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Biotecnologia
As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipulao de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de processos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicao dos conhecimentos de fisiologia, bioqumica e gentica, considerada
como tcnica biotecnolgica. Em seu senso mais restrito as biotecnologias esto associadas ao emprego das tcnicas modernas de biologia molecular e celular. Outros conceitos de biotecnologias: a) a utilizao de sistemas celulares
para a obteno de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a aplicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de
materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos ou servios (FAO,
1989); c) o uso das tcnicas de regenerao in vitro e do DNA recombinante
(Fernandes, 1987).
Uma das principais caractersticas das biotecnologias modernas sua abrangncia ampla e seu carter multidisciplinar. Sua insero em pases com
padres desiguais de desenvolvimento deve ser baseada no conceito de biotecnologias apropriadas ou pertinentes, proposto pela FAO. Assim, biotecnolgias
apropriadas seriam aquelas que contribuem com o desenvolvimento sustentvel por: a) serem tecnicamente factveis no atual contexto de desenvolvimento
tecnico-cientfico do pas; b) proporcionarem benefcios mensurveis aos destinatrios; c) serem ambientalmente seguras, socio-economicamente e culturalmente aceitveis no atual estgio de desenvolvimento do pas.
Dentre as muitas aplicaes destas tcnicas, destacam-se aquelas relacionadas com a transferncia de genes de organismos diferentes para a incorporao
de caractersticas como a resistncia de pragas e patgenos e a estresses abiticos, no genoma de uma determinada planta. Outras aplicaes visam o aumento da eficincia fotossinttica ou a produo de metablitos e constituintes importantes do ponto de vista nutricional e farmacutico . Estas tcnicas, quando
associadas com procedimentos de cultura de tecidos, permitem a propagao
rpida e massal de gentipos superiores estveis e isentos de doenas.
Novas estratgias para a propagao clonal, para a fixao de ganhos genticos e novas abordagens para gerar variao gentica so requisitos fundamentais para o melhoramento de plantas. Desta maneira, um dos maiores benefcios das tcnicas de cultura de tecidos vegetais para o melhoramento de
plantas perenes, refere-se possibilidade de capturar e fixar os componentes
aditivos e no aditivos da varincia gentica atravs da propagao clonal.
Desta maneira estas tcnicas, baseadas que so na totipotencialidade de explantes, podem se tornar ferramentas poderosas para a propagao massal de
gentipos superiores.
A possibilidade de manipulao de sistemas in vitro para a clonagem de
gentipos superiores de espcies vegetais dependente de uma srie de fatores. A compreenso e domnio de conceitos bsicos em fisiologia do desenvolvimento de fundamental importncia para a aplicao deste conhecimento. Um dos objetivos do presente texto a apresentao e a discusso sucinta
dos principais tpicos pelos quais possvel extrair-se respostas morfogenticas orientadas quando correlaes morfolgicas, fisiolgicas, genticas e bioqumicas, existentes em uma planta intacta so rompidas e sistemas de culturas
de tecidos clulas e rgos so utilizados para "orientar" novos padres morfogenticos.
Micropropagao
Diferentes rotas morfogenticas para a obteno de plantas in vitro
1.1 Cultura de tecidos desorganizados
Calos Cultivo e manuteno de massas celulares desorganizadas que se originam da proliferao
desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro.
Suspenses Proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados dispersos em um meio lquido, sob agitao.
2. BASE CONCEITUAL
pice caulinar: segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 a 1,0 mm) juntamente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento. Porm, no deve ser confundido
com o meristema, que o conjunto de clulas indiferenciadas e de caractersticas embrionrias.
Ativao: processo que favorece a reentrada ao novo ciclo bioqumico oi fisiolgico de rgo ou tecido.
muito comum referir-se a ativao de gemas. Para ocorrer a ativao necessria a existncia
de rgo ou tecido pr formado ou formado.
Clulas indiferenciadas: refere-se ao estado caracterizado por clulas isodiamtricas, com pouco ou
nenhum vacolo e grande ncleo. Geralmente esto localizadas no meristema e mantm as caractersticas embrionrias.
Ciclo celular: processo ou fases celulares de diviso padro. Enquadra-se em dois grandes
grupos: meiose e mitse, que em um organismo diplide pode originar respectivamente uma nova clula haplide, quando ocorre a sada do ciclo celular no final de G2 (sem a duplicao dos cromossomos) ou diplide, quando
do completo processo de diviso celular (cdc).
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Clones: Independente da origem e sob o aspecto aplicado, as tcnicas de cultura de tecidos vegetais
permitem a propagao clonal massal de gentipos superiores. Segundo o Cdigo Internacional
de Nomenclatura de Plantas Cultivadas, clone uma das categorias bsicas da cultivar e designa
um conjunto geneticamente uniforme de indivduos, derivados originalmente de um individuo simples por propagao assexuada (enxertia, estaquia, mergulhia, apomixia ou micropropagao). O
conceito de propagao clonal implica na seleo de gentipos com graus variados de heterozigose e sua fixao nas geraes subseqentes (Kester, 1983). Clones so empregados no melhoramento de plantas para capturar os componentes aditivos e no-aditivos da varincia gentica. Os
componentes aditivos da varincia gentica baseiam-se no efeito independente dos alelos, enquanto que os efeitos no-aditivos, muitas vezes perdidos nos cruzamentos sexuais, baseiam-se
na interao dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Uma das maiores vantagens da propagao clonal a possibilidade de se explorar a varincia gentica total, ao invs dos componente aditivo apenas. Muitos dos programas de melhoramento gentico de plantas perenes e estabelecidos no hemisfrio norte, a partir da dcada de 50, foram baseados na seleo recorrente. Nestes programas a seleo feita aps cada
gerao de intercruzamentos de materiais
selecionados para proporcionar a recombinao gentica. Enquanto que o melhoramento convencional permite a fixao dos
ganhos genticos nas geraes subseqentes, a micropropagao permite a explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da clonagem de gentipos
superiores (Figura 2). Apesar dos benefcios dos clones para a agricultura, a concentrao de uma produo em larga escala de apenas um gentipo ou de poucos
gentipos de origem comum pode tornar
todas as plantas igualmente vulnerveis
pragas e molstias ou estresses abiticos e
pode tambm diminuir o interesse na manuteno de uma diversidade mais ampla
nos bancos de germoplasma existentes, Figura 02 - Explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da
resultando no estreitamento da base genclonagem de gentipos superiores.
tica.
Crescimento desorganizado: Quando, tecidos formados in vitro, no apresentam estruturas claramente definidas e contm um nmero limitado de clulas especializadas e diferenciadas. Uma clula
diferenciada aquela que desenvolveu forma especializada (morfologia) ou funo especializada
(fisiologia). Um tecido organizado a agregao de clulas diferenciadas (ex. xilema ou epiderme).
Por outro lado estruturas indiferenciadas podem ocorrer na induo de calos que so agregados
celulares desorganizados que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro e por meio de suspenses celulares que so a proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados de clulas dispersos em um meio lquido, sob agitao
Crescimento organizado Tecido ou rgo de crescimento determinado em produzir um novo rgo
(desenvolvimento) de forma a resultar novas estruturas vegetais. Crescimento ps meristemtico.
Competncia celular: Capacidade das clulas reagirem a sinais (que podem ser reguladores de crescimento) especficos de desenvolvimento. Diz respeito capacidade das clulas em expressar um
potencial inerente. Esta habilidade da clula pode se dar por: a) Ativao que pode ser definida
como a mudana na competncia envolvendo a rediferenciao de determinadas clulas (modelos
diretos); b) Induo: que pode ser definida como a iniciao de uma resposta particular de diferenciao a partir da desdiferenciao celular (modelos indiretos). A induo est associada processos de desdiferenciao, que pode ser definida como a (re)entrada no ciclo celular. Buvat (1944)
demonstrou que a desdiferenciao celular consiste de dois estgios: regresso capacidade de
diviso e retorno estrutura citolgica de clula meristemtica (embrionria)
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Cultura de rgos: Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdios e segmentos foliares. Para os
propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so:
f) Cultura de meristemas: pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou
dois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.
g) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregada
para estabelecer culturas que originam multgemas, gemas, eixos ou brotaes caulinares mltiplos.
h) Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples ou
mltiplas.
i) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem
plntulas.
j) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando novas razes.
Diferenciao: processo de diversificao das caractersticas bioqumicas, anatmicas, morfolgicas e
fisiolgicas, ocorrida nas clulas, nos tecidos ou rgos durante o desenvolvimento a partir do estado meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio meristema apical so exemplos de
estado indiferenciado, as quais ganham novas competncias se tornando diferenciadas.
Desdiferenciao celular: retorno de clulas diferenciadas ao estado meristemtico no diferenciado.
Determinao celular: Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma clula torna-se limitado a uma rota especfica (Christianson,1985). A determinao celular diz respeito a uma canalizao progressiva no desenvolvimento.
Epignese: Ativao seletiva e diferencial de genes (reprogramao celular). Um exemplo comumente
citado como representativo em uma planta intacta a transio da fase juvenil para a fase adulta.
Epistasia: refere-se inativao de um (trans)gene (o supressor) sobre um outro (trans)gene.
Induo: o desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do explante a um estmulo fsico, qumico ou biolgico. A induo envolve o controle da expresso gnica, embora no seja
um fenmeno gentico, pois no ocorre ganho ou perda gentica (modificao allica ou genotpica). Refere-se somente a expresso dos genes pr existentes. Em cultura de tecidos, a sinalizao por um fitormnio a uma resposta especfica a nvel celular.
Haplide: indivduo que apresenta o nmero de cromossomoss igual ao do gametfito ou da haplofase
(n). de maneira mais especfica, plantas haplides so aquelas com carga cromossmica no duplicada, monoplides.
Hormnios vegetais: No presente contexto este trmo define uma das classes de compostos que regulam processos de desenvolvimento (morfognese) em plantas, sendo, provavelmente, os mais importantes mediadores na transduo de sinais. Os hormnios so molculas regulatrias de ocorrncia natural que agem como sinais qumicos para regular o crescimento e o desenvolvimento
(morfognese). Fitorreguladores ou reguladores de crescimento so substncias sintticas que mimetizam os efeitos dos hormnios no metabolismo celular.
Meristema: tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido com sntese protoplasmtica e formao de novas clulas por diviso mittica. Sem especificao, o termo refere-se normalmente ao
meristema apical do caule (regio localizada numa depresso central que d origem aos mais novos
primrdios foliares de tamanho varivel entre espcies vegetais, normalmente formado por uma poro de 60 a 100 clulas isodiamtricas indiferenciadas, que mantm permanentemente as caractersticas embrionrias primrias.
Micropropagao: Propagao clonal massal de um gentipo selecionado por tcnicas de cultura in vitro. Este trmo, utilizado primeiramente por Hartman e Kester (1975), passou a ser empregado para
definir os processos de propagao vegetativa na cultura de tecidos vegetais.
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Morfognese: Integrao entre crescimento (mudanas quantitativas) e diferenciao (alteraes qualitativas), mediada por diviso e especializao celular. A morfognese o resultado de um complexo
controle hormonal mltiplo, espacial e temporal, atravs da regulao e expresso de sistemas gnicos mltiplos. A morfognese na planta intacta mediada pela ao correlativa dos meristemas e
de seus produtos. Na cultura de tecidos vegetais, ao se romper as correlaes endgenas os tecidos ficam sujeitos s condies exgenas, representadas no caso pelos fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. A morfognese in vitro passa ento a ser modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. Isto foi comprovado experimentalmente por Skoog e Miller (1955) e cujos resultados so sumarizados na figura 03.
Figura 03 - Morfognese in vitro modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura.
Totipotencialidade: Princpio biolgico creditado ao fisiologista vegetal alemo Haberlandt, que em
1902, enunciou que cada clula vegetal possua o potencial gentico para reproduzir um organismo
inteiro. Como corolrio, este fisiologista elaborou previses de que tecidos, clulas e rgos
poderiam ser mantidas indefinidamente em cultura. De certa forma o conceito de totipotencialidade j
era inerente teoria celular de Schleiden e Schwan (1838 apud Vasil et al., 1979) ao postularem que
algumas clulas eram capazes de serem separadas do organismo e continuar a crescer
3. MECANISMOS REPRODUTIVOS E PADRES DE DESENVOLVIMENTO ENTRE ANIMAIS E
PLANTAS
Plantas e animais apresentam similaridades na natureza de seu material gentico e nos mecanismos
pelos quais a informao gentica processada e utilizada. Nos outros nveis as diferenas so
bvias e considerveis:
A) Plantas no estabelecem uma linhagem germinativa especfica, no havendo distino entre clulas
que formam o organismo e as clulas reprodutivas. Em animais os gametas so produzidos apenas
por clulas-filhas descendentes de uma linhagem germinativa. Todas a clulas vegetais nucleadas,
possuem, em princpio, a capacidade de produzir um novo individuo (totipotencialidade) e a
possibilidade de uma clula produzir gametas apenas uma funo de sua localizao no
organismo.
B) Plantas se reproduzem tanto sexuada como assexuadamente.
C) O ciclo de vida de uma planta mais elaborado e complexo do que em animais. Neste a reproduo
resulta da produo direta de gametas como resultado da meiose na linhagem de clulas
germinativas. O ciclo de vida das plantas envolve duas geraes alternantes. A gerao dominante
a esporoftica e inicia com a fertilizao do ovo e culmina com o desenvolvimento e maturao. A
gerao gametoftica, atravs da microsporognese e megasporognese gera respectivamente
plen e saco embrionrio. Um dos ncleos da clula espermtica masculina fecunda o ovo para
formar o zigto, marcando o fim da gerao gametoftica e o incio da esporoftica. A embriognese
acompanhada pela formao da semente. que , em ltima anlise, uma estrutura complexa para
nutrir o embrio.
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIACCA/UFSC MP GUERRA & RO NODARI; EDIO DA STEINMACH ER (2006)
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cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio.
Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B6): Fazem parte de coenzima metablicas de
aminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao
(George, 1996).
Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo de Krebs que levam formao deste cido (Ammirato, 1983).
cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar e
reduzir facilmente (Santiago, 2001).
d) Outros suplementos orgnicos
- Misturas complexas:
So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que servem para enriquecer o
meio de cultivo. A composio destes produtos de difcil determinao e de uso restrito a algumas
culturas e de difcil repetio experimental, quando as tentativas de adequao no forem suficientes
para promover determinado processo morfogentico. Em trabalhos de rotina, estas preparaes podem ser usadas caso estimulem respostas desejadas.
Protenas hidrolisadas: a mais comum a casena hidrolisada, por ser importante fonte de aminocidos. Outras tambm so utilizadas: lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona, etc.
Suco de laranja, tomate e outros: contm cido ctrico e outras substncias de crescimento no identificadas.
Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase lquida ou gelatinosa. um suplemento bastante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio.
Extrato de leveduras: fonte de aminocidos e vitaminas.
Polpa de Banana: usada na suplementao do meio de cultura de orqudeas.
- Hexitis:
Os hexitis so compostos cclicos com grupos OH em todos os seis carbonos. O mais usado o inositol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. O meso-inositol uma mistura das formas d e l.
O inositol considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fonte
de carboidrato. Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol, no armazenamento de compostos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte de acar, na nutrio
mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formao de parede celular,
homeostase de hormnios e no estresse fisiolgico (Santiago et. al. 2001).
- Compostos fenlicos:
So compostos derivados de fenlicos (mono-OH) e atuam em processos que promovem o desenvolvimento areo enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) esto envolvidos com a iniciao de razes
(George, 1996). Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado, compostos
fenlicos (bi-OH) inibem a degradao oxidativa do AIA, tendo efeito benfico no enraizamento
(Santiago et. al. 2001).
- cidos orgnicos:
A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, comum
em meio destinado cultura de protoplastos (Santiago, 2001). Estes compostos parecem estar envolvidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. Por serem solues antioxidantes so preparadas
usando uma mistura de 100 mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1litro de
gua e sua esterilizao feita em filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras (Ammirato, 1983; Santiago, 2001). O cido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento de tecidos
excisados de plantas.
- Purinas e Pirimidinas:
A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podem
tambm promover o crescimento de cultura de calo. A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o
crescimento de brotaes in vitro.
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4.2.4. pH
O pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente cido, entre 5 e 6
(normalmente 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meios
gelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). No ajuste
do pH, lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampo 4,0. Posteriormente lava-se o eletrdo e desta maneira o potencimetro estar calibrado para uso. O pH varia durante o perodo de cultura.
4.2.5. Materiais de suporte
a) gar
gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. A concentrao usada varia de
0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo de polissacardeos, aminocidos, sais, acar, etc., devendo ser lavado em gua destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido
temperatura de 80C e se solidifica 40C. necessrio a aquisio de agar de boa qualidade, pois
podem ser txicos em algumas condies de cultivo (Guerra, 2002).
Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So mais puros que o
gar e provenientes de fermentaes bacterianas (George, 1996). Usados na concentrao de 0,2%
(2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificao em algumas espcies.
Alguns laboratrios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes,
porm apresentam restries quanto a longevidade por degradar ao longo do cultivo.
b) pontes de papel
Em muitas cultura no possvel utilizar agentes geleificantes ao meio e tambm no possvel o
uso em imerso em meios lquidos, nestes casos ento, usa-se pontes de papel com meios lquidos.
Utilizado principalmente no resgate de embries imaturos e no cultivo de ovrios.
c) Outros produtos: poliacrilamida, slica gel e papel de filtro.
4.2.6 Carvo ativado
E um p bastante fino e de cor escura, sendo utilizado para eliminar substancias txicas produzidas
pelo explante. Concentraes em torno de 0,3% so usadas quando se deseja enraizamento in vitro, pois auxiliam na ao das auxinas e promovem a fixao dos compostos fenlicos produzidos
pelo explante. Sugere-se, em alguns casos, aumento da concentrao de auxina, quando na presena de carvo ativado. A pureza deste produto varivel.
4.3 PREPARAO DOS MEIOS
O preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preciso na dosagem dos componentes.
Normalmente se mantm os macronutrientes em solues estoque em concentraes 10 vezes superior ao da concentrao final (Torres, 1998). Para os micronutrientes as solues estoques so de
1000 vezes superior. Para o quelato EDTA F a soluo estoque de 50 vezes. As pores so
mantidas em geladeira e por um perodo no superior a uma semana para a maioria das solues
estoques, principalmente aquelas que apresentam precipitao.
Solues estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores.
Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macrtonutrientes e micronutrientes),
Fe EDTA, misturas orgnicas e reguladores de crescimento.
A sacarose e o mio-inositol so pesados e preparados no momento do preparo do meio.
4.4. QUANTIDADE DE MEIO
Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Devem ser
considerados principalmente as exigncias de luminosidade, temperatura, trocas gasosas e acmulo de produtos txicos no meio, que sero discutidas na morfognese.
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Desinfestante
Concentrao(%)
Exposio (min.)
Hipoclorito de Clcio
9-10
5-30
Hipoclorito de Sdio
0,5-5,0
5-30
gua Oxigenada
3-12
5- 15
lcool etlico
70-95
5- 15
5-30
0,1-1,0
2-10
Nitrato de prata
Cloreto de mercrio
Tabela 3: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas.
(Extrado do Catlogo da Sigma).
25
50
100
250
500
1000
20
25
28
31
35
40
2000
4000
121C e 1,05kg/cm/cm2 = 105kPa
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5.1. ORGANOGENESE
A organognese relaciona-se com a obteno de eixos caulinares monopolares originados de gemas pr-existentes ou neoformadas. Estes eixos caulinares so induzidos ao enraizamento in vitro
ou ex vitro resultando em plntulas completas que podem ser ento aclimatizadas. A organognese
pode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a partir de um explante primrio h a formao de um
eixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares. No segundo caso ocorre a desdiferenciao do explante, resultando na formao de calos, que podem ser definidos como a proliferao de
clulas no diferenciadas massas, originado meristemides (Thorpe, 1980). Para finalidades de micropropagao clonal a formao de calos indesejvel uma vez que a constituio cromossmica
deste material , em geral, instvel, podendo originar variantes genticos, por meio de um processo
chamado variao somaclonal (Larkin & Scowcroft, 1981). Neste caso, o perodo de crescimento
desorganizado deve ser o menor possvel, ou preferencialmente eliminado (Street, 1975; Murashige,
1977).
A possibilidade de manipulao da organognese depende do tipo e concentrao relativa dos reguladores de crescimento, como indicado pelo j clssico trabalho de Skoog e Miller (1957). Estes autores observaram que a relao entre a auxina e a citocinina no meio de cultura era responsvel pela resposta organogentica em tecidos medulares de tabaco. Desta forma meios de cultura contendo concentraes mais elevadas de citocininas promoviam a formao de brotaes areas ou eixos caulinares; meios de cultura contendo nveis mais elevados de auxinas induziam a formao de
razes e em concentraes equimolares destes reguladores de crescimento verificava-se a formao de calos.
A seleo de uma planta matriz e de um explante adequado condio fundamental para orientar
os padro de morfognese (Thorpe, 1980). Murashige (1974) discutiu os vrios fatores que devem
ser considerados nesta seleo, tais como o rgo da planta a ser utilizado como fonte de explante,
a idade fisiolgica, a poca do ano em que feita a coleta e as condies gerais da planta doadora.
5.1.1. SISTEMAS ORGANOGENTICOS
O termo cultura de rgos usado para todos os tipos de cultura nos quais uma forma organizada
de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a micropropagao os mais importantes tipos de culturas de rgos so:
a) Cultura de meristema
Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios foliares. A brotao
apical tipicamente cresce, originando um nico broto.
b) Cultura de pices caulinares
o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios foliares. Essas brotaes apicais podem produzir mltiplas brotaes.
c) Cultura de segmentos nodais
Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou
mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma nica brotao.
d) Cultura de embries
iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries germinam originando
brotos.
A cultura de meristema e a cultura de embries so descritos com mais detalhes a seguir.
5.1.1. Cultura de meristemas apicais
Esta tcnica compreende o isolamento e a inoculao do domo apical e alguns primrdios foliares,
ou do meristema (figura 5) isoladamente (0,10 a 0,20 mm de comprimento). Usualmente, a cultura
de meristema refere-se ao crescimento do domo apical da brotao, excluindo as folhas primordiais.
O meristema no apresenta fololos, sendo constitudo por duas regies diferentes, tnica e corpus.
A tnica constituda de uma a trs camadas de clulas, a mais interna forma a epiderme e as outras duas restantes do origem a folha ou somente a epiderme foliar.
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b) Quando as clulas meristemticas do domo apical esto em diviso ativa, o RNA do virus no consegue introduzir-se no genoma destas clulas;
c) Clulas meristemticas podem ter sistemas qumicos de inativao, que podem ser potencializados em
meristemas isolados;
d) Altas concentraes de auxinas presentes nos meristemas caulinares seriam responsveis pela ausncia de virus.
A propagao massal das plantas isentas de viroses poder ser feita atravs de outras tcnicas como as
que so descritas posteriormente.
5.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristema
A cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciao foliar e no estudo do florescimento, na propagao vegetativa para obteno de plantas livres de patognos e, na multiplicao clonal rpida. Os meristemas so amplamente utilizados na limpeza pois estes materiais so
livres de vrus. Isto explicado plos seguintes fatos:
a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a competio por metablitos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para sua multiplicao.
b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a passagem do vrus clula
a clula (o DNA do vrus maior que o plasmodesmata).
Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se destacar:
Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza,
mais a sobrevivncia menor;
Localizao do explante: explantes retirados da ponta do broto esto em um estdio mais jovem de desenvolvimento do que explantes da base;
poca de coleta: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo.
5.1.1.2. Proliferao de gemas axilares (segmentos nodais)
Esta tcnica fundamentada pela induo das gemas laterais existentes. Inclui o isolamento e a inoculao de segmentos nodais contendo gemas vegetativas axilares, propiciando a multiplicao direta
(ausncia de calo) de brotaes que podem ser separadas em microestacas para enraizamento in vitro
ou in vivo. Este procedimento pode originar respostas de propagao massal em progresso geomtrica.
Por ser um sistema direto, apresenta menores possibilidades de gerar variantes somaclonais. Um dos
exemplos de utilizao desta tcnica a propagao clonal do abacaxi atravs da liberao das gemas
axilares. Atualmente um sistema utilizado em laboratrios junto a viveiros comerciais de espcies lenhosas, pois fcil de fcil manipulao e de alta taxa de regenerao de explante. Alm disso, o material vegetal mantm as caractersticas genticas com quase ausncia absoluta de variaes epigenticas.
5.1.2. INDUO E PROLIFERAO DE GEMAS ADVENTICIAS
Consiste na induo e formao direta ou indireta de meristemides a partir de discos foliares, pices
caulinares ou radiculares, segmentos caulinares nodais e internodais, cotildones, hipoctilos e outras
estruturas de plntulas, segmentos de flores e inflorescncias imaturas (monocotiledneas: Gladiolus,
Hemerocallis, Iris, Freesia; Dicotiledneas: Gerbera, Chrysanthemum), escamas de bulbos (tecidos meristemticos na placa basal). Neste modelo, a escolha do explante e o tipo e concentrao do regulador
de crescimento determinam o sucesso da iniciao das brotaes adventcias. No caso de iniciao direta, algumas clulas parenquimticas epidrmicas ou sub-epidrmicas tornam-se meristemticas e grupos
celulares (meristemides) com forte reao a corantes especficos se desenvolvem. No modelo indireto
ocorre a desdiferenciao das clulas parenquimticas e a organizao dos meristemides e as brotaes adventcias surgem a partir da periferia dos calos.
Este modelo organogentico resulta nas maiores taxas de multiplicao, sendo de uso mais geral e comum em plantas hortcolas. Por outro lado ele pode originar a produo de variantes ou quimeras por estar baseado na formao de calos. Outro uso freqente deste modelo o co-cultivo com Agrobacterium
em tcnicas de transformao de plantas.
5.1.2. ESTGIOS E MODULAO DA ORGANOGNESE
A microproagao de plantas atravs da cultura de tecidos pode ser operacionalizada em uma seqncia
laboratorial de trs estgios, cada qual apresentando objetivos, pressuposies e necessidades especficas em termos de composio dos meios de cultura, tipo e balano dos reguladores de crescimento e
condies fsicas como luz, temperatura, foto perodo.
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIACCA/UFSC MP GUERRA & RO NODARI; EDIO DA STEINMACH ER (2006)
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Em condies laboratoriais cada estgio deve ser identificado e as condies timas devem ser estabelecidas (Murashige 1974). Debergh e Read (1991) propuseram a incluso do estgio 0 nesta seqncia de
operaes e, desta maneira, a induo e a expresso de respostas organogenticas in vitro deve obedecer aos passos listados a seguir:
Estgio 0 - Consiste em selecionar e cultivar a planta matriz doadora de explantes em condies adequadas e, eventualmente, controladas. Isto significa que pode ser necessrio modificar as condies de
fotoperodo e temperatura, ou aplicar a essa planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas,
alterando com isto a sua condio fisiolgica.
Estgio I - Consiste no estabelecimento da cultura assptica. O objetivo deste estgio a definio do
tipo de explantes a ser utilizado, o estabelecimento de culturas isentas de microorganismos contaminantes, a obteno de altos ndices de sobrevivncia e de rpido crescimento dos explantes. Neste estgio
torna-se necessrio monitorar e controlar as reaes de oxidao que ocorrem: a) pela oxidao de compostos fenlicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pela exciso de um rgo
ou tecido e; b) pela sntese de compostos mono e polimricos por parte do explante. A incubao destas
culturas na ausncia da luz por alguns dias pode inibir os processos oxidativos.
Estgio II - Multiplicao: este estgio fundamentado na diviso e diferenciao celular, objetivando a
obteno de uma plntula, de acordo com as diferentes rotas morfogenticas possveis. De maneira geral
procura-se promover a liberao de gemas axilares pr-formadas ou a induo de gemas adventcias.
Em muitos casos estgios intermedirios de calo esto envolvidos, contudo, quando o objetivo a manuteno da conformidade clonal, a passagem por estgios de calo deve ser evitada, tendo em vista a possibilidade de ocorrncia de variaes somaclonais. Neste estgio deve-se determinar o nmero e intervalo de sub-cultivos, bem como determinar e otimizar a taxa de multiplicao, ou seja, o nmero de gemas
ou de eixos caulinares que podem ser obtidos a partir de cada inculo nos sub-cultivos. Para bananeira e
abacaxizeiro, partindo-se de gemas apicais e laterais respectivamente, a taxa mdia de multiplicao
de 10 eixos caulinares a cada sub-cultivo realizado a cada 20 dias. A experincia adquirida com esses
dois sistemas indica que podem ser efetuados cinco sub-cultivos com certa garantia de manuteno de
fidelidade clonal. A partir deste sub-cultivo podem aparecer mutantes ou variantes somaclonais. No Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal do Depto. de Fitotecnia do CCA/UFSC, no
foram observadas alteraes morfolgicas na organognese do abacaxizeiro at o quinto sub-cultivo, a
partir do qual se identificaram mutantes, na freqncia de 1 para 700.
As condies ambientais neste estgio relacionam-se com a temperatura, cuja faixa tima est entre 22 e
27oC para plantas de clima temperado e tropical, respectivamente. O perodo de luz deve permanecer
em torno de 16 a 18 horas em intensidades luminosas mdias de 5 W.m-2.
Estgio III - Nesta fase busca-se o elongamento, a induo e iniciao radicular e a preparao para a
aclimatizao. O objetivo deste estgio a preparao para a converso das condies heterotrficas
para autotrficas. As estratgias deste estgio incluem eventuais incluses no meio de cultura de: a) GA3
para induzir o elongamento de eixos caulinares; b) AIB para induzir a iniciao radicular e; c) carvo ativado para favorecer a iniciao radicular. Redues nas concentraes dos sais e das fontes de carboidratos do meio de cultura podem trazer benefcios iniciao radicular, bem como facilitar o processo de
aclimatizao.
Tendo em vista que este estgio da cultura in vitro pode representar 30 a 60% do custo de uma planta
micropropagada, muitos laboratrios preferem promover o enraizamento ex-vitro e esta estratgia deve
ser considerada sempre que possvel. O emprego da tcnica da dupla-camada que consiste em adicionar
uma pequena quantidade de AIB sobre a superfcie do meio slido, para que ocorra a induo radicular
dos eixos caulinares tem gerado execelentes resultados em muitos sistemas.
Estgio IV - Aclimatizaco: Neste estgio ocorre a transio da condio heterotrfica para autotrfica. O
principal objetivo neste estgio diminuir ao mximo as perdas que ocorrem principalmente pela desidratao dos tecidos da microplanta. O emprego de estufas, tneis plsticos, sistemas de nebulizao e de
antitranspirantes deve ser considerado para cada situao, tendo em vista que as plantas neste estgio
normalmente no apresentam estmatos funcionais e suas folhas tem reduzida capacidade de formao
cutculas cerosas protetoras.
Composies adequadas de substratos tambm so importantes e na maior parte dos casos o emprego
de areia, terra, vermiculita, casca de arroz carbonizada isoladamente ou em misturas proporcionais, resulta em elevados ndices de sobrevivncia.
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De maneira geral este estgio inicia com a retirada das plntulas dos frascos e a cuidadosa remoo por
lavagem de resduos de meio de cultura solidificado junto ao sistema radicular. Um segundo passo consiste em repicar estas plntulas para bandejas de isopor contendo o substrato autoclavado, cuja composio foi previamente determinada. O terceiro passo consiste em manter estas bandejas, por perodos de
at 15 dias, em sala de cultura cuja temperatura e durao e intensidade luminosa possam ser controladas. A manuteno de uma cmara mida sobre as bandejas pode ser feita pela utilizao de filmes plsticos em cobertura. Posteriormente, transfere-se esta bandeja para uma estufa com sistema de nebulizao intermitente por perodos mdios de 15 a 30 dias, podendo-se aps, repicar estas plntulas para sacos plsticos contendo uma mistura convencional no autoclavada de solo argiloso, arenoso e matria
orgnica e mant-las em condio de ripado ou cobertura com sombrite que deixem passar em torno de
50% da luminosidade. Por fim procede-se uma retirada gradual da cobertura para que as mudas sejam
submetidas s condies normais que se verificam aps o transplante para o local definitivo. importante
salientar que determinada seqncias destas operaes podem ser eliminadas em algumas espcies.
Para abacaxizeiro, por exemplo, o segundo passo anteriormente descrito pode ser eliminado e no h a
necessidade de ser feita a repicagem para sacos plsticos, podendo as mudas ser comercializadas ou
enviadas ao campo nas bandejas de isopor. Torna-se necessrio, portanto, estabelecer procedimentos
especficos para cada espcie a ser trabalhada em um laboratrio de micropropagao.
5.1.3. CULTURA DE EMBRIES
A cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e crescimento de um embrio imaturo
ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma planta vivel.
Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente como explantes em cultura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em cultura de embries, entretanto, os embries so retirados das sementes e so individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo
uma planta por explante. A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de plntulas de
sementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo.
5.1.3.1.Tipos de cultura de embries:
a) Cultura de embrio imaturo
Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. mais difcil, devido a exciso e meio de cultura mais complexo.
b) Cultura de embries maduros
Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente.
5.1.3.2. Estdios de desenvolvimento do embrio
Quanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No estdio globular h requerimento de meios mais complexo (fitormnios, altas concentraes de acares, gua de coco, etc.). Antes
do formato de corao, os embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobilizando compostos de carbono.
No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas, nitrognio, citocininas, auxinas, gua de coco (algumas substncias podem ser opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornamse autotrficos e neste estdio requerem um meio mais simples.
Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e agente osmtico), pois tm
um potencial hdrico muito negativo (contedo alto de slidos). Uma alternativa para resolver a dificuldade
imposta pelo potencial hdrico do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de manitol (agente osmtico).
5.1.3.3 Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio
1) Gentipo: em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que em outras muito difcil
(h tambm diferenas entre cultivares de uma espcie).
2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil desenvolver embrio muito
pequeno in vitro.
3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em condies controladas resulta
em um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhora o crescimento do embrio isolado.
4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais crtica do que embries
maturos. Em ambos (maduro e imaturo) os macro e microelementos so importantes.
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Os meios usados so slidos: MS, White e 85, em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos
(sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embries maturos e imaturos, respectivamente) so fontes de energia e tambm agem abaixando o potencial osmtico, especialmente em embrio
jovens.
O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibio de crescimento). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas geralmente no so usados. As vezes se utiliza
giberelina. Substncias de contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especialmente para embries imaturos.
5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado no escuro por 7 a 14 dias.
6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando, geralmente entre 22 e 28C).
5.1.3.4. Aplicaes prticas da cultura de embries
a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de semente
Em algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo devido a caractersticas
genticas ou fisiolgicas.
b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveis
No melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir genes de interesse da
espcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade gentica) podem produzir embries abortivos
devido a incompatibilidade.
Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou ps-zigticas (sementes murchas e
embries abortivos). Os embries hbridos so salvos e removidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente cultivados in vitro.
c) Superao da dormncia das sementes
Em algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h requerimentos especficos de luz e
temperatura ou ainda a resistncia fsica presente nas estruturas que recobrem o embrio. A cultura de
embries uma alternativa para superar estes problemas.
d) Superao da esterilidade das sementes.
As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser o desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que cobrem o embrio ou algum tipo de dormncia recalcitrante para a qual nenhum mtodo tem sido desenvolvido.
e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios. Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia in
vivo. Assim tambm a retirada dos embries e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo o
desenvolvimento de plantas.
f) Preveno do embrio abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce de frutos carnosos
Em cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e nutrientes para o embrio
imaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto.
g) Propagao vegetativa
Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so excelentes explantes para
propagao clonal in vitro. Especialmente para conferas e gramneas.
5.1.4. MICROENXERTIA
Esta tcnica (figura 10) consiste em excisar de uma planta matriz uma gema apical ou o meristema propriamente dito que enxertado sobre uma plntula porta-enxerto que foi obtida em condies asspticas.
Sua principal aplicao a eliminao de viroses e de outros microorganismos de natureza sistmica que
tendem a se acumular em plantas propagadas vegetativamente, quando da impossibilidade de se usar a
tcnica de cultura de meristemas
Na citricultura esta tcnica tem sido empregada rotineiramente nos laboratrios de micropropagao porque no sistema tradicional baseado na propagao de clones nucelares de espcies poliembrinicas, o
tempo necessrio para a superao da juvenilidade muito longo. Alm disto, em espcies monoembrinicas ocorre variabilidade gentica uma vez que o embrio pode ser resultante de um processo de fecundao cruzada.
A termoterapia tambm pode ser empregada para a limpeza de virus em plantas de propagao vegetativa, contudo nem todas as plantas apresentam-se isentas dos vrus aps serem submetidas a este processo.
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Alm disto, algumas das clulas transplantadas podem dividir-se sem a necessidade da adio de reguladores de crescimento ao meio de cultura. Este fenmeno atribudo a superioridade gentica e aos altos
nveis endgenos de fitorreguladores nestas clulas.
A poliembriognese somtica de ocorrncia ampla nas gimnospermas, mas pode ocorrer tambm em
angiospermas. Revises completas sobre o assunto so encontradas nos artigos de Gupta e Durzan
(1986) e Durzan e Gupta (1988) e no livro "Plant Morphogenesis" de Sinnot (1960).
5.2.3. EMBRIOGNESE SOMTICA INDUZIDA
Este modelo resulta de calos e suspenses celulares depois que o tecido matriz (explante) submetido a
tratamentos que induzem competncia embriogentica (detalhes na figura 12). Isto significa que necessrio que ocorra a desdiferenciao e posterior rediferenciao celular atravs de uma reprogramao
gentica (epignese) cujos determinantes bsicos so o estgio fisiolgico do explante e o tipo e concentrao do regulador de crescimento que atuar como sinal qumico para a ativao gnica diferencial. De
maneira geral, a perspectiva de sucesso em extrair resposta embriogentica neste modelo depende da
utilizao de explantes juvenis ou embrionrios e da manipulao adequada de uma auxina forte, como o
2,4-D. Esta auxina atua como indutora do processo (efeito "pulse"), contudo sua presena no meio de
cultura depois da induo pode causar anormalidades ontogenticas. Portanto, neste modelo em particular e na embriognese somtica em geral, a ativao ou induo desencadeada pelo uma auxina forte
como o 2,4-D mas a expresso desta rota morfogentica somente ocorrer em meios de cultura isentos
ou com baixas concentraes deste regulador de crescimento.
Exemplos ilustrativos deste modelo foram obtidos e/ou citados para o cafeeiro por Sondahl et al. (1981),
para palmeiras por Tisserat et al. (1979), para gramneas por Vasil (1982), para soja por Christianson
(1985) e para cenoura por Litz et al. (1985), cujos artigos ampliam e aprofundam detalhes sobre este modelo.
Figura 12 - Ciclos da embriognese somtica e a seqncia de eventos celulares da desdifenciao e diferenciao (Adaptado de Durzan, 1988)
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Figura 15 - Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e
regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.
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5.3. CRIOPRESERVAO
Desde o inicio da multiplicao clonal ou da micropropagao das plantas, uma das grandes dificuldades
era a conservao de estoques de material vivo para os cultivos posteriores. A conservao por um logo
perodo pode ser aplicada por tcnicas de congelamento de explantes a baixas em nitrognio lquido (196 C). a partir de ento tornou-se possvel no s a conservao do material por um perodo mais longo, como tambm a conservao de recursos genticos vegetais de germoplasmas. Este procurou atender dois problemas bsicos de estocagem em bancos de germoplasma; de materiais de propagao vegetativa e de espcies com sementes recalcitrantes.
5.3.1. Mtodos para a criopreservao
Basicamente so dois os mtodos; o congelamento gradual e o congelamento imediato.
O resfriamento lento composto de etapas de congelamento a -20 C em freezer, seguido de abaixamento de -70 a -100C e a criopreservao em - 196 C.
No congelamento rpido existe a necessidade de evitar que as clulas produzam cristais a partir do contedo celular. Atravs dessa tcnica o contedo celular aquoso adquire a conformao vtrea, o que
desejvel.
Dois momento so crticos para a cultura a ser criopreservada quanto a possibilidade da formao de
cristais; na entrada e na sada da criopresrvao. a razo do sucesso e do fracasso desta tcnica em
muitos experimentos.
Antes da cultura entrar para o sistema de criopreservao, aplicado um redutor osmtico (manitol 4%)
para diminuir o contedo celular e um crioprotetor (DMSO), cuja funo de modificar a permeabilidade
da membrana, proteo de macromolculas e inativao de radicais livres (Benson & withers, 1987).
A criopreservao pode atender a conservao de suspenses celulares utilizando os seguintes passos
(Torres, 1998):
- Pr-condicionamento por a 5 dias em meio contendo 6% de manitol.
- Crioproteo com 0,5 mol.l-1 DMSO + 0,5 mol.l-1 de glicerol + 1,0 mol.l-1 de sacarose no meio de cultura.
- Transferir as clulas e soluo crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 1 C por minuto
at -35 a -40C, manter a temperatura por 40 minutos, aps transferir para o nitrognio lquido.
- Armazenar em nitrognio lquido;
- Descongelar em banho-maria a 40 C.
- Extrair as culturas dos meios de crioproteo.
Para culturas de parte area o procedimento assim definido (Torres, 1998):
- Pr-condicionamento por a 2 dias em meio contendo 5% de DMSO.
- Crioproteo com 10% de DMSO no meio de cultura.
- Transferir as clulas e soluo crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 0,5 C por minuto at -40C, manter a temperatura por 40 minutos, aps transferir para o nitrognio lquido.
- Armazenar em nitrognio lquido;
- Descongelar em banho-maria a 40 C.
- Extrair as culturas dos meios de crioproteo.
6. PROBLEMAS NA CULTURA IN VITRO
O cultivo in vitro como qualquer outro processo sensvel a alguns problemas de ordem ambiental ou
bioligico que afetam diretamente o desenvolvimento das culturas. Dentre estes problemas pode-se citar
a oxidao, o declnio no vigor e a hiperhidricidade.
6.1. DECLNIO DE VIGOR
As plantas desenvolvem o metabolismo de acordo com os estmulos recebidos, e portanto, quando ocorre problemas determinantes refletido diretamente na fisiologia vegetal do explante. A baixa taxa de desenvolvimento chamada de dclnio do vigor e est associado com a produo de substncias fenlicas
ou a outros fatores como vitrescncia, habituao ou maturidade dos explante.
A perda de vigor pode ser tambm afetado por erros no balano nutricional do meio de cultura, utilizao
de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do material vegetal.
a) Diminuio da taxa de proliferao
algumas espcies apresentam curvas acentuadas na taxa de proliferao da cultura. Esta taxa bastante
varivel de acordo com espcie e o tempo de cultivo ou subcultivos.
O declnio na taxa de formao de brotos tambm ocorre frequentemente em culturas que no so repicadas.
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b) Habituao
Quando os explantes esto em meio de cultura, pode haver habituao para fitorreguladores como a citocinina, que por doses de concentrao normais no respondem bem ao estmulo.
6.2. NECROSES
Necrose pode ser descrita como sendo a morte de uma parte de um organismo vivo. Isto ocorre com explantes colocados in vitro, podendo ter uma perda parcial ou a de toda a cultura (Santos, et. al., 2001).
a) Necrose apical em brotaes
Causas:
- Deficincia de clcio ocorre principalmente no pice quando o explante colocado em meios com baixa concentrao para a espcie ou quando ocorrem barreiras de disponibilidade do nutriente para a planta. Muito comum acontecer problemas relacionados com elevadas temperaturas que favorece a diferena
entre crescimento e translocao do nutriente. Em cultivo in vitro, a alta umidade limita a transpirao e
consequentemente a translocao no xilema de ons e compostos, assim como o clcio pode no alcanar os tecidos da regio apical.
- Substncias de crescimento - Alguns fitorreguladores podem induzir a necrose apical, principalmente
em subculturas, ou ainda, meio inadequado para determinada fase.
- Intervalo de subculturas quando as subculturas no so repicadas e ficam velhas pode ser observado
folhas amarelas e queda destas. O momento de fazer a subcultura deve se ajustado de acordo com cada
espcie de cultivo.
- Gases txicos a chama do bico de bussen para a flambagem da boca dos frascos pode produzir internamente e a diminuio de oxignio. Ocorre a produo de gases como o metano, butano, entano, propano, etileno, metanol e etanol. Esses gases provocam a absciso foliar, podendo causar a paralisao
da cultura, ou ainda ocasionar a morte das brotaes. O prprio estado de desenvolvimento fisiolgico e
crescimento da planta pode produzir altas taxas de CO2, que tambm varivel de acordo com o perodo
do dia.
b) Diminuindo a necrose
Prover as culturas com nitrato de clcio e procurar disponibiliz-lo na forma de fornecer ambiente adequado favorece a diminuio de necroses. Outro nutriente importante para algumas espcies o boro,
que tambm atua nas regies de intensa diviso celular.
A reduo dos gases pode ser conseguida com chamas de cor azul para fazer a flambagem da boca dos
frascos. Tambm as fontes podem ser substitudas como areia seca em altas temperaturas.
Permitir as trocas gasosas em culturas que se deseja crescimento reduz a concentrao de gases txicos
e aumenta a disponibilidade de oxignio. Porm, esta prtica no deve ser adotada quando se deseja um
crescimento mais lento da cultura.
6.3. OXIDAO
A oxidao a reao do oxignio com ons metlicos (+) dos outros compostos do meio de cultivo. Os
explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem liberar exudatos que tornam o meio de cultivo
escuro. Este tipo de escurecimento conseqncia da liberao de fenis dos ferimentos ocasionados
no processo de extrao dos explantes (Santos, 2001).
As substncias encontradas em meio de cultura no cultivo de algumas espcies lenhosas foram identificadas como sendo taninos, flavonides e fenis (George, 1993). Ferimentos normalmente provocam oxidao, sendo que discos foliares apresentam maior oxidao do que segmentos nodais por sofrerem ferimentos em maior rea. O efeito inibitrio no desenvolvimento dos explantes atribudo presena de
taninos e fenis, sendo a autotoxidade dos exudatos varivel com as cultivares, espcies e gneros.
A ocorrncia de oxidao pode ser geneticamente correlacionada, ou seja, em gneros cujas plantas apresentam maiores teores de tanino ou hidroxifenis a oxidao ocorre de forma mais intensa como o
exemplo de Quercus, Rhododendron, Sorghum e das conferas (Santos 2001).
Compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP, cido ascrbico e cido ctrico tm sido adicionados
ao meio de cultura com o objetivo de controlar o processo de oxidao.
Carvo ativado adicionado ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,3 a 2,0%, cuja ao
adsorver fenis do meio de cultura, alm de atuar induzindo os processos de morfognese e rizognese.
A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os compostos fenlicos evitando que estes
oxidem e polimerizem. Esta substncia geralmente adicionada ao meio de cultura em concentraes
que variam de 0,01- 4,0 %.
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Composio dos meios de cultura com variaes na concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou
diminuio em concentrao de ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variaes em tipo e
concentraes) alm da adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para controle da oxidao.
O cido ctrico atua como agente quelante de metais, mas no muito eficiente em retirar ferro da soluo. J o cido ascrbico normalmente acrescido ao meio de cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade metablica dos tecidos. A efetividade destes cidos s tem sido observada, quando adicionados ao meio em concentraes entre 10 e 140 mgL-1, podendo reduzir a oxidao em 50%.
Explantes jovens so mais propensos a ocorrer a oxidao e geralmente no inicio da cultura de tecidos.
A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita minimizando os danos causados ao explante, removendo os compostos fenlicos produzidos ou atravs da alterao da composio do meio de cultura e
a concentrao ou tipo de reguladores de crescimento empregados. A remoo dos compostos pode ser
feita ainda pela utilizao de meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes agentes de
solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro.
O agar usado para geleificao do meio pode conter compostos como acares, galactose, sulfatos reativos e at mesmo presena de cobre, podem apresentar elevada oxidao.
6.4. HIPERHIDRICIDADE
A hiperhidricidade definida como o estado fisiolgico que a planta apresenta elevado teor de gua no
interior das clulas e tecidos com aspecto translcido. As alteraes na estrutura das plantas cultivadas
in vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa sndrome de caractersticas anormais.
O fenmeno pode ser revertido, desde que seja realizada a transferncia de meio de cultivo e adequar o
ambiente, dando ateno especial para a temperatura, irradincia, fotoperodo e concentraes dos elementos do meio de cultivo.
A "sndrome do broto de vidro" como tambm chamado pode ocorrer em vrios nveis de severidade.
Inicialmente, apenas uma parte do broto, ou uma ou duas folhas podem ser afetadas. As brotaes de
culturas que demonstram sintomas leves frequentemente crescem mais rapidamente do que o normal e
pode mostrar altas taxas de brotaes axilares. Esta vantagem perdida em condies mais severas de
hiperhidricidade (Santos, 2001).
Em casos mais extremos, brotos vitrificados tem interndios curtos e o pice aparece fasciculado. Os brotos afetados frequentemente apresentam-se inchados e com uma colorao verde claro e suas folhas
so translcidas, aquosa e com aparncia de vidro; as folhas se apresentam tambm alongadas, trgidas
e frgeis, com uma colorao verde azulada.
a) Ocorrncia
A hiperhidricidade pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em regenerao de brotos a partir de calos,
em todos as espcies. mais freqente em massa de calos de plantas lenho as, mas tambm ocorre em
plantas herbceas, pode ser conseqncia da difuso passiva da gua dentro dos tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no processo metablico da planta.
b) Fatores que influenciam a hiperhidricidade
Culturas que desenvolvem-se rapidamente so menos propensas. Quando se busca melhores condies
de cultivo para cada espcie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a hiperhidricidade.
A hiperhidricidade tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradincia luminosa ou em culturas mantidas no escuro.
Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta umidade relativa apresentam maior susceptibilidade hiperhidricidade, pois este provavelmente o ambiente mais favorvel para ocasion-la. Culturas mantidas em meio lquido, incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente
desenvolvem mais facilmente do que aquelas que so cultivadas em meio slido.
Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio slido ficam totalmente vitrificadas quando
so transferidas para um meio de cultivo lquido.
Os brotos apresentam sintomas mais freqentes quando se utiliza concentraes de BAP acima de 2,0
mg.L-1, suplementado com sacarose e baixas concentraes de sorbitol. Culturas em meios com altas
concentraes de BAP sofrem imensamente a induo de hiperidricidade. Isto pode ser evitado transferindo a cultura para um meio que no possua BAP. As auxinas podem s vezes induzir a hiperhidricidade
entretanto, a adio de auxinas no meio contendo citocininas, frequentemente aumenta a proporo de
vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste problema.
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c) Diminuindo a hiperhidricidade
Existem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da vitrificao, dentre estes pode-se destacar:
1) Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no meio de cultura.
2) Aumento da concentrao de gar no meio semi-slido.
3) Controle da concentrao de sacarose.
4) Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro.
5) Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos explantes (ponte de papel).
6) Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o citrato, succinato ou malato para auxiliar a assimilao do NH4+.
7) Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo.
8) Utilizao de alta de luminosidade.
9) Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria.
10) Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina para a espcie estudada.
11) Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo.
12) Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de fitorreguladores.
13) Diminuio do uso de citocininas ou restrio do uso do BAP. Pode-se tambm aumentar o nmero
de subcultivos.
14) Substituio da sacarose por frutose ou galactose.
15) Ajuste correio do pH do meio de cultivo.
7. ACLIMATIZAO DAS PLANTAS
Aclimatizao e aclimatao so termos que apresentam conotaes diferentes. O primeiro trata dos processos para a passagem da planta que est in vitro para o ambiente e definido como a adaptao climtica de um organismo, especialmente uma planta, que transferida para um novo ambiente, sendo
todo esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatao tem um significado similar, mas um
processo no qual as plantas ou outros organismos se tomam ajustados a um novo clima ou situao, como resultado de um processo essencialmente natural. Na figura 8 so apresentadas as etapas do desenvolvimento vegetal observando as fases da aclimatizao e enraizamento de Feijoa sellowiana.
Pesquisas foram realizadas para verificar quais os possveis problemas referem-se aclimatizao. Um
grande nmero de planta micropropagada no sobrevive quando so transferidas das condies in vitro
para o ambiente externo.
7.1. PROBLEMAS DA ACLIMATIZAO
a) Baixa capacidade fotossinttica
A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas so, inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em condies de campo. Esta variao na anatomia ou ultra-estrutura pode afetar o processo de fotossntese. As organelas que apresentam capacidade autotrficas no esto bem desenvolvidas, e consequentemente, existe uma dificuldade em aclimatizao.
No estgio de aclimatizao as plntulas sofrem uma mudana drstica quando so removidas dos frascos onde a luz e as trocas gasosas so limitadas e existe grande disponibilidade de acar. Essa passagem faz com que mudem de heterotrficas para autotrficas, com grande gasto de energia.
b) Desidratao
A desidratao causada pela elevada perda de gua pelas plantas, principalmente nas folhas, ou absoro inadequada de gua pelas razes e, em geral, o maior problema no processo de transplante e
aclimatizao. In vitro, as plntulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada umidade relativa
com conseqente reduo do fluxo respiratrio. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de transpirao aumenta, surgindo um dficit hdrico na planta.
As plantas que so levadas s casas de vegetao so desprovidas de cutcula na folha e possuem muitos estmatos no funcionais. Quando expostas ao ambiente ocorre elevada perda de gua e um agravamento osmtico intracelular.
A morfologia e a densidade dos estmatos podem ser alteradas mudando-se as condies ambientes.
Em plntulas de rosa, por exemplo, um aumento na luminosidade e uma diminuio na umidade relativa
de 100 para 75%, resultou em estmatos semelhantes s plantas cultivadas em estufa.
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Figura 15 - Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e
regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.
c) Absoro de nutrientes
Plantas in vitro quase sempre produzem razes no funcionais, ou seja, no apresentam capacidade de
absoro de gua e nutrientes quando colocadas em contato com o solo. As plntulas in vitro ao serem
aclimatizadas, passam de um meio onde tm disposio alta concentrao de nutrientes para um substrato no qual so foradas a iniciar o processo de absoro de sais para seu desenvolvimento. A emisso
de novas razes muito importante, pois as formadas in vitro tm pouca capacidade de absoro e no
respondem imediatamente ao momento do transplante, alm de serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de microorganismos.
d) Doenas
Problemas de doenas podem facilmente aparecer nas culturas que so levadas s casas de vegetao,
pois a falta de presso de inoculo e a dependncia do meio no estimulou as plantas a desenvolver o sistema de defesa contra microrganismos. A fragilidade da plntula in vitro aliada alta umidade relativa, na
qual aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactrias. essencial, portanto, que se faa uma preveno de doenas para o sucesso do transplante, durante e aps a aclimatizao.
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Auxinas como o AIB (cido indolbutrico), AIA (cido indolactico) e ANA (cido naftalenoactico) so os
principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro.
Em alguns casos, a concentrao de auxina que promove bom enraizamento no a mesma que promove uma alta sobrevivncia ex vitro. As concentraes mais utilizadas para induzir rizognese normalmente esto entre 1,0 - 10,0 mg.L-1 para AIA, 0,05 - 1,0 mg.L-1 para ANA e 0,5 - 3,0 mg.L-1 para AIB
(Soares et. al., 2001). A anlise do mtodo de enraizamento deve levar em considerao o relutado final,
ou seja, o nmero de mudas produzidas e a qualidade fisiolgica das plntulas, que na maioria das vezes
dependente do mtodo de induo e fitorregulador usado. A auxina deve ser aplicada no meio de cultura ou anteriormente inoculao do explante (no caso de enraizamento ex vitro), levando-se em conta
que a sua concentrao inversamente proporcional ao tempo de permanncia com o regulador.
Associadas s auxinas, outras substncias tambm interferem de forma direta ou indireta no enraizamento dos explantes. Poliaminas, cido sulfrico, cloreto de magnsio e compostos fenlicos, como o floroglucin, atuam, por exemplo, estimulando a sntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. J
as citocininas, geralmente utilizada para estimular a formao de brotaes, costumam inibir o enraizamento. Existem poucos casos em que uma citocinina no interfere ou estimula a formao das razes. As
giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das vezes, a rizognese.
Fatores ambientais, tais como tamanho dos recipientes de inoculao, meio de cultura, gases, substratos,
luz, temperatura e o prprio explante, tambm afetam a formao de razes. O tamanho dos frascos onde
os explantes so colocados ajuda ou dificulta a formao e o crescimento das razes, no momento em
que se tornam uma barreira fsica (Soares et. al, 2001). Em frascos maiores se torna mais fcil conseguir
o enraizamento. A concentrao de sais no meio de cultura pode ser regulada de acordo com cada espcie, de forma que a reduo da concentrao inica dos meios (50% ou 75% da fora total do meio) pode
favorecer esta etapa do processo de micropropagao.
8.2. ENRAIZAMENTO EX VITRO
A tcnica de enraizamento ex vitro consiste em destacar brotaes e plant-las no substrato desejado,
que pode ser: turfa, areia, vermiculita, perlita, bandejas de espuma fenlica e ou substratos comerciais,
ainda solo esterelizado. As estacas no podem ser nem muito grandes, nem muito pequenas, pois esses
extremos so de difcil manuseio, dificultam o enraizamento e demandam mais tempo para formar mudas. Estacas de tamanho entre 2 e 5 centmetros so as ideais. Se possvel, o plantio deve ser em grupos, ao invs de isoladas, o que favorece o enraizamento, que, geralmente, ocorre em 2 a 5 semanas.
A principal vantagem do enraizamento ex vitro o menor custo financeiro que esta tcnica proporciona.
As estacas brotadas, ao invs de serem inoculadas em meios de cultura com reguladores propcios ao
enraizamento, so enraizadas fora das condies asspticas dos frascos de cultura, j fazendo parte da
etapa seguinte, a aclimatizao.
Calcula-se que os recursos economizados por esta tcnica, cheguem a 75% dos gastos totais, o que corresponde justamente aos gastos com mo-de-obra e materiais apenas para esta etapa da micropropagao. Como um dos grandes problemas da cultura de tecidos de plantas so os gastos com a produo,
esta alternativa muito importante para obter uma produo com baixos custos.
O enraizamento ex vitro reduz o tempo de cultivo e de comercializao da muda, pois elimina uma etapa
do processo de micropropagao, misturando as etapas de enraizamento e aclimatizao.
No entanto, o enraizamento ex vitro no possui apenas vantagens. Em algumas espcies, a taxa de enraizamento ex vitro to baixa, que a utilizao deste processo invivel. Em outras, a estaca, antes do
enraizamento, necessita de passar por uma etapa chamada de "endurecimento", para conseguir sobreviver ao ambiente adverso da fase de aclimatizao. A alta sensibilidade das estacas requer cuidados especiais para enraizar.
As condies de aclimatao que favoream o endurecimento sempre so positivas para o nmero final
percentual de enraizamento.
Devido ao substrato ser mais poroso e melhor arejado, as razes formadas so mais funcionais e eficientes na absoro de gua e nutrientes. Isso aumenta o nmero de sobreviventes na aclimatizao e tambm diminui o tempo de formao da muda. Se necessrio e de acordo com a espcie micropropagada,
pode-se enriquecer o substrato com sais, do meio de cultura nutritiva ou reguladores de crescimento como auxinas, que aumentam a intensidade e a velocidade do enraizamento. Estes reguladores podem ser
aplicados diretamente no substrato ou na passagem das estacas do tubo de cultura para o substrato.
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f) Haplodiploidizao
A descoberta de Guha e Maheshwari (1964) de que anteras de Datura inoxia cultivadas in vitro podiam
regenerar plantas haplides trouxe grande impacto para a aplicao de tcnicas biotecnolgicas ao melhoramento de plantas. Esta tcnica baseia-se na rediferenciao de clulas gametofticas gerando embries ou calos. Embora preferindo-se a formao de embries somticos como rota regenerativa para a
obteno de haplides geneticamente estveis, a formao de calos tambm pode ocorrer, particularmente em cereais. Aps a obteno dos haplides a di-haploidizao pode ocorrer espontaneamente ou
como resultado do tratamento com colchicina. A principal vantagem a obteno de linhas homozigotas
homogneas rapidamente.
g) Variao somaclonal
O ambiente da cultura in vitro pode induzir variabilidade nas culturas e este fenmeno, primeiramente observado por Larkin & Scowcroft (1981), foi denominado de variao somaclonal. A variabilidade gerada
desta maneira pode ser importante para o melhoramento gentico.
h) Cruzamento amplos
A ampliao da base gentica para o melhoramento de plantas pode envolver cruzamentos interespecficos e intergenricos.
Por exemplo, Atylosia, um gnero taxonomicamente prximo Cajanus, apresenta espcies com caractersticas desejveis, como resistncia a molstias e insetos e tolerncia salinidade e seca. Alguma espcies de Atylosia hibridizam com Cajanus, enquanto que outras no. Mesmo aps cruzamentos bem
sucedidos, ocorrem barreiras de ps-fertilizao, como o no desenvolvimento do endosperma e a subseqente degenerao do embrio hbrido. Nestes casos, o resgate e a cultura de embries pode facilitar
a obteno de hbridos viveis.
Alm de permitir uma nova fonte de variabilidade gentica, a hibridizao ampla tem se mostrado como
tcnica promissora para a produo de plantas haplides via eliminao seletiva de cromossomos, sendo
conhecida como tcnica bulbosum. Assim, quando Hordeum vulgare empregada como me em cruzamentos com H. bulbosum, aps a polinizao e fertilizao, o embrio resultante pode ser haplide uma
vez que o conjunto cromossmico de H. bulbosum pode ser seletivamente eliminado.
i) Hibiridizao somtica/fuso de protoplastos
Esta tcnica, descrita inicialmente por Carlson et al. (1972), pode ser considerada uma forma de engenharia gentica. Nela, protoplastos so isolados e fundidos, envolvendo interaes nucleares e citoplasmticas. A hibridizao somtica produz hbridos nucleares ou hbridos citoplasmticos (cbridos) e sua
eficincia depende do controle dos vrios estgios da tcnica: isolamento e fuso, identificao e seleo
dos heterocariontes e clulas hbridas e a regenerao de plantas. A fuso de protoplastos de diferentes
origens pode ser quimicamente induzida com o a auxlio de um agente indutor, como o polietileno glycol
(PEG) ou eletricamente induzida (eletrofuso).
A fuso somtica tambm pode permitir aos melhoristas a manipulao de caractersticas extracromossmicas, como a macho-esterilidade. O procedimento resulta na unio do citoplasma dos genitores, enquanto que nos cruzamentos sexuais apenas a me contribui com o citoplasma. Assim, a fuso de
proptoplastos pode permitir a obteno hbridos contendo diferentes tipos de citoplasma, o que no pode
ser obtido pelos mtodos convencionais.
A hibridizao somtica tambm pode ser empregada para superar algumas das limitaes inerentes aos
cruzamentos amplos que ocorrem entre espcies ou gneros divergentes. A maior restrio desta tcnica
refere-se, contudo, ao desbalanceamento genmico, perda de cromossomos no pareados ou falta de
fuso nuclear. Mesmo quando a fuso ocorre, pode ocorrer a perda seletiva de cromossomos e o desbalanceamento nuclear resultante pode reduzir a viabilidade e o potencial regenerativo. Esta tem sido a
principal limitao para a aplicao desta tcnica para o melhoramento gentico de plantas.
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c) Genes desejveis de clones selecionados podem ser mantidos em um banco gentico na forma de pomares clonais, onde podem ser recombinados atravs de cruzamentos dirigidos;
d) Interaes gentipo-ambiente podem ser melhor estudadas em populaes clonais;
e) A seleo clonal in vitro e a micropropagao podem ser utilizadas para a produo de gentipos superiores e o tempo necessrio para produzir grandes quantidades de plantas menor no programa clonal
do que em um programa baseado nos pomares clonais;
f)Tcnicas de micropropagao possibilitam a produo de um grande nmero de progenitores genticamente uniformes para a produo de sementes hbridas.
13. LIMITAES
Mesmo considerando-se as diversas aplicaes, ainda existem limitaes para a aplicao mais ampla
destas tcnicas no melhoramento de plantas:
a) Em muitos sistemas de cultura de tecidos a variao introduzida epigentica e, portanto, limitante
para o melhoramento de plantas.
b) Variaes deletreas como reduo na fertilidade e fixao de frutos e sementes e outras variaes
morfolgicas ocorrem em variantes somaclonais, com vrias implicaes no melhoramento de plantas,
principalmente quando a uniformidade gentica o objetivo.
c) O sucesso de um sistema regenerativo in vitro substancialmente dependente da adequao de um
meio de cultura apropriado para cada espcie.
d) O desenvolvimento de eixos caulinares, gemas e embries somticos no , em geral, sincronizado,
dificultando a aplicao de sistemas-biofbricas.
14. CONSIDERAES FINAIS
A possibilidade de uma adequada manipulao da morfognese in vitro para a obteno de processos
regenerativos via organognese ou embriognese somtica parece ser dependente de condies determinativas e permissivas. Nas primeiras salientam-se a "condio fisiolgica do explante" e o tipo e concentrao do regulador de crescimento a ser utilizado como sinal qumico para a induo/ativao da
morfognese. De maneira geral, quanto mais juvenil for o tecido doador de explantes e quanto mais meristemtica for sua condio, maiores sero as possibilidades de se orientar a morfognese in vitro. Para
a embriognese somtica, restam poucas dvidas de que tecidos embrionrios so os mais adequados
para a extrao de respostas nesta rota, apesar de que nem sempre estes tecidos so os mais interessantes para os propsitos a serem obtidos. Com respeito aos reguladores de crescimento, a sua ao
para a obteno de respostas organogenticas relaciona-se aos padres apontados por Skoog e Miller
(1957), isto , balanos favorveis as citocininas tendem a induzir organognese area enquanto que balanos favorveis as auxinas favorecem a rizognese. Para a ativao/induo da embriognese somtica a adio de auxinas fortes ao meio de cultura primrio parece ser uma condio essencial para o desencadeamento de reaes metablicas associadas com esta rota, apesar de que o balano entre fontes
nitrogenadas orgnicas e inorgnicas, oxidadadas e reduzidas parece exercer considervel influncia. As
chamadas condies permissivas incluem a composio geral dos meios de cultura e as condies fsicas, tais como temperatura e fotoperodo.
A utilizao de tcnicas de cultura de tecidos para a regenerao e propagao massal de gentipos superiores via organognese e embriognese somtica prtica rotineira em muitos laboratrios. Algumas
limitaes dizem respeito a necessidade de melhoria geral dos protocolos utilizados e a definio e estabelecimento de protocolos para as chamadas espcies "recalcitrantes". nfase especial deve ser dada a
possibilidade de estabelecimento de suspenses celulares morfogenticas. Um maior detalhamento das
tcnicas de biologia celular e molecular vem permitindo um maior refinamento das tcnicas de cultura de
tecidos vegetais e a conseqente aplicao para tecnologias de protoplastos e transformao gentica.
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