Virologia Bsica

Ricardo Brilhante de Medeiros

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Ttulo: Virologia Bsica Autor: Ricardo Brilhante de Medeiros Editora: CopyMarket.com, 2000

1. Vrus Fitopatognicos
Ricardo Brilhante de Medeiros

1.1. Caractersticas Gerais dos Vrus

So agentes submicroscpicos que no podem ser visualizados com microscpio tico, apenas atravs de microscopia eletrnica, pois seu tamanho varia na ordem de nanmetros (1nm = 10-3 m = 10-3 mm; portanto na escala de milionsimos de milmetros). Possuem como material gentico DNA ou RNA. Em organismos celulares, o DNA sempre o material gentico (que armazena a informao gentica - os genes) e o RNA o principal componente da maquinria biossinttica da clula (na forma de ribossomos, mRNA e tRNA). As protenas codificadas por seus genes so produzidas atravs do uso desta maquinria biossinttica (alm dos ribossomos, tRNAs, tambm usa os aminocidos, ATP, e outros elementos disponveis na clula); so portanto parasitas do metabolismo celular. Possuem composio orgnica simples, com poucas protenas estruturais. DNA ou RNA de fita simples ou dupla. Capa proteica ou capsdeo: invlucro proteico do material gentico, formada por centenas ou milhares de cpias de uma ou mais protenas, em geral uma nica protena. Possuem protenas estruturais (presente na partcula) e no-estruturais (as codificadas pelo vrus mas encontradas apenas na clula infectada, ausentes na partcula). Alguns vrus (chamados envelopados) possuem membrana (envelope): composta de fosfolipdios e polissacardeos, sequestrada da clula hospedeira. Morfologia do nucleocapsdeo: icosadrica (isomtrica), helicoidal ou elongada (bastonete). Parasitas intra-celulares obrigatrios, inertes fora das clulas. Progenia formada por montagem de novas partculas a partir das subunidades produzidas pela clula. Quase totalidade dos vrus de DNA so de fita dupla (excees: os parvovrus e geminivrus); para os de RNA, quase todos so de fita simples (excees: reovrus e birnavrus); ss = sigla em ingls para fita simples; ds = fita dupla. Membranas, quando existem, contm glicoprotenas codificadas pelo vrus e necessrias para entrada nas clulas animais (hospedeiro principal ou inseto vetor). Vrus de plantas possuem um gene sem homlogo entre os vrus animais: o gene responsvel pelo movimento na planta. Alguns vrus contm enzimas na partcula viral, como polimerases, proteases, etc. O genoma viral contm toda a informao gentica necessria para o vrus iniciar e completar o ciclo infeccioso numa clula suscetvel. O ciclo infeccioso inclui: ligao (animais), entrada, desmontagem (para os que possuem membrana)/decapsidao, replicao, transcrio/traduo, montagem, brotamento (para aqueles com membrtana) e liberao das novas partculas. Diferentes componentes das partculas virais podem ser sintetizados em diferentes compartimentos celulares (protenas no retculo endoplasmtico-RE, genoma no ncleo ou livre no citoplasma, etc); e o acmulo de cada protena tambm pode dar-se em diferentes compartimentos (Golgi, RE, membrana plasmtica). A montagem das partculas ocorre no chamado viroplasma e a partcula do vrus completa chamada vrion. Vrus so exemplos elegantes de arquitetura em escala molecular; o icosaedro o volume geomtrico de maior relao volume/tamanho.
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1.2. Origem e Evoluo dos Vrus

Vrias hipteses tm sido levantadas para a origem dos vrus, entretanto ainda no h um consenso visto que o tema envolve a origem da prpria vida, ou a origem das molculas que deram origem aos organismos vivos (DNA e RNA); portanto so hipteses de origem dos vrus so ainda especulativas, difceis de serem comprovadas. Alguns pontos so alvo de polmica: a) Seriam os vrus organismos vivos ou apenas pedaos de cido nucleico envoltos por estruturas protetoras? Esta questo semntica (depende da definio de organismo vivo). b) Os vrus surgiram antes ou depois das clulas? Alguns virologistas acreditam que teria sido depois, visto que vrus dependem de clulas para existir, outros acreditam ter sido antes, visto a simplicidade de alguns cidos nucleicos virais. Muitos acreditam ter sido concumitantemente com o aparecimento das clulas. c) O mundo pr-bitico parece ter sido formado, preponderantemente, de mlculas de RNA (teoria do RNA World, largamente aceita), o que poderia explicar a grande versatilidade das molculas de RNA, que podem funcionar como enzimas (ribozimas), estruturas (ribossomos) e armazenadoras de informao gentica de como em muitos vrus), como o DNA das clulas; assim alguns acreditam que os vrus de RNA teriam surgido primeiro. As hipteses de origem dos vrus so portanto: (i) teriam sido originalmente pedaos de RNA que adquiriram capacidade replicativa e que teriam antecedido a clula (RNA World); (ii) teriam se originado da alterao de estruturas celulares normais (mRNAs, plasmdeos, transposons,etc); (iii) teriam se originado da clula, como subprodutos celulares, que adquiriram a capacidade de enrtar e sair de clulas hospedeiras. interessante notar tambm que os vrus so as nicas entidades biolgicas a codificarem RNA-dependente-RNApolimerases, uma enzima inexistente em sistemas celulares. Ao lado disso, a falta de fsseis de vrus e a habilidade que estes possuem de mutarem muito rapidamente, devido ao seu genoma reduzido, dificulta o estudo da origem dos vrus. Contudo, o acmulo de dados moleculares obtido na ltima dcada jogou uma luz na rea da evoluo dos vrus. Anlises comparativas das sequncias de DNA e RNA dos genomas virais mostrou grandes similaridades na organizao dos genomas e na estratgia de replicao e expresso de vrus completamente diferentes em termos de gama de hospedeiras e morfologia das partculas. Por exemplo, os potyvrus, que possuem partculas em forma de bastonete e atacam plantas, e rhinovrus, que possuem partcula isomtrica e causam gripe em seres humanos, mostram a mesma organizao genmica e a mesma estratgia de replicao e expresso (o genoma de ambos os grupos codifica para uma poliprotena nica, com a mesma organizao gnica e certa homologia de sequncia, que clivada em vrias protenas aps a traduo). Isso indica uma mesma origem, ou seja, a partir de um ancestral comum. Inmeros outros exemplos similares so encontrados quando comparamos bacterifagos, vrus humanos, animais e de plantas. Os vrus de RNA de senso negativo (no traduzveis diretamente pelos ribossomos) parecem possuir alguns mecanismos diferentes de evoluo, embora em linhas gerais paream ser os mesmos dos vrus de RNA positivo. Para ambos a recombinao de pedaos de RNA/DNA parece ter um papel primordial na evoluo dos genomas virais.

1.3. Principais Vrus de Plantas e sua Classificao

Nota: ao contrrio dos organismos celulares, que seguem a nomenclatura em latim binomial, as espcies de vrus, por conveno, so nomeadas em ingls e a sigla usada na linguagem coloquial (HIV por exemplo, que a sigla para human immunodeficiency virus). A lista a seguir est organizada de acordo com o tipo de cido nucleico, morfologia da partcula, os gneros de vrus e as espcies.

DNA FITA DUPLA:

Caulimovrus: genoma circular, descontnuo, de 8 kb, usa RNA intermedirio na replicao, que ocorre no ncleo; genes expressados de um transcrito completo, usa transcriptase reversa como polimerase, tRNAs como primers, oito genes; partculas isomtricas montadas no citoplasma; vrions encontrados no plasmodesma; primeiro vrus de DNA reportado em plantas (Shepherd, R.J., 1968) e primeiro vrus de planta a ser clonado; transmitidos por afdeos de maneira bimodal; fator de transmisso coficado pelo vrus; forma incluso citoplasmtica.
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Espcies: cauliflower mosaic virus (CaMV, vrus do mosaico da couve-flor), strawberry vein banding, soybean chlorotic mottle, cassava vein mosaic, dahlia mosaic virus. Badnavrus: recentemente descobertos, no-envelopados, baciliformes, genoma de dsDNA descontnuo, circular, um dos genes possui homologia com transcriptase reversas, transmitido por cigarrinha. Espcies: rice tungro baciliform virus (um dos vrus causadores do tungro do arroz).

DNA FITA SIMPLES:

Geminivrus: genoma circular, mono e bipartido, semelhantes a plasmdeos, o que pode ter sido sua origem, partcula geminada formada por dois icosaedros, ssDNA (R. Goodman, 1970), replicao ocorre no ncleo por mecanismo de crculo rolante. Grupo A: transmitidos em geral por cigarrinha, monopartido. Espcies: maize streak, wheat dwarf, beet curly top, tomato yellow leaf curl (TYLCV, grande importncia econmica no mundo). Grupo B: em geral por mosca branca (Bemisia tabaci), genoma bipartido (DNA-A e DNA-B). Espcies: African cassava mosaic, bean golden mosaic (BGMV, mosaico dourado do feijoeiro, grande importncia econmica), tomato golden mosaic.

RNA FITA DUPLA:

Fitoreovrus: isomtrico, transmitidos por cigarrinhas (Agallia constricta, Nephotettix spp.), replicam no vetor, RNA multisegmentado, capa proteica com dupla camada; gnero faz parte de famlia que inclui vrus animais (Reoviridae); possuem receptores nos insetos vetores; Phytoreo: 12 segmentos (rice dwarf, wound tumor). Fiji: 10 segmentos (Fiji disease virus em cana-de-acar, pangola stunt, mal do rio quarto virus, maize rough dwarf).

RNA FITA SIMPLES, SENSO NEGATIVO:

1. Com Membrana: Fitorhabdovrus: uma nica fita de RNA de senso negativo, transmitido por afdios, cigarrinhas e caros; uma nica glicoprotena formando o envelope, protena matriz responsvel pela montagem das partculas; tambm parte de famlia de vrus animais (Rhabdoviridae). Espcies: maize mosaic (faixa necrtica das nervuras do milho), coffea ringspot (mancha anelar do cafeeiro, transmitido por caro), lettuce necrotic yellow, sonchus yellow vein. Tospovrus: 3 segmentos de RNA, 1 de senso negativo e 2 ambissensos; 4 protenas estruturais e 2 no-estruturais, duas glicoprotenas no envelope; montagem no Golgi, transmisso por diversas espcies de tripes (Frankliniella spp.; Thrips spp.) de maneira circulativa-propagativa, associao das glicoprotenas com receptores no vetor; parte da famlia de vrus animais Bunyaviridae. Espcies: tomato spotted wilt (TSWV, vira-cabea do tomateiro), tomato chlrotic spot, groundnut ringspot, Impatiens necrotic spot (todos de grande importncia econmica).

2. Sem Membrana:
Tenuivrus: filamentosos, multisegmentado (4 RNAs), transmitidos por cigarrinhas, infectam gramneas, aparentemente codificam para protenas de membrana, apesar de membranas no serem encontradas nas partculas purificadas, similares a tospovrus na estrutura genmica. Espcies: rice stripe, rice hoja blanca, maize stripe.

RNA FITA SIMPLES, SENSO POSITIVO:

Genoma Monopartido: a) Isomtrico: Luteovrus: transmitidos por afdeos de maneira circulativa no-propagativa, restritos ao floema, estabilidade no vetor associada uma protena (Gro-El) de uma bactria endossimbionte (Buchnera sp.). Espcies: barley yellow dwarf, potato leaf roll (vrus do enrolamento da folha, importante economicamente).
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Tymovrus: transmitidos por colepteros, formam vesculas no cloroplasto. Espcies: turnip yellow mosaic, eggplant mosaic, passion fruit yellow mosaic. b) Bastonetes: Tobamovrus: bastonete rgido, rtansmitido mecanicamente com muita facilidade, grande persistncia no ambiente, importncia histrica e como vrus-modelo. Espcies: tobbaco mosaic (vrus do mosaico do fumo), tomato mosaic. Potexvrus: alongados, flexveis, sem vetor. Espcies: potato virus X, papaya mosaic. Potyvrus: partculas flexveis, transmitidos por pulgo, fungo, caro e mosca branca; produzem incluses lamelares do tipo "cataventos" na clula, mais de 300 membros no grupo, grande importncia econmica pelo elevado nmero de espcies. Espcies: agropyron mosaic (caro), sweet potato mild mottle (mosca branca), barley yellow mosaic (Spongospora), potato virus Y (afdeo), bean common mosaic (semente), beet mosaic, lettuce mosaic (semente), papaya ringspot, soybean mosaic (mancha-caf), potato virus A, sugarcane mosaic, tobacco echt, watermelon mosaic. Carlavrus: partculas longas e rgidas, transmitidos por pulgo e mosca branca. Espcies: carnation latent virus. Closterovrus: bastante elongados, 600 - 2000 nm de comprimento, afdeos vetores, restritos ao floema. Espcies: citrus tristeza (vrus da tristeza dos citrus), beet yellows. 2. Genoma Bipartido: a) Isomtrico: Comovrus: transmitidos por colepteros. Espcies: cowpea mosaic, cowpea severe mosaic. Nepovrus: transmitidos por nematides (Xiphinema e Longidorus). Espcies: tobacco ringspot, grapevine fan leaf, potato black ringspot, tomato ringspot. b) Bastonetes: Tobravrus: elongado, vetorados por nematides dos gneros Trichodorus e Paratrichodorus, formam camadas em volta da mitocndria. Espcies: tobacco rattle virus, pepper ringspot. 3. Genoma Multipartido: a) Isomtrico: Ilarvrus: tripartido, transmitido por nematide e caro. Espcies: tobacco streak (necrose branca do fumo). Cucumovrus: tripartido, afdeos. Espcies: cucumber mosaic. Bromovrus: tripartido, transmisso mecnica. Espcies: brome mosaic, broad bean mottle, cowpea chlorotic mottle. b) Baciliforme: Alfafa Mosaic: tambm faz parte da famlia Bromoviridae, apesar da morfologia diferente; 4 partculas, em forma de bastonete e esfrica, 3 so infectivas e 1 no necessria a infeco, afdeos. Hordeivrus: elongado, vetor desconhecido. Espcies: barley stripe mosaic.

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1.4. Critrios Utilizados na Classificao dos Vrus

a) Morfologia das partculas (isomtrica, bastonete, baciliforme) b) Modo de transmisso: afdeos, colepteros, nematides, caros, fungos, semente, etc. c) Tipo de cido nucleico: DNA ou RNA. d) Nmero de fitas: simples ou dupla. e) Peso molecular do cido nucleico. f) Porcentagem do cido nucleico na partcula. g) Formato do capsdio: esfrico, elongado. h) Hospedeira: planta, bactria, fungo, inseto, vertebrado. i) Presena de envelope. j) Sintomatologia k) Citopatologia l) Sorologia (relacionamento sorolgico, homologia de epitopos). m) Homologia de sequncias de cidos nucleicos e outras caractersticas moleculares, que so hoje as principais caractersticas taxonmicas. Observaes complementares: i) ii) iii) Classificao: o arranjo das entidades biolgicas em categorias taxonmicas, baseando-se em similaridades e relacionamentos. Nomenclatura: a designao de nomes para os taxa (categorias taxonmicas), de acordo com regras internacionais (estabelecidas pelo ICTV para os vrus). ICTV: International Committee for Taxonomy of Viruses. Sub-dividido em subcomits: vertebrados, invertebrados, fungos, bactrias e plantas. Props o estabelecimento de uma taxonomia universal para todos os vrus. Grupos de estudo, formados por pesquisadores renomados em cada grupo de vrus, foi estabelecido para ditar as regras e validar as espcies de vrus publicadas. International Congress of Microbiology, Moscou, 1966: foi estabelecido o primeiro cdigo "rudimentar" para vrus. Objees surgiram nomenclatura "latinizada" (sistema binomial), visto que vrus no so organismos celulares, e alguns nem os consideram organismos. Seguiram-se os congressos de Sendai, Japo (1984); Edmonton, Canad (1987); Berlin, Alemanha (1990); Glasgow, Esccia (1994); Sydney, Australia (1998). Famlias, gneros e espcies de vrus podem ser encontrados na pgina Index Virum, uma verso do ltimo relatrio do ICTV on-line com servio de busca: http://life.anu.edu.au/viruses/ictv/index.html Famlias e gneros devem ser grafados em itlico, o nome das espcies deve iniciar-se com letra minscula, etc.

iv) v) vi) vii) viii)

1.5. Alguns Conceitos de Valor Taxonmico

a) Vrus: a palavra significa veneno em latim; vrias definies podem ser formuladas, alguns exemplos: a.1) Entidade biolgica que consiste de um tipo de cido nucleico (DNA ou RNA), envolto por capa proteica, s vezes por membrana de origem celular, e que se multiplica somente em clulas vivas. a.2) Agente biolgico submicroscpico, parasita intracelular obrigatrio que explora a maquinaria biosinttica da clula para reproduzir; genoma formado de DNA ou RNA, progenia formada por montagem de novas partculas, sem sistema de gerao de energia, cido nucleico envolto por capa proteica, e s vezes, por membrana de origem celular, e sem sistema de traduo proteica. b) Espcie de vrus: grupo de isolados com grande similaridade nas sequncias de cido nucleico e protena, e nas propriedades antignicas. c) Gnero: grupo de espcies com semelhante sorologia, morfologia e estratgia de replicao, alm de mesma origem. d) Famlia: gneros com mesma composio do genoma, no. de fitas, no. de partculas. e) Ordem: exemplo Mononegavirales (que so vrus com membrana, ss RNA, monopartite, senso negativo).

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1.6. Sintomas Causados por Vrus de Plantas

Tipos de sintomas: macroscpicos, microscpicos ou citolgicos, fisiolgicos. Macroscpicos: leses locais (clortica, necrtica), nanismo, mosaico, amarelos, leso em anel, queima, enao, tumores, cordo-de-sapato, breaking. Sintomas similares podem ser causados por: toxinas de insetos, deficincias nutricionais, poluentes do ar, pesticidas, altas temperaturas, anormalidades genticas, outros agentes submicroscpicos como micoplasmas, espiroplasmas e virides. Microscpicos: no mbito celular, como a proliferao de membranas, anormalidades nas organelas, incluses citoplasmticas, cristais, etc. Fatores que podem afetar os sintomas: estirpe do vrus, variedade da planta, ambiente (temperatura, umidade, fotoperodo). Alguns sintomas de vrus (poucos) possuem valor diagnstico.

1.7. Replicao e Expresso Gnica

Vrus de RNA de Senso Positivo: tobamovrus, potyvrus, bromovrus, etc. Chamados positivos por funcionarem como mRNAs (serem traduzveis diretamente pelos ribossomos celulares). Consequentemente no precisam carregar sua polimerase na partcula. Clones infecciosos podem ser obtidos a partir do RNA genmico com relativa facilidade, atravs da produo de clones de cDNA a partir dos RNA virais, usando a enzima transcriptase reversa, e a partir destes cDNAs, transcritos infecciosos so produzidos por transcrio in vitro usando a RNA polimerase II. Diferentes domnios da polimerase e diferentes protenas esto envolvidas conjuntamente no processo replicativo: helicase, metiltransferase, protease e a prpria polimerase. Para picornavrus, por exemplo, h ainda uma protena viral adicional, aparentemente envolvida na replicao: VPg. Para os potyvrus a protena da incluso citoplasmtica tambm est envolvida na replicao. Para os vrus de RNA(+) a decapsidao co-traducional e a capa proteica no participa de processos enzimticos. Fatores in cis (na prpria molcula de RNA) e in trans (outras molculas) esto envolvidos na replicao. O RNA viral (+) molde para os seguintes processos: encapsidao e decapsidao, traduo e sntese da fita negativa. O RNA complementar (-) o molde para transcrio e sntese da fita positiva (genoma do vrus). Todos esses processos so regulados criteriosamente, qualquer desbalano pode provocar interrupo da replicao e infeco. Por exemplo, traduo e sntese da fita negativa tem que ocorrer separadamente, seno haveria choque dos complexos enzimticos (ribossomo e polimerase), j que ocorrem em sentido contrrio no RNA(+). Replicao altamente especfica, RNAs celulares no so reconhecidos pelas polimerases virais e vice-versa; est sempre associada membranas celulares. Existe um excesso de moldes (+) na razo de 50-100 mais que moldes (-). Complexos enzimticos de replicao viral contendo at dez diferentes protenas tem sido extrados de clulas infectadas com BMV, destas apenas 2 so virais. Taxas de mutaes causadas pela falta de capacidade de correo das polimerases virais tem sido calculadas em 10-3 a 10-5, enquanto que na clula esta taxa 1000 a 100.000 vezes menor; acarretando implicaes evolutivas e em termos do limite do tamanho do genoma dos vrus de RNA. Vrus de RNA de senso negativo: rhabdovrus, tenuivrus e tospovrus. No so traduzveis diretamente pelos ribossomos, precisam ser inicialmente copiados para a fita positiva, que complementar, para ento serem transcritos e traduzidos. Clulas no possuem maquinaria necessria para sintetizar RNA a partir de RNA. Da mesma forma o genoma do vrus complementar menssagem (mRNA) e precisa ser transcrito antes que a traduo possa ocorrer. Assim esses vrus precisam carregar suas RNA-dependentes RNA-polimerases na partcula, para que possam infectar a clula.
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Alm da polimerase viral, a capa proteica necessria ao processo de replicao (apenas para os RNA negativo). mRNAs so encontrados nas clulas infectadas para todos os genes virais. As protenas L (polimerase) e N (capsdeo) so associadas ao RNA genmico formando o complexo ribonucleoproteico (RNPs). No caso dos rhabdovrus, h uma terceira protena NS (fosfoprotena) tambm requerida para a atividade polimerase. RNPs tambm so necessrios para o processo de transcrio; mRNAs possuem estrutura cap (tampa) e so poliadenilados, estas estruturas esto relacionadas com a iniciao da traduo e estabilidade do mRNA. Fatores da hospedeira so necessrios replicao. N provavelmente regula o mecanismo de troca de transcrio para replicao, atravs da ligao aos promotores. Cpia de RNA a partir de RNA um processo nico de vrus de RNA. RNAs no so infecciosos. Caractersticas da Polimerase Viral: O termo replicase ou polimerase referese enzima responsvel pela atividade de replicao (sntese de nova fita de RNA ou DNA) e transcriptase atividade de transcrio (sntese de mRNA). A polimerase viral, assim como as celulares, composta de vrios polipeptdeos com diferentes funes (enzima multifuncional). So encontradas associadas membranas celulares. Sequenciamento levou identificao de sequncias tpicas (motivos) e assim identificao de outras provveis polimerases. Iniciao e terminao ocorrem em stios especficos e requerem fatores da hospedeira. Exemplo da eficincia: 1 cpia de RNA de poliovrus gera 50.000 cpias em apenas 8 horas. Polimerases requerem um cofator inico para atividade (exemplo Mg+2). Entendimento do processo replicativo pode levar ao desenvolvimento de novas estratgias de controle, baseadas em tcnicas biomoleculares.

1.8. Movimento do Vrus na Planta

O movimento do vrus na planta (assim como nos tecido de animais e humanos) no passivo, envolve protenas codificadas pelo vrus (protenas de movimento), que se associam de forma especfica com componentes da hospedeira; no caso da planta esses componentes esto nos plasmodesma. O movimento tem duas fases: de clula-a-clula e o movimento vascular (sistmico), em geral via floema. O vrus pode se mover como uma partcula completa ou apenas seu genoma. Para alguns vrus (bromo e tobamo) esse movimento requer apenas a protena do movimento (para o TMV uma protena de 30 kDa, para BMV a protena 3a), mas a ausncia da capa proteica reduz a eficincia do transporte celular; para comovrus a capa proteica essencial. Tem sido mostrado que a maioria dos vrus ssRNA (+) podem infectar protoplastos de qualquer planta, de onde se conclui que a especificidade pela hospedeira funo da habilidade do vrus mover-se no tecido da planta. Os plamodesmata possuem tamanho limitado e algumas vezes o vrus usa de protenas cuja interao faz com que aumente-se o dimetro do plasmodesma (como mostrado para TMV). possvel que vrus limitados ao floema, como os luteovrus, no possuam esta capacidade de interagir com plasmodesmata, da sua localizao limitada. A protena de 30 kDa do TMV interage com o citoesqueleto celular, provavelmente par transportar o complexo RNA-30 kDa at o plasmodesma. Para o movimento a longa distncia (sistmico), muitas vezes a capa proteica essencial (BMV, TMV).

1.9. Transmisso de Vrus de Planta a Planta

Os vrus de plantas no conseguem penetrar a cutcula e a parede celular que protegem as clulas vegetais; para driblar esta limitao os vrus tem que encontrar maneiras de ultrapassar tais barreiras; o que ocorre atravs de: (a) trasmisso pela semente infectada ou rgos vegetativos, (b) ou atravs da penetrao direta via ferimentos ou ainda pela (c) penetrao com o auxlio de vetores (organismo que carrega o vrus atravs da interao e reconhecimento especficos com o vrus).
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A transmisso de vrus de plantas por vetores no um processo passivo, ao contrrio um processo dinmico e especfico (apenas determinados vetores transmitem determinados vrus), que depende de genes especficos do vrus e do vetor. Os principais grupos de vetores so: insetos (99% dos artrpodes vetores), sendo que dentre estes os afdeos (pulges) e as cigarrinhas so os mais comuns; temos ainda nematides (ordem Dorylaimida); fungos (Spongospora, por exemplo) e caros. Tipos de relao vrus-inseto vetor: Circulativa (persistente): vrus adquirido atravs do canal alimentar e translocado para outras partes do corpo do inseto vetor; segue-se um perodo de latncia,onde o inseto no consegue transmitir; e ento o vrus injetado na planta atravs da glndula salivar; dividida em dois sub-tipos: Propagativa: vrus multiplica-se no vetor (o que pode ser medido por ELISA), s vezes chega a infectar os ovos do inseto (transmisso transovariana), s vezes acarreta em aumento na mortalidade do inseto vetor; ou seja, neste caso, o inseto mais um hospedeiro do vrus. Exemplos: Fitorhabdovrus, Tospovrus, Fitoreovrus e provavelmente, Geminivrus. No-propagativa: vrus no multiplica-se no vetor. Exemplo: Luteovrus (PRLV). No-circulativa: vrus no circula no corpo do inseto; fica retido nas estruturas alimentares (estilete, canal alimentar, intestino anterior); no h perodo de latncia; o inseto perde a capacidade de transmitir (no mais virulfero) aps a ecdise; vrus no encontrado na hemolinfa ou na glndula salivar; subdivida em: No-persistente: inseto permanece virulfero (retm inoculatividade) por alguns minutos aps alimentar-se na planta infectada; perodo de fome aumenta capacidade de inocular o vrus; tempo necessrio para aquisio e inoculao dura segundos (picadas-de-prova); perodos de aquisio maiores que um minuto diminuem taxas de transmisso. Exemplos: potyvrus, AMV, carlavrus. Semi-persistente: intermedirio entre no-persistente e circulativo; inseto permanece horas inoculativo, tempo de aquisio e inoculao de minutos; perodo de fome no produz efeitos; perodos de aquisio maiores que um minuto aumentam taxas de transmisso; em geral so vrus de floema. Exemplos: closterovrus (Tristeza dos citrus), CaMV (bimodal, caractersticas de no-persistente e semi-persistente). Tipos de vetor versus tipo de vrus: Artrpodes: - Afdeos: potyvrus, caulimovrus, luteovrus. - Cigarrinhas: alguns geminivrus, fitoreovrus, fitorhabdovrus. - Mosca-branca: alguns geminivrus (BGMV). - Tripes: tospovrus. - Besouros: comovrus. - caros: wheat streak mosaic virus, alguns fitorhabdovrus. Nematides: Longidorus e Xiphinema (nepovrus) e Trichodorus (tobravrus); caractersticas de relao nopersistente. Fungos: tobacco necrosis virus, soil-borne wheat mosaic, potato mop-top. Outros modos de transmisso: - Semente e plen: TMV em tomate (tegumento), AMV (embrio), potyvrus (embrio), nepovrus (plen). - Cuscuta e enxertia. Especificidade da trasmisso de vrus por insetos determinada no plano molecular: protenas HC de potyvrus essencial para transmisso, assim como glicoprotenas de tospovrus e receptores virais em tripes; capa proteica de geminivrus, cucumovrus, potyvrus e fitoreovrus. Aspectos Moleculares da Interao Vrus-Vetor: Receptores Celulares e Ligantes Virais A entrada na clula o primeiro evento necessrio infeco viral. Vrus de animais e humanos utilizam receptores celulares (fator celular reconhecido pelo vrus que permite mudana de conformao da membrana plasmtica e consequente abertura de um canal para entrada do vrus na clula) no s para entrarem na clula hospedeira como tambm para se moverem de clula-a-clula.
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Dada a existncia da parede celular circundando a membrana plasmtica na clula vegetal e o fato destas clulas serem diretamente conectadas atravs de plasmodema, os vrus de planta, ao contrrio dos de animais, no podem e no utilizam receptores para sua entrada ou movimento celular. Para se movimentar os vrus de planta utilizam suas prprias protenas de movimento, provavelmente atravs da interao com componentes da planta hospedeira presentes nos plasmodesma; alm da interao com outros componentes da planta para o movimento sistmico; tais componentes poderiam ser chamados fatores de movimento. Vrus de plantas so diretamente introduzidos em suas hospedeiras atravs da re-alimentao por vetores (grande maioria insetos), que introduzem o vrus pela saliva infectada, ou por ao mecnica, ambos envolvendo a destruio parcial da parede celular e perfurao da membrana plasmtica. Alguns vrus de planta, entretanto, infectam, replicam e circulam em seus insetos vetores (os de relao circulativapropagativa), e consequentemente, como os vrus de animais e humanos, precisam interagir com receptores celulares nas clulas do inseto vetor para que possam infect-los e serem transmitidos suas plantas hospedeiras. Esses vrus possuem a capacidade de infectar clulas vegetais e animais, provavelmente pelo fato de serem patgenos de insetos fitfagos que posteriormente adquiriram a capacidade de mover-se em tecidos vegetais (teoria). Exemplos incluem fitorhabdovrus, fitoreovrus, tospovrus e, provavelmente, geminivrus. Os trs primeiros grupos, alis, fazem parte de famlias de vrus de animais e humanos, o que refora a teoria postulada acima. Para o rice dwarf phytoreovirus (RDV) tem sido mostrado que isolados defectivos quanto transmissibilidade (obtidos atravs da sucessiva passagem em plantas hospedeiras por inoculao mecnica) perdem a protena da capa P2 ou partes dela e que P2 est envolvida na adsoro do vrus clulas de cigarrinhas vetoras. P2 seria ento o ligante viral (protena codificada pelo vrus que reconhece o receptor celular). Similarmente, mostrou-se que as protenas da capa do bean golden mosaic e do African cassava mosaic virus (ambos geminivrus) so fatores determinantes da aquisio desses vrus por suas moscas-brancas vetoras, como esperado, visto que as capas proteicas so as protenas mais externas na partcula viral. Adicionalmente, efeitos citopticos em Bemisia tabasci tm sido observados, indicando replicao do vrus no vetor. {- Para luteovrus, que no replicam mas circulam em seus afdeos vetores (relao circulativa no-propagativa), existem inmeras evidncias de aquisio mediada pela interao com receptores vinda de estudos de imunocitoqumica. Adicionalmente mostrou-se que diferentes luteovrus ligam-se especificamente a GroEL, uma protena produzida por uma bactria endosimbionte (Buchnera sp.) no intestino de afdeos vetores, que tem sido proposta como o fator que determina a persistncia de luteovrus na hemolimfa de afdeos vetores. GroEL foi co-purificada com partculas virais via imunoprecipitao, isolada, microsequenciada e identificada por homologia com GroEL de Escherichia coli . O clone obtido foi usado para expresso heterloga e a afinidade por partculas virais foi demonstrada in vitro, assim como alguns aminocidos importantes na interao com a capa proteica foram identificados. Potyvrus e Caulimovrus, que possuem relao no-circulativa com seus afdeos vetores, dependem da capa proteica e de uma protena no-estrutural, denominada helper factor (HF), para a trasmisso via vetor. Tem sido hipotetizado que h uma interao entre os HF desses vrus e fatores celulares, que necessria para a aquisio do vrus pelos vetores. Para tospovrus foi demonstrado que uma protena clonada de uma biblioteca de cDNA de Frankliniella occidendalis (o principal tripes vetor), identificada por homologia como um receptor de arylforina (uma protena envolvida no sistema imune de insetos), liga-se especificamente a TSWV, est localizada no intestino mdio (mesnteron) do inseto, que o stio primrio de infeco, e que anticorpos produzidos contra esta protena bloqueiam a infeco de clulas de F. occidentalis em cultura. Todos esses dados indicam o receptor de arylforina como o provvel receptor de TSWV no vetor. Tambm mostrou-se que o receptor de arylforina possui homologia significativa com receptores celulares de hantavrus (pertencentes mesma famlia dos tospovrus, Bunyaviridae), as beta-integrinas (envolvidas na adeso celular e no sistema imune), o que pode indicar como esse grupo de vrus evoluiu at invadir o reino vegetal (atravs do reconhecimento de receptores similares em tripes). Adicionalmente, vrias evidncias experimentais indicam a glycoprotena G1 de TSWV como o ligante viral. A identificao de receptores para vrus de plantas, animais ou humanos em seus insetos vetores e a identificao e estudo de seus respectivos ligantes virais pode levar ao desenvolvimento de novas estratgias de controle mais eficientes no s das viroses mas tambm dos vetores, basedas em tcnicas de biologia molecular. Um exemplo o uso de plantas transgnicas expressando: (a) toxinas que reconheam especificamente os vetores virais (quimera do ligante e a toxina Bt); (b) o ligante viral ou partes dele (inundao do receptor). Esse estudo tambm pode levar ao entendimento dos mecanismos de evoluo desses grupos de vrus e lanar novas reas de pesquisa em virologia animal e vegetal.
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1.10. Epidemiologia de Vrus

Monitoramento de vetores: uso de armadilhas a) Vrus transmitidos por pulges de maneira no-persistente: O monitoramento das espcies presentes na lavoura pode indicar se espcies de pulges de grande eficincia de transmisso esto presentes. Se afdeos vetores esto presentes, a ocorrncia de vrus como PVY inevitvel e variedades resistentes podem ser escolhidas. O monitoramento tambm importante para estabelecimento das taxas de crescimento e disseminao dos vetores, as taxas de disseminao dos vetores pode algumas vezes indicar o incio de uma epidemia, como tem sido mostrado com o barley yellow dwarf virus (BYDV). Os fatores ambientais influenciam fortemente a dinmica populacional dos vetores. b) Vrus transmitidos de maneira circulativa: Monitoramento pode indicar o melhor momento para a aplicao de inseticidas. Monitoramento tambm pode levar previso de epidemias, como no caso acima.

1.11. Importncia Econmica dos Vrus de Plantas

Perdas causadas por vrus de plantas so responsveis, em mdia, por cerca de 10 a 20% das perdas causadas por fatores biticos (patgenos) nas lavouras no mundo; no entanto, este um valor mdio, comum encontrar-se lavuras 100% destrudas por vrus e em muitas regies as doenas causadas por vrus representam a maior ameaa produo. Adicionalmente, a diagnose das viroses em geral difcil, em comparao com outros patgenos, e a presena comum de infeces latentes, provavelmente faz-se com que hajam estimativas subestimadas. Tipos de danos causados por vrus: reduo na produo atravs da reduo no crescimento, incluindo as infeces assintomticas. aumento na sensibilidade geadas ou na pr-disposio outros patgenos ou pragas. defeitos no aspecto visual (forma e cor). reduo da qualidade (gosto, textura, composio qumica). reduo da capacidade regenerativa da planta. aumento dos custos de produo. Alguns exemplos de grandes perdas reportadas na literatura: 100% de perda no arroz causada pelo rice tungro (Indonsia, 1969-1971). 50-90% no alface e at 100% no tomate causadas pelo TSWV (Hava). 80% no algodo causada pelo cotton leaf crumple virus (Arizona, EUA). 70% na mandioca causada pelo African cassava virus (Africa). 60% no trigo causada pelo barley yellow dwarf (Nova Zelndia e Chile). At 100% em tomate causados por geminivrus (Caribe e Amrica Central). At 100% em diversas culturas, como tomate e feijo, causados por tospovrus e geminivrus (Brasil). Alm dos danos diretos sobre a produo, as tentativas sem sucesso de controle dos vetores usando inseticidas tem causado o acmulo de produtos nocivos sade humana na natureza.

1.12. Diagnose de vrus de plantas

Testes biolgicos: podem permitir a identificao do grupo de vrus, dificilmente permitir a identificao da espcie. Uso de plantas indicadoras (Nicotiana, Solanum, Chenopodium, Phaseolus, Brassica, etc): inoculao mecnica em determinadas plantas que apresentam sintomas caractersticos para determinados vrus ou grupos de vrus j foi um dos mtodos mais utilizados, at os anos 60 e 70, hoje usado como apoio diagnstico apenas j que o nmero de espcies de vrus aumentou logaritmicamente, impedindo sua diferenciao por este mtodo, em geral.
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Inoculao mecnica: abrasivo, tampo. Uso de vetores: quando a inoculao mecnica no possvel. Gama de hospedeiras: listas publicadas pelo CMI.

Microscopia eletrnica: leaf dips, ISEM (immuno-sorbent electron microscopy). Testes sorolgicos: anticorpo, epitopo, soro, antgeno, adjuvante, IgG. - Dupla difuso em gar, teste de aglutinao. - ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay: ensaio imunolgico com enzima conjugada). Testes biomoleculares: Western blotting (transferncia e anlise de protenas). PCR (polimerase chain reaction: reao de polimerase em cadeia). Eletroforese de dsRNA. Hibridizao de cidos nucleicos: - Dot-blot - Northern blotting (transferncia e anlise de RNA). - Southern blotting (transferncia e anlise de DNA). Preo + ++ +++ ++++ ++++ Praticidade + +++++ +++ +++++ +++ Tempo ++++ ++ ++ + ++ Especificidade + +++ ++++ ++++ +++++ Sensibilidade + +++ ++++ +++++ +++++

Tabela 1. Comparao relativa entre algumas das tcnicas de diagnose usadas para vrus de plantas. Tcnica Plantas indicadoras ELISA Western blotting PCR Dot-blot

Valores relativos representados por : + = muito baixo ou muito pouco; ++ = baixo ou pouco; +++ = mediano; ++++ = alto ou muito; +++++ = altssimo.

1.13. Controle conceitos gerais e medidas especficas para vrus

Conceito de Doena: alterao no processo fisiolgico de obteno de energia, resultando em perda desta energia pela hospedeira. Causas: parasitrias e no-parasitrias. Aspectos epidemiolgicos: o modo de disseminao do patgeno tem papel fundamental no estabelecimento de medidas de controle. Prticas culturais tambm influenciam pois determinam o estado fisiolgico e nutricional da hospedeira, alm de determinar as condies microambientais da cultura (por exemplo, espaamento de linhas detemina a umidade no dossel da planta). Princpios de Controle: estabelecidos por Whetzel (1929). a) b) c) d) e) f) Escape. Excluso. Erradicao. Proteo. Terapia. Resistncia.

a) Escape: Evitar condies favorveis doena. Exemplos: Escolha da rea ou regio: nvel de doenas pode ser menor se o plantio for feito em reas com baixa incidncia do vetor. Escolha do local: para escapar de solos infectados (por fungos ou nematides vetores) ou de locais com alta infestao de ervas daninhas infectadas.
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Escolha da data de plantio: condies (temperatura e umidade relativa) desfavorveis ao vetor ou ausncia espordica do vetor (BGMV, tungro). Uso de materiais propagativos sadios (sementes e mudas): importante para potyvrus, nepo, ilar, como, carla, cucumo, rhabdo, sobemo, carmo, potex, tobamo, tymo, bromo, furo, hordei, tobra, tospo, tombus, rymo, bymo, enamo, machlo, faba, capillo, alfamo, num total de cerca de 10% das espcies de vrus. Modificao das prticas culturais: se possvel, manipular o espaamento (que pode afetar a populao do vetor), controle de ervas daninhas, e outros que diminuam o risco de infeces. b) Excluso: Impedir a entrada do vrus (inculo) em uma rea isenta. Exemplos: Medidas estabelecidas atravs da legislao fitossanitria. a) Proibio, certificado de sanidade, inspeo, interdio. b) Comisso de Defesa Sanitria Vegetal. No plano do agricultor: sementes e mudas sadias, tratos culturais. Quarentena: nveis - importao proibida, restrio condicional, livre importao. Eliminao do inseto vetor (em geral, invivel). c) Erradicao: Eliminao do inculo na fonte. Exemplos: Controle biolgico: efeito biocida ou biosttico (inibidor) sobre o vetor, tentativas tm sido feitas com o pulgo vetor de BYDV utilizando-se insetos predadores. Rotao de culturas: quando hospedeiras e no-hospedeiras so utilizadas de maneira rotativa, que acabe reduzindo a populao do vrus. Remoo ou destruio de plantas suscetveis ou doentes: i) Arranquio: remover a fonte de inculo no incio do processo de infeco (TMV, TSWV, etc); ii) Eliminao de hospedeiros alternativos: ervas daninhas (TSWV, tungro); iii) Sanitao: eliminao de resduos (TMV). Eliminao por cultura de meristemas: vrus podem ser eliminados de meristemas, provavelmente pelos altos nveis metablicos, altas concentraes de auxina, competio por nutrientes durante alto metabolismo, processos de oxidao-reduo. Esta tcnica muita usada na produo de batata-smente livre de vrus (PVY, PRLV, PVA, PSTVd, PVS, PVX, PVM) e em ornamentais como crisntemo, dlia, cravo, gladolo, alm de couve-flor (CaMV), morango (vrios vrus), soja (SMV), mandioca (ACMV), banana (CMV), cana-de-acar (SuMV), uva (vrios). d) Proteo: Tornar o inculo no-infectivo no stio de infeco. Exemplos: Pulverizao com fungicidas protetores, no caso dos vrus transmitidos por fungos, e nematicidas, para os transmitidos por nematides. Controle do inseto vetor: pode no ser efetivo para o estabelecimento da doena, mas pode inibir a disseminao, de qualqer forma s efetivo para aqueles vrus de relao circulativa, pois nesse caso a transmisso leva algumas horas para se realizar, durante a alimentao do vetor na planta hospedeira. No caso dos de relao nocirculativa, a transmisso d-se rapidamente, no dando chance para que o inseticida atue eficientemente, j que o vrus pode ser transmitido at na picada-de-prova (exemplo: PVY por pulges). Uso de pesticidas tem sido uma das principais medidas de controle de geminivrus, tospovrus, tungro, rice stripe virus, vrus do mosaico da canade-acar, vrus do mosaico do pepino, etc. leo mineral tem sido usado, em baixa escala, para o controle de vrus como o PVY, pois impede a introduo do estilete do inseto. Modificao do ambiente: circulao de ar / umidade no dossel (para controle do vetor). Proteo cruzada (pr-imunizao): estirpes avirulentas ou de baixa virulncia so usadas para a obteno de variedades imunizadas. Exemplos: vrus da Tristeza dos citrus (cerca de 50 milhes de mudas pr-imunizadas foram produzidas em 1987); vrus do mosaico da soja; vrus da manha anelar do mamoeiro.
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Modificao na nutrio: excesso de nitrognio pode levar a maior suscetibilidade, deficincia de potssio e clcio tambm podem afetar. e) Terapia: Cura da infeco nas plantas doentes. Exemplos: Tratamento trmico em sementes e bulbos (usado para diversas espcies florestais; batata para PVS, fumo para AMV e CMV). Eliminao de partes da planta com infees atravs de desbrota e poda. Viricidas ? f) Resistncia: A resistncia pode ser de natureza fisiolgica, mecnica, funcional; pode ser baseada por exemplo no uso de inibidores, na incompatibilidade metablica, cutcula mais resistente, etc. Resistncia sistmica induzida, tolerncia. Resistncia vertical (altos nveis) e horizontal. Resistncia monognica e polignica (menos pronunciada, mais durvel). Em alguns casos, diversos estirpes precisam ser usadas nos programas de melhoramento para evitar-se a obteno de variedades resistentes a uma nica estirpe. Resistncia da planta ao vetor uma possibilidade, e pode ser dos tipos no-preferncia, antibiose, tolerncia. Exemplos: a incidncia de cucumber mosaic virus diminuiu em diversas cucurbitceas aps a introduo de variedades resistentes Aphis gossypii, o principal afdeo vetor; o mesmo para arroz e o rice hoja blanca virus. O uso de plantas transgnicas expressando a toxina Bt (que age contra insetos) reduziu a incidncia de algumas viroses no algodo e milho. Alguns exemplos de genes de resistncia a vrus encontrados em espcies de plantas selvagens, reportados na literatura: Tm-22 (em tomate contra TMV), Sw5 (em tomate contra TSWV), N (em fumo contra TMV), Ry (em batata contra PVY). Uso de plantas transgnicas resistentes aos vrus: em geral leva menos tempo que o melhoramento tradicional; no entanto requer o domnio prvio da clonagem do gene a ser transposto, e da transformao da planta, encarecendo o produto. Plantas transgnicas resistentes a vrus esto divididas em trs classes: a) Expressando genes de resistncia previamente clonados de outras plantas (resistncia derivada da planta): A resistncia um resultado da ao direta ou indireta do gene que confere resistncia, como no melhoramento tradicional, porm resultante de um s gene. Vantagem: variedades resitentes podem ser obtidas mais rapidamente. Desvantagem: resistncia teoricamente pode ser quebrada mais rapidamente. b) Expressando componentes do prprio vrus previamente clonados (resistncia patgeno-derivada): A resistncia resultado da interferncia da protena viral, expressada em altos nveis na planta transgnica, na replicao do vrus, impedindo os processos de decapsidao (quando a capa proteica usada) ou sntese de genoma viral (quando a replicase usada). Vantagem: mesma da anterior. Desvantagem: em teoria pode forar o aparecimento de estirpes mutantes do vrus. c) Expressando outros genes: inibidores de proteases, interferons e anticorpos, por exemplo. Observaes: Clonagem: pr-requisito para a produo da planta transgnica; atravs do uso de tcnicas como PCR ou de bibliotecas de genes. Transformao de plantas: agroinoculao com Agrobacterium tumefasciens, onde a regio chamada T-DNA do plasmdeo Ti da bactria integrado no genoma da planta (usam-se vetores binrios); outros mtodos so bombardeamento de clulas ou tecidos vegetais com DNA recombinante; eletroporao. Uso de marcadores moleculares: antibiticos como neomicina fosfotransferase II (NPT II) e protenas que inativam antibiticos como gentamicina e higromicina B, herbicidas.

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A indstria biotecnolgica a que mais cresce no mundo, a que menos fere o ambiente e das que possui os mais altos ndices de competio interna. Exemplos de algumas variedades transgnicas atualmente em uso comercial nos EUA: abbora resistente a trs viroses, CMV (cucumber mosaic), zucchini yellow mosaic (ZYMV) e watermelon mosaic II (WMVII), que foi a primeira variedade comercial resistente a vrus; mamo resistente ao TSWV e papaya ringspot. Riscos associados plantas transgnicas: recombinao de genomas de vrus diferentes ou similares pode levar ao aparecimento de estirpes mais virulentas e/ou com diferente gama de hospedeiras; encapsidao heterloga pode levar mudanas na epidemiologia dos vrus; marcadores moleculares podem ter efeitos secundrios, como antibiticos. Mecanismos de resistncia: - No movimento do vrus na planta: interferncia com protenas que se associam aos vrus e ao plasmodesma (movimento clula-a-clula) e aos fatores que auxiliam o vrus no movimento a longa distncia (movimento sistmico). - Interferncia com os fatores celulares que auxiliam as polimerases virais na replicao viral ou com as prprias polimerases, obstruindo os mecanismos de regulao da replicao (exemplos so plantas expressando a protena de 54 kDa de TMV e PEBV, e as polimerases de geminivrus, cucumovrus, BMV, PVX, PVY). - Inibidores dos fatores de patogenicidade do vrus. - Silenciamento gnico: mecanismo proposto onde RNAses da hospedeira detectariam um nvel elevado do mRNA transgnico e ativariam um mecanismo de degradao que acabaria por atingir os RNAs virais, tornando a planta assim resistente; foi proposto quando se constatou que mRNAs no-traduzveis conferiam resistncia. - Antissenso: RNAs antissensos bloqueiariam a traduo do gene viral via complementaridade. - Interferncia com o processo de desencapsidao viral, essencial para a replicao do vrus; ocorre quando a capa proteica expressa e inibe a decapsidao, de modo estereoqumico, pela alta concentrao obtida atravs de promotores fortes, como o CaMV 35S. - Uso de ribozimas: sequncias de RNA com capacidade de cortar RNA. - Uso de RNA satlite: interferncia da replicao do vrus (CMV). - Uso de RNAs defectivos: mesma anterior.

1.14. Histrico da virologia (animal, humana e vegetal)

1500 BC: sintomas do vrus da polio (poliovirus) desenhados em hieroglifos egpcios; acredita-se que a domesticao de animais, aliada ao aumento populacional, aparecimento de grandes cidades e o comrcio entre povos diferentes foram os fatores que levaram ao aparecimento das primeiras epidemias e pandemias causadas por vrus. 1500s: Varola (smallpox virus) trazida por espanhis ajuda a dizimar povos amerndios (Incas, Mayas e Aztecas). 1600s: breaking da Tulipa reportado, embora no se soubesse que se tratava de um vrus, mas de fato o primeiro vrus de uso benfico (plantas infectadas valiam mais no mercado). 1790: o mdico ingls E. Jenner realiza a primeira vacinao usando pstulas de varola bovina (cowpox virus) em humanos. 1880: transmisso do vrus da febre amarela por mosquitos provada (Finlay); a partir de ento outros insetos vetores so encontrados. 1885: Pasteur produz a primeira vacina de vrus atenuado (rhabdovrus) aps vrias passagens em coelhos. 1886-1898: Mayer, Iwanovsky e Beijerinck descobrem o TMV, o primeiro vrus (de planta ou animal) descrito; contagium vivum fluidum. 1929: Holmes, testes biolgicos, leses locais como teste quantitativo. 1930s: Stanley cristaliza o TMV, Rosalind Franklin visualiza-o por difrao de raios X (1935) ; vacinas da febre amarela (1935) e influenza (1936) so produzidas. 1940-50: dcada da microscopia eletrnica, crescimento de vrus humanos em cultura (poliovirus) e do sequenciamento de protenas (Sanger). 1951: Brakke, purificao via gradiente de sacarose; em 1955-56 Fraenkel-Conrad e outros demonstram que a capa proteica tem funo protetora e o cido nucleico infeccioso; 1958, Hewitt & Grogan, fungos e nematides vetores.
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1960-70: protoplastos (Takebe), cristalografia, replicao in vitro, estudos com fagos que levaram inmeras descobertas de funes celulares (Delbruck,Luria, Lederberg, Lwoff, Avery, Heshey & Chase); sequncia completa da capa do TMV. 1970s: Diener, viroids; Shepherd & Goodman, vrus de planta com DNA; Temin & Baltimore, transcriptase reversa; teste ELISA (Clark & Adams). 1980s: mutagnese oligo-direcionada (Smith); anticorpos monoclonais (Jerne); sequenciamento de DNA (Gilbert, Sanger); surge o HIV (AIDS); receptores virais. 1981: Zacaniello & Baltimore, primeiro cDNA infeccioso (polio). 1984: Ahlquist, clone infeccioso de BMV (primeiro de planta). 1986: Powell-Abel et al., planta transgnica resistente a vrus (TMV). 1990s: clonagem de genes de resistncia de plantas a vrus; primeiras plantas transgnicas ersistentes a vrus passam a ser comercializadas 2000s: substituio das antigas prticas de controle pelas novas estratgias criadas pela biotecnologia?

1.15. Outros Agentes Fitopatognicos Similares a Vrus

Virides: Descobertos por Diener (1971). No possuem capsdeo, genoma composto apenas por RNA, aparentemente no codificam nenhum polipeptdeo, tamanho reduzido. Usam RNA polimerase da clula hospedeira para sua replicao; por isso localizam-se no ncleo ou em organelas. RNA circular com cerca de 250 a 400 nucleotdeos (pequenos). Constituem os menores agentes infecciosos de plantas. Causa cerca de 20 doenas em plantas; nenhum descrito em animais. Resistncia do RNA no ambiente relacionada estruturas secundrias formadas na molcula. Difcil visualizao em microscopia eletrnica; diagnose por dot blot e PCR. Tambm no funcionam como mRNAs in vitro, apesar de serem de senso positivo. Replicao por mecanismo do tipo crculo rolante. Transmitidos mecanicamente (prticas culturais) e por propagao vegetativa. Exemplos: Exocortis do Citrus (CEV), potato spindle tuber viroid (PSTVd), Cadang-Cadang do Coqueiro (Filipinas), Avocado Sunblotch Viroid (ASVd), tomato planta macho (TPMVd).

RNAs Satlites e Vrus satlites: Os vrus satlites codificam capsdeos como os vrus mas no codificam replicases ou outra protena, usam as replicases dos vrus para sua replicao; os RNA satlites no codificam protenas. Constituem-se de fitas simples de RNA. No causam dano replicao dos vrus. So especficos a determinados tipos de vrus. No apresentam homologia com os genes virais. Exemplo: RNA satlite do CMV.

Virusides: Apresentam RNA como os virides: pequeno tamanho, circulares, fechados, fita simples. Porm so dependentes do vrus para replicao e so encapsidados pela capa proteica do vrus, como os RNA satlites. Exemplo: Velvet tobacco mottle virus (VTMoV). Prions: Ainda no encontrados em plantas.
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Aparentemente constituem-se de pequenos polipeptdeos com capacidade replicativa, no associados cidos nucleicos; no entanto, possvel que sejam codificados por pequenas sequncias de RNA ou DNA que ainda no foram purificadas por limitaes experimentais (vrus filtrveis). Exemplo: Encefalite causada pela doena da vaca louca (Inglaterra).
Caract. Tipo Nmero de clulas Parede celular Morfologia Crescimento em meio Metabolismo Tipo de Genoma Sensibilid. Penicilina Sensibilid. Tetraciclina Nmero de genes Reproduo Replicao Capsdeo Fungo Eukar. multi + micelial + sim DNA + ~4000 Sex./ Assex. NA NA Bactria Prokar. uni + elipside + sim DNA + + ~2000 Fisso binria NA NA Nemat Ricktsia Fitoplasma Eukar. multi + Prokar. uni Prokar. uni Vrus partcula NA NA variada no DNA ou RNA ~4 a 20 RNA sat. Viride Viruside Partcula partcula. Partc. NA NA NA NA NA bastonete no RNA 1 Mont. Depen. sim

Tabela 2. Algumas caractersticas diferenciadoras de tipos patgenos de plantas.

+ (ondulada) verme elipside pleomrfico + sim DNA ~5000 Sex./ Assex. NA NA +/sim DNA + + ~1000 sim DNA + (remisso) ~1000

bastonete Baston. no RNA 1 Mont. Depen. NA no RNA 0 Mont. Depen. no

Fisso Fisso binria Montagem binria NA NA Independ NA NA sim

NA = no se aplica.

Depen. = dependente do vrus

1.16. Paralelo entre Virologia Animal e Vegetal

A virologia moderna dividida didaticamente em virologia animal (que estuda os vrus que infectam animais e humanos) e virologia vegetal; do ponto-de-vista prtico, esta subdiviso inexiste. As tcnicas de pesquisa nas duas reas so, praticamente, as mesmas, assim como as estratgias experimentais de modo geral, e os objetivos e as linhas de pesquisa esto ganhando, a cada dia, maior similaridade. Tamanha similaridade entre vrus com hospedeiros to diversos (plantas, animais, humanos) surgiu, principalmente, aps a obteno sistemtica de dados moleculares no estudo de vrus. A dissecao molecular dos vrus mostrou que os vrus que infectam o ser humano, uma bactria ou uma planta, eram muito mais similares do que se imaginava, com diferenas menores do que as supostas anteriormente, pelo simples de fato que os genomas virais so diminutos e no h muito espao para grandes variabilidades. Exemplos: estratgias de replicao idnticas, genes com homologia altamente significativa, mecanismos de patognese similares, etc. possvel que a virologia, dentro das cincias microbiolgicas, seja a com maior interao entre as reas mdicas, agronmicas e puramente biolgica, tamanha a similaridade dos vrus em termos gerais. Esta similaridade levou, por exemplo, criao de duas superfamlias de vrus (tipo-picornavrus e tipo-alfavrus), que englobam vrus animais, vegetais e humanos. Assim, este subtpico visa mostrar alguns dados bastante relevantes obtidos com vrus humanos e animais que tiveram repercusso direta ou indireta na virologia de plantas, tcnicas que foram desenvolvidas em virologia animal e que depois foram adaptadas virologia vegetal e as similaridades gerais entre alguns vrus animais e vegetais. a) Retrovrus: Representantes: HIV-1 e 2 (AIDS), HTLV, RSV e outros oncovrus (envolvidos em processos carcinognicos).

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Caractersticas do genoma: dmero de ssRNA(+), 8-10 kb. Similares a elementos genticos celulares mveis: retrotransposons. Grupo similar em plantas: Caulimovrus (tambm codifica uma trancriptase reversa, sendo portanto um pararetrovrus, com mecanismo de replicao bastante similar; porm no envelopado e possui genoma de DNA). Estrutura genmica simplificada dos retrovrus:
gag vif env nef

5cap poli (A) 3

pol tat rev

Produtos e funes dos genes virais:

pol: gag: env: rev: nef: vif: tat:

transcriptase reversa, RNase H, integrase, protease. CA e NC (protenas do capsdeo), matriz (MA). glicoprotenas [SU(gp120), TM(gp40)]. exportao dos mRNAs para o citoplasma. envolvida na replicao e regulao negativa de CD4. aumenta infectividade. envolvida na replicao de maneira ainda no completamente elucidada, vai para o ncleo, interage com protenas da clula hospedeira.

- Ciclo celular:

clula hospedeira: macrfagos, clulas T

ncleo

integrao transcrio reversa encapsidao e montagem CD4 CXCR penetrao nucleocapsdeo brotamento glicoprotenas acumuladas na membrana plasmtica transcrio traduo

(prognie)

O receptor do HIV (CD4) foi um dos primeiros a serem identificados (Gallo & Montagnier, 1984). Desencadeou a procura pelo receptor de outros vrus, desde que logo se percebeu a possibilidade de desenvolvimento de estratgias para bloquear a entrada do vrus na clula; o que ainda no se confirmou na prtica visto que o receptor desempenha funes essenciais para a clula hospedeira.
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Mais de uma dcada depois foi identificado o co-receptor (CXCR4): - Feng et al. (1996. Science 272: 872-877) encontraram um co-receptor a partir da hiptese de que outro receptor deveria existir visto que alguns tipos de clulas que expressam CD4 so no-permissivas. Descrio da estratgia experimental: - 2 grupos de clulas NIH-3T3 (no-permissivas) foram transformadas com: (a) CD4, polimerase T7 e uma biblioteca de cDNAs de linfcitos T (permissivas) e (b) vetores contendo lacZ (sob o controle do promotor T7) e env. - Os dois grupos foram incubados num mesmo meio contendo X-gal (substrato da lacZ) e a seleo foi realizada pela identificao de clulas fundidas (azuis devido ao reconhecimento do promotor T7 pela pol T7 e consequente expresso de -galactosidase e hidrlise de X-gal). - A fuso de duas clulas implica na expresso do co-receptor que foi identificado como uma protena do tipo quimiocinina (p.e. CXCR4) que esto envolvidas no recrutamento de componentes do sistema imune para clulas em processo de inflamao. Controles experimentais utilizados: env- resultou em fuso negativa; outras clulas no-permissivas tambm tornaram-se infectadas. Possvel aplicao teraputica dos receptores: Construo de VSV recombinante expressando CD4 e CXCR4. Infeco em clulas previamente infectadas com HIV. Levou destruio das clulas infectadas. Schnell et al. 1997. Cell 90: 849-857.

Descoberta da transcriptase reversa (Temin & Baltimore, 1970) em retrovrus possibilitou o estudo de drogas inibidoras da replicao desses vrus, o que, anos depois levou produo comercial de AZT, zidovudina, saquinavir (inibidor de protease), etc (complexo de drogas hoje usado terapeuticamente). Paralelo com o estudo de caulimovrus: - Transformao de clulas hospedeiras de caulimovrus (protoplastos) extremamente dificultada (baixssima eficincia devido a restos da parede celular). - Vrus animais so comumente tecido-especficos o que acarreta numa grande variedade de tipos de clulas que podem ser utilizadas, ao contrrio de vrus de plantas. - Caulimovrus so bons modelos para o estudo da atividade de transcrio reversa, visto que no existem empedimentos ticos para a realizao de experimentos com organismos hospedeiros vivos do vrus (planta), ao contrrio do HIV. b) Picornavrus: Representates: poliovrus (poliomielite), rhinovrus (gripe), hepatite A; todos possuem 1 RNA e so isomtricos. Similares em plantas: comovrus (2 RNAs), nepovrus (2 RNAs), potyvrus (1 RNA, bastonete). Caractersticas do genoma e da estratgia de expresso que so idnticas nos picornavrus animais e seus similares em plantas: - ssRNA(+). - VPg (replicao) e cauda de poli(A) (estabilidade) associados ao RNA. - formao de poliprotena precursora a partir de um nico ORF. - clivagem ps-traducional por proteases virais. - No possuem CAP como estrutura de proteo do RNA, regio 5 UTR supre essa deficincia. Essas caractersticas em comum levaram ao estabelecimento da superfamlia dos vrus tipo-picornavrus. Os genomas tambm possuem uma organizao dos genes extremamente similar e domnios (regies das protenas especializadas em determinadas funes) homlogos, indicando uma evoluo monofiltica da superfamlia; ou seja, um provvel ancestral comum.

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ICAM-1

Ciclo Celular do Poliovrus:

replicao no citoplasma

traduo/ replicao/ montagem

sada via lise da clula

Curva de crescimento em nico passo:

montagem no retculo endoplasmtico ou em vesculas

Tcnica desenvolvida inicialmente com poliovrus, extremamente difundida para outros vrus; permite o estudo da dinmica de replicao do vrus e assim pode ser usada numa grande variedade de experimentos, com infinitas aplicaes. Exemplos de aplicaes: estudo de drogas antivrus e seu modo de ao, estudo de anticorpos antivirais e sua eficincia. Como se obtm a curva: Clulas em cultura so incubadas com vrus purificado por um perodo breve para ligao das partculas s clulas. Concentrao suficiente de vrus adicionada de modo que haja excesso de vrus em relao ao nmero de clulas, para que todas as clulas sejam infectadas. Clulas so lavadas para remoo do excesso (partculas no ligadas) atravs de sedimentao e resuspenso em novo meio de cultura. Alquotas so ento removidas a um determinado intervalo de tempo: clulas so rompidas (lisadas) por tratamento com detergente de modo que todos as partculas virais presentes na alquota (as que estejam dentro e as que j estejam fora das clulas) possam ser contadas. Amostras tratadas com albumina para diminuir o efeito do detergente nos passos subsequentes. Alquotas tratadas so ento usadas em ensaios de placa, que um ensaio simples de infeco de monocamadas de clulas em meio slido. possvel para vrus que sobrevivem a tratamentos com detergentes, o que no acontece com vrus com membranas, por exemplo. (Equivalente ao nmero de partculas)
deteriorao

Existem diversos tipos de curvas de crescimento, dependentes das caractersticas prprias do experimento e do vrus. Exemplo:

No. de placas (pfu)

elevao

lag

Tempo (horas)
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Sada da clula: lise ocorre aps o aumento da permeabilidade da membrana celular ocasionada pelo vrus (no caso do poliovirus, especificamente pela protena viral 2B). Foi mensurada pela utilizao de corante especfico a ons de clcio (Ca+2): mostrou aumento do influxo de Ca+2 no citoplasma aps infeco viral. Picornavrus inibem a sntese de RNA celular: caracerstica provavelmente comum a muitos vrus. Mecanismo (Clark et al. 1993. Mol. Cell Biol. 13: 1232-1237): - Todo promotor celular contm uma sequncia denominada caixa TATAA, reconhecida no DNA celular pela RNA pol II para que haja transcrio. - H um complexo de protenas, denominado TFIID, que associa-se a todos os mRNAs celulares, para que estes possam ser transcritos. - Uma protena denominada TBP uma das participantes do complexo. - Descobriu-se que a protease 3C de poliovrus (clonada, expressa e purificada de E. coli) cliva TBP in vitro. O mesmo foi verificado quando se purificou TBP de clulas previamente infectadas (controle: clula no infectada). - Transcrio de uma sequncia de DNA contendo um promotor de adenovrus foi inibida pela incubao com 3C purificada (controle: mutante de 3C). Paralelo com vrus de plantas: (i) a curva de crescimento em nico passo pode ser construda (com menor eficincia) utilizando-se hospedeiras de leso local, onde cada leso representar uma partcula viral vivel em determinado momento; (ii) as descobertas feitas com picornavrus abrem um leque de possibilidades experimentais com os seus similares em plantas; (iii) por exemplo a inibio da transcrio celular deve ocorrer tambm em plantas, o que no foi ainda comprovado. c) Togavrus: - Representantes: vrus da rubola (rubella virus), diversos vrus que causam encefalites (Sindbis virus, Eastern encephalitis virus). So envelopados, transmitidos por insetos em geral, com uma molcula de ssRNA(+). Similares em planta: bromovrus, cocumo, ilar (todos sem evelope e com 3 RNAs), tobamo, potex, (ambos sem envelope e formato bastonete). Todos esses vrus fazem parte da superfamlia dos alfavrus. Foram os primeiros clones infecciosos obtidos, a partir de cDNA transcritos in vitro que geraram RNAs infecciosos. Descobriu-se que os nucleocapsdeos so decapsidados por ribossomos (decapsidao portanto um evento paralelo traduo). Descobriu-se que usam a estratgia da leitura contnua (readthrough) para maximizar o nmero de genes (teoria da Economia Gentica): Um cdon de terminao fraco (UGA) encontrado entre os dois genes envolvidos na replicao; os ribossomos continuam a traduzir em 20% das vezes que encontram UGA. O cdon imediatamente adjacente a UGA tambm participa neste processo; para o Sindbis virus mostrou-se que quando o prximo cdon CUA a leitura continua, se a citosina modificada a leitura pra. Assim, uma regio do genoma que codificaria apenas um gene, codifica dois. O mesmo j havia sido descoberto para o bacterifago Q (na sntese de sua protena A1), mostrando novamente como vrus completamente diferentes podem possuir mecanismos extremamente similares de expresso dos seus genes. Os mRNAs subgenmicos so feitos a partir de um promotor interno na fita de RNA(-) ou complementar. Sequncias adjacentes aos terminais 5e 3, com comprimentos de 51 e 19 nt respectivamente, so conservadas dentro de um mesmo gnero e so importantes na sntese de RNA. O processo de encapsidao comea numa regio especfica.
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Sada da clula: por brotamento atravs da interao entre as glicoprotenas e o nucleocapsdeo; deleo de um ou outro levou ao bloqueio na produo de novas partculas completas. Paralelo com vrus de plantas: todos esse dados, gerais e extremamente importantes em termos de replicao e expresso gnica, comearam a ser pesquisados ento para alguns vrus de plantas, e alguns j foram confirmados, como exemplos: j foi encontrada em brome mosaic virus (BMV) e em TMV a regio especfica de incio do processo de encapsidao (cis e trans), o mesmo para promotores internos em rhabdovrus e outros; a estratgia de leitura contnua; assim como j foi possvel o desenvolvimento de clones infecciosos de BMV e outros. d) Papovavrus: Representantes: human papilloma virus (diferentes espcies causam diversos tipos de verrugas e alguns carcinomas), SV40 (vrus modelo); so dsDNA, circular. Similar em plantas: geminivrus (ssDNA circular). Infectam clulas epiteliais, esto presentes na maioria dos indivduos na populao. A maioria das estirpes no causa doenas, mas alguns so oncognicos (nesses casos o genoma viral integrado no humano). Possuem genoma do tipo dsDNA, replicam e montam sua partcula no ncleo, o dsDNA forma um minicromossomo com histonas celulares. SV40 (simian virus 40) um vrus-modelo em vrios tipos de estudos de replicao e patognese por se tratar de um vrus de fcil propagao in vitro e infectar um hospedeiro muito similar ao ser humano (portanto importante nos estudos de patognese). Produz uma protena chamada antgeno T, a qual foi demonstrada a capacidade de estimular a diviso celular, e portanto viral, atravs da ligao duas protenas celulares envolvidas no ciclo celular. Estas protenas esto presentes no ncleo, so chamadas p53 e Rb, e sua funo exata na ativao da diviso celular ainda no est elucidada. Cultura de fibroblastos tem sido extensivamente usada com esses vrus e so sistemas de culturas de clulas bem avanados e formam monocamadas com extrema eficincia. Paralelo com vrus de plantas: culturas de clulas em monocamadas ainda no so possveis com protoplastos, que so cultivados em suspenso, o que se torna limitante em ensaios quantitativos; geminivrus tambm possuem fase da replicao no ncleo; estmulo diviso celular deve ocorrer com alguns vrus de plantas. e) Rhabdovrus: Representantes em animais: vrus da raiva, VSV. Similares em plantas: rhabdovrus de plantas (fitorhabdovrus). Outros vrus similares em animais: paramyxovrus [viroses do sarampo, (measles virus) e da caxumba (mumps virus)], orthomyxo (8 RNAs, Influenza, causador da gripe espanhola). Estrutura genmica:
N P M G L

Genoma produz 5 distintos mRNAs monocistrnicos, que so transcritos sucessivamente com 70% de eficincia a cada parada da polimerase. Virions so liberados no citoplasma por endossomos: pH baixo expe uma regio hidrofbica da protena G que resulta na fuso. Necessidade de glicosilao: descobriu-se ser necessria para o transporte de protenas transmembrnicas no sistema de membranas na clula. Genes e funes: a) P: fosfoprotena necessria replicao e transcrio. b) N: nucleocapsdeo, tambm necessrio replicao e transcrio e proteo contra RNases celulares. c) M: protena matriz, responsvel pela montagem da partcula. d) G: glicoprotena, ligao ao receptor. e) L: replicase e transcriptase.
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H uma atenuao na razo de transcrio de cada promotor no sentido N > P > M > G > L. Descobriu-se com VSV que tubulina (protena que faz parte do citoesqueleto) age como fator de transcrio positivo. mRNAs capeados (cap = mGpppmA) e com poli(A), como os RNAs celulares. Produo de partculas infecciosas completas: experimento feito com VSV (vesicular stomatitis virus, tambm um vrus-modelo) descrito a seguir. - infeco de cultura de clulas com vetor de expresso vaccinia-polimerase T7 (provavelmente o vetor viral mais utilizado). - transfeco com (5) clones contendo os genes de VSV (controle): novas partculas virais podem ser obtidas a partir de cDNA. - Substituio de G de VSV por outra glicoprotena: G de Influenza, levou obteno de VSV recombinante (com G heterlogo na partcula); tornou-se uma ferramenta importante no estudo das glicoprotenas virais. - Mostra a flexibilidade da formao da partcula de VSV. - Requer o uso de lipofectina para transfeco (ao similar a de um detergente, porm sem natureza custica), ou outro qumico similar que forme bolhas. Caractersticas importantes do VSV que tornaram possvel seu uso como vetor de expresso: - Pode crescer em altos ttulos na maioria das clulas de mamferos e facilmente purificado em altas quantidades. - Permite a introduo de genes externos devido simetria bilateral do nucleocapsdeo, que permite o aumento do tamanho do genoma sem a perda da viabilidade (partcula pode crescer de tamanho). - Facilidade com que partculas recombinantes so formadas (no possui mecanismo de excluso de protenas da membrana). - Eventos de recombinao so aparentemente raros ou no acontecem. Influenza: mostrou-se que o vrus sequestra estruturas cap de mRNAs celulares para os seus mRNAs e que a polimerase forma as caudas de poli(A) a partir de um mecanismo de escorregamento, usando pequenas sequncias de UUU como molde. Paralelo com vrus de plantas: vetores virais tambm foram desenvolvidos (TMV, PVX) e so usados para a expresso transiente de genes heterlogos em plantas.

1.1. CARACTERSTICAS GERAIS DOS VRUS ............................................................. ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.2. ORIGEM E EVOLUO DOS VRUS ..................................................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.3. PRINCIPAIS VRUS DE PLANTAS E SUA CLASSIFICAO .................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.4. CRITRIOS UTILIZADOS NA CLASSIFICAO DOS VRUS ................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.5. ALGUNS CONCEITOS DE VALOR TAXONMICO ................................................. ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.6. SINTOMAS CAUSADOS POR VRUS DE PLANTAS ................................................ ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.7. REPLICAO E EXPRESSO GNICA.................................................................. ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.8. MOVIMENTO DO VRUS NA PLANTA .................................................................. ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.9. TRANSMISSO DE VRUS DE PLANTA A PLANTA ............................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.10. EPIDEMIOLOGIA DE VRUS .............................................................................. ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.11. IMPORTNCIA ECONMICA DOS VRUS DE PLANTAS ...................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.12. DIAGNOSE DE VRUS DE PLANTAS ................................................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.13. CONTROLE CONCEITOS GERAIS E MEDIDAS ESPECFICAS PARA VRUS .......... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.14. HISTRICO DA VIROLOGIA (ANIMAL, HUMANA E VEGETAL)............................ ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.15. OUTROS AGENTES FITOPATOGNICOS SIMILARES A VRUS ............................ ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. 1.16. PARALELO ENTRE VIROLOGIA ANIMAL E VEGETAL ........................................ ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO.

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