Gelose sangue
- Meio selectivo para bactrias Gram negativo (ex.: MacConkey)
- Meio selectivo para bactrias Gram positivo (ex.: Azido de Sdio, ANC)
- Meio selectivo para isolamento de Staphylococcus sp. - eventual
- Outros de acordo com a suspeita clnica (por ex. Meios selectivos para isolamento
de Haemophilus sp. ou Neisseria sp., etc.)
Meios lquidos (enriquecimento)
- BHI (Brain Hearth Infusion) ou meio Todd-Hewitt com sangue, ou outro.
- Meio de carne cozida
(seleccionar um ou dois destes meios)

Incubao a 35 C, aerobiose, 18-24 horas.

Efectuar sub-cultura dos meios lquidos para meios slidos de acordo com o produto
biolgico, o tipo morfolgico das bactrias observadas no exame directo, e/ou agentes
isolados nas culturas iniciais.

Se suspeita de anaerbios, vide seco respectiva do manual.

3.2. Material colhido com ZARAGATOA

Colocar a zaragatoa em 0,5 ml de caldo (BHI, Triptose ou Todd-Hewitt) e agitar com

auxlio de agitador mecnico (vortex).

Com a suspenso obtida, realizar o procedimento como descrito em 3.1.

77

3.3. Material TECIDULAR / BIPSIA

Triturar a amostra com auxlio de frasco com prolas ( ou outro mtodo disponvel).
Restante procedimento como em 3.1.

3.4. Exsudado de LCERAS de presso (escaras) ou vasculares (lceras varicosas)

Exame CULTURAL
- Gelose sangue
- Meio selectivo para isolamento de bactrias Gram negativo (ex: MacConkey)
- Meio selectivo para isolamento de bactrias Gram positivo(Azido de Sdio, ANC)

Restante procedimento como em 3.1.

BIPSIAS CIRRGICAS

(c/ dimenses que no permitem homogeneizao)

MATERIAL PROTSICO

( Vlvulas cardacas, fragmentos vasculares e sseos )

1. Colheita no Bloco Operatrio

Colocar em contentor estril de boca larga e enviar de imediato ao laboratrio.

No laboratrio em condies de asspsia adicionar meio lquido (ex.: BHI).
Em alternativa - ainda no bloco operatrio colocar a bipsia em frasco de boca larga
com meio BHI previamente fornecido pelo laboratrio. Enviar de imediato para
incubao e processamento laboratorial.

2. Processamento

Incubar 35 C at 12 dias.
Observar diariamente a turvao.
Se sobrenadante turvo, sub-cultivar em gelose sangue e realizar um esfregao da
cultura para colorao de Gram.
Se lmpido at ao 12 dia, realizar uma passagem cega para gelose sangue e realizar
esfregao para colorao de Gram.

CATETERES VASCULARES (mtodo de Maki)

O objectivo avaliar a possibilidade da responsabilidade do catter como origem de um quadro
de bacterimia.
1. Colheita e Transporte

Colher, de veia perifrica no cateterizada, sangue para hemocultura, imediatamente

antes da retirada do cateter
Retirar o penso e desinfectar com anti-sptico alcolico a porta de entrada do catter.
Colher assepticamente os 5 cm distais do cateter. Colocar num recipiente estril e
seco.

78

Enviar imediatamente ao laboratrio.

2. Processamento

Assepticamente remover o catter e coloc-lo na superfcie de uma placa de gelose

sangue. Rodar o cateter na superfcie do meio de cultura com auxlio de uma vareta
esterilizada.
Incubar a 35 C.
Se desenvolvimento > 15 colnias valorizar e identificar.
Correlacionar os isolamentos da cultura do catter, com o resultado da hemocultura
concomitante.
Quadro 1

Lista parcial de agentes bacterianos detectados em infeces da pele e tecido celular

subcutneo:
Microrganismo
Infeco ou Sindroma
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Leses actinomicticas
Aeromonas spp.
Feridas
Capnocytophaga spp.
Abcessos
Chromobacterium violaceum
Abcessos
Corynebacterium jeikeium
Feridas; Infeces de catteres
Capnocytophaga canimorsus
Feridas de mordedura de co
Eikenella corrodens
Infeces de tecidos moles; mordedura humana
Feridas; Feridas crnicas e/ou profundas;
Enterobacteriaceae
leses de queimaduras.
Enterococcus spp.
Feridas; leses de queimaduras.
Erysipelothrix rhusiopathiae
Erisipelide
Leses cutneas associadas com infeces
Haemophilus influenzae
sistmicas
Kingella kingae
Infeces sseas ou de articulaes
Flora oral
Feridas de mordeduras
Leses cutneas associadas com infeces
Neisseria gonorrhoeae,
Neisseria meningitidis
sistmicas
Nocardia spp.
Abcessos cutneos ou sub-cutneos
Pasteurella multocida
Mordedura de animais; osteomielite.
Pseudomonas aeruginosa
Feridas; leses de queimadura; furunculose;
Infeces eritematosas superficiais; infeces
Staphylococcus aureus
profundas; abcessos; leses de queimadura;
feridas; furnculos.
Staphylococcus spp. coagulase negativo Catteres
Infeces eritematosas superficiais; infeces
Streptococcus pyogenes (Grupo A)
profundas; abcessos; leses de queimadura;
feridas; furnculos; necrose muscular.
Streptococcus spp. beta-hemolitico
Feridas
Streptococcus spp. grupo viridans
Feridas; catteres; mordeduras.
Streptococcus moniliformis
Mordedura de animais
Vibrio vulnificus
Feridas; necrose muscular
(Quadro adaptado de Isenberg, H.D. (ed.) 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook,
American Society for Microbiology, Washington, D.C.)

79

Interpretao sumria dos resultados:

Deve realizar-se a Identificao e Teste de Susceptibilidade aos antimicrobianos em:

1. Estirpes com grande probabilidade de serem agentes patognicos, independentemente do

nmero presente: Streptococcus beta-hemoltico do Grupo A de Lancefield,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
2. Agentes potencialmente
imprevisvel.

patognicos

com

susceptibilidade

aos

antimicrobianos

3. Microrganismos isolados de doentes com infeces associadas a catteres e de locais

normalmente estreis.

Agentes provavelmente contaminantes da pele: (Geralmente no responsveis por

infeco)

1. Staphylococcus coagulase negativo, Streptococcus viridans, Bacillus spp., difterides.

2.

Excepo - microrganismos isolados em cultura pura e observados no exame directo

(Colorao de Gram)

No devem ser valorizados clinicamente:

Quando esto presentes mais do que trs espcies microbianas (particularmente da flora
intestinal) de locais como abcessos abdominais, liquido peritoneal, rea plvica, abcessos ou
fstulas peri-anais, lceras de decbito, lceras vasculares (varicosas).

80

EXAME BACTERIOLGICO DAS FEZES

1. INTRODUO

As infeces do aparelho gastrointestinal tm uma alta incidncia na populao em geral,

com grande morbilidade em determinados grupos etrios (crianas e velhos).

Os microrganismos responsveis por esta infeco, tm vindo a alterar-se devido a vrios

factores tais como o aumento dos movimentos migracionais, maior frequncia de viagens
intercontinentais, aumento do nmero de doentes imunodeprimidos e o desenvolvimento
de mtodos de diagnstico cada vez mais sensveis.

Os antecedentes epidemiolgicos, a existncia de factores predisponentes, a presena de

sinais e sintomas clnicos e o tipo de diarreia devem orientar na pesquisa do agente
etiolgico.

2. AMOSTRAS
2.1. COLHEITA

Devem ser obtidas at um total de trs amostras de fezes (cerca de 1 a 2 Gramas

tamanho de uma noz), colhidas em dias diferentes. Se possvel escolher uma poro com
muco, pus ou sangue.

Para pesquisa de toxina de Clostridium difficile s devero ser enviadas fezes diarreicas.

Exsudado rectal (para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae ou em casos seleccionados

para pesquisa de colonizao intestinal ex: Enterococcus spp resistentes vancomicina )

2.2. TRANSPORTE

Colocar as fezes em meio de transporte de Cary Blair ou meio de glicerol tamponado

salino.

Em situaes em que no exista disponibilidade de meio de transporte, as amostras devem

ser processadas at 2 horas aps a sua emisso.

As zaragatoas para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae devero ser colocadas em meio de

transporte com carvo.
Nota - No processar amostras contaminadas com urina.

81

3. MEIOS de CULTURA

MacConkey
Meios selectivos para Salmonella e Shigella - meio SS , meio Hektoen
Meio selectivo para Campylobacter spp.
Meio selectivo para Yersinia enterocoltica
Caldos de enriquecimento para Salmonella e Shigella spp. - meio de Selenito F, meio
GN e meio de Tetrationato

4. PROCEDIMENTOS
4.1. Exame CULTURAL

Por rotina devem ser pesquisados Salmonella spp, Shigella spp, e Campylobacter
spp.

Para alm das bactrias acima assinaladas, cada laboratrio deve determinar as bactrias
que pesquisa por rotina de acordo com a situao geogrfica e epidemiolgica.

.
Meios de cultura
a. Meio de MacConkey
b. Meio selectivo para Salmonella spp e Shigella spp ex.: meio SS, meio de
Hektoen.
c. Meio selectivo para Campylobacter spp
d. Meio de enriquecimento para Salmonella spp e Shigella spp ex: meio de
Selenito F, meio GN e meio de tetrationato.

Inocular os meios de MacConkey, os meios selectivos para Salmonella spp e Shigella

spp e os meios de enriquecimento em atmosfera de aerobiose, a 35 C, durante 18 a
24 horas.

Inocular o meio selectivo para Campylobacter spp. e incubar em atmosfera de

microaerofilia (5% de O2, 10% deCO2, e 85% de N2), a 42C, durante 48 a 72
horas.

Aps 12 horas de incubao dos meios de enriquecimento, efectuar subculturas para

meio de MacConkey e eventualmente para outros meios selectivos.

4.2. PROCEDIMENTOS ESPECIAIS

Vibrio spp
-

So capazes de crescer nos meios de rotina.

Meio selectivo TCBS (incubar a 35 C, 18 a 24 horas em aerobiose)
Agua peptonada alcalina incubar a 35 C em aerobiose e efectuar subcultura s 6 ou
12 horas para TCBS.

82

Yersinia spp
-

Clostridium difficile
-

Meio selectivo CYN ( Cefsulodina, irgasan, novobiocina )

Incubar a 35C, 18 a 24 horas em aerobiose.

Na suspeita de colite pseudomembranosa efectuar pesquisa de toxina A, em fezes

diarricas.

Escherichia coli enterohemorrgica O157- H7

-

Meio selectivo MacConkey Sorbitol

Incubar a 35C, 18 a 24 horas em aerobiose.

.
5. IDENTIFICAO

5.1. Identificao de Salmonella ou Shigella spp.

Das colnias no fermentadoras de lactose com ou sem produo de H2S, efectuar:
-

Subcultura para TSI (superfcie e profundidade) e Ureia

Observao do TSI e Ureia no dia seguinte e se padro compatvel com

Salmonella spp e Shigella spp, efectuar identificao bioqumica e posterior
identificao serolgica.

Nota: Se o Laboratrio no tem possibilidade de efectuar identificao serolgica, dever

enviar as estirpes para Laboratrio de Referncia.

5.2. Identificao de Campylobacter spp.

-

Observar as placas s 24 e 48 horas, e das colnias suspeitas efectuar esfregao e

corar com Safranina ou Fucsina durante 1 a 3 minutos, para observao da morfologia
bacteriana (pequenos bacilos curvos, em S ou em asa de gaivota).

Teste da oxidase

Teste do hipurato

Susceptibilidade ao Ac. nalidxico (30 g) e cefalotina (30 g) (j esto descritas

estirpes resistentes)
ou
Testes bioqumicos comercializados

83

5.2. Identificao de Vibrio spp.

-

Observao da cultura e das colnias suspeitas realizar identificao bioqumica.

Enviar estirpes para confirmao serolgica em Laboratrio de Referncia.

5.3. Identificao de Yersinia spp

-

Observao da cultura e das colnias suspeitas realizar identificao bioqumica

5.4. Identificao de E.coli enterohemorrgica O157:H7

-

Do meio MacConkey sorbitol, isolar as colnias no fermentadoras de sorbitol.

Identificao bioqumica

Confirmao serolgica

5.5. Pesquisa de toxina de Clostridium difficile

O teste de referncia a pesquisa de toxina B por cultura de tecidos, mas como muitos
laboratrios no tem possibilidade de fazer cultura de tecidos existem outros testes
alternativos.

Teste de aglutinao em ltex - detecta uma protena no toxina associada ao

Clostridium difficile e d resultados falsos positivos com outros Clostridium,
Peptoestreptococcus e Bacteroides assacaroliticos.

Deteco de Enterotoxina (Toxina A) - existem diversos mtodos comercializados para

detectar a toxina nas fezes.

84

APARELHO GENITAL

1. INTRODUO
A determinao de amostras apropriadas para o diagnstico de infeces do aparelho genital
depende do local de infeco e dos microrganismos. Algumas infeces do aparelho genital
feminino so devidas a microrganismos endgenos cuja patogenicidade activada por factores
do hospedeiro ou por desequilbrio da flora saprfita.
obrigatria a informao sobre o tipo de amostra, data de colheita, idade e uma breve
histria clnica.

2. AMOSTRAS
2.1. Aparelho genital feminino
-

Exsudado vaginal / endocervical

Exsudado uretral
Exsudado rectal
Endomtrio
Abcessos ( Fundos de saco, Trompas, Gl. Bartholin )
Lquido amnitico
lceras genitais

2.2. Aparelho genital masculino

-

Exsudado uretral
Exsudado rectal
lceras genitais
Epiddimo
Prstata
Testculos

2.3. Amostras para o estudo de Chlamydia trachomatis e de Mycoplasma / Ureoplasma

3. COLHEITA E TRANSPORTE
APARELHO GENITAL FEMININO
1. Exsudado endocervical

Introduzir o espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril.

Limpar o orifcio externo do endocolo com compressa esterilizada.

Introduzir uma zaragatoa de alginato de clcio ou dacron, cerca de 1 cm no endocolo e

rodar.

85

Colocar em meio de transporte com carvo

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa e efectuar esfregao aps o acto da colheita.

O envio da amostra deve ser imediato.

2. Exsudado vaginal

Introduzir o espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril.

Colher o exsudado do fundo de saco posterior e/ou paredes vaginais com zaragatoa de
alginato de clcio ou dacron.

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa e efectuar esfregao aps o acto da colheita.

3. Exsudado uretral

Se possvel antes da 1 mico. Se no possvel, esperar pelo menos uma hora aps a
ltima mico.

Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada.

Introduzir uma zaragatoa fina e flexvel com um movimento de rotao cerca de 1 cm

dentro da uretra, para o exame directo.

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa, para o exame cultural. Colocar em meio de
transporte com carvo.

4. Exsudado rectal

Introduzir uma zaragatoa suavemente atravs do esfncter anal.

Rodar contra as criptas rectais, deixar 10-30 segundos para fixar os microrganismos e
retirar.

Evitar o contacto com matria fecal. Quando a zaragatoa ficar contaminada com fezes,
deve obter-se nova amostra.

Introduzir a amostra em meio de transporte com carvo, que se deve manter temperatura
ambiente.

5. Endomtrio

Aspirao uterina atravs de catter aps prvia dilatao e descontaminao do crvix.

Enviar a amostra em recipiente estril.

No caso de suspeita de anaerbios, transporte adequado.

recomendvel realizar simultaneamente hemoculturas.

86

6. Abcessos ( Fundos de saco, Trompas, Gl. Bartholin )

Colheita cirrgica por aspirao (no caso da Gl. Bartholin, descontaminar a pele com
desinfectante no alcolico).

Enviar de imediato amostra at 5 ml num recipiente estril e no caso de se suspeitar de

anaerbios, em meio de transporte adequado.

7. Lquido amnitico

Colheita cirrgica

Enviar rpidamente a amostra, at 5 ml, ao laboratrio em tubo estril e/ou meio de

transporte de anaerbios.

8. lceras genitais

Contactar previamente o laboratrio de Microbiologia.

Treponema pallidum - Limpar a superfcie da leso com gazes humedecidas em soluo

salina. Remover a crosta se presente, evitando sangrar. Pressionar a base da leso at
surgir um fluido claro e colher com uma pipeta Pasteur ou capilar. Colocar uma gota numa
lmina, cobrir com lamela e examinar imediatamente em microscpio de fundo escuro.

Haemophilus ducrey - Limpar a superfcie da leso com soluo salina. Fazer a colheita
por aspirao com uma pipeta Pasteur ou com zaragatoa embebida em soluo salina.
Cultivar imediatamente em gelose chocolate enriquecida e suplementos antibiticos.

NOTA: Dispositivo intra-uterino D.I.U. - no produto para a realizao de exame

microbiolgico.

APARELHO GENITAL MASCULINO

1. Exsudado uretral

Fazer a expresso da uretra

A amostra deve colher-se antes da 1 mico da manh. Se no possvel, esperar pelo

menos uma hora aps a ltima mico.

Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze estril.

Introduzir uma zaragatoa fina e flexvel com um movimento de rotao at 2 cm dentro da

uretra, para o exame directo a realizar no acto da colheita.

Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para o exame cultural, que se deve introduzir
em meio de transporte com carvo e manter temperatura ambiente.

O envio das amostras deve ser imediato.

87

2. Exsudado rectal

Idntico procedimento ao do aparelho genital feminino.

3. Abcessos ( Epiddimo, Prstata, Testculos )

Colheita cirrgica

Introduzir o aspirado at 5 ml em meio de transporte adequado.

4. lceras genitais

Idntico procedimento ao do aparelho genital feminino

AMOSTRAS PARA O ESTUDO de CHLAMYDIA TRACHOMATIS e MYCOPLASMA

Para o estudo da Chlamydia trachomatis e Mycoplasma devem seguir-se as indicaes de
cada kit, j que a colheita de amostras, meios de transporte e conservao dependem da
tcnica utilizada.
Chlamydia trachomatis

Os mtodos culturais so mais sensveis e especficos, mas devido sua complexidade e

custo no so efectuados na rotina da maior parte dos laboratrios.

Os mtodos no culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antignios, c.

nucleicos, por tcnicas de imunofluorescncia directa, EIA ou sondas de c. nucleicos.

As amostras adequadas no so as secrees vaginais, mas sim os raspados, j que a

Chlamydia trachomatis afecta as clulas do epitlio cilndrico. No so adequadas
amostras vaginais.

Esfregao endocervical - Remover o excesso de muco com zaragatoa de alginato de

clcio ou dacron. Inserir uma nova zaragatoa no canal endocervical e rodar. Evitar contacto
com a mucosa vaginal. Transportar e conservar a amostra de acordo com a fonte comercial
utilizada.

Esfregao uretral - Limpar qualquer exsudado. Inserir uma zaragatoa fina 2 a 4 cm na

uretra e rodar. O doente no deve urinar pelo menos 1 hora antes da colheita. Restantes
procedimentos iguais ao exsudado endocervical.

Nota - Nas tcnicas de imunofluorescncia, as preparaes so realizadas no momento da

colheita.
Mycoplasma / Ureoplasma

Amostras - exsudado vaginal, cervical ou uretral.

Colher a amostra com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron e proceder de acordo com
as indicaes do fabricante.

88

4. PROCEDIMENTOS
4.1. Exame DIRECTO
- A fresco - observar a presena ou no de Trichomonas vaginalis e de elementos
leveduriformes.
- Aps colorao - corar o esfregao pelo mtodo de Gram e pelo Giemsa (opcional ) e
descrever a flora existente
4.2. Exame CULTURAL - semear os produtos em:
GS

GC polyViteX

M. N. gono.

M. Anaerbios

Endocrvix

Endomtrio

Gl. Bartholin

L. Amnitico

Recto

Trompas

Uretra

Vagina

Sabouraud

Mulher
X

X
X
X

Homem
Epiddimo

Prstata

Recto

Testculos

Uretra

GS (Gelose sangue) - incubar em aerobiose a 35C - 37C, durante 48 horas, com obs. s 24 e 48 horas.
GC polyvitex ( Gelose chocolate com polyvitex ) - incubar em atmosfera de 5 a 7 % de CO2 a 35C - 37C, durante 48
horas, com observao s 24 e 48 horas.
M.N. gono. ( Meio de Neisseria gonorrhoae - VCAT, NYC, Thayer - Martin ) - incubar em atmosfera de 5 a 7 % de
CO2 a 35C - 37C, durante 72 horas, com observao s 24, 48 e 72 horas.
M.Anaerbios ( Meio para pesquisa de anaerbios ) - incubar em anaerobiose a 35C - 37C, durante 6 dias, com
observao inicial s 48 horas e depois de 2 em 2 dias.
Sabouraud ( Meio de Sabouraud ) - Incubar em aerobiose a 30C, durante 5 dias, com observao s 24 e 48 horas.

5. VALORIZAO CLNICA DAS INFECES DO APARELHO GENITAL FEMININO

A valorizao clnica das culturas efectuada de acordo com a informao clnica e o exame
directo.

89

Assim, deve-se pesquisar por rotina :

Vulvo-vaginites
-

Candida albicans
Trichomonas vaginalis
Vaginose bacteriana

- diagnstico essencialmente morfolgico (nomeadamente a presena

de clue cells). Eventualmente pesquisa de Gardnerella vaginalis, Mobilluncus sp.
- associado ao uso de DIU
Actinomyces spp.
Listeria monocytogenes
- em abortos de repetio e infeces neonatais
Staphylococcus aureus
- associado ao uso de tampes
Streptococcus agalactiae - valorizar em grvidas

Endocervicites
-

Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoae
S. agalactiae
Actinomyces spp.

- grvidas
- assoc. ao DIU

Uretrite
-

Neisseriae gonorrhoae

Recto
-

Neisseriae gonorrhoae
Chlamydia trachomatis

Endomtrio (D. Inflamatria Plvica)

-

Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoae

Endometrite (ps - parto)

-

Bactrias anaerbias
E. coli
Enteroccocus
G. vaginalis
Streptoccocus agalactiae

Trompas
-

Neisseria gonorrhoae
Chlamydia trachomatis
Bacteroides spp.

lceras genitais (no efectuados por rotina)

-

Chlamydia trachomatis
Haemophilus ducrey
Treponema pallidum

90

Lquido amnitico
-

Bacteroides spp.
Fusobacterium spp.
E. coli
G. vaginalis
S. agalactiae
U. urealyticum

Glndula de Bartholin
-

Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoae
E. coli
Proteus mirabilis
U. urealyticum

6. VALORIZAO CLNICA DAS INFECES DO TRACTO GENITAL MASCULINO

Pesquisar por rotina
Uretrite
-

Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoae

Recto
-

Chlamydia trachomatis
Neisseriae gonorrhoae

lceras genitais
-

Chlamydia trachomatis
Haemophilus ducrey
Treponema pallidum

Epididimite
-

Chlamydia trachomatis
Neisseriae gonorrhoae

Prostatite
-

Enterobacteriaceae
Pseudomonas spp.

Orquite
-

Enterobacteriaceae
Pseudomonas spp

91

PROCESSAMENTO GERAL DOS PRODUTOS BIOLGICOS

PARA PESQUISA DE BACTRIAS ANAERBIAS

1. INTRODUO

A metodologia de trabalho para o diagnstico laboratorial das infeces por bactrias

anaerbias complexa e dispendiosa, mas perfeitamente padronizada, de tal modo que,
hoje, possvel proceder ao isolamento e identificao destas bactrias, na maior parte
dos laboratrios de Microbiologia Clnica.

A maioria das infeces por bactrias anaerbias so endgenas, polimicrobianas,

envolvendo vrias espcies de bactrias anaerbias e facultativas das mucosas prximas
ao local de infeco. Estas bactrias podem ser responsveis por qualquer tipo de
infeco, apresentando porm, uma prevalncia muito varivel (por ex. 5% das
bacterimias, 80% dos abcessos cerebrais, etc.). O conhecimento da flora comensal das
diferentes regies das mucosas possibilita ao microbiologista desenvolver as estratgias
mais adequadas ao diagnstico laboratorial.

O diagnstico laboratorial das infeces por bactrias anaerbias, envolve um conjunto de

procedimentos que se baseiam em trs pilares fundamentais: a qualidade dos produtos, a
rapidez do transporte ao laboratrio e a correco dos procedimentos laboratoriais.

2. COLHEITA e TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLGICAS

A qualidade da colheita e o transporte dos produtos so essenciais para o diagnstico, uma
vez que o nmero de anaerbios isolados, assim como o seu significado clnico, esto
estreitamente relacionados com estes procedimentos.
2.1. Colheita

A amostra deve ser obtida por aspirao ou bipsia e colhido de modo a evitar a
contaminao com a flora comensal, associada ao local de infeco.

A utilizao de zaragatoas como mtodo de colheita no aconselhada.

2.2. Transporte
Deve ser rpido, de forma a preservar a viabilidade das bactrias e as propores relativas das
populaes bacterianas nos produtos. Para isso, aconselhada a utilizao de meios de
transporte. So geralmente constitudos por um meio semi-slido pr-reduzido e esterilizado
em recipiente prprio, com uma atmosfera sem oxignio e que contm um indicador de
oxidao-reduo. Assim fundamental:

Utilizar sempre meio de transporte para o envio das produtos.

Conservar os produtos temperatura ambiente at serem processados.

92

Os produtos provenientes de curetagens, bipsias ou tecidos devem ser enviados em

recipientes esterilizados, e colocados imediatamente numa atmosfera de anaerobiose (por
exemplo Bio Bag, Gas Pack etc.)

Os produtos colhidos em zaragatoas (apesar de pouco recomendveis) devem ser

enviados em meios de transporte apropriados (ex: BBL Anaerobe Systems etc.).

No enviar produtos em seringa com agulha,

picadas, aquando do seu manuseamento.

pelo risco de acidentes de trabalho,

3. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Apenas devem ser processadas as amostras adequadas. Aconselha-se a execuo de
triagem prvia, atendendo aos seguintes critrios: natureza do produto, modo de colheita,
transporte etc
Nunca processar :

Exsudados colhidos com zaragatoa das seguintes regies: naso e orofaringe, face interna
da boca, gengiva, vagina, crvix, uretra, recto, e de lceras superficiais da pele.
Expectorao, expectorao induzida, lavado e aspirado brnquico
Urina (excepto puno suprapbica) e fezes (excepto para C. difficille)
Contedo gstrico ou do intestino delgado.

3.1 - Exame DIRECTO

Exame macroscpico - pesquisar sinais sugestivos de infeco por bactrias anaerbias:

sangue, aspecto purulento, cheiro ftido, tecidos necrosados, presena de gs,
fluorescncia luz ultra violeta, etc.

Exame microscpico - observao de esfregao do produto corado pelo mtodo de

Gram. Aconselha-se a fixao do esfregao com metanol e recomenda-se a utilizao
da fucsina bsica como corante de contraste. O exame microscpico pode fornecer
diversos tipos de informao, tais como:
-

Qualidade da amostra

Nmero e tipo de microrganismos presentes no produto

Identificao presuntiva (correlao da morfologia bacteriana com o tipo de amostra)

Deficincias na metodologia utilizada (colheita, transporte, processamento dos

produtos), traduzida por incapacidade de recuperao no exame cultural de todos os
microrganismos observados no exame microscpico directo.

Sugerir a necessidade de utilizao de meios de cultura adicionais e de outras

metodologias: cromatografia gs-lquida, tcnicas de imunofluorescncia, etc.

93

3.2. EXAME CULTURAL

Uma informao clnica completa (tipo de infeco, doenas subjacentes, teraputica
antimicrobiana) combinada com a informao obtida do exame macroscpico e microscpico,
essencial, ao microbiologista, na escolha dos meios de cultura a utilizar para as sementeiras
primrias.
3.2.1. Preparao e sementeira da amostra
O processamento da amostra deve ser realizado em cmara de anaerobiose. Se tal no
for possvel, o tempo de processamento em aerobiose, no dever ultrapassar os 20 minutos.

Preparao da amostra:
-

Produtos purulentos devem ser homogenizados no agitador vertical (vortex)

Produtos de tecidos (moles ou sseos) devem ser colocadas em 1ml de meio

lquido pr-reduzido (caldo de tioglicolato ou carne cozida), e triturados at obteno de
uma amostra homognea.

Produtos enviados em zaragatoas mergulhar em 0,5 ml de meio lquido prreduzido, agitar no vrtex e proceder de seguida ao processamento da amostra.

Sementeira da amostra:
Meios de cultura slidos semear cada um dos meios em duplicado:
- Produtos purulentos - uma gota de produto por placa
- Produtos no purulentos 2 a 3 gotas do produto por placa.
Meios de cultura lquidos semear 0,5 / 1 ml de produto.

Incubar de imediato em atmosfera de anaerobiose (cmara, jarras, bolsas de anaerobiose) a

35 - 37C durante 7 dias . As culturas devem ser observadas s 48 horas. Os meios selectivos
como o BBE (Bacteroides Bile Esculina) e EYA (Gelose Gema de ovo) podem ser observados
s 24 horas.
Nota - a aplicao de discos impregnados com Kanamicina 1000g e Penicilina 2 U.
respectivamente, no 1 quadrante dos meios enriquecidos no selectivos, constitui um
precioso auxlio na interpretao do exame cultural
3.2.2. MEIOS de CULTURA

As bactrias anaerbias so por via de regra nutricionalmente muito exigentes, requerendo

meios de cultura com base de gelose sangue, suplementados com vitaminas, coenzimas
e factores de crescimento.

A preparao dos meios de cultura e as condies de armazenamento dos mesmos, so

cruciais para o xito na sua utilizao. Os meios devem ser frescos (at 24 - 48 horas
aps preparao) e conservados em atmosfera de anaerobiose. recomendado
proceder pr-reduo dos meios de cultura primrios, sempre que no haja possibilidade
da utilizao de meios frescos.

94

Na prtica, dada a diversidade das exigncias nutricionais das bactrias anaerbias e a

natureza polimicrobiana das infeces, aconselha-se o uso de meios nutritivos gerais
enriquecidos no selectivos e selectivos, o que, para alm de aumentar a taxa de
isolamento, proporciona uma economia de tempo, uma vez que facilitam o reconhecimento
e isolamento de diferentes microrganismos .

A - Meios slidos NO SELECTIVOS (enriquecidos)

Geralmente so meios gelosados enriquecidos com sangue de carneiro (5%), menadiona (1
g/ ml), hemina (5 g/ ml) com uma base varivel (Columbia, Brucella, Schaedler, Brain
Heart Infusion, Wilkins Chalgren, etc.).
B - Meios slidos SELECTIVOS
Meios gelosados com agentes selectivos incorporados (antibiticos, bile etc.). H mltiplos
meios selectivos, no existindo porm unanimidade quanto sua utilizao. O ideal combinar
a utilizao de dois ou trs destes meios. So de uso comum:
-

Gelose sangue neomicina (75 mg/L) : inibe o crescimento dos bacilos Gram negativo
aerbios.

Gelose sangue lacado com Kanamicina (75 mg/L) e Vancomicina (7,5mg/L) selectivo
para Bacteroides spp e Prevotella spp.

Gelose bile esculina (BBE) com ou sem gentamicina (100mg/L): selectivo para
Bacteroides do grupo fragilis e Bilophila wadsworthia.

Gelose cicloserina-cefoxitina-frutose (CCFA): selectivo para Clostridium difficille.

C - Meios LQUIDOS:
-

Caldo de carne cozida ( grnulos) e glicose

Caldo de tioglicolato enriquecido com hemina, menadiona e carbonato de sdio.

3.2.3 SISTEMAS de INCUBAO

A escolha do sistema de incubao a utilizar determinada pelo volume de trabalho, custo do
equipamento e eventuais limitaes de espao. Alguns dos sistemas de incubao, so
sofisticados e necessitam de equipamento complexo assim como de pessoal especializado,
como o caso dos tubos rotatrios pr-reduzidos e esterilizados (PRAS) e da cmara de
anaerobiose. A incubao em jarra de anaerobiose, de fcil utilizao, proporciona
resultados na recuperao de bactrias anaerbias com importncia clnica, comparveis aos
sistemas referidos anteriormente.
1. Jarra de anaerobiose - sistema de incubao utilizado na maior parte dos laboratrios.
So recipientes hermticos, simples, onde a atmosfera de anaerobiose pode ser
conseguida de vrias maneiras:

Tcnica de evacuao / substituio em desuso

95

Sistema gerador de Hidrognio (ex: Gs Pack) - Este envelope constitudo por

uma tablete de cido ctrico e bicarbonato de sdio, e outra de borohidrato de sdio e
cloreto de cobalto. A atmosfera de anaerobiose efectuada pela adio de 10 ml de
gua ao envelope. Necessita da presena de catalisador.

Sistema gerador de dixido de carbono (ex: Anaerogen ) - Este envelope

constitudo por cido ascrbico. No necessita de cataltico nem da adio de gua
para desenvolvimento da atmosfera de anaerobiose.

2. Sistema gerador de anaerobiose em saco - podem ser utilizados, como sistema de

incubao, em situaes em que apenas uma ou duas placas necessitem de ser
estudadas.
3. Cmara de anaerobiose A atmosfera conseguida pelo preenchimento da cmara com
uma mistura gasosa cuja composio j foi acima referida. necessrio utilizao de
cataltico, que deve ser substitudo diariamente. necessrio controlar a humidade,
aconselhando-se a colocao de um recipiente com cristais de gel de slica no fundo da
cmara.
4. Jarra de Espera - Recipiente banhado por fluxo contnuo de azoto, onde so colocados
os meios de cultura inoculados e no inoculados, por perodos curtos (no mais de uma
hora) at incubao definitiva em atmosfera de anaerobiose.
A monitorizao do ambiente de anaerobiose deve ser efectuado, utilizando controlos
qumicos (rezasurina, azul de metileno, etc.) e controlos biolgicos (Pseudomonas
aeruginosa inoculada em meio de citrato).

4. OBSERVAO das CULTURAS PRIMRIAS

A observao das culturas primrias deve ser efectuada s 48 horas. Os produtos

incubados em cmara de anaerobiose podem ser observados s 24 horas.

Todos os diferentes morfotipos das colnias devem ser semi-quantificados e

subcultivados. Para isso:
-

Comparar os resultados das culturas obtidas em anaerobiose com os obtidos em

atmosfera com 3 a 5% de CO2.

Pesquisar caractersticas macroscpicas tpicas como corroso do meio (Pitting),

invaso (swarming), dupla hemlise, pigmentao etc.

Pesquisar a presena de fluorescncia.

Fazer o exame microscpico (Gram) dos diferentes tipos de colnias com

caracterizao e registo das particularidades morfolgicas e tinturiais observadas.

Executar subculturas em duplicado de todos os morfotipos, em meio no selectivo.

Incubar uma das subculturas numa atmosfera com 3 a 5% de CO2 Prova de

aerotolerncia).

96

Fazer subculturas dos meios lquidos das sementeiras primrias sempre que:
-

No tenha havido recuperao, nas sementeiras primrias, executadas em meios

slidos, dos microrganismos observados no exame microscpico directo.

Observada turvao das culturas primrias em meio lquido, sem obteno de

crescimento nas culturas primrias realizadas em meios slidos.

Interpretao das culturas:

-

Se esto presentes cinco ou mais morfotipos sugestivos de diferentes espcies de

bactrias anaerbias, no efectuar qualquer tipo de estudo. Informar - presena de
uma flora mista de bactrias anaerbias.

Se observamos mais do que dois morfotipos de bactrias anaerbias, (at um mximo

de trs), executar o exame microscpico directo (Gram) e uma prova de aerotolerncia.
Informar por ex. bacilos anaerbios Gram negativo.

Sempre que a cultura e o exame microscpico directo sugerir determinado

microrganismo, acrescentar esse dado informao, por ex. bacilos anaerbios Gram
negativo sugestivo de Fusobacterium) - Identificao nvel 1.

Se existe o predomnio de um microrganismo em relao aos outros, - efectuar uma

identificao parcial ou rpida (Gram, catalase, indol, TIQ ( teste de inibio pelos
quimioterapicos) - Identificao nivel 2.

Existncia de uma cultura pura de bactrias anaerbias - proceder ao seu estudo.

Contudo a dimenso do estudo a efectuar deve ser ponderado de acordo com a
situao clnica.

Os cocos anaerbios devem ser sempre informados da identificao a nvel de gnero

( Ex: Peptostreptococcus spp.)

5. IDENTIFICAO
A identificao das bactrias anaerobias pode ser efectuada a trs nveis, pela combinao de
vrias metodologias (quadro n. 1)
Quadro n. 1 Mtodos de identificao mais importantes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Exame microscpico directo - colorao de GRAM

Fluorescncia luz ultravioleta
Comportamento aos antimicrobianos (TIA)
Fermentao dos carbohidratos
Estudos enzimticos
Cromatografia gs- lquida
Deteco de antignios
Sondas de DNA
Anlise da estrutura do peptidoglicano

97

A Identificao nvel 1
Informao das culturas primrias de acordo com as necessidades da atmosfera, colorao de
Gram, e caractersticas macroscpicas das colnias Identificao apenas presuntiva
B Identificao nvel 2
Para alm das informaes de nvel 1, necessita da execuo de alguns testes como: teste de
inibio pelos antimicrobianosos (TIA), catalase, indol spot, nitratos, urease, lipase etc, o que
permite um agrupamento preliminar das bactrias, e, por vezes, mesmo uma identificao
definitiva de alguns microrganismos
C Identificao nvel 3
Indicada sempre que possa estar presente um microrganismo muito virulento, ou que a sua
identificao seja essencial para a prescrio teraputica.

Os mtodos convencionais de identificao so laboriosos com perodos de incubao

longos, baseados quer na fermentao dos carbohidratos ou outras actividades
bioqumicas, quer na determinao dos perfis de cidos gordos de cadeia curta, resultantes
da metabolizao da glicose.

Nos ltimos anos desenvolveram-se vrios sistemas alternativos de identificao A

micromtodos - uns baseados na fermentao dos hidratos de carbono (API 20 , Minetek II
etc), outros na pesquisa de enzimas pr-formadas (ATB32A, AnIdent system, BBL
CRYSTAL Anaerobe etc). A utilizao destas metodologias permitem percentagens de
identificao, a nvel de espcies, de 60- 90%.

A utilizao de sondas de DNA em estudos de hibridizao, com ou sem amplificao, no

constituem, ainda, uma alternativa eficaz para o estudo das infeces ocasionadas por este
tipo de microrganismos.

5.1 Provas rpidas de identificao

5.1.1. Prova da Catalase ver captulo GENERALIDADES
5.1.2. Teste do Indol spot geralmente includos nos sistemas comercializados
5.1.3. Teste de reduo dos nitratos - geralmente includos nos sistemas comercializados
5.1.4. Teste de Inibio a discos impregnados com carga especial de antimicrobianos
(TIA)

Princpio - A susceptibilidade ou resistncia das bactrias a determinados discos permite

o agrupamento preliminar de alguns gneros e espcies das bactrias anaerbias.

Material - discos impregnados com Vancomicina (5 g) Colistina (10 g) Kanamicina (1000

g) SPS (5%) e Bile (20%)

98

Procedimento
-

Subcultivar o microrganismo numa placa de meio enriquecido, fazendo a sementeira

por estria em trs planos perpendiculares.
Colocar os discos afastados uns dos outros 20 mm, num mximo de 4 discos por placa
de 90 mm de dimetro.
Incubar as placas em anaerobiose 24 a 48 horas.

Interpretao:

1. Vancomicina, Kanamicina, Colistina:

Sensivel zona de inibio > 10 mm
Resistente zona de inibio < 10mm
2. Polianatolsulfonato de sdio (SPS):
Sensivel - > 12 mm
Resistente - < 12 mm
3. Bile:

Sensivel qualquer zona de inibio volta do disco

Resistente nenhuma zona de inibio volta do disco

Controlo de qualidade:
-

B. fragilis ATCC 25285

C. perfringens ATCC 13124
F. necrophorum ATCC 25286
P. anaerobius ATCC 27337
P. asaccharolyticus ATCC 29745
Prevotela melaninogenica ATCC 25845

5.1.5. Prova da Lecitinase

Princpio - a lecitinase hidrolisa a lecitina em diglicerideos e fosforicolina. A formao destes
compostos insolveis causam uma opacidade volta das colnias.
Material - meio de gelose gema de ovo (EYA)
Procedimento - Subcultivar o microrganismo em meio de gelose gema de ovo e incubar em
anaerobiose 24 a 72 horas.
Interpretao:
-

Positiva: zona opaca e difusa do meio de cultura ao redor das colnias

Negativa: nenhuma alterao no meio de cultura

Controlo de qualidade:
C. perfringens ATCC 13124 - Positiva
C. sporogenes ATCC 11437 - Negativa

99

5.2 - Sistemas comercializados para Identificao

A Sistemas bioqumicos de identificao
Princpio - Utilizao ou consumo de substratos com produo de produtos finais, durante o
crescimento dos microrganismos.
Limitaes:
-

Baixo desempenho na identificao dos microrganismos no sacarolticos (F.

nucleatum, etc.), e nos de crescimento lento ( Prevotela spp).
Algumas bactrias sacarolticas reduzem o indicador, tornando difcil a interpretao da
cor final das reaces.
Reaces de indol so com frequncia falso negativas
Necessidade frequente da execuo de testes suplementares

B- Sistemas enzimticos de identificao

Princpio: Degradao de substratos cromogneos por enzimas pr-formadas (glicosidases,
aminopeptidases etc.).
Limitaes:
-

No podem ser utilizadas subculturas efectuadas em meios ricos em acares (ex.:

gelose Schaedler)
Alguns microrganismos provenientes da cavidade oral podem no ser completamente
identificados por estes mtodos.
Microrganismos subcultivados por longos perodos podem ocasionar reaces
aberrantes e identificaes incorrectas.
Algumas reaces so difceis de interpretar
As identificaes esto limitadas base de dados existentes, podendo alm disso no
ter includa alteraes taxonmicas posteriormente definidas.
Requerem um volume de inculo grande.

C- Cromatografia gs lquida
um mtodo de identificao definitiva, somente realizado em laboratrios de referncia, uma
vez que requer tecnologia e equipamento especial. Aconselha-se a consulta de literatura
apropriada.

6. TESTES de SUSCEPTIBILIDADE
6.1. Consideraes Gerais

Durante muitos anos as bactrias anaerbias, com a excepo dos Bacteroides do grupo
fragilis, apresentaram um padro de susceptibilidade previsvel. Hoje, o isolamento cada
vez mais frequente de espcies produtoras de -lactamases e de estirpes resistentes a
grande nmero de antimicrobianos, leva os laboratrios de microbiologia necessidade de
reavaliar a metodologia utilizada e a melhorar o tipo de informao fornecida aos clnicos.

100

Existem bactrias anaerbias (Bacteroides do grupo fragilis, Prevotella spp,

Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, B. gracilis, Bilophila wadsworthia, C. ramosum, C.
clostridiforme, etc.) em que obrigatria a execuo dos testes de susceptibilidade,
quer para orientao teraputica quer para estudos de susceptibilidade cumulativa
capazes de orientar as teraputicas empricas sempre que estamos perante estes
microrganismos.

Os mtodos de determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias tm evoludo

ao longo dos anos, suscitando ainda alguma controvrsia em relao a:
- Quais os antimicrobianos a ensaiar.
- Qual a metodologia a realizar.
- Interpretao dos resultados

Antibiticos como a Penicilina, Cefoxitina, Clindamicina, devem sempre ser avaliados

uma vez que a sua eficcia imprevisvel. Relativamente ao Metronidazol, Cloranfenicol,
Carbapenemes, no consensual a sua avaliao, uma vez que o seu padro de
susceptibilidade permanece inaltervel. Porm, importante que estes antimicrobianos
sejam monitorizados ao longo do tempo.

Mesmo os mtodos recomendados pelo NCCLS mtodo de diluio em meio slido

(mtodo de referncia), e os mtodos de macro e microdiluio em caldo, no
recolhem o consenso absoluto, uma vez que todos eles so complexos, e apresentam
vantagens e inconvenientes (recomenda-se a consulta do NCCLS).

A escolha do mtodo deve ser ponderada de acordo com a finalidade pretendida com a
execuo dos testes de susceptibilidade. Para alm da variabilidade tcnica entre as
vrias metodologias, existem factores que constituem uma dificuldade na interpretao dos
resultados tais como:
-

A definio e determinao do ponto de inibio CIM de determinados

antimicrobianos (-lactmicos), principalmente nas bactrias anaerbias Gram
negativo.
A escolha das concentraes criticas (breakpoints) adoptadas para a definio de
resistncia e susceptibilidade.
Existncia de cluster de concentraes inibitrias mnimas isto agrupamento de
valores da CIM muito prximas ou iguais s concentraes crticas.
Variabilidade na expresso dos resultados resultados expressos em valores de
CIM50 e CIM90, em percentagens de resistncia, em percentagens cumulativas de
estirpes resistentes a todas as concentraes de antimicrobianos estudadas.

consensual que os testes de susceptibilidade no devem ser executados por rotina,

e que a pesquisa de - lactamases deve ser efectuada em todos os bacilos Gram
negativo, uma vez que pode fornecer informaes para orientao teraputica, em tempo
til.

Assim o teste de susceptibilidade deve ser efectuado nas seguintes situaes:

-

Em todos os microrganismos isolados de locais geralmente estreis (SNC, sangue etc.)

Nas situaes clnicas, que requerem teraputicas prolongadas (endocardite,
osteomielite).
Na ausncia de resposta teraputica emprica instituda.

101

Na monitorizao peridica dos padres de susceptibilidade dentro de uma instituio.

No estudo da susceptibilidade das bactrias anaerbias a novos agentes antimicrobianos.

6.2. Mtodos de estudo da susceptibilidade

Apesar de todos os mtodos apresentarem limitaes, a escolha do mtodo para a
determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias deve depender, do tipo de
laboratrio e da finalidade da sua execuo. Em virtude da sua flexibilidade e da facilidade de
execuo o -test
um mtodo interessante, simples e eficiente (com boa preciso e
exactido) para a determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias.

102

IDENTIFICAO DE COCOS GRAM POSITIVO

INTRODUO
Os Cocos Gram positivo aerbios dividem-se na famlia Micrococcaceae em dois grandes
grupos:
Catalase POSITIVA nos gneros:
- Staphylococcus
- Micrococcus
- Stomatococcus
- Planococcus
Catalase NEGATIVA nos gneros:
- Streptococcus
- Enterococcus
- Leuconostoc
- Pediococcus
- Aerococcus
- Gemella
Para identificao destas bactrias fundamental:
-

Observao da sua morfologia ao microscpio aps colorao pelo mtodo de

Gram.
O aspecto macroscpico das colnias em meios de cultura slidos (selectivos ou
no selectivos) que pode sugerir a possvel identificao.
Provas especficas de identificao

GNERO STAPHYLOCOCCUS
1. Descrio do Gnero

So cocos Gram positivo (0.5 a 1.5 m de dimetro) que se dispem preferencialmente

em cachos, mas tambm podem aparecer isolados, aos pares, em ttradas, em
pequenas cadeias .

So imveis, no formam esporos e habitualmente so catalase positiva e desprovidos

de cpsula. A maioria das espcies anaerbia facultativa.

O Gnero Staphylococcus compreende actualmente 27 espcies.

2. HABITAT

O gnero Staphylococcus existe em abundncia na

principalmente na pele e mucosas dos mamferos e aves.

natureza,

encontrando-se

103

3. Significado CLNICO

Algumas espcies de Staphylococcus so frequentemente agentes etiolgicos de infeco.

A espcie S. aureus a causa mais frequente de infeco no homem dentro deste

gnero.

Os Staphylococcus coagulase negativo se bem que sejam considerados saprfitas ou

de baixa patogenicidade para o homem, so cada vez mais valorizados como agentes
oportunistas de infeco; sempre que isolados de locais habitualmente estreis tais como
sangue, L.C.R. e infeces associadas a prteses e catteres.

4. DIAGNSTICO LABORATORIAL
4.1. Exame DIRECTO - colorao de Gram
4.2. Exame CULTURAL

Em gelose sangue, as colnias desenvolvem-se a 35C em 18-24h e apresentam-se com

1 a 3 mm de dimetro com superfcie lisa e brilhante, bordo inteiro, consistncia
gordurosa, aspecto opaco, de cor varivel entre o branco e o amarelo; verifica-se por
vezes a existncia de hemlise.

As amostras provenientes de locais com flora mista devem ser semeadas em meios
selectivos como por exemplo manitol salgado ou gelose com colistina e cido
nalidxico (Columbia ANC).

4.3. Prova da Catalase - positiva

4.4. Prova da Coagulase
- Teste da coagulase em lmina
- Teste da coagulase em tubo
- Protena A (ex.: Staphaurex)
4.5. Teste da Deoxiribonuclease (DNase)
4.6. Teste da susceptibilidade Novobiocina
4.7. Sistemas Comerciais de Identificao da espcie

GNERO STREPTOCOCCUS e outros COCOS GRAM POSITIVO e

CATALASE NEGATIVA
Descrio do Gnero

Cocos Gram positivo aos pares (diplococos) ou em cadeia.

A maioria das espcies anaerbio facultativo, imveis, capsulados ou no capsulados.

104

Streptococcus hemoltico do Grupo A de Lancefield (S. pyogenes)

1. Significado CLNICO
a causa mais frequente da amigdalite bacteriana nas crianas dos 5 aos 10 anos de idade.
2. DIAGNSTICO LABORATORIAL
2.1. Exame DIRECTO

A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo, esfricos de 0,7 a 0,9 m que ocorrem
em cadeias de comprimento varivel (quando observado na amostra ou em cultura de meio
lquido).

2.2. Exame CULTURAL

Gelose sangue - incubao a 35C numa atmosfera com 5 % de CO2, 18 a 24 horas. As

colnias apresentam-se com 0,5 a 1mm de dimetro, transparentes ou translcidas, pouco
convexas de superfcie lisa e bordo inteiro com larga zona de hemlise quando o sangue
utilizado de equdeo ou carneiro.

Nalguns produtos pode usar-se meio lquido de enriquecimento (ex.: Todd-Hewitt) para
aumentar a sua recuperao.

2.3. Prova da Catalase - negativa

2.4.Teste de susceptibilidade Bacitracina (disco de 0,04 U) - positiva (identificao
presumptiva)
2.5. Identificao Serolgica o mtodo de referncia extraco de Lancefield que, pela
sua dificuldade tcnica, est actualmente substituido por mtodos comercializados.

Streptococcus hemoltico do grupo B de Lancefield (S. agalactiae)

1. Significado CLNICO
A importncia do Streptococcus do grupo B advm do seu potencial infeccioso no recmnascido.
2. DIAGNSTICO LABORATORIAL
2.1. Exame DIRECTO
A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo, esfricos de 0,7 a 0,9 m que ocorrem em
cadeias de comprimento varivel (quando observado na amostra ou em cultura de meio
lquido).

105

2.2. Exame CULTURAL

Para alm da sementeira em meio slido deve ser tambm semeado em meio lquido (ex:
Todd-Hewitt).
aconselhado o uso de gelose sangue incubado a 35C numa atmosfera com 5 % de CO2.
As colnias aps 18-24h de incubao apresentam-se com 0,5 a 1 mm de dimetro,
transparentes ou translcidas, pouco convexas de superfcie lisa e bordo inteiro com estreita
zona de hemlise quando o sangue utilizado de equdeo ou carneiro.
2.3. Prova da catalase - negativa
2.4. Identificao serolgica o mtodo de referncia extraco de Lancefield que, pela
sua dificuldade tcnica, est actualmente substituido por mtodos comercializados.

Streptococcus pneumoniae
1. Significado CLNICO
Fazendo parte da flora indgena da orofaringe a principal causa de pneumonia da
comunidade e frequente causa de otite mdia, sinusite e meningite.
2. Diagnstico LABORATORIAL
2.1. Exame DIRECTO
A colorao de Gram mostra diplococos Gram positivo de 0,8 a 1 de tamanho, ovides ou
lanceolados, com as extremidades mais largas opostas, por vezes capsulados.
2.2. Exame CULTURAL
Microrganismo anaerbio facultativo que aps 18-24h de incubao a 35C numa atmosfera
com 5 % de CO2 apresenta colnias, na gelose sangue, com cerca de 1 mm de dimetro,
redondas de bordo inteiro e circundadas por uma zona de hemlise. Podem ser mucoides.
A superfcie pode ser plana ou com depresso central.
2.3. Teste da Optoquina
2.4. Teste da Solubilidade em Blis
2.5. Identificao Serolgica

Enterococcus spp
1. Significado CLNICO
Dentro dos cocos Gram positivo o agente mais frequentemente associado a infeco
urinria. Est tambm muitas vezes associado Infeco Hospitalar.

106

2. Diagnstico LABORATORIAL
2.1. Exame DIRECTO
A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo ovides ou em curtas cadeias.
2.2. Exame CULTURAL
Embora no necessite de sangue para se desenvolver em cultura, as colnias em gelose
sangue aps 18-24h de incubao a 35C so de cor branca ou acinzentada com 0,5 a 1,5 mm
de dimetro e convexas. Aps incubao prolongada (superior a 48h) podem apresentar ,
ou ausncia de hemlise
2.3. Prova da Catalase - negativa
2.4. Teste da Blis-Esculina
2.5. Sistemas Comerciais de Identificao Bioqumica permitem a identificao da
espcie

Streptococcus viridians
1. Significado CLNICO
Microrganismo frequente como agente de endocardite sub-aguda bacteriana.
2. Diagnstico LABORATORIAL
2.1. Exame DIRECTO
A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo em cadeia.
2.2. Exame CULTURAL
Microrganismo exigente que necessita de meios enriquecidos com sangue. Aps 18-24h de
incubao a 35C em atmosfera de 5 % de CO2, as colnias em gelose sangue apresentam
dimetro varivel entre 0,1 a 0,5 mm de dimetro. Podem ter ou ausncia de hemlise.
2.3. Sistemas Comerciais de Identificao Bioqumica Permitem a identificao da
espcie
.

107

BACILOS GRAM POSITIVO

GNERO LISTERIA
Do gnero Listeria s a Listeria monocytogenes e a Listeria ivanovii esto associadas com
doena no Homem.
A Listeria monocytogenes a espcie mais frequentemente isolada nos laboratrios clnicos e
a sua patogenicidade bem conhecida no Homem.

Listeria monocytogenes
1. HABITAT
A Listeria monocytogenes encontrada numa ampla variedade de ambientes. Pode ser
isolada na flora comensal de vrios animais tais como alguns roedores, no aparelho
gastrointestinal do Homem saudvel e a partir de fontes ambientais tais como gua de rios,
vegetao em decomposio, esgotos etc. Pode ainda ser isolada no leite e derivados, quer
pasteurizados quer no pasteurizados.
2. Significado CLNICO

A Listeria monocytogenes causa mais frequentemente infeces em mulheres grvidas,

recm-nascidos, idosos e doentes imunodeprimidos.

As infeces mais frequentes so a meningite e a sepsis. Alguns doentes podem ter uma
bacterimia assintomtica. A Listeria monocytogenes pode ainda causar infeces
localizadas na pele, endoftalmites, endocardites, linfadenites, artrites, osteomielites,
abcessos cerebrais, peritonites e colecistites.

3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram positivo, no esporulados, geralmente curtos, mas ocasionalmente
dispostos aos pares e em cadeias curtas.
3.2. Exame CULTURAL
Meios de cultura - Gelose sangue:
-

Incubao a 35 C durante 24 horas em aerobiose, atmosfera de 5% de CO2 ou em

anaerobiose.
As colnias so pequenas, translcidas e acinzentadas, com pequeno halo de hemlise.

108

3.3. Testes de IDENTIFICAO

Catalase POSITIVA
Teste da mobilidade - realizar com um meio semi-slido (ex.: meio de Sims ), inocular
por picada com fio recto e incubar temperatura ambiente. Observa-se uma zona de
crescimento em chapu de chuva 2 a 5 mm debaixo da superfcie do meio.
Crescimento a 4 C
Hidrlise da esculina
Produo de H2S
Identificao definitiva - testes bioqumicos comercializados

GNERO CORYNEBACTERIUM

O gnero Corynebacterium inclua um grupo muito heterogneo de bactrias. Durante a

ltima dcada, taxonomistas redefiniram o gnero Corynebacterium e vrias espcies
foram reagrupadas em outros gneros.

Este gnero inclui espcies aerbias e anaerbias facultativas, so na sua maioria

Catalase POSITIVA. So imveis, com excepo do Corynebacterium aquaticum.

HABITAT e Significado CLNICO

As bactrias do gnero Corynebacterium encontram-se amplamente distribudas na

natureza (solo e gua) e fazem parte da flora da pele e mucosas do Homem.

Exceptuando-se o Corynebacterium diphtheriae, os isolamentos em produtos biolgicos de

bactrias deste gnero, so geralmente considerados contaminantes. No entanto, o seu
repetido isolamento em amostras normalmente estreis (sangue, LCR e outros lquidos
biolgicos) sugere a sua implicao na etiologia do processo infeccioso.

Corynebacterium diphtheriae
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram positivo, pleomrficos, rectos ou ligeiramente curvos e grossos, no
formam esporos.
3.2. Exame CULTURAL
Meios no selectivos
-

Gelose sangue - crescem algumas estirpes de Corynebacterium que no crescem

nos meios com telurito.

109

Meio de Loeffler Utiliza-se para o diagnstico presuntivo de Corynebacterium

diphtheriae nos exsudados farngeos. Este meio favorece a formao de grnulos que
coram metacromticamente com coloraes simples, por ex: com azul de metileno de
Loeffler.

A morfologia das colnias em gelose sangue semelhante s colnias dos outros bacilos
aerbios Gram positivo, portanto tero que ser subcultivadas para meio selectivo ou
identificadas bioquimicamente.
Meios selectivos
So meios com telurito de potssio - O telurito de potssio inibe o crescimento da maior
parte das bactrias saprfitas do aparelho respiratrio superior permitindo o crescimento dos
Corynebacterium.
-

Gelose sangue com telurito e cistina - o meio com cistina e telurito mais fcil de
preparar e tem uma durabilidade de cerca de um ms. Neste meio, todas as espcies
de Corynebacterium produzem colnias de cor acinzentada / preta aps 24 horas de
incubao a 35 C.

Meio de Tinsdale - o meio de Tinsdale mais difcil de preparar e deve ser usado no
prazo de 2 a 3 dias aps a preparao. As colnias de Corynebacterim diphtheriae so
facilmente diferenciadas das dos outros Corynebacterium porque tm um halo
acastanhado.

3.3. TESTES de IDENTIFICAO

Identificao Presuntiva - presena de grnulos metacromticos observados em

esfregao realizado a partir da cultura em meio de Loeffler.

Identificao Definitiva - testes bioqumicos comercializados.

Testes de TOXOGENICIDADE - estirpes de C. diphtheriae no toxignicas podem ser

isoladas da orofaringe e nasofaringe de pessoas saudveis. Assim, por razes clnicas e
epidemiolgicas, a identificao laboratorial definitiva das estirpes patognicas deve incluir
testes de toxigenicidade (Teste de toxigenicidade in vitro Elek modificado consultar
manuais de microbiologia).

Corynebacterium spp
As bactrias do gnero Corynebacterium so freqentemente isoladas de uma grande
variedade de amostras clnicas.
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram positivo, no esporulados, pleomrficos que variam de curtos cocobacilos a
longos bacilos.

110

3.2. Exame CULTURAL

Meio de cultura - Gelose sangue - Incubao 18 a 24 horas em 5 % de CO2.
3.3. Testes de IDENTIFICAO
- Testes bioqumicos comercializados

GNERO ERISIPELOTHRIX

No gnero Erysipelothrix so conhecidas duas espcies, o E. rhusiopathiae e o E.

tonsillarum. O Erysipelothrix rhusiopathiae a nica espcie deste gnero que agente
patognico para o Homem.

Erysipelothrix rhusiopathiae
1. HABITAT
Erysipelothrix rhusiopathiae encontra-se amplamente distribudo na natureza e tem sido isolado
do solo, alimentos e gua presumivelmente contaminados por animais infectados. Tem sido
isolado do aparelho gastrointestinal de sunos saudveis e acredita-se ser o porco domstico o
maior reservatrio.
2. Significado CLNICO
Foi isolado pela primeira vez no Homem a partir de leses da pele que se convencionou
chamarem de erisipeloides. uma forma de celulite que envolve habitualmente a pele das
mos e dedos. uma doena profissional em pessoas que manipulam carne, peixe,
crustceos e galinceos. Pensa-se que a bactria entra na pele atravs de solues de
continuidade da mesma. Raramente pode ocorrer sepsis e endocardite.
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram positivo, pequenos, finos, rectos ou ligeiramente curvos. s vezes formam
longos filamentos.
3.2. Exame CULTURAL
Meios de cultura:
-

Gelose Sangue e Gelose chocolate - incubar a 35 C em aerobiose at 48 horas.

Meio lquido de enriquecimento com 1% de glucose - incubao a 35 C em
atmosfera de 5 % de CO2.

111

As colnias podem ser planas ou rugosas. As colnias planas podem medir entre 0,5 e 1 mm e
so convexas, circulares e transparentes. As colnias rugosas so maiores, baas e tm um
bordo fimbriado. Aps prolongado perodo de incubao, pode aparecer uma descolorao
esverdeada do meio adjacente s colnias - hemlise.
3.3. Testes de IDENTIFICAO
-

Catalase NEGATIVA

Testes bioqumicos comercializados

GNERO RHODOCOCCUS

Do gnero Rhodococcus, a espcie Rhodococcus equi a mais frequentemente responsvel

por infeces no Homem, embora outras espcies tenham sido referidas como agentes
causadores de infeces oportunistas.

Rhodococcus equi
1. HABITAT
O Rhodococcus encontra-se amplamente distribudo no solo e em alguns animais.O solo pode
ser a origem das infeces no Homem que no contacta com animais. A infeco no Homem
pode ser adquirida por inalao do agente a partir destes reservatrios.
2. Significado CLNICO
A infeco pulmonar a mais frequente, nomeadamente pneumonias invasivas com cavitao
particularmente em doentes com SIDA. A disseminao para o crebro, fgado, bao e outros
rgos tambm frequente nestes doentes.
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram positivo, curtos e s vezes cocides, disposio difteroide ou em paliada.
3.2. Exame CULTURAL
Meio de cultura - Gelose sangue
Incubar a 35 C em aerobiose 18 a 24 horas. As colnias so lisas, brilhantes e com uma cor
que pode variar de rosa salmo a alaranjada aps incubao prolongada

112

3.3. Testes de IDENTIFICAO

-

Catalase POSITIVA

Testes bioqumicos comercializados.

GNERO NOCARDIA
O gnero Nocardia um dos gneros pertencentes famlia das Nocardiaciae. So
actinomicetos aerbios parcialmente acido-resistentes, no entanto a presena desta
propriedade varivel estando dependente das condies da cultura e da prpria estirpe.
Os microrganismos pertencentes ao gnero Nocardia so Gram positivo, variavelmente
cido-resistentes, catalase POSITIVA e aerbios estritos.
1. HABITAT
A maior parte das espcies encontrada normalmente no solo e na gua.
2. Significado CLNICO
Das 11 espcies includas no gnero Nocardia, s a N. asterides, N. nova, N. farcinica, N.
brasiliensis, N. otitidiscaviarum e a N. transvalensis esto descritas como sendo
patognicas para o Homem. A Nocardia asterides responsvel por mais de 80 % das
infeces nos humanos.
As infeces a Nocardia podem ser adquiridas quer por inoculao traumtica quer por
inalao. A Nocardia spp pode causar infeces na pele, infeces pulmonares invasivas e
infeces sistmicas.
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL
3.1. Exame DIRECTO

Bactrias Gram positivo, ramificadas ou parcialmente ramificadas e filamentosas.

So cido-resistentes quando coradas por colorao de Ziehl-Neelsen (utilizar cido

Sulfrico a 1% para descorar).

3.2. Exame CULTURAL

Meios de cultura
Gelose sangue
Gelose chocolate
Meio de Sabouraud dextrosado

A maior parte dos actinomicetos aerbios no tem exigncias nutricionais complexas e

cresce nos meios de cultura de rotina laboratorial tais como a gelose sangue, gelose
chocolate ou meio de Sabouraud dextrosado. No entanto, como um microrganismo de
crescimento lento, a flora comensal que pode estar presente em determinadas amostras
clnicas pode mascarar o seu crescimento.

113

Podem ser semeados os meios de Lowenstein e Middlebrook 7H10 que facilitam a

identificao presumptiva destes agentes.

Incubar a 35 C e a 30 C, durante 2 a 3 semanas. A morfologia das colnias nos meios de

rotina extremamente varivel: so aderentes, rugosas, secas, quebradias e com uma
cor que pode variar do branco cal ao laranja acastanhado.

3.3. TESTES de IDENTIFICAO - Identificao presuntiva

114

IDENTIFICAO COCOBACILOS GRAM NEGATIVO

GNEROS NEISSERIA e MORAXELLA

1. INTRODUO

Para a identificao destas bactrias fundamental a observao das caractersticas das

colnias assim como a sua morfologia aps colorao pelo mtodo de Gram.

Estes microrganismos so cocos Gram negativo. Organizam-se em pares ou pequenas

cadeias, sendo que os pares apresentam os lados adjacentes achatados com a forma de
gro de caf ou de rim. A diviso celular em dois planos em ngulo recto por vezes com
a formao de tetradas.

As clulas individuais variam em tamanho de 0,6 a 1,5 m dependendo da espcie, local

de isolamento e idade da cultura.

So imveis e no produzem esporos.

As espcies patognicas para o Homem so, geralmente, exigentes nas necessidades de

crescimento, com um desenvolvimento ptimo a 35 C e metabolizam poucos ou nenhuns
hidratos de carbono. So capnofilicas e desenvolvem-se melhor em atmosfera hmida.

Todas as espcies so oxidase positiva e catalase positiva (excepto a N. elongata que

catalase negativa).

O habitat natural destas bactrias so as membranas mucosas dos animais de sangue

quente.

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL
1. Meios de CULTURA
1.1. Produtos biolgicos normalmente estreis:
-

Gelose sangue
Gelose chocolate simples e/ou com suplemento polivitamnico

1.2. Produtos biolgicos com flora indgena

-

Meios selectivos para isolamento de Neisseria spp.:

- Thayer-Martin modificado (MTM)
- Gelose chocolate ou com sangue lacado suplementado com VCAT ou
LCAT

115

Os meios selectivos contm agentes antimicrobianos que inibem outros microrganismos e

permitem o isolamento selectivo quer de N. gonorrhoeae quer de N. meningitidis
2. INCUBAO
-

Em aerobiose, atmosfera hmida com 5% de CO2 a 35 C.

Deve ser observado o crescimento at s 72 horas

3. Morfologia das COLNIAS e IDENTIFICAO

A morfologia das colnias varivel. Tm opacidade varivel, tendem a ser pequenas,

brilhantes e elevadas. Nas subculturas estas caractersticas podem modificar-se. As
culturas devem observar-se s 24, 48 e 72 horas. Devem ser feitos esfregaos das
colnias para comprovao da morfologia caracterstica.

Neisseria gonorrhoeae

s 24 horas de incubao apresenta colnias branco opaco elevadas e brilhantes que

reflectem a luz.

Para a identificar deve efectuar-se o teste da oxidase e Gram das colnias suspeitas, o
que permite uma identificao presuntiva se isolada de amostra urogenital.

A identificao confirmatria da espcie deve ser feita com testes bioqumicos (mais
frequentemente) ou com mtodos serolgicos.

Neisseria meningitidis

Os menigococos no so to exigentes como os gonococos, embora as amostras de

produtos com suspeita de infeco a este agente devam ser semeadas em meios
enriquecidos.

Embora estas bactrias no se desenvolvam bem em meios lquidos as amostras de locais

habitualmente estreis podem tambm ser inoculadas nestes meios.

Morfologicamente as colnias so maiores que as dos gonococos, atingindo um dimetro

superior a 1 mm s 18 horas de incubao. So redondas e convexas com uma superfcie
lisa, hmida e brilhante e um bordo inteiro. As culturas jovens apresentam uma
consistncia gordurosa e as colnias emulsificam com facilidade em soro fisiolgico e
com tempo h uma autlise e as colnias ganham uma consistncia elstica e pegajosa.

A identificao presuntiva faz-se pelo teste da oxidase e pela colorao de Gram.

A confirmao feita por testes bioqumicos.

A serogrupagem muito importante para fins epidemiolgicos, e deve ser feita

exclusivamente em Laboratrios de Referncia.

116

Outras Neisseria spp.

Outras Neisseria sp. podem fazer parte da flora indgena da nasofaringe e da orofaringe.

A N. lactamica, N. cinerea, N. polysaccharea, N. flavescens, N. subflava, N. sicca, N.

mucosa e N. Elongata, embora sejam consideradas de baixa virulncia, em alguns casos
tm sido responsabilizados como agentes etiolgicos de infeces.

A N. lactamica e a N. polysaccharea so as que mais se confundem com a N. meningitidis

porque crescem em meio selectivo para gonococo e fermentam a glucose e a maltose.

Moraxella catarrhalis

considerada causa de doena humana desde o principio do sculo XX embora s h

cerca de 20 anos tenha havido uma clara apreciao do seu envolvimento na patogenia de
algumas doenas.

A M. catarrhalis tem sido responsvel como agente de infeco do aparelho respiratrio

(otite mdia aguda, sinusite, e infeces bronco pulmonares). Esto tambm descritos
casos de endocardite e meningite.

O seu isolamento faz-se em gelose sangue ou gelose chocolate, com incubao a 35 C

em aerobiose com uma atmosfera de 5 % de CO2. No se desenvolve em MacConkey.

As colnias so pequenas, redondas, inteiras, esbranquiadas, de 3 a 5 mm de dimetro.

No aderem ao meio, deslizam inteiras quando arrastadas com a ansa.

catalase e oxidase positivas, no fermenta os aucares, produz DNAse, reduz os

nitratos e produz butirato esterase.

Um dos testes mais teis a comprovao da produo de DNAse. A identificao pode

tambm fazer-se (ou confirmar-se) por testes bioqumicos (geralmente comercializados).

GNERO HAEMOPHILUS
Este gnero inclui vrias espcies:
- H. .influenzae
- H. parainfluenzae
- H. haemolyticus
- H. parahaemolyticus
- H. aphrophilus
- H. paraphrophilus
- H. segnis
- H. ducreyi

117

As espcies deste gnero fazem parte da flora habitual do aparelho respiratrio

superior humano e dos animais (com excepo do H. ducrey). As espcies consideradas
patognicas para o homem so: H. influenzae, H. parainfluenzae, H. aphrophilus e H.
ducreyi.

As infeces humanas variam desde as no complicadas e facilmente tratveis

(conjuntivite, otite mdia aguda, sinusite, etc.) at s invasivas e potencialmente mortais
(pneumonia, meningite, pericardite, endocardite, etc.) geralmente causadas pela espcie
H. influenzae.

O H. ducreyi agente patognico obrigatrio exclusivamente humano (provoca a doena

sexualmente transmitida designada por cancride).

1. Exame DIRECTO
Na colorao de GRAM geralmente apresentam a forma de cocobacilos Gram negativo
pleomrficos.
2. Exame CULTURAL
Meios de cultura:

- gelose chocolate
- gelose com sangue de cavalo ou coelho (tm hemina e NAD).

A maioria das espcies de Haemophilus exigem hemina (factor X) e NAD (factor V) para
o seu desenvolvimento, por isso no crescem em gelose com sangue de carneiro (que s
tem hemina) nem em MacConkey.

Algumas espcies bacterianas produzem NAD pelo que, na gelose com sangue de
carneiro, se podem desenvolver colnias de Haemophilus spp volta dessas colnias
produtoras de NAD fenmeno de satelitismo.

As espcies de Haemophilus no se desenvolvem bem nos meios lquidos habitualmente

usados no laboratrio, incluindo os meios comercializados para hemoculturas.

Desenvolvem-se em aerobiose, mas o seu crescimento estimulado com atmosfera

suplementada com 5% de CO2.

Geralmente observa-se crescimento aps 24 h de incubao a 35C, mas pode ser

necessrio prolongar a incubao at 48-72 h. (O H. ducreyi exige perodo de incubao
de 7 dias).

As colnias so pequenas, redondas, convexas ou achatadas, translcidas com a zona

central mais opaca e com cheiro caracterstico a ninho de ratos.

3. TESTES de IDENTIFICAO

Podem ter reaco positiva para o teste da oxidase e a reaco tambm varivel
para a catalase.

Tradicionalmente, a identificao consiste na demonstrao da exigncia dos factores

de crescimento X e/ou V.

118

O mtodo mais vulgar para demonstrar essa exigncia consiste em colocar discos ou tiras
de papel de filtro impregnados respectivamente dos factores X, V e XV sobre um meio de
cultura no suplementado (gelose simples, Mueller-Hinton, Tripticase,etc) o qual foi
previamente inoculado com uma suspenso (0.5 de McFarland) do microrganismo. Aps
18-24 h de incubao verifica-se se h crescimento bacteriano volta dos discos/tiras
(existem comercializados discos e tiras impregnados de factores de crescimento).
(Quadro n. 1)

A identificao tambm pode ser feita pelo Teste da Porfirina - detecta a presena de
enzimas que convertem o cido alfa-aminolevulnico (ALA) em porfirinas ou protoporfirinas.
As espcies que requerem o factor X no possuem essas enzimas (teste negativo). Este
teste pode ser feito em caldo, gelose ou disco. As porfirinas so detectadas por iluminao
com luz UV (360 nm) apresentando fluorescncia vermelha.

CATALASE

FERMENTAO

FERMENTAO

SACAROSE

FERMENTAO

+
+
-

+
+
+
+
+
-

+
+
-

+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+

+
+

+
+
+

MANOSE

LACTOSE

BETA-HEMLISE

GLUCOSE

FACTOR V

H. influenzae
H. influenzae
bitipo aegypticus
H. haemolyticus
H. parahaemolyticus
H. parainfluenza
H. paraphrophilus
H. segnis
H. ducreyi
H. aphrophilus

FACTOR X

ESPCIE

FERMENTAO

QUADRO 1

V
V
-

+ reaco positiva - reaco negativa V reaco varivel;

A identificao de espcie tambm se pode fazer recorrendo a testes bioqumicos

geralmente comercializados (ex. Api NH , Vitek NHI ). (Quadro 1)

A deteco dos antignios capsulares do H. Influenzae tem interesse epidemiolgico e

em investigao mas tem pouco interesse clnico.

A deteco de antignios ou a utilizao de sondas moleculares, quando disponveis no

mercado, podero revelar-se muito teis na deteco do H. ducreyi que dificilmente
cultivvel.

119

GNERO BORDETELLA
As 3 espcies principais so:
-

B. pertussis
B. parapertussis
B. bronchiseptica

A B. pertussis e B. parapertussis so agentes patognicos exclusivamente humanos

e causam um quadro de infeco respiratria alta designada por tosse convulsa. A sua
incidncia diminuiu muito depois da utilizao generalizada da vacina.

A infeco humana por B. bronchiseptica muito rara estando quase sempre

relacionada com histria de contacto com animais.

1. Exame DIRECTO
So cocobacilos Gram negativo, embora corem mal pelo mtodo de Gram.
2. Exame CULTURAL

A colheita do exsudado naso-farngeo para exame cultural tem, obrigatoriamente, de ser

realizada com zaragatoa de alginato de clcio.

Meio de cultura: Meio de Bordet-Gengou (B. pertussis e B. parapertussis no se

desenvolvem bem em gelose sangue nem em gelose chocolate)

Incubao: Aerobiose (so aerbios estritos), atmosfera hmida a 35 C.

A maioria das vezes as colnias s se tornam visveis ao fim de 3 a 5 dias; inicialmente so

pequenas, brilhantes, fazendo lembrar gotculas de mercrio.

3. TESTES de IDENTIFICAO

A identificao presuntiva baseada na morfologia bacteriana coradas pelo mtodo de

Gram e pelo aspecto das colnias.

As espcies so todas catalase positiva.

A identificao da B. bronchiseptica faz-se por testes bioqumicos, eventualmente

comerciais (ex.: Api 20 E , GNI-Vitek ). (Quadro 2)

A identificao definitiva serolgica utilizando um antisoro especfico aplicado ao

microrganismo em cultura pura.

120

QUADRO 2
B. pertussis

B. parapertussis

B. bronchiseptica

Crescimento em gelose sangue

Crescimento em MacConkey

Oxidase

Urease

+ (24h)

+ (4h)

Reduo dos nitratos

Motilidade a 37C

+ reaco positiva

- reaco negativa

v - reaco varivel

GNERO PASTEURELLA
O gnero Pasteurella um dos gneros pertencentes famlia Pasteurellaceae. Todos os
membros do gnero Pasteurella tm certas caractersticas fenotpicas em comum.
So bacilos ou cocobacilos Gram negativo, anaerbios facultativos e imveis. A maior
parte das espcies oxidase POSITIVA, catalase POSITIVA, fermenta a glicose e reduz os
nitratos a nitritos.

Pasteurella multocida
1. HABITAT
A maior parte das espcies de Pasteurella faz parte da flora comensal de alguns animais
selvagens e domsticos. transmitida ao Homem por contacto prximo ou por mordedura
destes animais. Pode ainda colonizar o aparelho respiratrio superior de quem possui animais
domsticos.
2. Significado CLNICO
A maior parte das espcies, pode ser considerada como patognica oportunista. A Pasteurella
multocida a espcie mais frequentemente isolada. Em doentes imunodeprimidos tambm
pode ser responsvel por infeces do aparelho respiratrio e do S.N.C., entre outras.
3. IDENTIFICAO
3.1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram negativo, rectos e tipicamente curtos.
3.2. Exame CULTURAL
Meios de cultura -

Gelose sangue
Gelose de Chocolate

Incubao: Aerobiose, suplementada com 5% CO2 a 35 C num mnimo de 24 horas.

121

Morfologicamente, as colnias em gelose sangue so convexas, lisas, cinzentas, no

hemolticas mas por vezes h variantes rugosas e mucides.

3.3. Testes de IDENTIFICAO

Testes que permitem diagnstico presuntivo:
- Oxidase positiva
- Catalase positiva
- Reduo de nitratos a nitritos
- Indol positivo
- Urease negativa
Testes confirmatrios:
- Testes bioqumicos (geralmente comercializados)

122

IDENTIFICAO das ENTEROBACTERICEAE

1. INTRODUO

As bactrias da famlia das Enterobacteriaceae so agentes comuns de infeco no Homem.

Estas estirpes bacterianas so das mais frequentemente isoladas no Laboratrio de
Microbiologia, do ambiente ou colonizadores de outros animais.
Todos os membros das Enterobacteriaceae so:
-

Bacilos Gram negativo

Oxidase NEGATIVA
Fermentam a glicose
Crescem em gelose de MacConkey
A maior parte tambm reduz os nitratos a nitritos

Habitat natural

As Enterobacteriaceae habitam numa grande variedade de locais que incluem o aparelho

gastro intestinal humano, o de outros animais e vrios locais do meio ambiente.

3. Significado CLNICO
GNEROS e ESPCIES de ENTEROBACTERIACEAE que NO ESTO habitualmente
associadas a INFECES HUMANAS
Budvicia aquatica
Buttiauxella agrestis
Cedecea lapagei
Cedecea neteri
Citrobacter farme i
Citrobacter younge
Obesumbacterium spp.
Citrobacter braakii
Citrobacter werkmanii
Citrobacter sedlakii
Edwardsiella hoshinae
Edwarsiella ictaluri
Enterobacter asburiae
Enterobacter hormaechei
Enterobacter intermedius
Enterobacter cancerogenus
Enterobacter dissolvens
Enterobacter nimipressuralis
Erwinia spp.
Escherichia fergusonii
Escherichia hermannii
Escherichia vulneris
Escherichia blattae
Ewingella americana
Klebsiella ornithinolytica
Klebsiella planticola
Klebsiella rhinoscleromatis
Klebsiella terrigena
Kluyvera ascorbata

Kluyvera cryocrescens
Leclercia adecarboxylata
Leminorella grimontii
Leminorella richardii
Moellerella wisconsensis
Morganella morganni subsp.siboni
Pantoea dispersa
Pragia fontium
Proteus myxofaciens
Providencia alcalifaciens
Providencia rustigianii
Providencia heimbachae
Rahnela aquatilis
Serratia rubidaea
Serratia odorifera
Serratia plymuthica
Serratia ficaria
Serratia entomophila
Serratia proteamaculans subsp. quinov
Tatumella pytseos
Trabulsiella spp.
Xenorhabdus spp.
Yersinia kristensenii
Yersinia rohdei
Yersinia aldovae
Yersinia bercovieri
Yersinia mollaretii
Yokenella regensburgei

123

GNERO e ESPCIES de ENTEROBACTERIACEAE que normalmente colonizam o

HOMEM e PODEM estar associadas a INFECES HUMANAS
Citrobacter freundii
Citrobacter (diversus) koseri
Citrobacter amalonaticus
Edwardsiella tarda
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterobacter agglomerans group ( Pantoea agglomerans)
Enterobacter gergoviae
Enterobacter sakazakii
Enterobacter amnigenus
Enterobacter taylorae
Escherichia coli
Hafnia alvei
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Klebsiella ozaenae
Morganella morganni

Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Proteus penneri
Providencia retgeri
Providencia stuarti
Salmonella (todos os serotipos)
Serratia marcescens
Serratia liquefaciens (grupo)
Shigella dysenteriae (grupo A)
Shigella flexeneri (grupo B)
Shigella boydii (grupo C)
Shigella sonnei (grupo D)
Yersinia pestis
Yersinia enterocolitica
Yersinia frederiksenii
Yersinia intermedia
Yersinia pseudotuberculosis

Alguns so agentes de zoonoses.

As espcies que colonizam normalmente o Homem podem provocar infeces endgenas.

Estes microrganismos so frequentemente agentes de infeco nosocomial.

As espcies Salmonella spp., Shigella spp., e Yersinia enterocoltica so sempre

agentes patognicos do aparelho gastrointestinal.

As Enterobacteriaceae clinicamente relevantes podem ser consideradas em 2 grupos:

Bactrias patognicas oportunistas (os mais comuns)

- E. coli.
- Klebsiella spp.
- Proteus spp.
- Enterobacter spp.
- Serratia spp.
- Citrobacter spp.

Bactrias patognicas obrigatrias

- Salmonella spp
- Shigella spp.
- Yersinia pestis, Y. enterocoltica, Y. pseudotuberculosis

EPIDEMIOLOGIA das Enterobacteriaceae CLINICAMENTE SIGNIFICATIVAS

MICRORGANISMO

Escherichia coli

Shigella spp

HABITAT

TRANSMISSO

Nas infeces no gastrointestinais os microrganismos

podem ser endgenos ou transmitidos de pessoa a
Flora normal do intestino humano
pessoa, especialmente no hospital; nas infeces
e de outros animais; tambm
gastrointestinais, a transmisso varia com o tipo de E.
pode habitar o aparelho genital
coli, e pode ser transmisso fecal-oral entre humanos
feminino
atravs de ingesto de alimentos ou gua contaminados,
carne mal cozinhada ou leite de gado colonizado.

S se encontra em humanos na
altura da infeco; no faz parte da
flora normal do intestino

De pessoa a pessoa por via fecal-oral, especialmente

em reas sobrecarregadas e reas com ms condies
sanitrias

124

MICRORGANISMO
Salmonela typhi e
paratyphi
Outras Salmonella
spp
Edwardsiella tarda

Yersinia pestis

Y. enterocolitica
Y. pseudotuberculosis
Citrobacter spp
Enterobacter spp
Klebsiella spp
Morganella spp
Proteus spp.
Providencia spp.

HABITAT

TRANSMISSO

S se encontra em humanos mas

De pessoa a pessoa via fecal-oral por ingesto de comida
no faz parte da flora normal
ou gua contaminadas com excrementos humanos
do intestino
Ingesto de alimentos contaminados derivados de animais,
frequentemente aves domsticas, e tambm de lacticnios.
Amplamente disseminadas na
Pode ocorrer transmisso de pessoa a pessoa via fecalnatureza e associadas a vrios
oral em centros de prestao de cuidados de sade
animais
quando as normas de lavagem das mos no so
respeitadas.
Aparelho
gastrointestinal
de
Incerto; provavelmente pela ingesto de gua contaminada
animais de sangue frio, tais como
ou contacto directo com o animal transmissor
rpteis
De roedores a humanos pela picada de pulga ou pela
ingesto de tecidos de animais contaminados. Durante as
Transmitida pelos ratos de cidade
epidemias humanas de doena pneumnica pode ser
e
domsticos
e
roedores
transmitido de pessoa a pessoa pela inalao de gotas de
selvagens
ar contaminadas; raramente transmitida pelo manuseamento ou inalao de tecidos ou fludos contaminados
Ces, gatos, roedores, coelhos,
Ingesto de alimentos mal cozinhados (especialmente
porcos ovelhas. No faz parte da
porco), produtos do dia, tais como leite e ingesto de gua
flora normal humana
contaminada ou contacto com animais infectados
Roedores, coelhos, veados e
Ingesto do microrganismo durante o contacto com
pssaros. No fazem parte da
animais infectados ou comida ou gua contaminadas
flora humana normal

Flora gastrointestinal normal

Endgena, ou pessoa a pessoa, especialmente em

doentes hospitalizados.

Serratia spp

4. EXAME LABORATORIAL
4.1. Exame DIRECTO

Microscopicamente, estes microrganismos aparecem como cocobacilos, ou bacilos

rectos Gram negativo, com extremidades arredondadas.

A Yersinia pestis assemelha-se a um alfinete de segurana fechado, quando corada

com azul de metileno ou corante de Wayson; este a chave caracterstica para o
diagnstico rpido da peste.

4.2. Exame CULTURAL

Meios de Cultura
- Gelose sangue
- Gelose chocolate
- MacConkey.
- Cled
Nas coproculturas utilizam-se meios selectivos:

Para pesquisa de Salmonella spp e Shigella spp - Gelose Hektoen (HE), gelose de
xilose-lisina-desoxicolato (XLD) e gelose de Salmonella-Shigella (SS).

125

Para a pesquisa de Yersinia enterocoltica - Gelose CIN (cefsulodina-irgasannovobiocina)

Para a pesquisa de E.coli O157:H7 - Gelose MacConkey com sorbitol.

Incubao em atmosfera de aerobiose, 18 a 24 horas a 35 C.

Os meios selectivos para Yersinia spp incubam a 25 a 30 C

4.3. TESTES de IDENTIFICAO

Identificao bioqumica com testes geralmente comercializados - qualquer sistema
comercial de identificao pode ser utilizado para a identificao das Enterobacteriaceae e
podem-se obter resultados dentro de 4 a 24 horas, consoante o sistema utilizado.
Em alternativa utilizao dos testes comercializados, a maioria das Enterobactericias pode
ser identificado presuntivamente utilizando um nmero reduzido de substractos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Kligler / T.S.I
Indol
Ureia
Citrato
Vermelho de metilo
Voges-Proskauer

Utilizam-se para identificar presuntivamente as Espcies patognicas entricas.

Identificao serolgica do Gnero Salmonella spp
-

Os antisoros polivalentes fornecidos comercialmente, designados como A, B, C1, C2, D,

E, F, G, H, I, e Vi, so comumente usados para o grupo preliminar de Salmonella spp.

O antisoro A at I contm anticorpos anti-antignios somticos (O), e o antisoro Vi

preparado contra o antignio capsular (K) da Salmonella typhi.

A serotipagem feita usando um teste de aglutinao em lmina. Se uma bactria

aglutina com o antisoro Vi e no reage com os do grupo O, deve-se preparar uma
suspenso salina do microrganismo, aquecida a 100C por 10 minutos para inactivar o
antignio Vi. O microrganismo deve ento ser retestado. A Salmonella typhi positiva
com o grupo Vi e grupo D.

Identificao serolgica do Gnero Shigella spp

-

O grupo serolgico preliminar de Shigella spp tambm executado usando anticorpos

polivalentes somticos O, fornecidos comercialmente, designados como A, B, C e D.
Assim como a Salmonella spp, tambm a Shigella pode produzir uma cpsula, e pode
ser necessrio aquecer, antes da serotipagem
A subtipagem de Shigella spp, nos grupos A, B e C (a Shigella grupo D s tem um
sertipo) geralmente feita em laboratrios de referncia.

126

 Identificao serolgica da Espcie E.coli O 157

-

A E. coli sorbitol negativa pode ser serotipada, usando antisoro fornecido

comercialmente, para determinar a presena dos antigneos somticos O 157 e
flagelar H 7.

127

BACILOS GRAM NEGATIVO NO FERMENTATIVOS

1. INTRODUO

Grupo de bactrias aerbias estritas no esporuladas que se desenvolvem rapidamente

nos meios habituais de cultura e se caracterizam por no produzirem energia pelo
processo da fermentao, ou seja, na fosforilao oxidativa, o aceitador final dos
electres apenas o oxignio.

Representam cerca de 15% dos bacilos Gram negativo isolados nos laboratrios de
microbiologia, e destes, 75% so representados pela Pseudomonas aeruginosa e
Acinetobacter baumanni.

A maioria destas espcies fazem parte do meio ambiente e causam infeces oportunistas.

2. PROCEDIMENTOS GERAIS de DESPISTE dos NO-FERMENTADORES

Cheiro, pigmentao e morfologia das colnias

Colorao de Gram
Morfologia da bactria e presena de esporos
Motilidade e tipo de flagelos
Modo de utilizao da glicose
Produo de sulfito de hidrognio e presena de arginina-dihidrolase (ADH)
Produo de OXIDASE
Crescimento a 42C
Oxidao da glicose, xilose, lactose e maltose em meio oxidativo-fermentativo (OF) ou
meio de Hugh-Leifson

GNERO PSEUDOMONAS, BURKHOLDERIA e outros semelhantes

Nomenclatura actual

Nomenclatura prvia

Brevundimonas diminuta..Pseudomonas diminuta

Brevundimonas vesicularis..Pseudomonas vesicularis
Burkholderia cepacia....Pseudomonas cepacia
Burkholderia pseudomallei..Pseudomonas pseudomallei
Burkholderia malleiPseudomonas mallei
Burkholderia gladioli.Pseudomonas gladioli
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas alcaligenes
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas mendocina
Pseudomonas pseudoalcaligenes
Pseudomonas putida
Pseudomonas sp. CDC gr. 1
Pseudomonas stutzeri (inclui CDC gr. Vb-3)
Pseudomonas denitrificans
Pseudomonas-like gr. 2
CDC grupo Ic
Ralstonia pickettiPseudomonas picketti e Burkholderia picketti

128

1. DEFINIO
-

Grupo de bacilos Gram negativo, aerbios estritos, oxidase positiva, no

fermentativos, mveis por 1 flagelo polar, que utilizam uma variedade de carbohidratos,
lcoois e aminocidos como fontes de energia. So bacilos com 1 a 5 m de
comprimento e 0,5 a 1 m de largura.

So bactrias mesoflicas: tm uma temperatura ptima de crescimento entre 30 e

37C, mas podem sobreviver a baixas temperatura (4C), ou crescer a 42C.

2. HABITAT
-

A Burkholderia spp e Ralstonia picketti fazem parte do meio ambiente e no da flora

humana habitual. A sua transmisso em meio hospitalar envolve contacto humano com
equipamento mdico contaminado. A B. cepacia a mais frequente, tem como
reservatrio as plantas (p.ex.: cebolas), solo e gua e pode sobreviver no material
mdico e desinfectantes.

B. pseudomallei o agente de uma infeco especfica, a melioidose.

As Pseudomonas so bactrias patognicas oportunistas, responsveis por infeces

nosocomiais, sendo as mais frequentes: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P.
stutzeri.

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL

Crescem nos meios de cultura habituais como a gelose sangue e MacConkey, com
colnias no fermentadoras da lactose, aps incubao em aerobiose ou com 5% CO2,
bem como em caldos nutritivos (tioglicolato e BHI).

Nos doentes com fibrose qustica, deve ser efectuada a pesquisa de B. cepacia utilizando
um meio selectivo (p.ex.: OFPBL - oxidativo fermentativo polimixina bacitracina lactose).
Pode requerer incubao at s 96 horas.

A maioria dos sistemas comercializados identifica correctamente a Pseudomonas

aeruginosa e a Burkholderia cepacia, mas para os outros microrganismos, no to fivel.

A identificao da P. aeruginosa baseia-se nos seguintes testes preliminares:

-

Oxidase POSITIVA
Bom crescimento a 42C
Produo de pigmento azul-esverdeado (piocianina), ou vermelho acastanhado
(piorubina), difusvel em meio incolor (ex: gelose simples, meio Mueller-Hinton).

A P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida fazem parte do grupo das Pseudomonas

pigmentadas, mas apenas a primeira cresce a 42C. As estirpes mucides de P.
aeruginosa podem reagir mais lentamente nos testes bioqumicos e impedir a sua correcta
identificao pelos sistemas comercializados. Deve-se suspeitar de B. cepacia quando se
encontra uma bactria no fermentativa que descarboxila a lisina (80%). A identificao
correcta das estirpes lisina-negativo (20%) ou oxidase negativo (15%) requer a execuo
completa dos testes bioqumicos.

129

MICRORGANISMO

Burkholderia cepacia

HABITAT
Solo, gua, plantas, meio hospitalar.
No faz parte da flora humana; pode colonizar
aparelho resp. em doentes com fibrose qustica

TRANSMISSO

DOENAS e INFECES

Exposio a material contaminado,

transmisso pessoa a pessoa

Infeces graves em doentes com fibrose

qustica ou doenas granulomatosas crnicas

Burkhoderia pseudomallei
(bacilo de Withmore)

Solo. No faz parte da flora humana.

reas do Sudoeste asitico

Inalao ou inoculao directa a partir da

pele ou mucosas

Agente da Melioidose, com formas leves a

formas fatais por sepsis

Burkholderia mallei

No faz parte da flora humana

Agente de doena em equdeos e macacos

Transmisso a humanos rara. Contacto

com animais e penetrao pela pele ou
mucosas

Infeces humanas raras, desde inf. agudas ou

crnicas da pele at sepsis.

Burkholderia gladioli

Meio ambiente. Causa doenas em plantas

No faz parte da flora humana pode colonizar
ap. resp. doentes com fibrose qustica

Transmisso a humanos rara. Modo de

transmisso desconhecido

Idem

Ralstonia picketti

Meio ambiente

Modo de transmisso desconhecido;

envolve exposio a material mdico
contaminado.

Pseudomonas aeruginosa

Meio ambiente, sobrevive em tubagens e

canalizaes domsticas, piscinas, solues de
lentes de contacto e meio hospitalar.
Raramente faz parte da flora humana

Ingesto de alimentos ou gua

contaminada; exposio a material e
solues contaminadas; transmisso
pessoa a pessoa.

Pseudomonas fluorescens,
putida, stutzeri

Meio ambiente (solo, gua)

No faz parte da flora humana

Exposio a material e solues

contaminadas

Infeces humanas raras.

Pode ser isolada no sangue, urina ou
expectorao: suspeitar de contaminao
Patogneo oportunista pode causar infeces
comunitrias (foliculite, otite externa, osteomielite
ps traumtica, endocardite e inf. respiratrias)
ou nosocomiais (aparelho respiratrio, urinrio,
feridas, bacterimia e SNC)
Infeces humanas raras. Pode ser isolada no
sangue, urina ou expectorao: suspeitar de
contaminao

P. mendocina alcaligenes,
pseudoalcaligenes, CDC gr 1,
Meio ambiente
P. denitificans,
No faz parte da flora humana
Pseudomonas-like gr. 2, CDC
gr. Ic

Desconhecido. Rara em humanos

No causam infeces no Homem

Brevindomonas vesicularis e
diminuta

Desconhecido. Rara em humanos

Infeces humanas raras.

B. vesicularis causa rara de bacterimia

Meio ambiente
No faz parte da flora humana

130

GNEROS ACINETOBACTER, STENOTROPHOMONAS,

FLAVIMONAS e CHRYSEOMONAS spp.

Nomenclatura actual

Nomenclatura prvia

Chryseomonas luteola..........................................Pseudomonas luteola, CDC grupo Ve-1

Flavimonas oryzihabitans.....................................Pseudomonas oryzihabitans, CDC grupo Ve-2
Acinetobacter spp;
Sacaroltico, no-hemoltico..................................Acinetobacter baumanii, A .calcoaceticus,
A . anitratus, A . calcoaceticus subsp. anitratus
Acinetobacter spp;
sacaroltico, hemoltico..........................................Acinetobacter alcaligenes, A .anitratus,
A . haemolyticus
Acinetobacter spp;
assacaroltico, no-hemoltico...............................Acinetobacter calcoaceticus subsp. Lwoffi
Acinetobacter johnsonii, A . junii, A . lwofii
Acinetobacter spp;
assacaroltico, hemoltico
Stenotrophomonas maltophilia...............................Xanthomonas maltophilia, P. maltophilia
CDC grupo NO-1

1. DEFINIO

So cocobacilos Gram negativo, oxidase NEGATIVA que oxidam a glicose ou no a

utilizam, ao contrrio das Enterobacteriaceae que a fermentam.

Nenhum deles faz parte da flora saprfita humana mas devido a uma alta prevalncia de
Acinetobacter spp. e S. maltophilia no meio hospitalar, estas espcies podem colonizar a
pele e o aparelho respiratrio de doentes hospitalizados em UCI, em unidades de
queimados, ou doentes debilitados, submetidos a manobras invasivas e sujeitos a
antibioticoterapia sendo mais frequentemente isolados como colonizadores do que como
agentes de infeco.

Microrganismo

Habitat

Acinetobacter spp

Meio ambiente e
hospitalar
Flora saprfita da
pele e aparelho
respiratrio

Colonizao de
doentes
hospitalizados;
equipamento
hospitalar (p. ex.
cateteres i.v. ou
urinrios)

Geralmente isolado como agente colonizante. As

verdadeiras infeces so nosocomiais (ITU, ap.
respiratrio, feridas, tecidos moles e bacterimia)

Meio ambiente e
equipamento
hospitalar

Semelhante ao
Acinetobacter spp

Agente de colonizao de doentes internados.

Infeces nosocomiais

Meio ambiente e
equipamento
hospitalar

Incerta

Cateteres, bacterimia e peritonite associada a dilise

peritoneal contnua ambulatria

Orofaringe de
animais

Mordedura ou
arranhadela de
animal

Infeces de ferida

Stenotrophomonas
malthophilia
Chryseomonas
luteola
Flavimonas
oryzihabitans
CDC grupo NO-1

Transmisso

Tipo de Infeces

131

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL

2.1 Exame DIRECTO

Apresentam-se como cocbacilos GRAM negativo.

2.2 Exame CULTURAL

Crescem bem em meio de MacConkey, Gelose sangue e caldos nutritivos (BHI e

tioglicolato) aps incubao a 35C com ou sem CO2.

O Acinetobacter spp. e S. maltophilia podem ser facilmente identificados com os mtodos

bioqumicos comercializados.

Dentro do grupo Acinetobacter spp, as estirpes dividem-se em :

-

Espcies sacarolticas (oxidam a glicose) no-hemolticas A. baumanni

Espcies assacarolticas (no oxidam a glicose) no-hemolticas A.lwoffi
Espcies hemolticas A. haemolyticus

132

GENERO BRUCELLA
1. INTRODUO
As bactrias do gnero Brucella so responsveis por uma infeco conhecida historicamente
como febre ondulante, febre Mediternea, febre de Gibraltar ou febre de Malta. A Brucelose
uma zoonose, isto uma doena que o Homem pode adquirir atravs do contacto directo com
os animais infectados ou pela ingesto de produtos lcteos contaminados. A doena pode
ainda ser contrada por inalao de aerossis.
O gnero Brucella comporta seis espcies: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B.
bovis e B. neotomae das quais s as quatro primeiras espcies so responsveis por doena
no Homem. A Brucella melitensis a espcie mais virulenta.

2. HABITAT
A Brucella pode infectar uma grande variedade de animais tais como gado caprino, gado
ovino, gado bovino, etc. O microrganismo transmitido entre os animais atravs do aparelho
gastrointestinal, pele e membranas mucosas. Nalguns animais a bactria pode proliferar no
tero e glndulas mamrias.

3. SIGNIFICADO CLNICO

A brucelose pode ser difcil de diagnosticar devido ao largo espectro de manifestaes

clnicas associadas. Na fase aguda da doena os sintomas mais frequentes so febre,
suores nocturnos, arrepios, mialgias e artralgias. Linfadenopatias, esplenomegalia e
hepatomegalia bem como manifestaes cutneas podem estar presentes.

Na forma crnica e aguda, a brucelose pode originar complicaes que atingem vrios
rgos, nomeadamente o sistema nervoso central, aparelho respiratrio, sistema
esqueltico, cardiovascular e pele.

4. DIAGNSTICO LABORATORIAL
4.1. Exame DIRECTO
Apresentam-se como cocobacilos GRAM negativo, aerbios estritos, imveis, no
capsulados e no esporulados.
4.2. Exame CULTURAL
Meios de cultura:
- meio lquido de Triptose
- meio de Castanheda ou outro meio de hemocultura que permita o crescimento desta
bactria
- meio de Middlebrook 7H10.

133

Como a Brucella um microrganismo de crescimento lento a incubao deve ser de 4 a 6

semanas a 35 C em atmosfera de aerobiose.

Fazer passagens cegas semanalmente para gelose sangue e gelose chocolate.

Incubar estes meios a 35 em atmosfera de 5% de CO2. A Brucella abortus em cultura

primria necessita de 5% de CO2 para se desenvolver.

4.3. Testes de IDENTIFICAO

Os mtodos convencionais para a identificao da Brucella incluem:

Necessidade de atmosfera de 5% de CO2 para o seu crescimento

Produo de H2S
Produo de urease
Crescimento na presena de corantes (Tionina, Tionina azul e Fucsina Bsica)
Catalase POSITIVA
Oxidase POSITIVA

Testes serolgicos - Confirmao serolgica do gnero Brucella com antisoros monoclonais.

No permite a identificao da espcie.
Nota: A Brucella um microrganismo que s deve ser manipulado em Laboratrios do
grupo IV.

134

IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS EXIGENTES

Grupo HACEK
1. INTRODUO

O termo exigente aplica-se tradicionalmente a microrganismos que no se

desenvolvem ou desenvolvem mal nos meios convencionais de cultura (gelose
sangue, gelose chocolate, MacConkey), requerem atmosfera capnoflica ou
microaeroflica e podem exigir incubao prolongada para serem detectados.

As suas exigncias especiais de crescimento tambm dificultam a sua identificao

bioqumica.

Nenhum dos sistemas de identificao comerciais identificam de forma fivel estes

microrganismos.

O facto de serem considerados agentes de infeco raros pode reflectir, em parte, a

dificuldade no seu isolamento e identificao.

Em geral, fazem parte da flora microbiana normal do Homem e animais, e como tal a sua
virulncia baixa, excepto se associados a infeco periodontal. Geralmente s causam
doena no Homem quando introduzidos em tecidos ou locais estreis, por exemplo aps
traumatismos tais como mordeduras ou manipulaes da cavidade oral.

GNERO ACTINOBACILLUS

Este gnero contm 6 espcies:

-

Actinobacillus equuli
Actinobacillus ureae
Actinobacillus hominis
Actinobacillus lignieresii
Actinobacillus suis
Actinobacillus pleuropneumoniae ( espcie factor V dependente)

A infeco humana est associada s 3 espcies que colonizam exclusivamente

homem: A. actinomycetemcomitans, A. ureae, e A. hominis.

O A. actinomycetemcomitans j foi classificado neste gnero mas estudos recentes

mostraram uma relao muito prxima com o H. aphrophilus e H. segnis (no entanto, em
termos prticos, continua a ser tratado como uma espcie do gnero Actinobacillus).

So agentes indgenas habituais das mucosas dos aparelhos respiratrio e genitourinrio quer humano quer animal. A maioria das espcies so agentes patognicos para
os animais.

135

O A. actinomycetemcomitans est associado a periodontite, endocardite e abcessos

principalmente cerebrais. O A. ureae e A. hominis so bactrias oportunistas isoladas
sobretudo na expectorao e secrees traqueais de doentes com doena respiratria
crnica e pneumonia.

As infeces humanas por A. lignieresii e A. equuli decorrem geralmente de mordeduras de

animais, sendo o agente isolado quer da ferida quer do sangue.

1. Exame DIRECTO
Bacilos Gram negativo curtos (0,4-1 m), dispostos isoladamente, aos pares ou em
cadeia e tendem a exibir colorao bipolar.
2. Exame CULTURAL

Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey, ou

tem um crescimento muito escasso.

Incubao em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2 ou em anaerobiose,

durante 24-72h

As culturas podem ser pleomrficas dando o aspecto de cultura no pura.

As colnias de A. actinomycetemcomitans so acinzentadas, viscosas e aderentes ao

meio; muito tpico o enrugamento no centro das colnias em forma de estrela.

As colnias de A. ureae tm 0.5-1 mm de dimetro, lisas, convexas, no hemolticas, com

ligeiro escurecimento da gelose por baixo das colnias.

As colnias de A. hominis inicialmente tm 1-2 mm, transparentes, mas tornam-se

brancas ou acinzentadas com o tempo.

Nos meios lquidos forma grnulos que aderem s paredes do tubo ficando o caldo lmpido.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO CAPNOCYTOPHAGA

Este gnero contm 7 espcies:

-

C. gengivalis
C. granulosa
C. haemolytica
C. ochracea
C. sputgena
C. canimorsus
C. cynodegmi

136

A C. gengivalis, C. granulosa, C. haemolytica, C. ochracea e C. sputgena fazem parte da

flora oral humana, enquanto a C. canimorsus e C. cynodegmi colonizam a cavidade oral de
ces e gatos.

As espcies que colonizam o homem so bactrias oportunistas tendo sido implicadas

em doena periodontal, abcessos, queratites, osteomielite, endocardite, etc.

As espcies que colonizam os animais so responsveis por infeces no Homem

resultantes de mordeduras desses animais.

1. Exame DIRECTO

Bacilos Gram negativo fusiformes, de 1-3 m de comprimento, por vezes com a forma
de lgrima, podendo ainda apresentar formas filamentosas ou cocides.

2. Exame CULTURAL

Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey.

Incubao em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2 durante 24-72h

As colnias s 24h so muito pequenas podendo atingir 2-3 mm de dimetro s 48-72h de

incubao.

As colnias so convexas ou achatadas, com bordos irregulares (fingerlike), no

hemolticas, podem apresentar swarming e podem corroer o meio de cultura. As colnias
de C. haemolytica podem ser fracamente hemolticas mas essa propriedade perde-se
rapidamente nas subculturas. As colnias de C. ochracea tm cheiro a amndoa amarga.

As espcies animais (C.canimorsus e C. cynodegmi) distinguem-se das humanas por

serem, sempre catalase POSITIVA e oxidase POSITIVA .

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO EIKENELLA

Este gnero pertence famlia Neisseriaceae. Inicialmente classificada como Bacteroides

corrodens mais tarde reclassificada como Bacteroides ureolyticus (estirpes anaerbias
estritas) e por fim Eikenella corrodens (estirpes microaeroflicas). Os microrganismos
inicialmente classificados como HB1 so hoje reclassificados como Eikenella corrodens.

comensal da flora oral humana podendo ser responsvel por infeces quer orais quer
extra orais: pleuropulmonares, abcessos dos tecidos moles, artrite, meningite, endocardite,
ferida cirrgica, etc.

1. Exame DIRECTO

Bacilos Gram negativo finos e rectos, de 1,5 a 4 m de comprimento, com extremidades

arredondadas, imveis.

137

2. Exame CULTURAL
Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey.

Incubao em atmosfera suplementada com 5% de CO2 , durante 24-72h

Demora 2-4 dias at se desenvolverem colnias bem visveis. Inicialmente as colnias so

transparentes mas com o tempo adquirem uma cor amarelada. Podem apresentar um
cheiro semelhante ao Haemophilus.

A maioria das estirpes corroem o meio, no entanto na mesma cultura podem aparecer
colnias que corroem e outras no.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO KINGELLA e Grupo EF-4 do CDC

Pertencem famlia Neisseriaceae. A Kingella spp faz parte da flora do aparelho

respiratrio humano. A K. kingae uma bactria oportunista, podendo causar endocardite,
osteomielite e sepsis. A K. oralis tem sido isolada na placa dentria mas o seu papel na
doena periodontal desconhecido. A K. denitrificans s muito raramente isolada tendo
sido associada a endocardite.

As estirpes EF-4 fazem parte da flora oral de ces e gatos podendo provocar infeces
humanas aps mordeduras, arranhes e at contaminao de feridas preexistentes. O EF4a est mais associado a ces enquanto o EF-4b est mais associado a gatos.

1. Exame DIRECTO

Cocobacilos Gram negativo dispostos em pares ou cadeias curtas podendo ser

confundidos com Neisseria, no esporulados, imveis. Os microrganismos do grupo EF-4
tambm so cocobacilos Gram negativo mas dispostos isoladamente.

2. Exame CULTURAL

Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate.

Incubao atmosfera de aerobiose, suplementada com 5% de CO2. Tempo de incubao

prolongado >48 horas.

As colnias de Kingella so lisas e convexas com tendncia para se espalharem e por

vezes corroem o meio.

A K. kingae produz -hemlise.

As colnias de EF-4 podem pigmentar fracamente de amarelo e cheiram a pipocas.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

A K. kingae diferencia-se das outras espcies porque acidifica a maltose, mas uma
reaco demorada.

138

A K. denitrificans a nica espcie de Kingella que reduz os nitratos.

As caractersticas fenotpicas do EF-4 so semelhantes Kingella spp. mas a catalase

positiva e algumas estirpes crescem em MacConkey.

GNERO CARDIOBACTERIUM e SUTONELLA

Os dois gneros so membros da famlia Cardiobacteriacea (que inclui ainda o gnero

Dichelobacter agente patognico veterinrio) e fazem parte da flora habitual do aparelho
respiratrio e ocasionalmente do aparelho urogenital humanos.

O gnero Cardiobacterium constitudo por uma nica espcie, Cardiobacterium hominis

e o gnero Sutonella tambm constitudo por uma nica espcie, Sutonella indologenes
(antes classificada como K. indologenes).

O C. hominis tem sido associado a endocardite e S. indologenes a infeces oculares.

1. Exame DIRECTO

O C. hominis apresenta-se como bacilos Gram negativo pleomrficos de 1-3 um de

comprimento, com extremidades bulbosas, dispostos em roseta ou em cacho.

S. indologenes so bacilos Gram negativo e, tal como a Kingella e Cardiobacterium

resistentes descolorao.

2. Exame CULTURAL

Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey.

Incubao Em atmosfera aerbia, durante 24-72h

Aps dois dias de incubao observam-se pequenas colnias circulares, achatadas,

com tendncia para se espalharem.

As colnias de Cardiobacterium so brancas ou amareladas, podem ter ligeira -hemlise

e corroer o meio, enquanto as de Sutonella so cinzentas e translcidas.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

C. hominis fosfatase alcalina negativo e acidifica a maltose, enquanto S. indologenes
fosfatase alcalina positivo e a acidificao da maltose varivel, geralmente negativa.

STREPTOBACILLUS MONILIFORMES

Faz parte da flora da orofaringe e nasofaringe dos ratos (selvagens e de laboratrio), as

infeces humanas, geralmente , so consequncia de mordeduras de rato ou do consumo
de alimentos contaminados.

139

Tem sido isolado no sangue , lquido sinovial e aspirados de abcessos.

1. Exame DIRECTO

Bacilo Gram negativo muito pleomrfico, de 0,3-0,5 m de largura e 1-5 m de

comprimento, mas podendo apresentar formas filamentosas de 100-150 m.

2. Exame CULTURAL

Meio de Cultura Meios slidos ou lquidos tm de ser suplementados com 10% de

sangue de cavalo e 10% de extracto de levedura. (O SPS se presente em meio de
hemocultura inibidor deste gnero bacteriano).

Incubao Em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2, durante 24-72h.

Aps os trs dias de incubao aparecem colnias de 1-2 mm de dimetro, redondas,

lisas, cinzentas, butirosas. Algumas colnias tm aspecto de ovo estrelado fazendo
lembrar as de Mycoplasma.

Nos meios lquidos desenvolvem-se sob a forma de puff balls.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

Actinobacillus

Capnocytophaga

Eikenella

Kingella

EF-4a

EF-4b

Cardiobacterium

Sutonella

DF-3

Streptobacillus

Chromobacterium

QUADRO de TESTES IDENTIFICAO

Oxidase

Catalase

Desenvolvimento em
MacConkey

Citrato Simmons

Reduo dos nitratos

Dihidrolase da
arginina

Urease

Indol

Manitol (acidificao)

Glicose (acidificao)

+ reaco positiva - reaco negativa V reaco varivel F fermenta a glicose O oxida a glicose.

140

IDENTIFICAO das VIBRIONACEAE

Nome actual

Nome prvio

Vibrio alginolyticusVibrio parahaemolyticus biotipo2

Vibrio cholerae
Vibrio cincinnatiensis
Vibrio damsela
Vibrio fluvialis.CDC grupo EF-6
Vibrio furnissi
Vibriohollisae.CDC grupo EF-13
Vibrio metschnikovii.CDC grupo entrico 16
Vibrio mimicus..Vibrio cholerae (sucrose negativo)
Vibrio parahaemolyticus..Pasteurella parahaemolyticus
Vibrio vulnificus.CDC grupo EF-3
Aeromonas caviae
Aeromonas hydrophila
Aeromonas jandaei
Aeromonas schubertii
Aeromonas sobria
Aeromonas veronii
Aeromonas shigelloides
Chromobacterium violaceum

1. INTRODUO

Grupo de bacilos Gram negativo, mveis por flagelo polar. Sendo aerbios ou
anaerbios facultativos, tm um metabolismo oxidofermentativo (a glicose fermentada
sem produo de gs), so oxidase POSITIVA, e crescem em meio de MacConkey.

No fazem parte da flora humana habitual, e a transmisso faz-se por ingesto de gua
contaminada, mariscos ou atravs de descontinuidade da pele e mucosas.

Desta famlia fazem parte os gneros Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas shigelloides e

Chromobacterium violaceum.

2. HABITAT e SIGNIFICADO CLNICO

MICRORGANISMO

HABITAT(reservatrio)

TRANSMISSO

DOENA

Vibrio cholerae

Nicho fora do aparelho GI humano

entre epidemias incerto.
Sobrevive em estado latente em
guas marinhas. Portadores
assintomticos raros

Fecal-oral, ingesto de gua

contaminada, ou marisco
contaminado

Clera

Vibrio alginolyticus

gua salgada

gua contaminada

Infeces feridas
ou ouvido

V. parahaemolyticus

gua salgada

Aeromonas sp.

gua salgada, gua canalizada,

piscinas

Plesiomonas
shigelloides

gua doce especialmente em clima

quente

Ingesto gua contaminada ou

marisco
Ingesto alimentos ou gua
contaminada; exposio de pele
ou mucosas; picada de anzis

Gastroenterite,
feridas e sepsis

Ingesto gua contaminada ou

marisco

141

3. DIAGNSTICO LABORATORIAL

Para o diagnstico da clera, as amostras devem ser colhidas em meio de Cary-Blair e

no meio de glicerol.

EXAME DIRECTO
Na colorao de Gram, os vibries apresentam-se como bacilos Gram negativo, curtos,
geralmente isolados, em forma de vrgula.

EXAME CULTURAL
-

Meio TCBS ( tiosulfato citrato sais biliares sucrose)

Meio de MacConkey
Meio SS
Pode ser ultilizada gua peptonada (pH 8.4) como meio de enriquecimento, com
incubao durante 5 a 8 horas a 35C e subcultura para meio TCBS.

Todas as espcies crescem bem em gelose sangue, gelose chocolate e meio de

MacConkey, meio de caldo crebro-corao e meio tioglicolato, a 35C com ou sem CO2
ao fim de 24 horas.
Morfologia das COLNIAS nos Meios de CULTURA
Microrganismo

Vibrio spp

Meio de cultura
GS

Mdias ou grandes, lisas, opacas

com halo esverdeado.

Mac

Lactose (-) , excepto V. vulnificus.

TCBS

Amarelas ou verdes, consoante a

espcie

GS

Grandes, redondas, opacas; betahemolticas excepto A. cavie.

Mac

Lactose (+) ou (-)

GS

Brilhantes, opacas, lisas, nohemolticas.

Mac

Lactose (+) ou (-)

GS

Redondas, lisas, convexas algumas

beta-hemolticas; pretas ou violeta
escuro; cheiro a amnia

Mac

Lactose (-)

Aeromonas spp.

Plesiomonas shigelloides

Chromobacterium
violaceum

Aparncia das colnias

As colnias destes microrganismos so semelhantes s Enterobacteriaceae, mas so

oxidase POSITIVA (excepto V. metschnikovii).

O principal problema na identificao do gnero Vibrio deve-se ao caracter haloflico da

maioria das espcies e ausncia de concentraes suficientes de NaCl nos meios de
cultura dos testes de identificao comercializados.

142

Dividem-se em 2 grandes grupos:

1. Espcies haloflicas - necessitam de meio salino para se desenvolverem: V.
parahaemolyticus, V. Alginolyticus.
2. Espcies no-haloflicas - no necessitam de meio salino: V.cholerae,
V.mimificus, Aeromonas spp. e Plesiomonas shigelloides.

As estirpes patognicas de Vibrio cholerae pertencem ao serogrupo 01, que compreende 3

especificidades antignicas (A,B,C) para os dois biotipos, V. cholerae (clssico) e El Tor.
Os serotipos Ogawa e Inaba so os mais frequentes. As estirpes toxignicas do serogrupo
01 so as que esto envolvidas nas epidemias.

Oxidase

D-glicose

Lactose

Sucrose

Myo.inositol

LDC

ADH

ODC

Cresc/ 0%NaCl

Cresc/ 6%NaCl

Cresc/ TCBS

Cr
TCBS

colnias

3.2. Identificao BIOQUMICA testes bioqumicos comercializados

Plesiomonas shigelloides

Chromobacterium violaceum

NT

NT

Vibrio chorelae

Bom

Amarelo

Vibrio mimificus

Bom

Verde

Vibrio metschnikovii

Amarelo

Vibrio vulnificus

Bom

Verde

Vibrio alginolyticus

Bom

Amarelo

Vibrio parahaemolyticus

Bom

Verde

MICRORGANISMO

Aeromonas hydrophila
Aeromonas caviae
Aeromonas v. biovar sobria
Aeromonas v. biovar veronii

+ : >90% espcies positivo

- : > 90% espcies negativo

V: varivel

NT- no testado

143

TESTE de SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIMICROBIANOS

INTRODUO

O Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (AM) deve realizar-se para qualquer

microrganismo que seja responsvel por um processo infeccioso e que necessite de
teraputica antimicrobiana, sempre que a susceptibilidade no puder ser previsvel pelo
conhecimento da identidade do microrganismo. Os testes de susceptibilidade esto
principalmente indicados quando o microrganismo pertence a uma espcie capaz de exibir
resistncia aos antimicrobianos mais frequentemente utilizados.

Nos casos em que a infeco, apesar de provocada por um microrganismo cuja

susceptibilidade a um determinado AM devidamente reconhecida (ex.: susceptibilidade
Penicilina do Streptococcus pyogenes) e o doente alrgico a esse AM, outros AM devem
ser testados.

Os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos devem ainda ser efectuados em estudos

epidemiolgicos de resistncia e em estudos de novos agentes antimicrobianos.

Os vrios tipos de testes de susceptibilidade disponveis podem-se classificar em dois

grandes grupos como mostra o esquema abaixo:

TESTES de DILUIO
TESTE de Gradiente de difuso
TESTES de DIFUSO

Em meio LQUIDO
Em AGAR

Macro
Micro

Teste

Mtodo de Kirby-Bauer
Mtodo de Stokes
Mtodo Comparativo

Os testes de diluio, quer em meio lquido ou em agar, usam-se para medir quantitativamente
a actividade in vitro de um AM numa estirpe bacteriana.
1. Teste de Macrodiluio em Meio Lquido

Foi dos primeiros a ser desenvolvido e ainda o 1 Mtodo de Referncia.

Utiliza diluies seriadas do antimicrobiano em caldo de Mueller-Hinton suplementado com

caties, que so distribudas por 10 tubos. O tubo n. 10 no tem AM e serve como controlo
de crescimento.

Inoculao de cada um dos tubos com uma suspenso bacteriana padronizada.

Incubao a 35 C durante 18 horas.

No final da incubao, os tubos so visualmente examinados para observao de turvao

144

A turvao indica que o crescimento bacteriano no foi inibido pela concentrao de AM

contido naquele tubo.

A mais baixa concentrao de AM em g / ml que impede o crescimento bacteriano in

vitro a Concentrao Inibitria Mnima (CIM).

2. Teste de Microdiluio em Meio Lquido

Adaptao do teste anterior a pequenos volumes.

A susceptibilidade do microrganismo aos antimicrobianos determinada em microplaca.

As vantagens do mtodo so o uso de pequenos volumes de reagentes, a possibilidade de

testar grande nmero de bactrias contra um painel de AM e o baixo custo.

3. Teste de Diluio em Agar

o 2 mtodo de referncia.

Adaptado ao uso em rotina em grandes laboratrios.

Uma suspenso padronizada da bactria inoculada numa srie de placas de gelose

Mueller-Hinton, cada uma contendo uma diferente concentrao de AM. As concentraes
de AM utilizadas abrangem as concentraes teraputicas da droga.

O valor da CIM estabelecida como sendo a da placa em que j no h crescimento

bacteriano (endpoint).

4. Testes de Difuso

Utilizam uma suspenso bacteriana padronizada que semeada em meio slido

apropriado aos diferentes mtodos utilizados.(ex.: gelose Mueller-Hinton para o Kirby
Bauer)

Colocao de discos de papel de filtro impregnados em antimicrobianos

Medio dos halos de inibio de crescimento

Resultados - Sensvel / Intermdio /Resistente

5. - Test

Combina o princpio do mtodo de difuso com disco (a preparao do inoculo igual) com
o do mtodo de diluio (concentraes seriadas do AM impregnadas em tiras)

145

Resultados em CIM. Os critrios utilizados para a interpretao da CIM so os utilizados

pelos mtodos de diluio e encontram-se nos documentos do NCCLS M7-A3 para
bactrias aerbias e M11-A3 para anaerbias

6. Pesquisa de lactamases (ver seco respectiva)

TESTE DE DIFUSO - Mtodo de KIRBY-BAUER

1. DEFINIO
O mtodo de difuso em agar um dos mais utilizados na rotina dos Laboratrios de
Microbiologia, para testar in vitro, a susceptibilidade aos antimicrobianos (AM) das bactrias
de crescimento rpido e de alguns microrganismos exigentes.
O mtodo actualmente recomendado pelo NCCLS, Documento M2-A7 baseia-se no mtodo
originalmente descrito por Bauer e col. em 1966. Esta metodologia simples, mas bem
controlada permite obter um resultado qualitativo que se baseia na relao dos breakpoints
das CIM com os nveis teraputicos dos antimicrobianos atingidos no sangue nas infeces
sistmicas, ou ainda com nveis de AM concentrado na urina para aqueles utilizados apenas
em infeces do aparelho urinrio.
As tabelas de consenso do NCCLS so actualizadas anualmente num processo contnuo que
se reflecte nos procedimentos, mtodos e protocolos. Assim, imprescindvel que os
Laboratrios de Microbiologia que utilizem esta metodologia estejam actualizados com
as novas edies ou suplementos das recomendaes publicadas pelo NCCLS, para os
testes de susceptibilidade aos AM.

2. PRINCPIO

Um inculo padronizado do microrganismo aplicado na superfcie de uma placa de

gelose Mueller-Hinton, onde se colocam discos impregnados de antimicrobianos.

Aps incubao, em geral durante 16-18 horas, so medidos os dimetros dos halos de
inibio de crescimento para cada disco.

O tamanho do halo inversamente proporcional CIM do microrganismo, e

baseando-se nas recomendaes do NCCLS, obtido um resultado qualitativo que se
exprime em sensvel, intermdio ou resistente.

3. INDICAES do MTODO

Os testes de susceptibilidade esto indicados para qualquer microrganismo responsvel

por um processo infeccioso em que seja necessria a teraputica antimicrobiana.

146

Este mtodo de difuso utilizado para os seguintes microrganismos:

-

Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
Enterobacteriaceae
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter spp
Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus spp.
Vibrio choerae

Excepto para os microrganismos em que, com a evoluo microbiolgica, o NCCLS vai

criando recomendaes e tabelas de consenso, o teste de difuso no deve ser utilizado
para testar a susceptibilidade noutros microrganismos de crescimento lento, que
requerem enriquecimento especial dos meios de cultura (ex.: Campylobacter spp.,
Corynebacterium spp.).

Devem ser utilizadas colnias isoladas do microrganismo em causa, obtidas a partir de

uma cultura pura.

Esto desaconselhados testes de susceptibilidade feitos directamente a partir do produto

biolgico.

4. SELECO dos ANTIMICROBIANOS para os TESTES DE ROTINA

A seleco dos antimicrobianos a serem testados deve ser uma deciso de cada
laboratrio clnico em conformidade com a Comisso de Farmcia e Teraputica e a
Comisso de Controle de Infeco. A lista de antimicrobianos a testar por
microrganismo, proposta nas Tabela 1 e 1A do NCCLS inclui agentes
comprovadamente eficazes para o tratamento das infeces por eles provocadas e
pode ser uma indicao dos AM a testar.

Todos os antimicrobianos devem ser referidos utilizando os nomes genricos e

agrupados por classes farmacolgicas.

5. REAGENTES e MATERIAL
5.1 Meios de Cultura slidos

Gelose Mueller-Hinton (MH)

Gelose Mueller-Hinton com 5% sangue carneiro (MH5%SC)
Gelose GC com 1% suplemento
Gelose Haemophilus Test Medium (HTM)

O pH da Gelose MH deve ser de 7,2 a 7,4 e verificado sempre para cada lote do meio na
altura em que est pronto a ser distribudo em placas. Tambm deve conter 10-30mg de
ies livres de Mg++/L e 50-60 mg de ies livres de Ca++/L.

147

Nas placas, o meio deve ter uma superfcie plana e altura uniforme de 4 mm.

Todas as placas devem ser conservadas a 4C e as produzidas no Laboratrio, devem ser

utilizadas no prazo de uma semana.

5.2 Meios Lquidos para preparao do inculo

-

Caldo de Mueller-Hinton (CMH)

Caldo BHI
Meio TSB
Soluo de NaCl a 0,85%

5.3 Soluo padro de McFarland a 0,5 / Densitmetro

5.4 Discos de antibiticos com concentraes conhecidas (ver tabela)

Os discos de -lactmicos, carbapenemes, cefalosporinas e combinaes com

clavulanato devem ser armazenados a 20 C por perodos longos, ou a 4 C por perodos
mais curtos.

Todos os outros, armazenar refrigerados a 4 C ou congelados. Devem ser retirados do

frigorfico 1 a 2 horas antes de serem utilizados e deixados temperatura ambiente antes
de retirar da embalagem de conservao (com exsicante) pois as gotas de condensao
podem causar diminuio da actividade antimicrobiana ou da concentrao de AM, levando
a falsas resistncias.

Nunca utilizar discos fora de prazo.

5.5 Outro material

-

Pina esterilizada
Craveira ou rgua
Fonte luminosa regulvel
Superfcie negra no reflectora
Agitador de tubos (vrtex)
Estufa de 33-35C

6. PROCEDIMENTO GERAL

Para os testes de susceptibilidade dos microrganismos de crescimento lento

(Streptococcus spp., Haemophilus spp. e N. gonorrhoeae), ver modificaes especiais ao
procedimento geral.

6.1. Temperatura

Deixar as placas e os discos atingirem a temperatura ambiente antes de serem utilizadas.

148

As placas podem ser colocadas na estufa a 35C entreabertas para evaporao das gotas
de condensao na superfcie do meio e na tampa, por perodos curtos para evitar a
desidratao do meio (< 30 min).

6.2. Preparao do Inculo

Microrganismos provenientes de meios de conservao, congelados ou liofilizados devem

ser subcultivados 2 vezes, antes de serem testados.

A - Mtodo PADRO (de crescimento) ou de Fase Logartmica (LFG)

Este o mtodo recomendado para
os testes de susceptibilidade de
microrganismos de crescimento rpido em placas de cultura com incubao > 24h.

Retirar 4 a 5 colnias bem isoladas, morfologicamente semelhantes, de meio de cultura

selectivo ou no selectivo. Tocando com a ansa no topo de cada colnia, transferir o
inculo para um tubo com 4 a 5 ml de caldo de Mueller-Hinton ou outro caldo nutritivo.
Incubar este meio a 35C (2 a 6 horas) at atingir ou exceder a turvao de 0,5 da escala
8
de McFarland (contm 1 a 2 x 10 CFU/ml).
Ajustar escala 0,5 com NaCl 0,85% ou caldo, visualmente ou com densitmetro.
Agitar no vrtex durante 15-20 segundos para homogeneizar.

B - Mtodo DIRECTO (suspenso de colnias)

Este o mtodo recomendado para os testes de susceptibilidade de:

Qualquer microrganismo proveniente de culturas de 18-24 horas

Haemophilus spp, Neisseriae gonorrhoeae, e Streptococcus spp.
Deteco da resistncia meticilina nos Staphylococcus spp.

Retirar 4 a 5 colnias bem isoladas, morfologicamente semelhantes, de meio de cultura

no selectivo e inocular em NaCl 0,85 %.
Ajustar escala 0,5 com NaCl 0,85%, visualmente ou com densitmetro.
Agitar no vrtex durante 15-20 segundos para homogeneizar.

6.3. Inoculao das Placas

Dentro de 15 minutos aps a preparao do inculo, rodar uma zaragatoa esterilizada na

suspenso, e esprem-la contra as paredes do tubo acima do nvel do lquido, para retirar
o excesso de lquido.

Aplicar a zaragatoa no meio de cultura, semeando em estrias apertadas em toda a

superfcie da placa, em 2 ou mais direces, rodando cerca de 60 de cada vez, de modo
a garantir a distribuio uniforme do inculo. Por fim, rodar a zaragatoa na periferia da
placa.

Evitar embater com fora a zaragatoa nos bordos da placa, para que no se formem
aerossis.

149

Deixar secar as placas inoculadas 3-5 min, mas no mais que 15 minutos, antes de
aplicar os discos.

6.4. Aplicao dos discos de Antimicrobianos

Aplicar os discos na superfcie da placa (distribuidor automtico ou pina esterilizada) com

ligeira presso de modo a assegurar o contacto completo com o agar.

A distncia entre discos (centro-centro) deve ser superior a 24 mm e cada um a 15 mm do

bordo da placa:
-

Placas de 100 mm de diametro mximo de 5 discos

Placas de 150 mm de diametro mximo de 12 discos

Nunca recolocar um disco em local diferente aps contacto com a placa, porque o AM
difunde imediatamente.

Os meios de cultura com sangue contm timidina, um antagonista do trimetoprim,

sulfamidas e cotrimoxazol, pelo que estes AM no devem ser testados no meio de
MH5%SC.

6.5. Incubao

Inverter a placa e colocar em estufa a 35 C, em aerobiose, durante 16 a 18 horas (no

mais de 15 minutos aps a aplicao dos discos).

A atmosfera de CO2 altera o pH da superfcie e s deve utilizar-se para o Haemophilus

spp., N. gonorrhoeae e Streptococcus spp. (ver procedimentos especiais).

No colocar mais que 5 placas sobrepostas na estufa.

Para o Staphylococcus spp. incubar 24 horas o disco de oxacilina, no ultrapassando

a temperatura de 35 C.

Do mesmo modo, para o Enterococcus spp. incubar 24 horas o disco de vancomicina.

6.6. Leitura das Placas

Examinar as placas ao fim de 16 a 18 horas, e medir os halos de inibio se o crescimento

for confluente ou semi-confluente. Se houver crescimento com colnias isoladas, repetir o
teste.

Nos meios transparentes (MH, HTM, GC 1%), os halos devem ser medidos em mm (rgua
ou craveira), com a placa fechada invertida debaixo de luz reflectida a um ngulo de 45,
sobre um fundo negro.

Na leitura do disco de oxacilina nos Staphylococcus spp., e do disco de vancomicina nos

Enterococcus spp., observar cuidadosamente o halo de inibio com luz transmitida,
segurando a placa entre a luz e o observador. Qualquer crescimento dentro da zona de
inibio indicativo de resistncia meticilina ou vancomicina, respectivamente.

150

Nos meios com sangue, retirar a tampa e medir os halos pela frente, com luz reflectida a
um ngulo de 45.

Quando testado um microrganismo hemoltico medir cuidadosamente o halo de inibio e

ignorar a hemlise.

Com excepo do disco de oxacilina nos Staphylococcus spp. e disco de vancomicina nos
Enterococcus spp., ignorar a presena de pequenas colnias visveis apenas com luz
transmitida, ou com lupa.

Ignorar a presena de swarming nas estirpes de Proteus spp..

Na leitura dos halos de sulfamidas, trimetoprim ou cotrimoxazol, ignorar pequenas colnias

em crescimento (haze), medindo o halo correspondente a 80% ou mais de inibio.

Grandes colnias que crescem dentro do halo de inibio, podem representar cultura mista
ou variantes resistentes. Devem ser repicadas, subcultivadas, identificadas e retestadas
para TSA. Se os testes derem o mesmo resultado, ou na zona de resistncia, dar como
resistente.

7. PROCEDIMENTOS ESPECIAIS

7.1. HAEMOPHILUS SPP.

O meio de cultura a utilizar sugerido pelo NCCLS o Haemophilus test medium (HTM)

Para o inculo utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma
placa de gelose chocolate com 18 a 24 horas de crescimento.

Fazer uma suspenso em caldo de MH ou NaCl a 0,85% ajustada a 0,5 da escala de

McFarland.

Uma vez que este microrganismo produz grandes halos de inibio no meio HTM, devem
ser aplicados menos discos (habitualmente 3).

Incubar as placas a 35 C em atmosfera de 5% CO2 durante 16 a 18 horas.

7.2. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ou outros STREPTOCOCCUS spp.

O meio de cultura a utilizar o Mueller-Hinton c/ 5% sangue carneiro (MH5%SC).

Para o inculo utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma
placa de gelose sangue com 18 a 24 horas de crescimento.

Fazer uma suspenso em caldo de MH ou NaCl a 0,85% ajustada a 0,5 da escala de

McFarland.

Incubar em 5% CO2 durante 20-24 horas a 35C.

151

A resistncia Penicilina de Streptococcus viridans deve ser feita determinando a CIM.

7.4. NEISSERIA GONORRHOEAE

O meio de cultura a utilizar a Gelose GC suplementado a 1% aps autoclavagem.

Para o inculo, utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma
placa de gelose chocolate com 18 a 24 horas de crescimento.

Fazer uma suspenso em caldo de MH ajustada a 0,5 da escala de McFarland (contm 1

8
a 4 X 10 CFU/ml)

Incubar em 5 % CO2 durante 20-24h a 35C.

7.5 NEISSERIA MENINGITIDIS

No h critrios padronizados para o mtodo de difuso em agar (Kirby-Bauer)

7.6. MORAXELLA CATARRHALIS

Fazer apenas a pesquisa da -lactamase pelo mtodo da nitrocefina - susceptibilidade

extrapolada para ampicilina, penicilina e amoxicilina.

Para os outros AM (cotrimoxazol, tetraciclina, eritromicina, amoxicilina+c.clavulnico,

cefuroxime, cefotaxime, e cloranfenicol) utilizar a Tabela 2 do NCCLS M2-A7.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

O controle de qualidade deve ser efectuado fazendo o antibiograma das estirpes padro
durante 30 dias consecutivos.

Para cada antibitico, se apenas 3 em 30 resultados estiverem fora dos limites de

confiana, o CQ pode ser reduzido para semanal.

Para um controle dirio, apenas 1 em 20 resultados pode estar fora dos limites.

Para um controle semanal, todos os resultados devem estar dentro dos limites.

Quando houver resultados fora dos controles, efectuar aces correctivas.

ESTIRPE PADRO
E. coli ATCC 25922

Indicao

Observaes

Conjunto de discos para bacilos Gram

negativo

Estirpe -lactamase
negativa

E. coli ATCC 35218

-lactmico+inibidor das -lactamases

Estirpe -lactamase positiva

S. aureus ATCC 25923

Conjunto de discos para cocos Gram

positivo

Estirpe -lactamase negativa

152

ESTIRPE PADRO

Indicao

Observaes

P. aeruginosa ATCC 27853

Aminoglicosdeos

E. faecalis ATCC 29212 ou

33186

Cotrimoxazol

H. influenzae ATCC 49247

Conjunto de testes para Haemophilus

Utilizar com HTM

H. influenzae ATCC 49766

Algumas cefalosporinas

Utilizar com HTM

H. influenzae ATCC 10211

Controle de crescimento do HTM

Utilizar com HTM

N. gonorrhoeae ATCC 49226

Conjunto de testes para N. gonorrhoeae

S. pneumoniae ATCC 49619

Conjunto de testes para S. pneumoniae e

outros Streptococcus spp.

Controle de aminoglicosdeos Alta Carga

(AC)

Verifica as quantidades de
timidina do agar

Utilizar com MH 5 %SC

9. INTERPRETAO do TESTE
Desde que o Controle de Qualidade com as estirpes padro esteja dentro dos limites de
confiana - Tabela 3 e 3A , interpretar as zonas de inibio de acordo com as tabelas do
NCCLS e descrever o microrganismo como sensvel, intermdio ou resistente a cada AM
testado.

SENSVEL o microrganismo responde teraputica com o AM utilizando a dosagem

normalmente recomendada para aquele tipo de infeco e espcie bacteriana.

RESISTENTE improvvel uma boa resposta teraputica s concentraes de AM

atingidas com as dosagens habitualmente utilizadas com aquele AM e/ou est presente um
mecanismo especfico de resistncia.

INTERMDIO a CIM do AM para o microrganismo prxima do valor que ele pode

atingir no sangue ou tecidos e para a qual a resposta clnica inferior de uma estirpe
sensvel. Implica clinicamente a sua utilizao em locais onde a droga concentrada
fisiolgicamente (urina) ou a utilizao de altas doses do AM (-lactmico).
Tabela 2A Enterobacteriaceae
Tabela 2B P. aeruginosa e Acinetobacter
Tabela 2C Staphylococcus spp.
Tabela 2D Enterococcus spp..
Tabela 2E Haemophilus spp.
Tabela 2F Neisseria gonorrhoeae
Tabela 2G Streptococcus pneumoniae
Tabela 2H Outros Streptococcus spp..
Tabela 2I Vibrio cholerae

A leitura interpretativa do TSA pressupe um conhecimento vasto sobre os antimicrobianos,

incluindo a estrutura qumica, modo de aco, farmacodinmica, farmacocintica, mecanismos
de resistncia e respectivos fenotipos, resistncia intrnseca, e correlao dos resultados in
vitro com a resposta clnica teraputica.

153

Algumas regras importantes (ver comentrios nas tabelas respectivas) :

9.1. ENTEROBACTERIACEAE

Nas estirpes de Salmonella e Shigella spp. isoladas nas fezes, s deve ser testada a
ampicilina, uma quinolona e o cotrimoxazol. Para as estirpes isoladas em infeces extraintestinais, testar tambm o cloranfenicol e uma cefalosporina de 3 gerao. No testar
cefalosporinas de 1 e 2 gerao e aminoglicosdeos. Os resultados para a Salmonella
spp. no devem ser fornecidos aos clnicos nas gastroenterites sem gravidade.

O disco de ampicilina representativo da ampicilina e amoxicilina.

O disco de cefalotina representativo da cefalotina, cefapirina, cefradina, cefalexina,

cefaclor e cefadroxil.

A cefazolina, cefuroxime, cefpodoxime, cefprozil e loracarbef devem ser testadas

individualmente.

Nas estirpes isoladas no LCR, testar e informar o resultado para o ceftriaxone ou

cefotaxime.

9.2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA e ACINETOBACTER spp.

O tamanho dos halos dos aminoglicosdeos so dependentes do pH e da constituio do

meio, devido s variaes catinicas, pelo que a Tabela 2B s deve ser aplicada quando a
estirpe de P.aeruginosa ATCC 27853 se encontra dentro dos limites aceitveis.

O cloranfenicol, cotrimoxazol e tetraciclina podem ser testados nas estirpes de

Acinetobacter, mas no na Pseudomonas aeruginosa.

9.3. STAPHYLOCOCCUS spp.

O disco de oxacilina 1
g deve ser utilizado para testar a susceptibilidade s penicilinas
resistentes penicilinase (meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina e flucloxacilina) por
ser mais resistente degradao do armazenamento e por detectar melhor as estirpes
heteroresistentes.

Os Staphylococcus meticilina-resistentes (MRSA) so resistentes in vivo a todos os

betalactmicos, associaes betalactmico+inibidor, cefalosporinas e carbapenemes,
independentemente do resultado in vitro para estes AM. Um dado suspeito de estirpe
MRSA a presena frequente de multiresistncia a outras classes de antimicrobianos
(aminoglicosdeos, macrlidos, clindamicina e tetraciclina).

Algumas estirpes de MRSA podem no ser detectados por este mtodo fazer o teste de
screening da oxacilina com MH c/ NaCl.

As estirpes resistentes Penicilina so quase sempre produtoras de -lactamase. Deve ser

utilizado o disco de Penicilina 10 U, e os resultados so extrapolveis para todas as

154

penicilinas sensveis penicilinase (ampicilina, amoxicilina, azlocilina, carbenicilina,

mezlocilina, piperacilina e ticarcilina)

O cloranfenicol, macrlidos e clindamicina no devem ser referidos nos isolados da urina.

9.4. ENTEROCOCCUS spp.

No CQ, pode ser utilizada a estirpe de S. aureus ATCC 25923 para os AM referidos na
tabela, excepto para o disco de Gentamicina (120g) e de Estreptomicina (300g), nos
quais de deve utilizar a estirpe de E. faecalis ATCC 29212:
-

Gentamicina - 16 a 22mm
Estreptomicina - 14 a 19mm
Cotrimoxazol (1.25/23.75g)- 20 mm (testa o contedo em timidina do meio MH)

O disco de ampicilina representativo da ampicilina, amoxicilina e combinaes com

inibidores das betalactamases para as estirpes no produtoras de -lactamase.

O disco de Vancomicina deve ser lido s 24 horas, utilizando luz transmitida (ver
procedimento geral - leitura das placas) e um resultado intermdio deve ser confirmado
com a determinao da CIM.

recomendada a deteco da resistncia penicilina ou ampicilina exclusivamente pela

produo de -lactamase pelo mtodo da nitrocefina.

No devem ser testados cefalosporinas, clindamicina, cotrimoxazol e aminoglicosdeos

(excepto ALTA CARGA) devido a serem potencialmente errneos.

9.5. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Deve ser utilizado o disco de Oxacilina de 1

g para detectar a resistncia Penicilina e
no o disco de Penicilina (10 U):
Sensvel - 20 mm ( CIM 0,06
g/ml)
Resistente - 19 mm

Este mtodo no distingue a resistncia intermdia (CIM entre 0,06-1

g/ml) da alta
resistncia (CIM 2 g/ml). Em estirpes com um halo a 19 mm deve ser
determinada a CIM da Penicilina e do Ceftriaxone ou Cefotaxime.

A resistncia Penicilina NO por produo de -lactamase por isso este teste no deve
ser utilizado.

O disco de Oxacilina representativo para as Aminopenicilinas e Cefalosporinas orais (1 e

2 geraes). Se a estirpe fr sensvel Penicilina tambm sensvel a todas as
Cefalosporinas e Carbapenemes.

A susceptibilidade ao Cefotaxime e Ceftriaxone deve ser feita pela determinao da CIM e

no pelo mtodo de difuso.

155

Nas infeces graves (meningite, bacterimia) deve ser determinada a CIM para a
Penicilina, Cefotaxime ou Ceftriaxone bem como Vancomicina.

As estirpes sensveis Ofloxacina tambm so sensveis Levofloxacina.

9.6. STREPTOCOCCUS spp.

Nos Streptococccus viridans isolados em hemoculturas e locais no estreis (LCR) a

susceptibilidade Penicilina deve ser determinada pela CIM.

9.7. HAEMOPHILUS spp.

Deve ser feita a pesquisa da -lactamase, e as estirpes POSITIVAS devem ser dadas
como resistentes ampicilina e amoxicilina, independentemente do tamanho dos halos.

As raras estirpes resistentes ampicilina -lactamase NEGATIVAS (alterao das PBP)

devem ser consideradas resistentes s associaes -lactmico+inibidor das -lactamases,
Cefaclor,
Cefetamet,
Cefonicid,
Cefprozil,
Cefuroxime,
Loracarbef
e
Piperacilina/Tazobactam, independentemente dos resultados in vitro para estes agentes.

Nas estirpes isoladas em hemoculturas e LCR em infeces graves (meningite,

bacterimia, epiglotite, celulite, etc.) s deve ser dado o resultado da Ampicilina,
Cefalosporina de 3 gerao e Cloranfenicol.

O resultado dos AM administrveis por via oral s deve ser dado nas infeces localizadas
pouco graves (sinusite, otite mdia no complicada, infeces broncopulmonares)

9.8. NEISSERIA GONORRHOEAE

A deteco de resistncia plasmdica Penicilina deve ser feita pela pesquisa da lactamase, pelo mtodo da nitrocefina.

10. LIMITAES da TCNICA

Este mtodo apenas est padronizado para bactrias de crescimento rpido e alguns
microrganismos de crescimento exigente, referidos no incio.

Sempre que seja utilizado para os microrganismos sem mtodo de difuso padronizado, os
resultados devem ser dados como presumptivos, devendo isso ser referido no resultado
final (p.ex.: Eikenella spp.)

Alguns bacilos Gram negativo no fermentativos, crescem melhor a 30 que a 35C, e

podem dar halos de inibio anormalmente grandes a 35C, originando falsas
susceptibilidades. Este mtodo s vlido para P. aeruginosa e Acinetobacter spp.

156

Em culturas > 24 horas, o n. de microrganismos inviveis aumenta, pelo que o inculo

8
feito pelo mtodo directo ajustado a 0,5 da escala McFarland, contm menos de 1.5 x 10
CFU/ml.

Existem numerosas FONTES DE ERRO que podem afectar os resultados:

-

Inculo demasiado concentrado ou diludo.

Composio do meio de Mueller-Hinton: pH, contedo inico em Mg e Ca (estes

ies afectam a susceptibilidade da P.aeruginosa aos aminoglicosdeos) e contedo
em timina e timidina.

Espessura do meio : se < 4 mm - aumento do dimetro dos halos e vice-versa .

Perda da potncia dos discos.

Pr incubao das placas > 15 minutos.

Pr-difuso das placas > 15 minutos.

Temperatura incorrecta da estufa de incubao e frigorfico.

Erros na leitura dos halos e erros de transcrio.

++

++

11. TESTE DE DESPISTE de RESISTNCIA METICILINA do Staphylococcus spp. em

meio slido (Tabela M7-A5)

O meio a utilizar o Mueller-Hinton c/ NaCl (4%p/v ; 0,68 mol/L).

A concentrao de AM de 6ug/ml Oxacilina ou 10 ug/ml Meticilina.

Para o inculo utilizar o mtodo DIRECTO de suspenso das colnias (0,5 da escala de
McFarland).

Incubar a 35C em aerobiose durante 24 horas.

A presena de 1 colnia sinnimo de RESISTNCIA.

Para o CQ utilizar as estirpes de Staphylococcus aureus ATCC 29213 (susceptvel) e de

Staphylococcus aureus ATCC 43300 (resistente).

12. TESTE de DESPISTE da RESISTNCIA de ALTO NVEL AOS AMINOGLICOSDEOS

nas estirpes de Enterococcus spp. pelo mtodo de difuso em agar (Tabela M2-A7)

O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton.

Os discos de AM a utilizar so: Gentamicina 120ug e Streptomicina 300ug

Leitura dos halos Tabela 2D

157

Um resultado intermdio deve ser confirmado por outros testes (diluio em agar ou
microduluio).

PESQUISA de LACTAMASES

1. INTRODUO

As -lactamases so enzimas bacterianos heterogneos que clivam o anel - lactmico

das Penicilinas e Cefalosporinas para inactivar o AM.

As -lactamases so encontradas numa variedade de bactrias Gram positivo e Gram

negativo.

Os enzimas produzidos pelos Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Moraxella

catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae e Enterococcus faecalis, so clinicamente
importantes.

O significado dos enzimas produzidos pelas Enterobacteriaceae menos claro e estas

bactrias no devem ser testadas para pesquisa de -lactamases. No entanto, o
aparecimento das -lactamases de espectro estendido (ESBL) nestas bactrias tem
merecido especial ateno particularmente no que diz respeito aos seus mecanismos de
resistncia.

Os processos mais usados nos laboratrios para pesquisar as -lactamases so:

1. Mtodo da cefalosporina cromognea
2. Mtodo acidimtrico
3. Mtodo iodomtrico

Todos estes testes so baseados na deteco visual dos produtos finais da hidrlise dos lactmicos pela -lactamase, os quais so detectados por reaco colorimtrica.

2. AMOSTRAS

4 a 5 colnias morfologicamente semelhantes de uma cultura pura e isoladas de qualquer

meio no selectivo, com 18 a 24 horas de incubao.

Alguns Staphylococcus spp. requerem induo, isto uma prvia exposio a um agente
-lactmico para aumentar a produo do enzima para nveis detectveis. Neste caso,
seleccionar colnias da periferia do halo de inibio do disco de 1 g de oxacilina.

3. Mtodo da CEFALOSPORINA CROMOGNICA

3.1. Princpio
Discos de papel de filtro so impregnados com Cefinase (cefalosporina cromognea). A lactamase hidrolisa a ligao amido do anel -lactmico e produz alterao de cor.

158

Este mtodo o preferido no uso clnico porque fcil de realizar e detecta as mais
conhecidas -lactamases incluindo as dos Enterococcus spp, Neisseria spp e Moraxella
catarrhalis.
3.2. Meios e Reagentes
-

Discos / bastes de Cefinase (Nitrocefin), guardados sempre em congelador (20C)

H2O destilada esterilizada
Laminas de vidro
Pipetas Pasteur esterilizadas
Ansa

3.3. Procedimento (Cefinase em disco)

Humedecer com H2O destilada e esterilizada o disco de Nitrocefin previamente colocado na

lmina de vidro

Usando uma ansa, remover 4 a 5 colnias morfologicamente semelhantes da cultura e

depositar na superfcie do disco.

Verificar se h modificao da cor: resultados positivos aparecem 15 segundos a 5 min

depois. Se no houver alterao de cor o teste negativo

Nota: Algumas estirpes de Staphylococcus spp. podem dar reaces tardias ( at 1 hora )

4. Mtodo ACIDIMTRICO
4.1. Princpio
Pode ser realizado em tira ou disco de papel e em tubo e utiliza uma soluo de vermelho de
fenol. A soluo ou o disco contm benzilpenicilina e um indicador de pH, normalmente o
vermelho de fenol ou a prpura de bromocresol.
A -lactamase hidrolisa a benzilpenicilina e forma acido penicilinico, causando uma descida
do pH e uma consequente alterao da cor. Fcil de realizar mas no detecta todas as lactamases.
4.2. Meios e reagentes
-

Disco ou tira acidimtrica

Restante material igual ao do mtodo anterior

4.3. Procedimento

Igual ao do mtodo anterior

O resultado positivo ocorre dentro de 10 min. Se no houver alterao de cor aos 10 min,
considerar o teste negativo

Nota: Algumas estirpes de Staphylococcus spp. podem dar reaces tardias.

159

O mtodo acidimtrico em tubo e o mtodo iodomtrico no so descritos neste manual por

no serem de execuo fcil na prtica diria laboratorial. O mtodo iodomtrico no to
especfico nem to sensvel como os mtodos anteriores.

5. Procedimentos ESPECFICOS
-lactamases nos Staphylococcus spp.:

A produo de -lactamase pelos Staphylococcus spp. requer induo pela exposio

destes Penicilina. Se um teste negativo 1 hora em bactrias que no foram
expostas a um agente indutor (
-lactmico), no se pode concluir que o isolado no
seja produtor de -lactamase. Deve-se retestar a estirpe aps a induo com um lactmico.

A pesquisa das -lactamases tem a vantagem de ter os resultados disponveis muito mais
precocemente que os testes de susceptibilidade convencionais.

A produo de -lactamase no o nico mecanismo de resistncia aos -lactmicos

(embora seja o mais frequente).

Um teste de -lactamase positivo indica resistncia Penicilina, Ampicilina e Amoxicilina.

Um teste de -lactamase negativo no garante susceptibilidade a estes agentes, pelo que

dever ser efectuado um teste de susceptibilidade convencional.

Os testes de microdiluio com CIM falham para detectar a produo de -lactamases

nalgumas estirpes que a produzem em pequenas quantidades. Um teste aps induo
necessrio nestas situaes.

-lactamases na Moraxella catarrhalis

As recomendaes do NCCLS para os testes de rotina da Moraxella catarrhalis s incluem a
realizao de pesquisa de -lactamase, uma vez que a incidncia de resistncias aos outros
AM muito baixa. Deve ser feita com Nitrocefin
-lactamases no Haemophilus influenzae

Se a -lactamase negativa, recomenda-se o teste de susceptibilidade convencional

Ampicilina, porque h outros mecanismos de resistncia (alteraes das PBPs)
principalmente se o Haemophilus isolado de locais habitualmente estreis (consultar
testes de difuso com discos).

-lactamases na Neisseria gonorrhoeae

Todas as estirpes devem ser testadas para pesquisa de -lactamase com Nitrocefin
-lactamases no Enterococcus faecalis

O mtodo da cefalosporina cromognea o nico mtodo que mostrou ser eficaz na

deteco de produo da -lactamase pelo Enterococcus faecalis ( no requer induo)

160

Estirpes de Enterococcus faecalis produtores de -lactamase geralmente parecem ser

susceptveis Ampicilina e Penicilina pelos mtodos convencionais de difuso em disco e
CIM, mas devem ser dados como Resistentes a estes agentes se so produtores de
lactamase.

6. CONTROLO de QUALIDADE

Estirpes padro utilizadas

- Staphylococcus aureus ATCC 29213 - positiva
- Haemophilus influenzae ATCC 10211 - negativa

Manter as culturas stock a 70 C at 3 anos ou at perderem a viabilidade. Subcultivar

duas vezes antes de testar.

Testar as estirpes de C.Q. sempre que se realiza o teste e em cada novo lote de
reagentes.

Registar os resultados na folha de registo do C.Q. e determinar se os resultados so

aceitveis.

7. TESTES de DESPISTE e CONFIRMATRIOS da presena de LACTAMASES DE

ESPECTRO ALARGADO (ESBL) em estirpes de K. pneumoniae, K. oxytoca e E. Coli
7.1. TESTES de DESPISTE

O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton.

Discos de AM a utilizar (um ou mais dos seguintes):

- Cefpodoxime (10ug)
- Ceftazidima (30ug)
- Aztreonam (30ug)
- Cefotaxime (30ug)
- Ceftriaxone (30ug)

Para o inculo, seguir os mtodos recomendados no procedimento geral.

Incubao a 35C, em aerobiose , durante 16-18 horas.

Se se obtiver um dos seguintes resultados presena de ESBL suspeita.

- Cefpodoxime 22mm
- Ceftazidima . 22mm
- Aztreonam 27mm
- Cefotaxime 27mm
- Ceftriaxone 25mm

161

Para o CQ, utilizar as estirpes E.coli ATCC 25922 e K.pneumoniae ATCC 700603.
- Cefpodoxime 9 a 16mm
- Ceftazidima - 10-18mm
- Aztreonam - 9-17 mm
- Cefotaxime 17-25mm
- Ceftriaxone 16-24 mm

7.2. TESTES CONFIRMATRIOS

O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton.

Discos de AM a utilizar:
-

Ceftazidima (30ug)
Ceftazidima/c.clavulnico (30/10ug)
e
Cefotaxime (30ug)
Cefotaxime/c.clavulnico (30/10ug)

Para os testes confirmatrios utilizar os discos de Cefotaxime e Ceftazidima isolados e

em combinao com o cido clavulnico

Para o inculo, seguir os mtodos recomendados no procedimento geral.

Incubao a 35C, em aerobiose , durante 16-18 horas.

Um aumento de 5 mm do halo de inibio para cada AM testado isolado e com o

c.clavulnico ESBL POSITIVO

Para o CQ, utilizar as estirpes:

-

E. coli ATCC 25922 aumento de 2 mm do halo de inibio para cada AM testado

isolado e com o c.clavulnico
K. pneumoniae ATCC 700603 - aumento de 5 mm do halo de inibio Ceftazidima e
de 3 mm do halo de inibio do Cefotaxime

As estirpes de Klebsiella spp e E. coli produtoras de ESBL podem ser clinicamente

resistentes ao tratamento com Penicilinas, Cefalosporinas e Aztreonam apesar da
aparente susceptibilidade in vitro, por isso deve ser informada a resistncia a todos
estes agentes
Nota: H outros mtodos confirmatrios como, p. ex., a deteco do sinergismo entre
Amoxicilina/cido Clavulnico com Cefotaxime, Ceftazidime ou Aztreonam.

162

TESTES DE DIFUSO
Microrganismo

AM a
testar

Tabela de
leitura

Inculo

Meio de
cultura

Temp. Tempo de
incubao

Atmosfera

Estirpes CONTROLE

Staphylococcus spp Tabela 1

Tabela 2 C M2-A7 Directo

MH

30-35C

16-18 horas
24 horas
(oxacilina)

aerobiose

S. aureus ATCC 25923

E. coli ATCC 35218

Enterococcus spp.

Tabela 1

Tabela 2 D M2-A7

Directo
/LPG

MH

35C

16-18 horas
24 Horas
aerobiose
(vancomicina)

S. aureus ATCC 25923

Enterobacteriaceae

Tabela 1

Tabela 2 A M2-A7

Directo
/LPG

MH

35C

16-18 horas

aerobiose

E. coli ATCC 25922

E. coli ATCC 35218

P. aeruginosa e
Acinetobacter spp.

Tabela 1

Tabela 2 B M2-A7

Directo
/LPG

MH

35C

16-18 horas

aerobiose

P. aeruginosa ATCC 27853

E.coli ATCC 35218

16-18 horas

5% CO2

H. influenzae ATCC 49247

H. influenzae ATCC 49766
H. influenzae ATCC 10211
E. coli ATCC 35218

Haemophilus spp.

Tabela 1 A

Tabela 2 E M2-A7 Directo

HTM

N. gonorrhoeae

Tabela 1 A

Tabela 2 F

GC+1%
suplement 35C
o

20-24h

5% CO2

N. gonorrhoeae ATCC 49226

Tabela 1 A

Tabela 2 G M2-A7 Directo

MH5%SC

35C

20-24h

5% CO2

S. pneumoniae ATCC49619

Tabela 1 A

Tabela 2 H M2-A7 Directo

MH5%SC

35C

20-24h

5% CO2

S. pneumoniae ATCC49619

MH

35C

16-18 horas

aerobiose

E. coli ATCC 25922

S. pneumoniae
Streptococcus spp.
V. cholerae

Tabela 2I M2-A7

Directo

Directo
/LPG

35C

163

A QUALIDADE em MICROBIOLOGIA
(Q Qualidade ; LM Laboratrio de Microbiologia)
A Qualidade consiste num espectro de actividades e processos que formam as caractersticas
de um produto ou servio, espectro esse que se divide em traos gerais, em 5 nveis:
1. Qualidade total ou gesto total da Qualidade ou melhoria contnua da Qualidade abordagem de gesto que visa o sucesso a longo prazo atravs da satisfao do cliente,
ou seja, uma forma de gesto que pretende, atravs da satisfao das necessidades do
cliente atingir sucesso a longo prazo. Satisfao do cliente ao mais baixo custo.
2. Gesto da Qualidade - consiste na coordenao e articulao dos vrios elementos que
dizem respeito poltica de Qualidade, seus objectivos, responsabilidades, e meios de
implementao tais como: planeamento da Qualidade, controlo da Qualidade, garantia da
Qualidade, melhoria da Qualidade.
3. Sistema de Qualidade - todo o conjunto de esforos para atingir os objectivos da
Qualidade, i.e., a estrutura organizacional, recursos, processos e procedimentos
necessrios para assegurar a conformidade do produto ou servio, sem desvios em
relao a um referencial escolhido.
4. Garantia de Qualidade - conjunto de actividades que demonstram que uma organizao
atingiu um nvel aceitvel de Qualidade.
5. Controlo de Qualidade - tcnicas operacionais para medir, comparar com objectivos,
identificar erros ou problemas e respectivas medidas correctivas.

Actualmente, a maioria dos servios de sade operam a nvel do Controlo de Qualidade

(nvel 5) e da Garantia de Qualidade (nvel 4).

Os servios de sade devem fazer um esforo para atingir, pelo menos, o nvel 3 (Sistema
de Qualidade), particularmente se pretendem corresponder aos requisitos de Sistemas
Acreditao ou Certificao os quais inevitavelmente, acabaro por se impor em todos os
pases europeus ( por ex. Certificao segundo as Normas ISO 9000, Certificao segundo
o Kings Fund, Acreditao segundo a Norma NP 17025).

Para que uma organizao como um hospital atinja os padres de Qualidade desejados
necessria a participao activa de todo o seu pessoal. Num Hospital, as funes de cada
grupo profissional tm que estar definidas na estrutura de gesto da Qualidade da
Instituio (ver quadro n. 1).

O conceito de Qualidade em Microbiologia dever portanto ser encarado como parte do

conceito mais vasto da Qualidade dos servios de sade. Assim cada LM dever procurar
implementar sua escala um sistema de Qualidade.

Para implementar um sistema de Qualidade em Microbiologia bom comear por definir

especificamente nesta rea trs (3) termos muito utilizados:
Controlo de Qualidade (CQ) - monitorizao contnua das prticas de trabalho, do
equipamento e dos reagentes. o prprio pessoal que faz a avaliao dos
resultados/dados. Tambm denominado Controlo de Qualidade Interno.

164

Avaliao de Qualidade (AQ) ou Avaliao do desempenho - consiste na avaliao

por terceiros, do desempenho do LM atravs da anlise dos resultados obtidos em
exames de material de controlo (amostras fictcias) realizados da forma e nas
condies habituais de funcionamento do LM. Tambm denominado Controlo de
Qualidade Externo, embora a avaliao do desempenho possa ter origem externa ou
interna ao LM.

Garantia da Qualidade (GQ) - o processo total que garante a Qualidade dos

resultados finais fornecidos pelo laboratrio; compreende no s o controlo da fase
analtica mas tambm das fases pr e ps analticas do ciclo analtico. O controlo da
fase analtica compreende tanto o CQ como a AQ.

FASE PR-ANALTICA

1. Utilizao RACIONAL do Laboratrio de Microbiologia

Para garantir a Qualidade dos seus servios, o LM tem uma palavra a dizer na forma como
utilizado utilizao racional do LM.

Assim, indispensvel existirem recomendaes quanto adequao, nmero e

frequncia dos pedidos de exame microbiolgico. Tais recomendaes devem ser
estabelecidas por consenso entre os responsveis dos servios clnicos e os
microbiologistas.

Em laboratrios informatizados o prprio Programa informtico pode ser concebido para

fazer cumprir tais recomendaes. Alguns exemplos:
-

Se recepcionada uma hemocultura isolada em 24 horas, automaticamente emitida

uma mensagem para o mdico/servio requisitante chamando a ateno para a
necessidade de colher trs (3) hemoculturas a fim de optimizar o diagnstico de
bacterimia.
Se recepcionadas duas (2) ou mais uroculturas em dias consecutivos,
automaticamente emitida uma mensagem para o mdico/servio requisitante
informando que as amostras redundantes s sero processadas depois de consultado
o Microbiologista.

No sentido de uma utilizao racional o LM deve ainda, recusar a requisio de exames

microbiolgicos que no permitem obter resultados clinicamente fiveis, como por
exemplo:
-

Exsudados uretrais para diagnstico de infeco urinria.

Exsudados vaginais para diagnstico de endometrite.
Urina colhida por jacto mdio para cultura de anaerbios.
Expectorao para cultura de anaerbios.
Exsudados nasofarngeos para diagnstico de otite mdia aguda ou sinusite.

165

2. COLHEITA e TRANSPORTE das AMOSTRAS

A Qualidade dos resultados microbiolgicos est directamente dependente da Qualidade e

adequao das amostras recebidas, por isso amostras correctamente colhidas e
transportadas ao laboratrio so essenciais para a Qualidade dos resultados em
Microbiologia.

O LM responsvel pela elaborao de normas de colheita e transporte das amostras,

bem como pela sua divulgao junto dos utilizadores (utentes, pessoal da sade, servios
clnicos, etc.).

Essas normas devem incluir, no mnimo, indicaes sobre:

-

Desinfeco do local da colheita

Mtodo da colheita, tipo e volume de amostra
Recipientes a utilizar (esterilizados e com encerramento hermtico)
Meios de transporte
Dados que devem constar na requisio (ex.: data e hora da colheita, tipo de
produto, se h presena de dispositivos invasivos, se o doente est a fazer
teraputica antibitica, etc.)

O LM tambm deve monitorizar regularmente se as amostras so transportadas dentro

de um prazo razovel de tempo. Para isso necessrio saber a data e hora da colheita e a
data e hora da recepo no LM (ver sondas de Qualidade - Quadro n. 8).

O LM deve, no mnimo, documentar a data e hora da recepo da amostra no

laboratrio.

O LM deve poder garantir a informao que determinada amostra deu entrada no

laboratrio e em que ponto do processamento se encontra ( audit trail).

O LM deve ainda, estabelecer normas para avaliao da qualidade das amostras

recebidas e deve recusar amostras cuja qualidade duvidosa, no permitindo a obteno
de resultados fiveis tais como : zaragatoas de material de leses da boca, abcessos perianais, lceras de decbito ou lquios, pontas de alglia, pontas de drenos, tubos
orotraqueais, etc.

3. Poltica de REJEIO de AMOSTRAS

O LM deve estabelecer claramente uma poltica de rejeio de amostras cujo principal

objectivo seja evitar a produo de resultados errneos e garantir a segurana e sade
quer do pessoal que faz o transporte quer do pessoal do laboratrio.

O LM tem de estabelecer critrios especficos de rejeio de amostras e aces

subsequentes, como por exemplo:
-

Amostra no identificada - no processar at resoluo do problema. Chamar

algum do servio requisitante para vir ao LM fazer a identificao.
Discrepncia entre a identificao da requisio e da amostra - pedir ao
mdico/servio requisitante para resolver o problema. Documentar o ocorrido no
relatrio de resultados.

166

Amostra em contentor visivelmente conspurcado - avisar o mdico/servio

requisitante. No processar.
Amostra enviada em recipiente inadequado - notificar o mdico/servio requisitante
e se possvel colher nova amostra. S processar se no for possvel nova colheita,
documentar o problema no relatrio de resultados.
Atraso excessivo entre a colheita e a recepo no LM - notificar o mdico/servio
requisitante e pedir nova colheita. S processar se grave prejuzo para o doente,
documentar o problema no relatrio de resultados.
Volume insuficiente de amostra para todos os testes solicitados - notificar o
mdico/servio requisitante para que escolha os exames prioritrios.

FASE PS ANALTICA

O LM deve responsabilizar-se pela entrega atempada dos resultados ao mdico/servio

requisitante.

O LM deve estabelecer os tempos de demora mdia esperada para cada tipo de anlises
executadas. Embora idealmente o tempo de demora mdio esperado deva ser estimado
entre o momento da colheita e o momento em que o resultado entregue ao
mdico/servio requisitante, em termos prticos o LM apenas consegue garantir o tempo
que decorre desde o momento em que a amostra recepcionada no laboratrio e o
momento em que o respectivo resultado emitido.

Sempre que se detecta um erro depois do resultado ser emitido deve fazer-se um novo
relatrio de resultados corrigido mas sem apagar o erro original, i.e., o relatrio corrigido
deve referir claramente o erro ocorrido. As eventuais correces com importncia clnica
relevante devem ser comunicadas de imediato ao mdico/servio prescritor.

Sempre que se detecta algum erro, o LM deve proceder s modificaes necessrias de

polticas e/ou procedimentos para evitar a recorrncia do erro.

Idealmente o LM deve estabelecer uma poltica para a comunicao o mais rpida

possvel de informao com particular relevncia clnica (por ex. resultados positivos
de exames directos ou culturais de Lquor, presena de B.A.A.R. em amostras
respiratrias, hemoculturas inequivocamente positivas, etc.), bem como proceder a uma
monitorizao apertada do tempo de demora mdio na obteno dessa mesma
informao.

Se a poltica do LM incluir a comunicao telefnica de determinada informao deve ficar

documentado quem d a informao, quem a recebe, data e hora da comunicao. A
comunicao telefnica pode levar a mal-entendidos e por isso deve ser restringida apenas
aos dados clinicamente relevantes e urgentes. Toda a informao comunicada pelo
telefone dever ser considerada preliminar at sua apresentao por escrito.

Os LM hospitalares devem periodicamente (no mnimo anualmente) disponibilizar os

resultados cumulativos dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, j que
esta informao de grande importncia para a seleco racional das teraputicas
antimicrobianas empricas, para desenvolver e actualizar o formulrio de antimicrobianos
do hospital e para analisar e prever as tendncias de resistncia nos microrganismos
isolados.

167

FASE ANALTICA

O controlo da fase analtica compreende tanto o CQ (Controlo de Qualidade Interno)

como a AQ (Avaliao da Qualidade ou Controlo de Qualidade Externo). O CQ e a AQ
so actividades complementares e no podem ser usadas para se substiturem uma
outra.

Devem aplicar-se Programas de Controlo de Qualidade quer internos quer externos que
sejam prticos, realistas e econmicos, independentemente da dimenso do laboratrio.
Cada laboratrio deve desenvolver o seu prprio Programa de Qualidade, pois o tempo e
recursos despendidos variam (na razo inversa) consoante o volume e o leque de anlises
realizadas no laboratrio.

No necessrio monitorizar todos os reagentes e todas as tcnicas todos os dias. A

frequncia da monitorizao deve ser directamente proporcional frequncia dos erros
detectados.

Para ser bem sucedido o Programa de Qualidade deve ser supervisionado por um membro
snior da equipa tcnica

1. CONTROLO de QUALIDADE INTERNO

O CQ interno reparte-se pelas seguintes reas principais:
-

Manual de procedimentos
Manuteno e controlo do equipamento
Monitorizao dos meios de cultura e reagentes (corantes, antisoros, discos de
identificao, discos de antibioGrama, etc.).

Para um Programa eficaz de CQ indispensvel que o LM possa dispor de um conjunto mais

ou menos extenso de estirpes microbianas de referncia, reconhecidas internacionalmente,
tambm chamadas estirpes de coleco (ATCC American Type Culture Collection, NCTC
National Collection of Type Cultures) e que esto disponveis em vrias fontes comerciais.
Estas estirpes tm caractersticas e comportamentos bem definidos e conhecidos e por isso
servem de referncia ou controlo (ver quadros n. 2 e 3).
1.1. MANUAL de PROCEDIMENTOS (MP)

O MP o documento mais importante para melhorar e manter a Qualidade de um servio

( imprescindvel para a Acreditao dos Laboratrios de Microbiologia Clnica). Deve
conter toda a informao relevante sobre o funcionamento do LM.

Embora o MP de outros laboratrios possa ser usado como guia, cada LM tem
caractersticas especficas e portanto deve desenvolver o seu prprio MP. A utilizao
exclusiva da literatura inclusa nos kits comerciais no recomendada embora a sua
utilizao como fonte de informao seja de encorajar.

168

O MP para ser verdadeiramente til tem que preencher 4 requisitos:

1. Ter carcter vinculativo - deve ser elaborado por um ou mais membros seniores da
equipa tcnica, com reconhecida idoneidade e experincia prtica na matria e deve
ser ratificado pela pessoa que tem a responsabilidade dos procedimentos em uso no
LM.
2. Ser realista - fazendo uma descrio clara, concisa e explicativa dos procedimentos
(por exemplo, recorrendo a uma descrio por passos numerados), evitando ideais
tericos. Procedimentos complicados rapidamente deixam de ser respeitados e
cumpridos. Um MP bem estruturado aquele que permite a qualquer tcnico de outro
laboratrio executar determinado exame apenas com recurso ao MP.
3. Estar actualizado - formalmente o MP deve ser revisto anualmente; no entanto a
reviso deve ser um processo contnuo sendo o MP actualizado sempre que
necessrio. Nenhum procedimento novo ou modificado deve entrar em uso at ser
verificado pelo responsvel do LM e oficialmente incorporado no MP. Todos os
procedimentos originais e subsequentes revises e/ou modificaes devem ser
datadas , aprovadas e assinadas pelo responsvel do LM. Todos os procedimentos
que se tornaram obsoletos devem ser conservados por um perodo regulamentado por
lei.
4. Estar disponvel - o MP deve estar facilmente acessvel nas reas de trabalho a todo
o pessoal relevante. da responsabilidade dos profissionais mais velhos e experientes
garantir que o MP seja rigorosamente cumprido.

O LM deve conservar, por um perodo regulamentado por lei, os registos suficientes

para documentar todos os aspectos respeitantes s anlises executadas sobre as
amostras recepcionadas.

1.2. MANUTENO e CONTROLO dos EQUIPAMENTOS

Junto de cada equipamento deve estar o seu manual de instrues com:

-

Descrio do equipamento
Princpio de funcionamento e seu objectivo
Acessrios e reagentes - necessrios ao seu funcionamento
Avarias /problemas mais frequentes e respectiva resoluo
Procedimentos de C.Q. de rotina
Programa de manuteno

Cada LM deve estabelecer um Programa de manuteno e controlo de todos os

equipamentos em uso. Esse Programa tem que ser documentado atravs de um registo
concebido e adaptado a cada laboratrio: por exemplo pode ir de simples fichas a um
Programa informtico (ver Quadro n. 4).

Actualmente, a microbiologia clnica utiliza cada vez mais equipamento complexo que exige
um Programa de manuteno adequada a fim de evitar avarias e consequentes perodos
em que no pode ser utilizado (down time).

169

Os Programas de manuteno geralmente contemplam dois aspectos:

1) Manuteno de rotina - tarefas necessrias, (incluindo a limpeza), para manter em
funcionamento todos os elementos que constituem determinado equipamento. Tem
que estar definida no Manual de procedimentos.
2) Manuteno peridica - a sua frequncia ou periodicidade definida em funo do
tipo de equipamento e respectiva utilizao. Os equipamentos mais utilizados exigem
uma manuteno mais frequente do que aqueles usados raramente.

Embora o pessoal do laboratrio se possa encarregar da manuteno mais simples e deva

ser responsabilizado por tarefas especficas da manuteno de rotina, as tarefas mais
complicadas (manuteno peridica) so da responsabilidade dos Servios de Instalao e
Equipamentos (SIEs) ou da responsabilidade do prprio fabricante do equipamento,
mediante um contrato de manuteno.

Os custos dos contratos de manuteno devem ser pesados contra os custos de

reparao, quase sempre mais caros, e contra as consequncias dos tempos de
imobilizao do equipamento (down time).

A manuteno do equipamento no deve ser encarada como um aspecto secundrio da

Qualidade. Uma vez definida (responsabilizao, tarefas especficas e periodicidade) e
treinado o pessoal, o Programa deve ser regular e sem interrupes. Uma soluo prtica
aconselhada atribuir especificamente a um determinado tcnico do laboratrio a
responsabilidade da manuteno, bom funcionamento de cada aparelho e respectiva
documentao.

Nos equipamentos cuja temperatura crtica, esta deve ser controlada com
termmetros calibrados. Os limites de tolerncia geralmente considerados aceitveis so
os seguintes:
-

Estufas de incubao: 2c, excepto se uma dada temperatura especfica exigida.

Banhos-maria e blocos de aquecimento: 1c.
Frigorficos: 4 - 8c
Congeladores: 5c.
Ultra congeladores: 10c, desde que abaixo de 60c.

A limpeza das superfcies dos equipamentos deve seguir as instrues do fabricante, o

qual recomenda por vezes, a sua prpria soluo de limpeza e descontaminao. Evitar as
solues de hipoclorito de sdio nas partes metlicas devido sua aco corrosiva. As
solues mais indicadas so geralmente de lcool a 70%. O uso de toalhetes de papel
embebidos na soluo desinfectante indicada pode ser uma soluo prtica.

Devem seguir-se todas as recomendaes de segurana no que se refere ao

equipamento, preconizadas no manual de segurana do laboratrio.

Leitura recomendada para informao mais detalhada sobre manuteno e controlo de

equipamentos: captulo n. 12 de Clinical Microbiology Procedures Handbook 1992,
ASM.

170

1.3. MONITORIZAO DOS MEIOS DE CULTURA E REAGENTES

1.3.1. MEIOS de CULTURA
Dos meios de cultura (comercializados ou preparados no prprio LM) esperam-se as seguintes
caractersticas:
Esterilidade
e
Propriedades nutritivas para permitir o desenvolvimento microbiano
e/ ou
Propriedades de selectividade ou inibio para determinados microrganismos
e/ou
Capacidade para manifestar uma resposta bioqumica apropriada.
Meios preparados no LM
Se os meios de cultura forem preparados no prprio laboratrio a partir de materiais
desidratados que tm de ser reconstitudos, aquecidos e por vezes suplementados com
aditivos, essencial controlar o efeito de cada um desses passos. Todos os lotes antes de
serem utilizados, tm que ser testados quanto a:
1. Esterilidade do Meio (testes de esterilidade)

Uma amostra representativa de cada novo lote incubada 18-24h a 35-37C, e mais
24h temperatura ambiente (para excluir a contaminao com bactrias psicrfilas).
Para lotes de 100 unidades ou menos, uma amostra representativa deve ser no mnimo
de 5% das unidades; para lotes maiores 10 unidades escolhidas ao acaso suficiente.

A contaminao dos meios selectivos pode no ser detectada pelos testes habituais de
esterilidade mas se forem dissolvidos alguns mililitros do produto final em 10 vezes o
seu volume de caldo estril (para diluir as substncias inibidoras) detecta-se qualquer
eventual contaminao.

Se os testes de esterilidade mostrarem contaminao o respectivo lote no deve ser

usado.

As amostras usadas nos testes tm que ser descartadas no podendo ser reutilizadas
(devido desidratao).

2. Comportamento do Meio

A capacidade para proporcionar o desenvolvimento microbiano ou exibir determinadas

qualidades selectivas e/ou diferenciais testada com o recurso a estirpes de controlo.
Ver quadro n. 5.

Sempre que aplicvel e possvel, podem utilizar-se as estirpes descritas no quadro n.

2 como estirpes controlo. No entanto, estirpes selvagens isoladas no prprio LM,
depois de bem caracterizadas, de preferncia em laboratrio de referncia, podem ser
conservadas e utilizadas no CQ.

171

As estirpes de controlo podem alterar as suas caractersticas quando so mantidas em

subculturas sucessivas, prefervel manter as estirpes congeladas a 70 C ou
liofilizadas.

2.1. Testes para a Capacidade de Desenvolvimento

Semear os meios a testar com um inculo leve e incubar nas mesmas condies em que
vo ser utilizados por rotina.

Para obter um inculo leve, fazer uma suspenso da estirpe de controlo apropriada com
densidade de 0.5 de McFarland; diluir esta suspenso de 1/10 ou 1/100 em caldo estril ou
soro fisiolgico.

Inocular os meios a testar com:

1 microlitro - para a diluio de 1/10
10 microlitros - para diluio de 1/100

A inoculao nos meios slidos pode fazer-se com ansa calibrada.

2.2. Testes para a Capacidade de Inibio ou Selectividade

Os meios selectivos so concebidos no s para permitir o desenvolvimento de alguns

microrganismos, mas tambm para inibir o crescimento de outros e por isso devem ser
testados com 2 tipos de estirpes controlo, um cujo desenvolvimento esperado e outro
cuja inibio esperada:

Inocular pelo menos um microrganismo para testar as caractersticas de desenvolvimento e

um microrganismo para testar/confirmar as caractersticas inibitrias.

Para se demonstrar o efeito inibitrio semear os meios a testar com um inculo forte e
incubar nas mesmas condies em que vo ser utilizados por rotina.

O inculo utilizado deve ser forte: suspenso bacteriana com densidade de 0.5 de
McFarland Inocular os meios a testar com 10 microlitros.

2.3. Testes para a resposta Bioqumica (caractersticas fenotpicas)

Para cada resposta esperada especfica (por exemplo fermentao de hidratos de carbono,
produo de SH2, produo de indol, etc.) tem que se inocular um microrganismo
apropriado que produza a desejada reaco.

Deve usar-se pelo menos um microrganismo como controlo positivo, que produz a reaco
esperada e um microrganismo como controlo negativo, que no produz a reaco
esperada.

Os meios diferenciais (com indicadores bioqumicos) tambm so testados com 2 tipos de

estirpes controlo: um que se sabe demonstrar resposta positiva e outro que se sabe
demonstrar resposta negativa.

Os laboratrios que preparam os seus prprios meios tm que arranjar uma forma prtica
mas segura para os rotular com indicao do n. de lote, data de preparao e data de
validade - expirao.

172

Os contentores de meios desidratados usados no laboratrio devem ter registada a sua

data de abertura ( a sua composio e prazo de validade geralmente j fazem parte do
rtulo comercial).

O prazo de validade dos meios preparados no prprio LM varivel e o LM deve informarse disso, mas de um modo geral:

Os meios em placa duram cerca de:

- 15 dias - se conservados a 4c
- 4-6 semanas - se conservados a 4c, em sacos de plstico fechados
Os meios em tubo duram cerca de :
- 2 semanas - se conservados temperatura ambiente
- 4 semanas - se conservados a 4c, com rolhas arejadas (de algodo)
- 6 meses - se conservados a 4c e fechados hermeticamente
Meios Comercializados prontos-a-usar:

Actualmente, a maioria dos laboratrios usa meios de cultura comercializados cuja

Qualidade controlada pelo prprio fabricante ou entidade autorizada.

O LM deve ter a documentao, fornecida pelo fabricante/vendedor comprovativa de que o

meio de cultura adquirido (comprado) est conforme o protocolo de CQ recomendado pelas
autoridades ou entidades de sade de cada pas. Esta documentao muitas vezes faz
parte da bula.

O utilizador no necessita de repetir o protocolo de CQ, excepto no que se refere

verificao se o meio no est desidratado, hemolisado, contaminado ou fracturado, ou
ainda sempre que se verifique algum mau funcionamento de qualquer dos meios em
utilizao nas condies de rotina do laboratrio. Nestes casos o CQ faz-se segundo um
esquema idntico ao descrito para os meios preparados no prprio laboratrio

1.3.2. REAGENTES

Todos os reagentes em uso, quer de origem comercial quer preparados no prprio

laboratrio, devem estar rotulados quanto sua composio, data de preparao (ou
abertura) e prazo de validade.

Os reagentes de origem comercial devem ser conservados de acordo com as instrues do

fabricante, descartados quando fora do prazo de validade, e sujeitos a CQ preconizado
pelo fabricante.

Todos os reagentes em uso, quer de origem comercial quer preparados no prprio

laboratrio, devem ser testados regularmente com pelo menos uma testemunha positiva e
uma testemunha negativa; esta periodicidade varivel de acordo com cada reagente e
deve ser estabelecida pelo Microbiologista responsvel (Quadros n. 6 e n. 7).

Os kits de identificao microbiana de origem comercial, so geralmente constitudos por

uma coleco mais ou menos extensa de testes miniaturizados, pelo que o seu CQ tem
que demonstrar que todos os testes esto a funcionar correctamente quer isoladamente
quer no seu conjunto; assim quase sempre necessrio recorrer a vrias estirpes de

173

controlo (e no apenas a uma testemunha positiva e outra negativa). As estirpes de

controlo a utilizar devem ser indicadas pelo fabricante (muitas vezes so estirpes descritas
no Quadro n. 3).

Leitura recomendada para informao mais detalhada sobre monitorizao dos meios de
cultura e reagentes: captulo n. 13 de Clinical Microbiology Procedures Handbook
1992, ASM.

AVALIAO DA QUALIDADE ( AQ)

Tambm denominada avaliao da proficincia, avaliao do desempenho ou controlo de

Qualidade externo da Qualidade, embora a sua origem possa ser externa ao LM ou no. A
Avaliao da Qualidade consiste na avaliao do desempenho do LM atravs da anlise dos
resultados obtidos/ emitidos nos exames de material de controlo, realizados da forma e nas
condies habituais de funcionamento.

Na prtica, a avaliao da Qualidade consiste num sistema em que amostras de contedo

conhecido mas no revelado, so introduzidas no laboratrio para serem examinadas
exactamente da mesma forma que so examinadas na prtica habitual do laboratrio as
amostras semelhantes dos doentes/utentes. Os resultados obtidos so depois comparados
com os resultados esperados e que no tinham sido revelados.

Esta avaliao do desempenho pode ser Externa ou Interna:

1. Na Avaliao Externa h uma entidade externa ao LM que regularmente envia as
amostras controlo para serem examinadas e procede avaliao dos resultados.
2. Na Avaliao Interna o prprio LM que cria amostras de controlo, por exemplo a
partir de material biolgico. Essas amostras so examinadas no prprio LM em tempos
diferentes ou por tcnicos diferentes, comparando-se depois a fiabilidade e
reproductibilidade dos vrios resultados obtidos, ou ento essas amostras so
enviadas para um laboratrio de referncia para posterior comparao dos resultados.

Todos os LM devem estar envolvidos em Programas de avaliao da Qualidade de acordo

com o respectivo grau de especializao (Bacteriologia geral, Micobacteriologia, Micologia,
Parasitologia, Biologia molecular, etc.)

Devido sua complexidade e diversidade em relao s outras reas da medicina

laboratorial, torna-se muito difcil produzir materiais de controlo que abranjam todas as
reas da microbiologia; alm disso existem vrias dificuldades tcnicas na preparao de
amostras para a AQ (ex.: manter a viabilidade dos microrganismos, conseguir a
uniformizao de todas as amostras, conseguir a simulao de amostras reais, etc.) por
isso, quase sempre mais fcil e mais econmico participar num Programa j em
funcionamento (p.ex.: NEQAS) do que estar a criar o seu prprio Programa.

174

INDICADORES ou SONDAS de QUALIDADE

Actualmente uma das formas mais recomendadas para avaliar a Qualidade global dos
servios de sade, incluindo a Medicina Laboratorial atravs da comparao de
indicadores de desempenho com padres/objectivos/especificaes considerados
desejveis.

Um indicador (tambm chamado sonda ou monitor) uma varivel mensurvel relacionada

com algum aspecto da prestao de cuidados (servios).

Devem escolher-se indicadores teis, capazes de fazer a discriminao entre um sistema

que est a funcionar bem e outro com deficincias.

importante compreender que os indicadores mais teis podem requerer acesso a

informao que no est facilmente disponvel no laboratrio por exemplo o processo
clnico do doente/utente.

No Quadro n. 8 mostram-se alguns indicadores apropriados para a prtica da

microbiologia.

175

QUADRO n. 1 - FUNES DO PESSOAL Programa de GARANTIA de QUALIDADE

CARGO / ORGO

Conselho de Administrao

Director do Laboratrio
( Servio de Patologia Clnica )

Director Clnico

Director / Responsvel do LM

Microbiologista e Tcnicos de
microbiologia

FUNO
Liderar e apoiar o Programa de melhoria de
Qualidade da Instituio.
Designar o pessoal e distribuir os recursos destinados
s actividades do Programa de melhoria de
Qualidade.
Delinear os objectivos/metas do Servio, rever os
procedimentos, interpretar os resultados do Programa
externo de Qualidade.
Fazer a ligao com as outras unidades funcionais da
Instituio.
Rever e aprovar as polticas e procedimentos
necessrios para se conseguir atingir as metas
traadas num Programa de melhoria de Qualidade.
Implementar procedimentos e gerir a informao de
acordo com os objectivos/metas do Programa de
Garantia de Qualidade.
Providenciar junto do Director, recomendaes para
melhorar produtos e servios.
Participar na monitorizao e avaliao dos servios
laboratoriais.
Providenciar recomendaes para melhorar produtos
e servios.

QUADRO n. 2 - ESTIRPES PADRO indicadas para CONTROLO de ATMOSFERA DE

INCUBAO
Tipo de Atmosfera

Estirpe controlo

Comentrio

Atmosfera de CO2
(5-10%)

N. gonorrhoeae ATCC
43069

Pode utilizar-se uma estirpe

CO2 dependente isolada no
prprio LM

Atmosfera de microaerofilia
(10% CO2, 5% O2 e 85% de N2 )

C. jejuni ATCC 33291

Atmosfera de anaerobiose
(5% Hidrognio, 10% CO2 e 85%
de N2)

Clostridium novyi A ATCC

19402
Fusobacterium nucleatum
ATCC 25586

176

QUADRO n. 3 - ESTIRPES-PADRO indicadas para os TESTES de SUSCEPTIBILIDADE

aos ANTIMICROBIANOS

MICRORGANISMO

S. aureus (sensvel aos AM habitualmente

testados)
E. faecalis (sensvel aos AM
habitualmente testados)
P. aeruginosa (sensvel aos AM
habitualmente testados)
E. coli (sensvel aos AM habitualmente
testados)
S. aureus ( resistente Meticilina)
E. faecalis (resistente Vancomicina e
Aminoglicosidos alta concentrao)
K. pneumoniae ( produtora de
lactamases de espectro expandido)

Mtodo de
diluio
(NCCLS)
ATCC 29213
(produtora de lactamase)
ATCC 29212
ATCC 27853
ATCC 25922
ATCC 43300

Mtodo de
difuso
(NCCLS)
ATCC 25923
NCTC 12981
(no produtora
de -lactamase)
ATCC 29212
NCTC 12697
ATCC 27853
NCTC 12934
ATCC 25922
NCTC 12241
NCTC 12493

Mtodo de
difuso
comparativo
(Stokes)

Comentrios

NCTC 6571

ATCC 29213 pode ser usada como controlo positivo e

a ATCC 25923 como controlo negativo nos testes de
produo de lactamase

NCTC 12697

Para testar o contedo do meio em antagonistas do

Trimetoprim-Sulfametoxazol

NCTC 10662
NCTC 10418

ATCC 51299
ATCC 700603
ATCC 35218
NCTC 11954
NCTC 11560
ATCC 49619
NCTC 12977
NCTC 12140
ATCC 49766
ATCC 49247
NCTC 12699

E. coli
( produtora de lactamase)

ATCC 35218

S.pneumoniae
(sensibilidade intermdia Penicilina)

ATCC 49619

H. influenzae

ATCC 49766

H. influenzae

ATCC 49247

H. influenzae

ATCC 10211

ATCC 10211

N. gonorrhoeae

ATCC 49296

ATCC 49296
NCTC 12700

Para testar os inibidores da lactamase

Mtodos de difuso em Mueller-Hinton com sangue
NCTC 11913

Para testar Cefalosporinas de 1 e 2 G (orais)

Para testar antimicrobianos em geral excepto
Cefalosporinas de 1 e 2 G (orais) no meio HTM.
Para testar meio de HTM, especialmente indicado para
os fabricantes

NCTC 12700

Mtodos de difuso em meio de GC

177

QUADRO n. 4 - CONTROLO e MANUTENO dos EQUIPAMENTOS

FREQUNCIA
EQUIPAMENTO
Estufas de incubao
aerobiose
Estufas de incubao
CO2

Jarras de CO2

Jarras de microaerofilia

Cmara de
Anaerobiose

Jarras de
anaerobiose

Diria ou em cada
utilizao ou em cada
lote
Registo da temperatura
Registo da temperatura
Verificar presso de CO2
(5-10%)
Subcultura de estirpe de N.
gonorrhoeae ATCC 43069
Limpeza com gua e
detergente
Subcultura de estirpe de N.
gonorrhoeae ATCC 43069
Limpeza com gua e
detergente
Subcultura de estirpe de C.
jejuni ATCC 33291
Verificar temperatura e
presso de gs
Usar indicador redox: azul
de metileno ou resazurina.
Reactivar o catalisador
(aquecer 2h a 160C) se
aplicvel
Limpeza com gua e
detergente. Usar um
indicador (azul de metileno
/resazurina). Reactivar o
catalisador (aquecer 2h a
160C) se aplicvel

Semanal

Mensal

Verificar humidade
(40-50%)

Limpeza

Reviso anual

Limpeza
Verificar humidade

Testar com
dispositivo de
Fyrite

Reviso anual
Verificar ventoinha
e contaminao
com fungos

Verificar
humidade.
Limpeza e
descontaminao
com cloreto de
Benzalkonium

Reviso anual

Limpeza

Reviso anual

Verificar se paredes e
tampa esto
deterioradas (substituir
se necessrio)
Verificar se paredes e
tampa esto
deterioradas (substituir
se necessrio)
Cultura controlo de
Clostridium novyi A
ATCC 19402

Verificar se paredes e
tampa esto
deterioradas (substituir
se necessrio)
Testar indicador
biolgico- Bacillus
stearothermophilus
Verificar vlvulas de
segurana.

Autoclaves

Verificar registos de
Temperatura

Centrfugas

Controlo do equilbrio
Limpeza

Frigorficos

Verificar temperatura

Limpeza e
descontaminao

Microscpios

Retirar leo de
imerso.Cobrir para
proteger do p.

Limpeza das
lentes e platina

Equip.autom.
identificao
microbiana e
antibioGrama
Equipamentos
automatizados
Hemoculturas
Cmaras de segurana

Colorador de laminas

Segundo indicaes do
fabricante
Segundo as indicaes do
fabricante

Segundo indicaes
do fabricante. Controlo
com estirpes de
referncia
Segundo as
indicaes do
fabricante

Verificao do fluxo de
ar.Limpeza com lcool 70
Limpeza das superfcies.
Filtragem e reposio dos
corantes

Peridica
(por pessoal
especializado)

Limpeza das cuvettes.

Renovao dos
corantes

Reviso anual
Teste com
tacmetro
Reviso anual
Descongelar bianual
Reviso anual
Limpeza,
lubrificao e
realinhamento

Segundo
indicaes do
fabricante

Reviso anual

Segundo as
indicaes do
fabricante

Reviso anual
Verificar integridade
dos filtros HEPA e o
fluxo do ar bianual
Reviso anual

(Alguns dos intervalos entre revises so da responsabilidade dos autores deste trabalho)

178

QUADRO n. 5 - CONTROLO do COMPORTAMENTO dos MEIOS de CULTURA

Meio de cultura
Gelose-sangue
( 24h aerobiose)

Estirpes de
controlo

Incubao

Resultados esperados

S. pyogenes

24h aerobiose

Desenvolvimento: colnias com -hemlise

H. influenzae
N. gonorrhoeae
E. coli
P. mirabilis
N. gonorrhoeae
E. coli
S. epidermidis
Candida spp
C. jejuni
E. coli
E. aerogenes
E. coli
S. typhimurium
E. coli
P. mirabilis
P. aeruginosa

24h aerobiose
24h CO2

24h aerobiose

Desenvolvimento
Desenvolvimento
Desenvolvimento: colnias rosadas
Desenvolvimento: colnias incolores
Desenvolvimento
Sem desenvolvimento
Sem desenvolvimento
Sem desenvolvimento
Desenvolvimento
Sem desenvolvimento
Desenvolvimento: colnias rosadas
Sem ou escasso desenvolvimento
Desenvolvimento: colnias incolores com centro negro
Rampa pH cido e base pH cido, com gs, sem SH2
Rampa pH alcalino e base pH cido, com gs, com SH2
Rampa pH alcalino e base pH alcalino, sem gs, sem SH2

F. necrophorum
C perfringens
S. pneumoniae

At s 48 h
anaerobiose
24h aerobiose

Desenvolvimento
Desenvolvimento: colnias com dupla zona de hemlise
Desenvolvimento

B. fragilis

24h anaerobiose

Desenvolvimento

Thioglicolato, BHI ou
outros

B. fragilis
S. aureus
S. pyogenes

24h anaerobiose

Desenvolvimento
Desenvolvimento
Desenvolvimento

Caldo de Selenito,
Tetrationato ou GN

S. typhimurium
E. coli

12h aerobiose

Desenvolvimento na subcultura
Sem ou com escasso desenvolvimento na subcultura

Caldo de ureia
(produo de urease)

P. vulgaris
E. coli

4-6h aerobiose

Positivo: mudana para cor rosa forte

Negativo: sem mudana de cor ou cor amarela

Gelose-chocolate
MacConkey
Thayer-Martin
(selectivo para N.
Gonorrhoeae)
Gelose selectiva para
Campylobacter
Gelose SS

Kligler ou TSI
Gelose-sangue para
anaerbios
Caldo de hemocultura
para Aerbios
Caldo de hemocultura
para Anaerbios

24h aerobiose
24h CO2
48h microaerofilia
24h aerobiose

24h aerobiose

Colnias rosadas -FL

Colnias incolores - NLF

pH cido: cor amarela

pH alcalino: cor rosa-vermelho
SH2: cor negra
Gs: bolhas de ar ou meio
fracturado

A subcultura deve fazer-se 12h

aps a inoculao.

179

QUADRO n. 6 - CONTROLO de REAGENTES

Reagente

Catalase
(H2O2)
Coagulase
(plasma)
Indol

Microrganismo
S. aureus

Positiva : borbulha

Streptococcus spp

Negativa : no borbulha

S. aureus

Positiva: formao de cogulo

em 4h
Negativa: ausncia de cogulo
Positiva: formao de anel
vermelho superfcie em 24h.
Negativa: formao de anel
amarelo superfcie
Positiva: cor prpura em 10-30
segundos.
Negativa: sem cor em 10-30
segundos

S. epidermidis
E. coli
E. aerogenes
P. aeruginosa

Oxidase
Factores de
crescimento:
Discos de X,
V, XV
Optoquina
(disco)
Discos
impregnados
de antibitico

(para TSA difuso)

Colorao de
Gram
Colorao de
Kinyoun
e ZiehlNeelsen

Reaco esperada

E. coli
H. influenzae

Crescimento volta do disco XV,

em 24 h

S. pneumoniae

Sensvel em 24h = halo de

inibio de 19 mm
Resistente = sem zona de
inibio.

S. viridans
Estirpes ATCC
indicadas no captulo
TSA

Halo de inibio com dimetro

dentro dos limites esperados
(tabela NCCLS )

S. aureus

Gram positivo: cor azul escuro

(cocos em cacho)
Gram negativo: cor vermelhorosado (bastonetes)

E.coli
M. gordonae

Bacilos vermelho-rosados sobre

um fundo azul

M. gordonae

Positiva: bacilos com

fluorescncia amarela
Negativa: bacilos azuis no
fluorescentes

(cido-alcoolresistente)

Colorao de
fluorescncia
(cido-alcoolresistente)

Kits de
identificao
de origem
comercial

Streptomyces spp

Estirpes de controlo
indicadas pelo
fabricante

De acordo com indicaes do

fabricante

Comentrio
Usar H2O2 a 3%
O teste tambm
pode fazer-se com
uma gota de
sangue

O teste em spot
pode ser controlado
da mesma forma

As tabelas so
actualizadas
periodicamente

Os laboratrios de
nvel de segurana
2 podem usar M.
tuberculosis.

As estirpes de
controlo so quase
sempre estirpes de
coleco
conhecidas

180

QUADRO n. 7 - FREQUNCIA do CONTROLO de REAGENTES

Reagente

Frequncia do controlo

Reagentes qumicos:
catalase, coagulase, indol,
oxidase, etc

Cada vez que se abre novo frasco e depois em cada dia de

utilizao

Discos de optoquina, discos

de factores de crescimento

Cada vez que se abre novo frasco e depois semanalmente

Discos impregnados de
antibitico
(para TSA difuso)

Cada vez que se inicia novo lote e depois semanalmente

Soros para deteco de

antignios (antisoros de
identificao)

Cada vez que abre um frasco novo e depois mensalmente

Colorao de Gram,
Kinyoun, Ziehl-Neelsen

Cada vez que se utiliza novo lote ou frasco e depois

semanalmente

Colorao de fluorescncia

Cada vez que se utiliza novo lote ou frasco e depois em cada

utilizao

Kits de identificao de
origem comercial

Cada novo lote

181

QUADRO n. 8 - INDICADORES ou SONDAS de QUALIDADE

Procedimento/
Amostra

Objectivo

Indicador

Hemoculturas

Utilizao
adequada

Hemoculturas isoladas ou
> 3 hemoculturas/ 24h

Hemoculturas

Colheita correcta

Hemoculturas contaminadas

Expectorao

Colheita
apropriada

Esfregao corado pelo Gram:

> 25 clulas epiteliais por
campo 10
Uma nica colheita para pesquisa de BAAR

Anlise
Determinar a prevalncia e as razes de hemoculturas
isoladas ou em n. excessivo
Determinar a % de contaminantes, taxa por servios, etc.
Rever os procedimentos quando verificada uma taxa muito alta
Determinar a % global e por servios, de amostras
de m Qualidade. Interveno educativa quando detectada
uma % muito elevada
Determinar a % global e por servios.
Determinar as razes de uma nica colheita
Rever as discrepncias e as razes da incorrecta interpretao
Do Gram.
Determinar o n. de amostras com volume insuficiente. Calcular
a sua % global e por servios.
Rever os procedimentos quando verificada uma taxa muito alta
Determinar o n. de contaminantes e a % global e por servios.
Verificar se a deficincia do laboratrio ou da colheita.

Expectorao

Utilizao
adequada
Interpretao
correcta do Gram

Liquor (LCR)

Colheita
apropriada

Volume suficiente para os exames requisitados

Liquor (LCR)

Colheita
apropriada

Culturas contaminadas

Liquor (LCR)

Utilizao
adequada

Requisio para serologia da sfilis, pesquisa de

antignio criptoccico ou culturas para micobactrias
quando o exame citoqumico normal

Liquor (LCR)

Utilizao dos
resultados

Instituio de teraputica face ao resultado preliminar

do Gram

Urina

Colheita
apropriada

Culturas com 2 agentes

Urina

Utilizao
adequada

Repetio de colheitas no mesmo doente

AntibioGrama
(TSA)

Utilizao dos
resultados

Correlao da teraputica antimicrobiana com o TSA

Determinar a % de tratamentos adequados e tratamentos

discrepantes. Notificar imediatamente o mdico assistente.

AntibioGrama
(TSA)

Utilizao dos
antimicrobianos

Taxa cumulativa dos perfis de susceptibilidade aos

AM

Publicitao dos dados para as decises de teraputica emprica.

Reviso dos dados com fins epidemiolgicos,
ex. : tendncias de resistncia.

Expectorao

Correlao entre a observao do Gram e os

resultados da cultura

Determinar a % de resultados positivos e a razo dos pedidos.

Desenvolver um algoritmo para a requisio dos exames.
Determinar a % de doentes tratados com antibitico em
funo do resultado positivo do Gram
( dever ser 100% nos casos inequvocos)
Determinar a % global e por servios (no dever ser > 5%)
Determinar a razo do problema: colheita incorrecta?,
atraso no transporte?, etc.
Determinar a razo de > 2 colheitas/semana.
Infeco suspeita ou confirmada?.

182

Bibliogragia principal (QUADRO N. 8):

Raymond C. Bartlett. MEDICAL MICROBIOLOGY quality cost and clinical relevance: John
Wiley& sons, 1974.
JJS Snell, ID Farrel, C Roberts. QUALITY CONTROL principals and practice in microbiology
laboratory: PHLS, 1992.
Henry D. Isenberg . Clinical Microbiology procedures Handbook: ASM, 1992.
RC Bartlett, MMSulivan, JZ Tetreault, S Lobel, J Nivard. Evolving approaches to management
of Quality in Clinical Microbiology. 1994. Clin Microbiol. Rev. 7: 55-88.
JJS Snell, DFJ Brown, C Roberts. QUALITY CONTROL - principals and practice in
microbiology laboratory: PHLS, 1999.
NCCLS. Performance and standards for antimicrobial susceptibility testing, 2002.

183

O LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA NA VIGILNCIA

EPIDEMIOLGICA DAS INFECES

Os dados de rotina do laboratrio constituem o ponto de partida da maioria dos mtodos de
vigilncia epidemiolgica das infeces nosocomiais. Por outro lado, o laboratrio
solicitado, com alguma frequncia, a realizar estudos microbiolgicos para outros fins que no
o de diagnstico de infeco. O contributo da Microbiologia no Controlo de Infeco abrange as
seguintes reas:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Identificao correcta e atempada dos agentes de infeco

Vigilncia das resistncias aos antimicrobianos
Procedimentos especficos para caracterizao de estirpes
Investigao de surtos
Culturas para vigilncia de doentes e de pessoal
Culturas para vigilncia do ambiente

CONSIDERAES GERAIS
A. Um aspecto fundamental que deve ser tido em considerao quando o laboratrio fornece
informao para fins epidemiolgicos a distino entre n de agentes isolados e n de
doentes/infeces. A anlise de resultados globais ou de isolamentos leva a distores
significativas pelo que, para alm da excluso de isolamentos repetidos no mesmo doente,
deve haver uma poltica clara sobre a incluso de estirpes isoladas em infeces da
comunidade versus infeces nosocomiais por um lado e, por outro, a excluso de
duplicados (quando se considera um isolamento uma mesma infeco).
B. Do ponto de vista do estudo de resistncias e dadas as limitaes dos mtodos
automatizados, o laboratrio deve ter a possibilidade de executar mtodos manuais para
confirmao epidemiolgica de resistncias.
C. Finalmente, considerando a necessidade de estudos suplementares ou tipagem de estirpes
deve ser definida uma poltica para conservao de culturas iniciais em casos de
microrganismos resistentes ou outros microrganismos alerta e a conservao de estirpes
multirresistentes especficas consideradas endmicas ou nosocomiais dando origem a
surtos.
No estando no mbito deste captulo abordar os aspectos relacionados com a actividade de
rotina do laboratrio iremos considerar apenas os aspectos da colaborao do laboratrio na
investigao de surtos, culturas de vigilncia de doentes e profissionais, esclarecimento das
contaminaes ambientais nomeadamente de superfcies, do ar e dispositivos mdicos.

INVESTIGAO de SURTOS
Um surto definido como o aparecimento de um nmero de casos de uma infeco
superior ao habitual. A nvel hospitalar e quando se refere, por exemplo, a microrganismos

184

multirresistentes, um surto o isolamento, em dois ou mais doentes, da mesma estirpe

multirresistente.
A investigao de surtos necessria para os controlar e evitar novos surtos, para melhorar os
conhecimentos no que se refere ao hospedeiro, ao agente e suas inter-relaes no ambiente,
para avaliar ou iniciar um sistema de vigilncia e ainda para desenvolver aces educativas no
terreno.
So as seguintes as etapas de uma investigao de surto:
1. Identificao do problema

Comprovar a existncia de surto excluindo os falsos surtos devidos mudana de

tcnicas laboratoriais ou de rotinas de requisio de exames devido a novos
profissionais ou novos servios.

Confirmar o diagnstico recorrendo aos isolamentos microbianos, serologia, etc. (

suficiente a confirmao de mais ou menos 20% dos casos)

2. Caracterizao do surto

Definir e contar os casos: recorrer a critrios simples tendo em conta a definio

habitual de infeco trata-se de uma definio epidemiolgica e no clnica. No caso
de microrganismos multiresistentes deve-se distinguir infeco da colonizao.

Calcular a taxa de ataque.

Organizar os dados em funo de tempo (curva epidemiolgica) local e pessoas

3. Identificao das causas e resoluo da situao

Determinar a populao de risco

Formular/testar uma hiptese: veculo comum ou transmisso directa ou indirecta?

pessoa a pessoa ou por vector?

Comparar a hiptese com os factos. Deve haver concordncia entre dados clnicos,
laboratoriais e epidemiolgicos.

Aprofundar o estudo para precisar melhor os pormenores da via de transmisso,

veculos e dose infectante e para definir melhor os grupos de risco e outros factores
pertinentes.

Redigir o relatrio

Recomendar e implementar as medidas de controlo e preveno

Em diversas destas etapas necessria a interveno do laboratrio nomeadamente atravs

de Tipagem de estirpes, estudos em doentes, no pessoal ou no ambiente.

185

TIPAGEM DE ESTIRPES

A investigao de surtos muitas vezes requer o reconhecimento e diferenciao da

estirpe causal. Se se trata da mesma estirpe (clone) pode-se inferir tratar-se de uma
fonte ou reservatrio comum ou de transmisso de pessoa a pessoa. Tradicionalmente
as estirpes epidmicas tm sido caracterizadas, recorrendo a mtodos fenotpicos,
por gnero, espcie, biotipo, fagotipo, produo de bacteriocina e susceptibilidade aos
antimicrobianos. Os mtodos fenotpicos reflectem caractersticas genticas e so
geralmente bastante especficas. Contudo, so influenciados pela presso selectiva
ambiental, instabilidade de algumas das caractersticas, e pelo facto de os padres de
resistncias aos antimicrobianos serem fortemente influenciados pelas prticas na
utilizao de antibiticos.

Por isso, torna-se por vezes necessrio recorrer aos mtodos genotpicos com
anlise de DNA cromossmico ou plasmdico que pode dar informao mais rigorosa.
Os diversos mtodos disponveis devem ser seleccionados de acordo com o
microrganismo implicado e torna-se quase sempre necessrio recorrer ao exterior para
este tipo de estudos.

Mtodos para a vigilncia microbiolgica de pessoal e doentes

A vigilncia microbiolgica de profissionais e/ou doentes apenas deve ser iniciada em
situaes bem definidas de surto. Em casos muito especficos e previamente definidos
pode ser necessrio fazer culturas de vigilncia em doentes imunodeprimidos. importante
salientar que estes estudos devem ter uma abordagem diferente das culturas para fins
diagnsticos. necessrio identificar todos os microrganismos presentes e a quantificao
desejvel. Por isso, a maioria dos autores no recomenda a vigilncia de doentes a no
ser em situaes de surto, em que se procura um agente especfico.
1. Os locais a cultivar dependero do microrganismo suspeito:

Staphylococcus aureus : colheitas no nariz, axilas, mos e perneo. Ter presente

que 30% de adultos podem ser portadores de S. aureus. essencial confirmar
que se trata da mesma estirpe. Um aspecto importante a ter em conta a presena
de situaes que podem favorecer a disseminao (dermatite, leses nasais e
paronquia).

Streptococcus beta hemoltico do grupo A : colheita da orofaringe e em

situaes especiais do anus ou vagina.

Enterobacteriaceae e Enterococcus: colheita por zaragatoa rectal

2. Mtodos para colheitas das mos dos profissionais: so geralmente efectuadas para
estudar a contaminao/colonizao com microrganismos implicados em surtos a fim de
identificar possveis vias de transmisso cruzada.

Humedecer zaragatoas estreis com soro fisiolgico ou BHI e friccionar na superfcie

palmar de ambas as mos. Semear em meio apropriado de acordo com o microrganismo a
pesquisar e incubar 24 horas a 37C.

186

Alternativa 1: colocar 50ml de BHI num saco estril. Friccionar as mos dentro do lquido
durante 1minuto. Semear e incubar conforme indicado.

Alternativa 2: Pressionar a face palmar da mo sobre a superfcie da placa. Incubar as

placas conforme indicado.

Interpretao dos resultados: como o objectivo encontrar um microrganismo especfico a

interpretao fcil devendo ser seleccionados os meios de cultura selectivos que facilitem o
isolamento do agente pretendido.

Para fins educativos podem-se fazer colheitas por impresso das polpas dos dedos,
incluindo o polegar, numa placa de gelose. um mtodo quantitativo e no h
indicao para identificao dos microrganismos encontrados. O limite aceitvel para
mos limpas de menos de 5 ufc/dedo.

VIGILNCIA MICROBIOLGICA DO AMBIENTE

Inclui o estudo de superfcies (clnicas e domsticas), ar e gua. A monitorizao

ambiental deve ser planeada cuidadosamente porque constitui um acrscimo de
custos, no existem padres validados para comparao podendo-se gerar dados
inconclusivos levando implementao de procedimentos desnecessrios.

Actualmente recomenda-se a monitorizao sistemtica de processos de esterilizao,

gua e lquidos utilizados em hemodilise, bancos de leite materno, rgos de transplante
e cmaras de fluxos laminares. Estes estudos tm sistemas prprios ou so efectuados em
laboratrios especializados no sendo funo dos laboratrios de microbiologia
hospitalares.

As situaes especiais onde pode ser solicitada a colaborao do laboratrio so a

investigao epidemiolgica para identificar reservatrios ou fontes ou, por vezes, quando
se pretende provar a eficcia de um mtodo de limpeza ou desinfeco. Poder envolver
dispositivos mdicos, ar, gua e outros fluidos, alimentos e superfcies.

Consideraes gerais

Nunca se deve iniciar estudos do ambiente antes de se decidir de forma clara o objectivo
pretendido, os critrios para avaliao dos resultados e as aces a tomar face aos
resultados obtidos.

Deve-se iniciar por uma reviso dos resultados dos ltimos meses a fim de identificar
padres ou situaes de aparecimento do agente em estudo. Dada a especificidade dos
locais e mtodos de colheita em funo do agente suspeito, recomenda-se uma reviso
bibliogrfica prvia para orientao.

Os estudos epidemiolgicos devem ser feitos por solicitao e com a colaborao da

CCIH. Antes de iniciar o estudo, deve-se elaborar conjuntamente um plano escrito com
descrio clara dos locais, nmero, mtodos e frequncia de colheitas, definir se se trata
de um estudo qualitativo e/ou quantitativo, os mtodos de processamento, tempo e
condies de incubao e critrios de leitura dos resultados e intervenes possveis em
funo dos resultados esperados/encontrados.

187

Mtodos de estudo do ambiente

Podem ser estudos qualitativos e/ou quantitativos. Deve-se ter em conta a possibilidade de
falsos negativos devido presena de resduos de desinfectantes, inculos muito
pequenos e microrganismos com exigncias especficas. As colheitas devem ser
efectuadas em condies rigorosas de asspsia.

Nos mtodos quantitativos faz-se uma contagem de colnias. Nos mtodos qualitativos
devem ser seleccionadas para identificao pelo menos duas colnias representativas de
cada tipo morfolgico presente nas culturas.

Os meios de cultura utilizados para anlise quantitativa devem ser nutritivos, no selectivos
(como o BHI ou tripticase soja) com ou sem sangue. Para o estudo qualitativo so
utilizados meios selectivos. Quando indicado, deve-se utilizar um meio para neutralizar
detergentes ou desinfectantes presentes. A seleco do neutralisador depende do
desinfectante residual presente.
Quadro 1: Neutralisadores de desinfectantes qumicos

Glutaraldedo; Formaldedo
Fenlicos
Amnios quaternrios
Cloro; Iodo
Perxido de hidrognio

Glicina
Tween 80
Lecitina + Tween 80
Tiossulfato de sdio
Catalase

Nota: o Tween 80 muitas vezes recomendado como um suplemento para os lquidos usados
para colheitas por lavagem
Os tempos e temperaturas recomendadas para incubao so os seguintes:
Bactrias
Fungos

Tripticase soja

30C +/- 1C
25C +/- 1C

3 dias
5 dias

ESTUDO MICROBIOLGICO DE SUPERFCIES E DISPOSITIVOS

1. Estudo microbiolgico de superfcies: placas de contacto

No um mtodo para estudo da carga biolgica porque apenas recolhe uma pequena
proporo de microrganismos presentes. Avalia a qualidade de higiene de superfcies planas
como cho, mesas, alguns equipamentos e roupas.

Pressionar a superfcie de placas (tipo RODAC) contra a rea a estudar e incubar. So

necessrios um mnimo de 15 placas para uma sala mdia. A incubao deve ser de 48
horas. No deve ser utilizado em superfcies sujas ou hmidas porque o elevado n de ufc
previsto no permitir uma leitura adequada das placas.

Roupa: embora no existam padres para a roupa limpa considera-se que a presena de
menos de 5 ufc por placa constitui um resultado aceitvel.

188

2.

Mtodo de lavagem

Se o artigo o permitir, imergir totalmente a pea em BHI contido num recipiente estril

Retirar e estudar o lquido

Para artigos como nebulizadores ou tubagens de equipamento respiratrio introduzir o

lquido nos canais, agitar e recolher o lquido para estudo

3.

Colheita com zaragatoa

Para superfcies grandes, planas e no absorventes, criar um molde (template) para

delimitar a rea (p.ex. 5cm x 5cm) e friccionar a rea com zaragatoa humedecida em soro
fisiolgico ou BHI. Os moldes so geralmente feitos em cartolina e esterilizados.

Para superfcies irregulares ou com reentrncias: friccionar a zaragatoa de forma repetida

(10 vezes) e consistente de modo a cobrir todas as reas.

A interpretao dos resultados depende dos objectivos do estudo. No caso de dispositivos

mdicos o resultado deve ser analisado em funo de se tratar de material crtico (ausncia
total de microrganismos), semi-crtico ou no crtico (ausncia de agentes patognicos).
Embora no existam padres estabelecidos, tm sido recomendados os seguintes critrios:
0 a 25 colnias
BOM
26 - 50 colnias ACEITVEL
> 50 colnias
MAU

Quadro 2: Principais agentes nosocomiais e suas fontes

Agente
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
P.aeruginosa
B. cepacia
S. maltophilia
Proteus/Morganella
Providencia
Flavobacterium
Citrobacter
Acinetobacter
Staphyloccocus
C. difficile
Legionella
Micobacterias
atpicas

Fonte ambiental
Equipamento de suporte respiratrio
Fluidos IV; gua
Equipamento de suporte respiratrio
gua, desinfectantes, Equipamento de
suporte respiratrio
Reservatrios de gua, equipamento
contaminado
gua
gua
gua
gua, fluidos IV
gua
Equipamento de suporte respiratrio
Superfcies em redor de doentes e
zonas sujas
gua, torres de arrefecimento
gua da torneira, equipamento
respiratrio contaminado

fonte humana
faringe, fezes, urina
mos, fezes, urina
mos, urina
mos, faringe, fezes
urina
mos
mos
mos, urina
mos
mos
mos, secrees respiratrias
mos, nariz
mos, fezes
secrees respiratrias
secrees respiratrias

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ESTUDO MICROBIOLGICO DO AR

O nmero de partculas no ar varia em funo das condies atmosfricas, movimentao

de pessoas, operao de equipamento e materiais em uso. A avaliao microbiolgica do
ar no deve ser iniciada de nimo leve porque a execuo das colheitas e a interpretao
das placas relativamente complexa dada a inexistncia de padres uniformes e o facto
de que as partculas no ar poderem estar livres ou aglomeradas (com vrios
microrganismos) e a probabilidade de as mesmas serem desfeitas ser maior ou menor
conforme os mtodos de colheita.

importante salientar que os dados obtidos so apenas valores indicativos e no valores

absolutos reais. Para se ter uma apreciao global necessrio analisar ao partculas com
0,5 ou maiores.

Os mtodos disponveis para o estudo do ar podem ser activos ou passivos. Nos mtodos
activos existem equipamentos que recolhem, por tcnicas diversas, um volume
estabelecido de ar que contacta com placas contendo os meios de cultura apropriados. Os
resultados no esto padronizados e dependem do volume de ar, a velocidade do fluxo e o
tempo da sua recolha (que so variveis para cada tipo de aparelho) e ainda do nmero de
microrganismos presentes. As exigncias para este tipo de aparelhos so as seguintes:
capacidade de deteco de nveis baixos de contaminao, possibilidade de controlar o
volume do ar, facilidade de manuseamento, de limpeza, desinfeco e esterilizao e
ainda a validao do mtodo.

Os locais de colheita devem ser seleccionados em funo do risco: mesa operatria, mesa
de instrumentao, locais onde h menor circulao do ar. Deve-se fazer duas colheitas de
cada local.

No mtodo passivo mede-se a sedimentao de partculas atravs da exposio de placas

contendo meios de cultura apropriados. No h correlao com os mtodos activos j que
a sedimentao afectada pelo tamanho, forma e velocidade de deposio das partculas
e no possvel controlar o volume de ar estudado. No entanto, constitui um mtodo
simples e barato de avaliao quantitativa, podendo ter indicao nas situaes menos
complexas. A fim de permitir uma padronizao deve-se utilizar placas de 9 cm de dimetro
colocadas a um nvel de 1 metro do cho e afastadas um metro das paredes e expostas
durante 1 hora. A incubao deve ser feita a 37C durante 24 horas.

Fungos - O ar transporta fungos oriundos do solo, ambientes hospitalares hmidos e locais

em obras. Dado a sua ubiquidade, a sua avaliao s interessa em meios controlados
(ambientes com ventilao com filtros HEPA, fluxos laminares, etc.). Nestas situaes o
que interessa a avaliao quantitativa em comparao com ambientes contguos no
controlados. Os resultados permitiro determinar a eficcia do sistema de ventilao e o
seu eventual papel nas infeces em doentes imunodeprimidos.

Apenas se recomenda o estudo de fungos no ar nas seguintes situaes:

1. Infeces nosocomiais atribudas a fungos aerotransportados
2. No decurso de obras na proximidade de servios com neutropnicos
3. Aps a instalao de sistemas de ventilao especiais e antes de ocupao das
respectivas instalaes.
Nos equipamentos de fluxo laminar, blocos operatrios, farmcia etc. deve ser feita por outros
mtodos nomeadamente contagem de partculas e anemmetro.

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ESTUDO MICROBIOLGICO DE LQUIDOS

Existem vrios mtodos para o estudo microbiolgico de lquidos e a seleco de um deles

depende da natureza do lquido (pour plates, spread plates, filtros de membrana).

O estudo microbiolgico da gua requer mtodos especiais pelo que deve ser efectuado
em laboratrios especializados. As amostras devem ter um mnimo de 100 ml e a colheita
deve ser feita com equipamento estril, recomendando-se a adio de um agente redutor
(tiossulfato de sdio) para neutralizar o cloro residual. Antes de efectuar colheitas em
torneiras deve-se deixar correr bastante gua e no caso de torneiras misturadoras, estas
devem ser desmontadas. As amostras devem ser transportadas frias e trabalhadas dentro
de 24 horas.

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Bibliografia
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