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Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose

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Bioquímica I

2010/2011
Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose

Alunas: Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado n.º 40267

29 de Março de 2011
1.º Ano - 2.º Semestre

proteínas. As macromoléculas. neste caso. Tratamento e Discussão de Resultados Tira de acetato de celulose obtido na electroforese 1 – Albumina 2 – Globulinas 1 3 – Globulinas 2 4 – Globulinas  5 – Globulinas  6 – Ponto de aplicação Imagem 1 Tira de acetato de celulose obtida na electroforese (após a transparentização). o movimentam-se eléctrodo com carga positiva (ânodo). Interpretação do electroforama obtido A electroforese envolve o movimento de espécies carregadas em solução sob a acção de um campo eléctrico. quando têm carga global positiva – pH inferior ao pI da proteína para –. vão se movimentar no sentido oposto à sua carga (num determinado valor de pH).Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 2 1. eléctrodo com carga 29 de Março de 2011 . o movimentam-se Imagem 2 Esquema de uma electroforese. Quando as proteínas têm carga global negativa – pH superior ao pI da proteína para –. Apresentação.

com um raio r.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 3 negativa (cátodo). logo a amostra foi aplicada perto do cátodo pois assim seria mais fácil observar a diferença entre as bandas. Globulinas 1. Se o pH for igual ao pI. já que a sua carga global será nula – logo não migrará para nenhum eléctrodo. No entanto.6 todas migram para o ânodo. a proteína ficará no ponto de aplicação. Se o pH da solução for superior ao pI. que lhes confere a mobilidade numa electroforese. q. Globulinas 2. a proteína ficará com carga global positiva (logo irá mover-se para o cátodo). Globulinas . Se o pH da solução for superior ao pI (ponto isoeléctrico). e inversamente proporcional ao tamanho da molécula e à viscosidade do meio (ɳ) em que se processa a electroforese. Esta grandeza é inversamente proporcional à carga. como apresentam mobilidades semelhantes geralmente apresentam apenas 5 bandas distintas:      Albumina. A mobilidade electroforética (µ) de um composto é definida como sendo igual à sua velocidade de migração (v) por unidade de intensidade de campo eléctrico aplicado (E). Como todas as proteínas ficam com carga global negativa quando em solução tampão a pH 8. é válida a relação: A carga das proteínas. No soro de coelho normal estão presentes 15 proteínas que influenciam o modelo electroforético. Globulinas . No caso de a molécula ser esférica. 29 de Março de 2011 . a proteína ficará com carga global negativa (logo irá mover-se para o ânodo). depende do valor de pH da solução tampão em que se encontram.

Proteínas Nível no plasma (g dm-3) Mr pI aproximado Albumina Globulinas 1 Globulinas 2 Globulinas  Globulinas  40.5 8.3 – 7.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 4 Na tira de acetato de celulose apresentada acima (Imagem 1) é possível observar 5 bandas distintas. β e  .0 66 000 40 000 – 60 000 100 000 – 400 000 110 000 – 120 000 150 000 – 400 000 4. é a albumina a proteína que mais migra.3 6. Pode-se também verificar que as intensidades das cores são diferentes. Quanto maior a diferença entre o pH e o pI e menor a massa relativa da proteína mais esta migra. o seu nível no plasma e o seu pI. . Quadro 1 Quadro com a massa relativa de cada proteína.9 4. sendo seguida pelas globulinas 1. Verifica-se.5 6. 2. o factor de diferenciação das moléculas na tira vai ser a massa molecular relativa.9 – 6.0 4. Assim.as suas concentrações no plasma são menores. que a banda correspondente à albumina é a de cor mais intensa – pois está presente no plasma em maiores concentrações – e as menos intensas são as globulinas α. No entanto.  (esta última é a que apresenta uma diferença entre o pH e o pI menor e a que tem maior massa).6 29 de Março de 2011 . como a que tem menor massa relativa é a albumina e é nesta que a diferença entre o pH e o pI é maior. quando as cargas das proteínas são semelhantes. devido às concentrações em que estão presentes no plasma.5 11. então.

O aumento da intensidade de corrente deve-se não só ao número de tiras. os dois compartimentos (que continham solução tampão) tinham a mesma carga. a tempos de exposição à intensidade de corrente diferentes. registada pelos diferentes grupos. como se pode observar no quadro 2. é a área. Durante a realização da electroforese verificou-se um aumento da intensidade de corrente. Para que elas começassem a migrar era necessário criar uma diferença de potencial entre eles (um tinha de ficar com carga positiva – ânodo – e outro com carga negativa – cátodo). é a velocidade de impulso e . logo ligou-se os eléctrodos da tina à fonte de alimentação e regulou-se a diferença de potencial para 200V. logo as proteínas não migravam. pois a área por onde passa a corrente eléctrica é maior (pela equação é a corrente eléctrica. Tira nº Tempo(min) 0 I (mA) 9 13 14 15 6 3 1 2 3 4 5 6 45 50 60 70 90 100 No inicio da electroforese. onde é a carga) como também ao aumento da temperatura (devido a energia dissipada) que 29 de Março de 2011 . 6 mA.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 5 Justificação do aumento da intensidade de corrente ao longo da electroforese Quadro 2 Medição da amperagem. Como consequência. Esta corrente só existe enquanto houver diferença de potencial entre os compartimentos – para que continue a existir corrente eléctrica é necessário manter ligada a fonte de alimentação. ao ligarmos os dois compartimentos através da tira de acetato de celulose houve uma corrente eléctrica no sentido do cátodo para o ânodo.

Quando se retirou a terceira tira (no total de seis) é possível observar que a intensidade de corrente começou a baixar. e. Quando se retirou as tiras de acetato de celulose. isto deve-se ao facto de haver menos tiras a ligar os dois compartimentos (a área por onde passa a corrente eléctrica é menor). sendo à intensidade da corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência. o aumento da Função do Ponceau S Imagem 3 Fórmula estrutural da solução de Ponceau S. à resistência e . pois liga-se aos grupos amina (carregados positivamente) e às regiões apolares da proteína. A coloração das proteínas tornou possível visualizar com maior facilidade as cinco bandas referidas acima. no final da electroforese. estas foram mergulhadas em solução de Ponceau S. aumenta a intensidade da corrente mobilidade dos iões na solução. Este reagente permite corar as proteínas. Desta forma.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 6 tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão. pela lei de Ohm ( que corresponde ao potencial eléctrico. 29 de Março de 2011 . portanto. o que se traduz numa diminuição da resistência. bem como determinar a que estava em maior ou menor concentração – a com cor mais intensa é que existia em maior concentração. numa tira de acetato de celulose é possível observar bandas vermelhas (que são as proteínas coradas) num fundo transparente.

Tiras 1 (45 minutos) Resultado 2 (50 minutos) 3 (60 minutos) 4 (70 minutos) 5 (90 minutos) 6 (100 minutos) A electroforese realizada na aula prática foi deixada a decorrer durante tempos diferentes para os diferentes grupos.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 7 Comparação dos resultados obtidos pelos diferentes grupos Quadro 3 Resultados obtidos pelos diferentes grupos. 29 de Março de 2011 . de modo a podermos comparar os resultados da eficiência de uma electroforese. aproximadamente. O tempo pré-definido fora os 45 minutos – tempo ao qual foi retirada a primeira tira. A partir daí as tiras foram retiradas de 10 em 10 minutos.

foi possível distinguir-se com alguma facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível das suas migrações. pelo que a corrente eléctrica a que esta tira foi exposta também foi fraca o que. assim como uma fraca migração das 5 proteínas. Esta tira apresenta uma intensidade de corrente eléctrica semelhante à registada quando se retirou a quarta tira. Aqui a intensidade de corrente era praticamente idêntica à que se verificava quando se retirou a primeira tira. Aos 70 minutos foi retirada a quarta tira.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose O primeiro grupo foi aquele cujos resultados foram menos visíveis – a tira deste grupo esteve exposta a uma corrente eléctrica durante um curto tempo. quando comparada com as restantes tiras. Por esse motivo. foi retirada a segunda tira. Como esta tira esteve mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica. Aos 100 minutos. devido ao maior tempo de exposição. em semelhança às últimas duas. pelo que o factor determinante na distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo. Esta tira ainda se apresentava na condição atrás mencionada: pouco tempo de exposição á corrente eléctrica. Nesta tira podemos assumir que a corrente eléctrica foi mais fraca. nesta tira também não foi possível distinguir com facilidade as 5 bandas das diferentes proteínas do soro de coelho e não se observou uma boa migração por parte das mesmas. também esteve exposta a uma menor intensidade 8 29 de Março de 2011 . foi retirada a sexta e a última tira. podemos afirmar e observar que se conseguiu distinguir mais facilmente as 5 bandas distintas de proteínas e a migração das mesmas também foi mais eficaz. retirou-se a quinta tira. Esta tira. Dez minutos depois foi retirada a terceira tira. No entanto. Após 90 minutos desde que se retirou a primeira tira. As bandas das proteínas não são claramente visíveis e são difíceis de distinguir (pouca migração das 5 proteínas) por esse mesmo motivo (fraca exposição à corrente eléctrica) Após 50 minutos do início da electroforese. somando ao pouco tempo da sua exposição. resulta numa fraca distinção das bandas. uma vez que havia menos tiras na tina de electroforese.

pdf (2 de Abril de 2011. mais fácil se torna a distinção das bandas assim como o diferente grau das suas migrações.. Lisboa. Eds..angelfire. Lidel. A. Halpern. podemos dizer que quanto mais tempo estiver exposta e mais forte for a passagem de corrente eléctrica. Como esta tira esteve ainda mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica. foi possível distinguir-se com mais facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível das suas migrações. M.J.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 9 de corrente eléctrica e. 2. Freire.. Em conclusão.com/clone2/fouad/techniques/ponceau_S_sol ution. mais uma vez. “Bioquímica – Organização Molecular da Vida”. às 15:04 h) 29 de Março de 2011 . Bibliografia   Quintas. o factor determinante na distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo.P. 2008 http://www. A.

usou-se um tampão de fosfatos de sódio (pH 6. Questões a desenvolver As instruções para a realização de uma electroforese em papel indicam que a amostra deve ser aplicada numa tira de papel 10x10cm.  Por engano.5) 100mM na separação. Ao não se ligar o sistema de refrigeração do aparelho a temperatura aumentaria logo. Ao aumentar a força iónica da solução provoca-se uma super condutividade eléctrica que gera calor (energia dissipada). à resistência e . o aumento da mobilidade dos iões na solução. sendo que à intensidade da corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência.5) 1mM. Preveja as consequências das seguintes acções. para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência. a viscosidade da solução tampão diminuiria bem como a sua resistência. R à resistência e I à intensidade da corrente). Ao diminuir a resistência de acordo com a lei de Ohm ( .Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 10 3. Este calor tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão. a electroforese decorreria mais rapidamente. pela lei de Ohm ( corresponde ao potencial eléctrico. portanto. e sujeita depois a 10mA durante 1h a 0ºC. aumenta a intensidade da corrente o que leva a que 29 de Março de 2011 . previamente impregnada de uma solução tampão de fosfato de sódio (pH 6. não se ligou o sistema de refrigeração do aparelho. o que se traduz numa diminuição da resistência. sendo que V corresponde ao potencial eléctrico. aumenta a intensidade da corrente e. justificando:  Por engano. o que iria provocar que as proteínas mergulhassem na solução tampão. Desta forma. Ao usar um tampão com maior concentração aumenta-se a força iónica da solução.

2. haveria a tendência para que esta se deslocasse no sentido de equilibrar os volumes. Esta diferença de pressão conduziria a um movimento de iões da solução da zona de maior pressão para a de menor pressão. 29 de Março de 2011 . Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do deslocamento do volume fossem iguais: as proteínas migrariam mais rapidamente.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 11 as proteínas da amostra possam atravessar totalmente a tira de acetato de celulose mergulhando na solução. Este facto iria afectar os resultados da electroforese pois: 1.  Um compartimento do aparelho de electroforese tinha um volume maior de solução tampão do que o outro. situação que corresponde a equilíbrio. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do deslocamento do volume fossem opostos: as proteínas migrariam no sentido contrário ao que deveriam (sentido da sua carga) e por isso o resultado obtido seria errado. A diferença entre os volumes levaria a uma maior pressão na extremidade da tira de acetato de celulose em relação à outra extremidade. Se num dos compartimentos houvesse um volume maior de solução tampão. podendo mergulhar na solução. até que a pressão nas duas extremidades da tira se igualassem.

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