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WESTERN BLOT - Apostila e Protocolo PDF
WESTERN BLOT - Apostila e Protocolo PDF
1. Introdução
A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de
proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação
das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um
anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa
membrana para análise dos dados.
3. Fracionamento de proteínas
Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão
migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para
retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É
utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas
mascarando a carga intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo
positivo em um campo elétrico. Além disso, o SDS quebra as ligações não covalentes das
proteínas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primária, liberadas da associação
com outros monômeros ou outras proteínas e moléculas de lipídeos. Além disso, usa-se,
geralmente, um agente redutor tal como o β-mercaptoetanol, que quebra as ligações
dissulfito (S-S) dos resíduos de cisteína que promovem a ligação de proteínas a outros
monômeros, outras proteínas ou mesmo a estrutura terciária da mesma proteína, mantendo
assim, as proteínas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condições,
proteínas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na
presença de um campo elétrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao β-
mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas
(Figura 1b, c).
1. Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a solução para efetuar
as diluições para preparar a curva de calibração.
- Eliminar o isopropanol lavando com água destilada e secar com papel Watmann.
- Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa
menor voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta.
- Diluir o tampão com a amostra na proporção 1:4, e aquecer por 3-5 min a 95˚C
2.3. Corrida
3. Western
3.2. Transferência
- Após esse tempo, remover os papéis Whatmann sem mover o gel e verificar se a
transferência funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso
Molecular.
- Caso as bandas do Marcador de Peso Molecular não tenham sido transferidas para
a membrana, remontar o sandwich e continuar a transferência por um período maior.
3.3. Bloqueio
- Descartar a solução do Tampão de Lavagem e adicionar um volume de Tampão de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.
- Deixar a membrana bloqueando sob leve agitação (orbital) durante 30 minutos a 1
hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primário. Em todos
os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
de Tampão de Bloqueio.
- Descartar a Solução do Anticorpo Secundário e lavar a membrana com
aproximadamente 30 ml de Tampão de Lavagem de acordo com os tempos definidos
abaixo: 2 X rápido, 2 X 15 min, 2 X 5 min.
- Preparar a membrana para revelação.
3.6. Revelação
- Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que
excitar o fluoróforo associado ao anticorpo secundário utilizado no experimento (700 ou
800nm).
Material Suplementar
What is Cancer?
https://www.youtube.com/watch?v=LEpTTolebqo
Aurora Kinases
https://www.youtube.com/watch?v=Qn7lKYHjE_Y