Fertilização

Fertilização

• União de 2 gâmetas haplóides ( ♀ + ♂ ),

para produzir um zigoto diplóide:

1. Contacto/reconhecimento do espermatozóide

2. Entrada de 1 espermatozóide e bloqueio imediato

3. Fusão dos 2 pró-núcleos

4. Activação do ovo; início do desenvolvimento

Reconhecimento do Espermatozóide

1. Quimiotáxia (atracção) dos espermatozóides

(ocorre apenas qd oócitos estão maduros)

2. Reacção do acrossoma

3. Ligação do espermatozóide ao envelope extracelular do

óvulo (envelope vitelino ou zona pelúcida [ZP])

4. Passagem do espermatozóide através da ZP

Só finalmete se dá a fusão das membranas plasmáticas!

* Por vezes (e.g., nos mamíferos) os passos 2 e 3 estão invertidos

Fertilização no Ouriço-do-mar
 Ouriço: os problemas da fertilização externa
A diluição de gâmetas no meio aquático cria problemas q se resolvem com:
• Atracção específica e,
• Activação específica dos espermatozóides

1. Quimiotaxia (atracção) e.g., em Arbacia punctulata a

geléia liberta o resact (péptido de 14aa) q atrai atrai
espermatozóides c/ receptor específico (de Arbacia)

2. Reacção acrossómica (activação)

a) Exocitose da vesicula acrossómica
b) Extensão do processo acrossómico
A Ligação do Óvulo ao Espermatozóide no Ouriço-do-mar
 Reacção acrossómica no ouriço-do-mar

Efluxo de ↑ pH Polimerização Processo

H+ e Na+ actina acrossómico

Activação da ↑ Actividade
Contacto Influxo de dineina flagelo
c/ geléia Ca2+
Exocitose Libertação de enzimas
(digerem a geléia)
Exposição de bindina
 O papel da bindina:

• Proteína da membrana (acrossoma) q se liga ao envelope vitelino

A interacção da bindina com o óvulo é altamente específica

Há um nº limitado de receptores de Aglutinação de óvulos só ocorre com bindina

bindina na superfície do óvulo pois da mesma espécie
à áreas sem espermatozóides!
Fusão no Ouriço: O “cone de fertilização”

• A ligação induz polimerização de F-actina no óvulo:

– microvilosidades
– “cone de fertilização” (≈ processo acrossómico)

• “Ponte” citoplasmática permite entrada do núcleo,

mitocôn-drias, centríolo e cauda
• A bindina tb induz a fusão de vesículas fosfolipídicas
Fertilização em mamíferos
 Mamíferos: fertilização interna

Aqui a especificidade está garantida pelo isolamento do

comportamento reprodutor entre as espécies:

Mas parece tb haver um mecanismo de quimiotaxia:

Foi observado q fluido folicular atrai espermatozóides!

É possível q o efeito não seja específico, mas q seja

como um estímulo geral de movimento ou
metabolismo…a quimiotaxia nos mamíferos ainda não
está provada!
A fertilização em humanos (e maioria dos mamíferos) ocorre perto do ovário.
Ligação dos espermatozóides no ratinho
 Comparando o Ouriço e o Ratinho…
Ouriço-do-mar
• Envelope vitelino fino e poroso, qd o esperm.
se liga, fica muito perto da membr. plasm.
do óvulo, logo, o receptor da bindina pode-
-se extender através do envelope
 1º reacção acros., depois ligação
• espermatoz activado por quimioatração
Ratinho
• Zona pelúcida muito grossa, o esperm.
fica mto afastado óvulo, tem que se
ligar 1º e depois concentrar as enzi-
mas de lise, que só assim penetrarão
 1º ligação, depois reacção acros.
• Atração, capacitância e activação do
espermat. pelo fluido ovárico
Ligação no ratinho: o papel da proteína ZP3

A zona pelucida = envelope vitelino dos invertebrados

Matriz glicoproteica, cujas fibrilhas são formadas por

dímeros de proteínas ZP2 e ZP3, cruzadas com ZP1.

Teste: ligação do espermatoz. depois de incubação com proteínas ZP

ZP3 é a glicoproteína específica da zona pelucida

que se liga ao espermatoz.; qd se liga ao receptor
na membrana do espermat. inicia a reação acrossómica

Mecanismos de ligação são pouco conhecidos

O espermatoz. reconhece regiões de carbohidratos da

ZP3 (eliminação destas regiões inibe a ligação)
 Reacção acrossómica no ratinho

Ligação entre ZP3 e Abertura dos Aumento do Ca2+ Exocitose do

receptor no canais de Ca2+ no espermatozóide acrossoma
espermatozóide

ZP2 também tem um papel na reacção acrossómica:

Durante a reac. across., a parte anterior da membrana do espermat. sai (esta é a região onde
estavam os receptores de ZP3!). Mas o espermatoz. tem que se manter ligado `a zona pelucida para
a poder lisar. O que o mantêm ligado? ZP2! (q se liga a receptores de ZP2 na membrana interna do
processo acrossomal - ligação secundária do espermat. à zona pelucida
Fusão nos Mamíferos

- Semelhante ao ouriço-do-mar.

- A membrana plasmática do
espermatozóide contém fertilina
q é essencial para a fusão

-A fertilina liga-se a integrinas

a6b1 na membrana do óvulo
 O Problema da Polispermia

•A entrada de vários espermatozóides tem consequências

desastrosas para a maioria dos organismos:
•e.g., no ouriço-do-mar – 2 esperm.  núcleo triplóide
que se divide por 4 células, que morrem ou se
desenvolvem anormalmente (umas com cromos. a
mais, outras a menos).
•Boveri (1902) usou estes resultados para mostrar q os
cromossomas determinam desenvolvimento!

• No ouriço do mar há 2 mecanismos de bloqueio:

• Boqueio rápido (eléctrico)

• Bloqueio lento (mediado por Ca2+)
 BLOQUEIO RÁPIDO (eléctrico)
(Ocorre tb em rãs, mas não na maioria dos mamíferos)

Potencial de repouso da membrana do óvulo = -70mV

(o interior é negativo em relação ao exterior)

1-3 segundos depois da entrada do 1º

espermat. o potencial de repouso da
membrana do óvulo aumenta para +20mV
(entrada de algum Na+ no óvulo)
 esperm. já não se conseguem fundir-se
com o ovo

Com um potencial positivo não há fusão, talvez o

espermat. tenha uma proteína fusiogénica
positiva, cuja entrada no óvulo seja regulada
pela carga.

Ainda não se sabe se o aumento da permeabilidade ao Na+ (que aumenta o potencial) se

deve à ligação ou à fusão do espermatozóide.

NÃO é suficiente para evitar a polispermia: o aumento do potencial é transitório (1 min.)!

Reacção cortical em ouriços (bloqueio lento):

• 20 seg. após fertilização a membrana

expande-se e afasta os espermatozóides
• Proteases separam envelope vitelinico da
membrana (assim como os recep. bindina)
• Mucopolissacáridos Gradiente ósmótico
faz entrar água para o espaço perivitelínico
• Forma-se o Envelope de fertilização
• Peroxidases endurecem o envelope,
libertando os espermatoz. excedentários
• Hialina forma uma cobertura à volta do
ovo, que se liga às microvilosidades
(suportará o embrião até à gastrulação)
O Ca2+ induz a formação do envelope de
fertilização, a partir do ponto de entrada

Não se deve à entrada de cálcio, é cálcio intracelular, armazenado no

retículo endoplasmático do óvulo (em cobras e vermes vem de fora)
Reacção cortical em mamíferos:
• Nos mamíferos, há reacção cortical mas não se forma
um envelope de fertilização

• Modificação enzimática das receptores da zona pelucida

(ZP2 3 ZP3), de modo a não permitirem mais a ligação
dos espermatozóides

 reacção da zona

A presença de cálcio (induzida pelo espermatozóide –
não se sabe bem como!) é essencial para activar o
desenvolvimento do embrião!

O cálcio activa uma série de reacções metabólicas no

citoplasma do ovo, independentes da presença do núcleo.

No final, tais reacções levam à síntese de DNA e proteica

(que utiliza RNAm já existente no óvulo), essenciais para
as primeiras fases do desenvolvimento do embrião.
 Activação do metabolismo do óvulo
ouriço-do-mar

Events___________________________________________ Approximate time post insemination

EARLY RESPONSES

Sperm binding 0 sec

Fertilization potential rise (fast block polyspermy) within 1 sec
Sperm-egg membrane fusion within 6 sec
Calcium increase first detected 6sec
Cortical vesicule exocitosis (slow block polyspermy) 15-16 sec

LATE RESPONSES

Activation of NAD kinase starts at 1 min

Increase in NADH and NADPH starts at 1 min
Increase in O2 consuption starts at 1 min
Sperm entry 1-2 min
Acid eflux 1-5 min
Increase in PH (remains high) 1-5 min
Sperm chromatin decondensation 2-12 min
Sperm nucleus migration to egg center 2-12 min
Egg nucleus migration to sperm nucleus 5-10 min
Activation of protein synthesis starts at 5-10 min
Activation of amino acid transport starts at 5-10 min
Initiation of DNA synthesis 20-40 min
Mitosis 60-80 min
First cleavage 85-95 min
Fusão do material genético em mamíferos (12 horas):

A) Fim da 1ª divisão meiótica do óvulo.

B) O esper. entra no oócito e forma-se

àster; 2ª divisão meiótica do oócito.

C) Os 2 pró-núcleos aproximam-se, enquanto

replicam o DNA.

D) Na 1ª profase mitótica os 2 conj.de cro-

mossomas condensam-se separada/

E) Na prómetafase os cromos. misturam

-se no equador e o fuso mitótico
inicia a 1ª divisão mitótica; só se
observa um verdadeiro núcleo diplóide
no estádio de 2 células
Fusão dos Prónucleos em Mamíferos

Zigoto humano
Não equivalência dos pró-núcleos dos mamíferos

. Os pró-núcleos femininos e masculinos não são equivalentes,

mas têm funções complementares em algumas fases do desen-
volvimento.

. Às vezes, só o alelo materno ou paterno de determinado gene

está activo; assim, alguns genes são activados se derivam do
espermatozóide, outros se provêm do óvulo (normal/ ambos os
alelos estão activados, isto é uma excepção às leis de Mendel!).
. Ambos os pró-núcleos são necessários para o desen-
volvimento normal do mamífero.

e.g., se o núcleo diplóide derivado apenas do espermat., não se

forma o embrião, apenas uma massa de tecido tipo-placenta.

se só genoma feminino (in vitro), o embrião morre ao fim de

10-11 dias (partenogénese não se conseguiu ainda em mamíferos).
Rearranjo do citoplasma do ovo de rãs, após fertilização

Após entrada do espermatozóide:

• A camada externa pigmentada do óvulo roda (em relação ao

citoplasma interno) cerca de 30º em direcção ao ponto de entrada do Animal pole
espermatoz.

• Assim, a região anteriormente coberta pelo citoplasma

cortical escuro, fica exposta.

• Esta região exposta é o CRESCENTE CINZENTO

- situa-se no local oposto à entrada do espermatozóide

- é o local onde se iniciará a gastrulação
Vegetal pole

O motor deste movimento citoplasmático é um conjunto de microtúbulos

paralelos que se forma entre o citoplasma cortical e o interno do polo
vegetal, paralelo à direcção da rotação do citoplasma.

Pólo animal pigmentado Crescente cinzento a 1ª clivagem divide ao meio

o crescente cinzento

Pólo vegetal