Produo de Protenas Recombinantes em Escherichia coli

Prof. Dr. Catarina Akiko Miyamoto

Resumo
A produo de protenas recombinantes para fins teraputicos,
veterinrios, e agro-pecurios tem se mostrado bastante eficaz
tecnolgica e economicamente. O objetivo deste manuscrito passar
uma viso geral de como estas protenas podem ser produzidas na
bactria Escherichia coli. Mostramos aqui desde a pesca do gene de
interesse do genoma original, clonagem do mesmo em plasmdeos de
expresso at a produo da protena recombinante. Discutimos tambm
a possibilidade de melhorar a sequncia gnica para que aumente a
produo protica.
Palavras-Chave
protena recombinante, clonagem, plasmdeo, PCR

Introduo
A tecnologia do DNA recombinante possibilita a produo de
protenas heterlogas em grande quantidade. O sistema de expresso
adequado depende da protena a ser produzida. O entendimento do
dogma central da biologia molecular essencial para a produo de
protenas recombinantes, uma vez que este compreende os trs processos
principais que a clula utiliza para que a informao gentica seja
expressa: replicao, transcrio e traduo (Figura 1). Em ltima anlise,
a mensagem gentica presente no DNA pode ser decifrada e expressa na
forma de protena. Utilizando deste conhecimento, dos controles da
expresso gnica e das preferncias de cdons em Escherichia coli (E.
coli), protenas de interesse biotecnolgico podem ser produzidas em
grande escala.

Autor
1 Mestre e Doutor em Cincias (rea de concentrao Bioqumica), USP.
Docente das Faculdades Integradas de Trs Lagoas AEMS. Cursos de
Biomedicina, Nutrio, Tecnologia em Processos Qumicos e Tecnologia em
Gesto Ambiental.

Figura 1. Dogma central da biologia molecular mostrando os trs processos

principais que a clula utiliza para que a mensagem gentica seja expressa.
Adaptado de Lehninger Principles of Biochemistry, 5 Edio, W.H. Freeman and
Company, Nova York, EUA.

Atualmente, empresas de biotecnologia sintetizam genes com

cdons preferenciais para vrios sistemas de expresso. Inicialmente, nos
ateremos metodologia tradicional. Posteriormente, mostraremos como
uma sequncia de DNA pode ser melhorada para que haja aumento na
produo de protenas.
As etapas principais para a produo de uma protena
recombinante compreendem: (1) pesca do gene de interesse, (2) escolha
do sistema de expresso, (3) clonagem, e (4) expresso. A seguir,
descreveremos cada um destes passos com detalhe.
1. Pesca do gene de interesse
A primeira pergunta que surge : Qual o organismo original da
protena de interesse? De uma clula procaritica, um eucarioto inferior ou
um eucarioto superior?
A sequncia do RNA mensageiro (mRNA) de clulas procariticas
e de eucariotos inferiores igual do DNA genmico. A figura 2A mostra o
dogma central de uma clula procaritica e de um eucarioto inferior. Deve-

A.

B.

Figura 2. Dogma central da biologia molecular. (A) Procariotos A sequncia

do mRNA igual sequncia do DNA genmico. (B) Eucariotos superiores O
transcrito primrio sofre processamento (perda dos introns), e somente os exons
esto presentes no mRNA.

se ressaltar que o material gentico do ltimo est envolto pela membrana

nuclear. A pesca do gene de interesse destes organismos pode ento ser
direta de seu DNA genmico, atravs da tcnica da reao em cadeia da
polimerase (PCR) (Figura 3A). Esta tcnica, descrita abaixo, permite a
pesca seguida da amplificao de qualquer sequncia de DNA.
1.1. Reao em cadeia da polimerase (PCR)
Esta tcnica permite a pesca direta do gene de interesse de
procariotos e eucariotos inferiores, seguida da amplificao do mesmo.
Consiste de trs etapas: desnaturao do DNA, anelamento com os
oligonucleotdeos iniciadores (primers), e amplificao do gene de
interesse (Figura 3A).
A etapa da desnaturao do DNA, ou rompimento das ligaes de
hidrognio entre as bases nitrogenadas permite que, na etapa seguinte,
primers especficos se anelem s fitas individuais de DNA. A temperatura
normalmente utilizada de 94-95 oC por um perodo de 1-3 minutos.

A etapa do anelamento dos primers importante uma vez que os

mesmos devem se hibridizar de forma precisa na sequncia original do
DNA. Para se obter a temperatura ideal para este fim, testes com vrias
temperaturas de anelamento so realizados. A temperatura inicial de 5
o

C abaixo da temperatura de fuso (Tm) dos primers. A temperatura ideal

pode ser maior ou menor. Termocicladores com gradiente de temperaturas

o

so ideais para a realizao destes testes, onde a temperatura de 5 C

abaixo das Tms dos primers locada no meio do gradiente.
A etapa da amplificao da regio codificadora do gene de
interesse realizada na presena da mistura dos quatro nucleotdeos e
DNA polimerase proveniente de bactrias termoflicas. A temperatura ideal
para estas enzimas realizarem a reao de extenso da segunda fita est
entre 68-72 oC. O tempo de extenso varia de uma enzima para outra. As
trs etapas, acima descritas, so repetidas 30-35 vezes. Deste modo, a
regio flanqueada pelos dois primers amplificada exponencialmente
(Figura 3B).
Vrias DNA polimerases esto disponveis comercialmente, sendo
as mais utilizadas, Taq- e Pfu polimerases. A primeira proveniente de
Thermus aquaticus, e a segunda de Pyrococcus furiosus. Deve-se
ressaltar que a Pfu polimerase uma enzima de alta fidelidade (1), sendo
ento recomendada para a pesca de genes de interesse.
1.2. Reao da transcriptase reversa seguida de PCR (RT-PCR)
A sequncia de mRNAs de clulas eucariticas superiores
diferente da do DNA genmico, desde que o produto primrio da
transcrio gnica sofre processamento para se transforma em mRNA
(Figura 2B). Assim, pesca de genes destas clulas deve ser realizada
atravs da reao da transcriptase reversa seguida de PCR. Esta enzima

A.

B.

Figura 3. Reao em cadeia da polimerase (PCR). (A) As etapas da reao:

Etapa 1 DNA submetido a altas temperaturas para que ocorra a desnaturao;
Etapa 2 DNA desnaturado est apto a se anelar com os primers diretos (D) e
reversos (R) iniciadores; Etapa 3 DNA polimerase sintetiza a segunda fita de
DNA na presena dos desoxi-ribonucleosdeos 5-trifosfatos dTTP ( ), dATP ( ),
dCTP ( ) e dGTP ( ). (B) Amplificao exponencial da sequncia flanqueada
pelos primers.

catalisa a sntese de uma fita de DNA complementar (cDNA) do RNA,

degrada a fita de RNA do hbrido DNA-RNA, e em seguida sintetiza a
segunda fita do DNA (2) (Figura 4).

Figura 4. Reao da transcriptase reversa.

Esta enzima utiliza a fita de RNA como molde e
sintetiza uma de DNA complementar primeira.
Em seguida, degrada a fita de RNA do hbrido
DNA-RNA e por final, sintetiza a segunda fita de
DNA.

1.3. Oligonucleotdeos iniciadores (primers)

A pesca e amplificao do gene de interesse por PCR e RT-PCR
exigem primers iniciadores para as enzimas sintetizarem a fita de DNA. As
DNA polimerases utilizam primers direto e reverso que abrangem as
regies contguas e as terminaes 5 da fita direta e da reversa,
respectivamente, do gene (Figura 5A).
A.
B.

C.
Figura 5. Primers iniciadores. A. Primers direto e reverso correspondem a
cpias idnticas das terminaes 5 das duas fitas do gene de interesse. B.
Primers com stios de restrio (em itlico) para posterior clonagem em
plasmdeos de expresso. As bases que no pareiam com a fita complementar
esto salientadas com asteriscos. C. Produto de PCR (amplicon) da regio do
DNA mostrada em B.

Estes primers podem ser desenhados de modo que contenham os

stios de restrio que sero utilizados posteriormente para clonagem da
sequncia codificadora de interesse em plasmdeos de expresso. Os
mesmos devem tambm ter Tms semelhantes para facilitar a obteno de
temperatura de anelamento adequada. A figura 5B mostra os primers
(direto e reverso) utilizados para a clonagem de uma sequncia de DNA.
Os stios de restrio Nde I (catatg) e Bam HI (ggatcc) flanqueiam as
terminaes 5 e 3 do gene, respectivamente. Note que algumas bases
no pareiam com a fita complementar (salientados com asteriscos). A
figura 5C mostra o produto de PCR (ou amplicon) obtido utilizando estes
primers.

enzima transcripitase

reversa

necessita

de

um

primer

complementar ao RNA para a sntese de cDNA. Poli-dT utilizada no caso

de sequncias codificadoras desconhecidas (Figura 4). Por outro lado,
usa-se primers especficos para regies codificadoras conhecidas.

2. Escolha do sistema de expresso

Os plasmdeos de expresso contm um promotor forte e um stio
de mltipla clonagem, alm da origem de replicao (OR), do marcador
gentico (MG) e outras sequncias (Figura 6).

Figura 6. Desenho esquemtico de um

plasmdeo de expresso mostrando as
principais caractersticas: promotor forte,
stio de mltipla clonagem (SMC),
origem de replicao (OR) e marcador
gentico (MG).

Os principais plasmdeos de expresso utilizam os promotores

Lac, Tac e T7. O promotor Lac semelhante ao utilizado pelas cepas tipo
selvagem de E. coli, sendo ento reprimido pela protena repressora lacI
na ausncia de indutor (lactose ou isopropiltiogalactosdeo - IPTG) e
induzido em sua presena (Figura 7A). O promotor Tac contm a regio
operadora (onde a RNA polimerase se liga) do Operon Trp e a regio
promotora (onde a protena repressora se liga) do Operon Lac (Figura 7B).
Assim, ambos promotores so induzidos por lactose ou IPTG e utilizam a
RNA polimerase bacteriana para transcrever o gene de interesse (Figuras
7A e 7B).

A.

B.

Figura 7. Comparao dos promotores Lac e Tac. A. Promotor Lac A induo

da expresso do gene alvo acontece somente na presena do indutor (IPTG). B.
Promotor Tac por ter a regio operadora do promotor Lac, a induo ocorre
tambm na presena de IPTG.

O promotor T7, por outro lado, utiliza a RNA polimerase do fago

T7. A vantagem deste promotor que esta RNA polimerase 20 mais
ativa do que a bacteriana, e consequentemente, o nvel de expresso
protica bem maior. Entre os plasmdeos que utilizam a T7 RNA
polimerase, esto os do sistema pET de expresso (3; Manual pET
System, Novagen). Neste sistema, a induo da expresso da protena de
interesse indireta. A induo direta do gene da T7 RNA polimerase,
lisogenizada no DNA genmico, que est sob controle do promotor Lac
(Manual pET System, Novagen). Ao ser traduzida, a protena T7 RNA
polimerase se liga em sua regio promotora presente no plasmdeo pET, e
ento, o gene de interesse transcrito e a seguir, a protena expressa
(Figura 8, Manual pET System, Novagen). Geraes mais recentes de
vetores pET apresentam tambm a regio operadora do operon Lac
(Figura 8, Manual pET System, Novagen); com isto a expresso basal de
T7 RNA polimerase no suficiente para que ocorra tambm a expresso
basal da protena de interesse. Ou seja, esta s ser expressa aps

induo com o indutor. Isto importante porque protenas txicas s

bactrias no so expressas aps induo quando h vazamento de
expresso de forma basal.

Figura 8. Esquema de induo

do sitema pET. Na presena de
indutor ( ), o repressor Lac no
se liga em OLac e a T7 RNA
polimerase expessa. Esta ento
se liga em seu promotor presente
no DNA plasmidial.

3. Clonagem do gene de interesse

O gene de interesse pode ser clonado em um nico stio de
restrio ou em dois diferentes. Utiliza-se uma ou outra estratgia
dependendo da finalidade do procedimento. A clonagem do gene para fins
de produo protica normalmente realizada em dois diferentes stios de
restrio para que a sequncia se insira no plasmdeo de forma
direcionada. Focalizaremos nossa discusso para esta finalidade.
Inicialmente, um estudo do mapa de restrio do gene de interesse
deve ser realizado para em seguida selecionar os stios que flanquearo o
mesmo. Os stios ausentes ou os que esto presentes em menor nmero
so os preferenciais. Conjuntamente, os stios de restrio presentes e
suas posies relativas no stio de mltipla clonagem (smc) devem ser
observados. Os stios mais a montante no smc devem ser escolhidos para
flanquear a terminao 5 do gene de interesse, enquanto os posicionados
mais a jusante, a 3.
Sequncias codificadoras podem ser clonadas de modo que as
protenas resultantes sejam expressas de forma autntica ou quimrica. A

primeira contm apenas os aminocidos presentes na protena original. As

quimeras podem conter caudas com aminocidos extras tanto na poro
N- como na C-terminal da protena resultante. Estas caudas so teis para
o processo de purificao da mesma. Caudas de histidinas, da enzima
tioredoxina, entre outras so amplamente utilizadas.
Para a expresso de protena autntica, a terminao 5 de sua
sequncia codificadora deve conter o cdon de iniciao da traduo
(ATG). Insero de stio de restrio contendo este cdon conveniente
para esta finalidade. As enzimas Nde I e Nco I podem ser ento utilizadas,
uma vez que seus stios (CATATG e CCATGG, respectivamente) contm
este cdon. A terminao 3 deve conter um dos cdons de terminao
(TGA,TAA ou TAG) seguido a jusante de um stio de restrio presente no
smc do plasmdeo selecionado (Figura 6). Um exemplo de amplicon
utilizando esta estratgia est mostrado na Figura 5C. A sequncia de
interesse est flanqueada pelos stios de restrio Nde I e Bam HI. O
amplicon obtido e o plasmdeo onde o mesmo ser clonado so digeridos
com as mesmas enzimas, e a seguir, ambos so ligados pela enzima DNA
ligase. Um exemplo de plasmdeo recombinante assim obtido est
mostrado na figura 9.
Para a produo de protena quimrica com cauda na poro Nterminal, sua regio codificadora deve ser clonada em fase com a
sequncia da cauda extra de aminocidos. Para este fim, insere-se
convenientemente um stio de restrio adequado na terminao 5 do
gene. Sua terminao 3 deve conter um dos cdons de terminao,
seguido a jusante por outro stio de restrio. Por outro lado, na construo
do plasmdeo de expresso de uma protena com cauda na poro Cterminal, o gene de interesse deve conter o cdon de iniciao de
traduo, o cdon de terminao, caso presente, deve ser cancelado, e a

sequncia da cauda deve estar em fase com a do primeiro. Plasmdeos

para estes fins so comercialmente disponveis.
A.

B.

C.

Figura 9. Produo de plasmdeo recombinante. A. O plasmdeo de expresso

e amplicon so digeridos com as mesmas enzimas de restrio (Nde I e Bam HI).
B. Produtos das digestes. C. Plasmdeo recombinante formado pela ligao dos
produtos das digestes pela enzima DNA ligase.

4. Expresso das protenas recombinantes

Os plasmdeos recombinantes de expresso obtidos, conforme
acima descrito, so ento introduzidos em clulas de cepas de E. coli
convenientemente engenheiradas para que as mesmas produzam a
protena de interesse. Estas clulas transformadas com os plasmdeos
so plaqueadas em meio de cultura semi-slido e incubadas (37 oC, 12-14
hs). Algumas colnias so inoculadas em meio de cultura lquido rico, at
densidade ptica a 600 nm (DO600) adequada para cada sistema e ento
induzidas com indutor (lactose ou IPTG). Em sistemas que utilizam a RNA
polimerase bacteriana, a cultura bacteriana induzida na fase midi-log de
crescimento (DO600 ~ 0,4-0,5); os que utilizam a T7 RNA polimerase, a
induo normalmente no final da fase logartmica (DO600 ~ 0,7-0,8). Aps
induo, as culturas so crescidas por mais 5-6 horas (RNA polimerase

bacteriana) ou 3-4 horas (T7 RNA polimerase). A seguir, as clulas

bacterianas so coletadas por centrifugao, e o nvel de expresso
protica verificado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (4) de
uma pequena amostra de bactrias induzidas. Um esquema do
procedimento para expresso de protenas recombinantes est mostrado
na figura 10, e o nvel de expresso na figura 11.

Figura 10. Esquema do procedimento para expresso de protenas

recombinantes. 1. Cultura de E. coli, transformadas com plasmdeo de expresso,
em meio semi-slido, 2. Inoculao e crescimento (37 oC), sob agitao, de
algumas colnias em meio lquido rico, 3. Induo com IPTG ou lactose em DO 600
ideal (a) sistemas que utilizam RNA polimerase bacteriana, e (b) sistemas que
utilizam T7 RNA polimerase. 4. Coleta das bactrias por centrifugao.

Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamidaSDS de amostras de bactrias transformadas com

plasmdeos de expresso. PM Marcadores de Peso
Molecular (mostradas ao lado em kDa), NI Bactrias
no induzidas, I bactrias induzidas. Verifica-se a
presena de uma banda (indicada por uma flecha) no
poo I que no est presente no poo NI

5. Otimizao das sequncias codificadoras

A sequncia gnica de interesse pode conter cdons que no so
muito utilizados pela E. coli (5, 6). O grau de frequncia destes cdons

pode diminuir, ou mesmo no haver expresso da protena heterloga. Os

mesmos devem ser substitudos pelos cdons sinnimos mais utilizados
pela bactria (ndice de adaptao de cdons, ou do ingls codon
adaptation ndex, CAI) (7). Sequncias gnicas podem ser analisadas e
melhoradas atravs de softwares disponveis em stios na rede
internacional de informtica (8). Companhias de biotecnologia sintetizam
genes com cdons ideais para vrias clulas hospedeiras de expresso.
6. Consideraes Finais
Muitas protenas tm atividades biolgicas somente aps sofrerem
modificaes

ps-traducionais.

Estas

protenas

devem

ser

ento

produzidas em sistemas de expresso de eucariotos, como por exemplo,

clulas de mamferos, de insetos, entre outros.
7. Referncias Bibliogrficas
1. Lundberg, KS; Shoemaker, DD; Adams, MW; Short, JM; Sorge, JA;
Mathur, EJ. 1991. High-fidelity amplification using a thermostable DNA
polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene, 108:1-6.
2. Temin, HM. 1976. The DNA provirus hypothesis. Science, 192: 1075-80.
3. Studier, FW; Rosenberg, AH; Dunn, JJ; Dubendorff, JW. 1990. Use of
T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Meth. Enzymol.,
185:60-89.
4. Laemmli, UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4. Nature, 227:680-85
5. Makrides,SC. 1996. Strategies for achieving high-level expression of
genes in Escherichia coli. Microb. Review, 60:512-38.

6. Wada, K-n; Aota, S-i; Tsuchia, R; Ishibashi, F; Gojobori, T; Ikemura, T.

1990. Codon usage tabulated from the GenBank genetic sequence data.
Nucl. Ac. Res., 18:2367-411
7. Sharp, PM and Li, W-H. 1987. The codon adaptation index a measure
of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications.
Nucl. Ac. Res., 15:1281-95.
8. http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/