O QUE SÃO TESTES

SOROLÓ
SOROLÓGICOS ?

Imunodiagnóstico São técnicas para a detecção e

quantificação de antígenos e
anticorpos, ou outras
substâncias que desempenhem o
Conceitos papel de antígeno no ensaio, tais
como drogas, hormônios, ácidos
nucléicos, citocinas, receptores
de células, etc.
Prof:
Prof:Teresa
TeresaGomes
Gomesde
deOliveira
Oliveira

Reatividade Cruzada

Reações Cruzadas

Anti-A Anti-A Anti-A

Ac Ac Ac

Ag A Ag B Ag C

Epitopo Epitopo similar

Compartilhado

Quantificaç
Quantificação da Resposta Imune

Título -

Fatôres que afetam as • descreve uma quantidade relativa de ac.

• dependente do ensaio
reações de Ag/Acs • geralmente expressa como a recí
recíproca da última diluiç
diluição
do soro que forneceu uma reaç
reação positiva

Não tem unidade

 Reações de Precipitação

Concentração do Antígeno • Antígeno solúvel

• Precipitação ocorre na
zona de equivalência
Concentração do Anticorpo
• Em tubo são pouco
utilizada atualmente
(Ex: PCR -
proteína C reativa)

Imunodifusão Radial Simples - Mancini

Gel contendo Ac anel de precipitação

Ag Ag Ag Ag diam.

x
desconhecido
diâmetro

x
concentraç
concentração (mg/dl)

Imunodifusão radial simples-Teste Quantitativo

Dosagem de imuneglobulinas AGLUTINAÇ
AGLUTINAÇÃO
IgM, IgG,IgA

Técnica de Mancini
Floculação (Aglutinação) de
cristais de colesterol •• Floculação
Floculação
•• VDRL
VDRL (Veneral
(Veneral Disease
Disease Research
Research ––VDRL
VDRL
Laboratory)
Laboratory) –cardiolipina de
–cardiolipina de boi
boi
––cardiolipina
cardiolipina de
de boi
boi éé sensibilizada
sensibilizada com
com
cristais de colesterol e lecitina
cristais de colesterol e lecitina
––pesquisa-se
pesquisa-se aa presença
presença de de anticorpos
anticorpos
anti-lípidios na
anti-lípidios na sífilis
sífilis

Pró
Prózona

Diluiç
Diluição 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
Reaç
Reação - - - + + + -

Observação no microscópio (objetiva 4X e 10X pró

prózona

Título = ?
= 64
 Fenômeno Prozona Aglutinação
Ativa ou direta
Falsos resultados negativos em soros com
elevado título de anticorpos aglutinantes

Esse efeito é eliminado empregando-se

diluições seriadas do soro

AGLUTINAÇÃO AGLUTINAÇÃO EM PLACA

GRUMOS

Aglut. Aglut.
Positiva Negativa

SINAL: GRUMOS

Aglutinação/Hemaglutinação
Passiva ou Indireta
• Artificialmente adsorve-
adsorve-se à
partí
partículas:
– antí
antígeno
– anticorpo
• passiva reversa

Prof:Teresa
Prof:TeresaGomes
Gomesde
deOliveira
Oliveira
 Aglutinação/Hemaglutinação
Passiva ou Indireta

A reação
A reação pode
pode ser
ser feita
feita em
em
placas contendo
placas contendo 96
96 poços
poços
+

Hemaglutinação

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

AGLUTINAÇ
AGLUTINAÇÃO DO LÁ
LÁTEX
Hemaglutinação
1/1024
1/256
1/128

1/512
1/16

1/64
1/32

Neg.
Pos.
1/8
1/4
1/2

Paciente Título

1 64
2 8
3 512
4 <2
5 32
6 128
7 32
8 4
 Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação
Aglutinação/Hemaglutinação Passiva ou Indireta Reversa
(teste de Gravidez)
Teste Negativo Aglutinação

Sem aglutinação
Teste Positivo

+ +
Amostra do paciente
Anticorpos
(HCG)

Imunofluorescência
• Direta
– Ac marcado com corante fluorescente liga-se ao
Ag tecidual

Ac marcado com
corante fluorescente

Ag Raiva
Tecido

Imunofluorescência
• Indireta
– Ac liga-se ao Ag tecidual
Chlamydia trachomatis não marcado
Anti-Ig marcada
– Anti-Ig marcada com com Fluorocromo
Ac não
corante fluorescente é marcado
usado para detectar a 1a
ligação do anticorpo
Ag
Tecido
• Qualitativo
• Semi-Quantitativo
 FAN -
células Hep-2
Técnicas Imunoenzimáticas
Imunoperoxidase
• Avrameas e Uriel - Nakame e Pierce (1966)
• Em relação a IF:
– preparações duradouras
– não necessita de microscópio de fluorescência
• Vantagens da peroxidase:
– baixo peso molecular
– resultados reprodutíveis
– fácil visualização da coloração
– substrato: diaminobenzidina

Imunoperoxidase

Vírus Epstein-Barr
 Técnicas Imunoenzimáticas
ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay)
• Envgall e Perlmann (1971)
• Enzimas e substratos cromógenos:
– peroxidase → OPD (o-fenilenodiamina)
→ TMB (3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina)
→ ABTS (2,2’-diazino do ácido etilbenzotiazolino
sulfônico
– fosfatase alcalina → nitrofenilfosfato

ELISA*
ELISA Etapa 1: Ag (ex. virus)
é adicionado ao tubo ou poç
poço

Etapa 2: Soro do paciente

(anticorpos??)
anticorpos??) é adicionado

Etapa 3: Ac anti-
anti-humano com
enzima ligada é adicionado

Etapa 4: um substrato
cromogênico é adicionado

Etapa 5: Haverá
Haverá formaç
formação de cor,
cor,
será
será medida em leitor de ELISA

*enzyme-linked immunosorbent assay

 ELISA

Para a pesquisa de anticorpos

Método indireto

lavagem

lavagem
E E E E

antígeno anticorpo anti-imunoglobulina substrato

(amostra) marcada cromogênico

ELISA ELISA

Para a pesquisa de anticorpos Para a pesquisa de antí

antígenos
Método de captura de IgM Método de captura

E
lavagem

E E

lavagem
E
lavagem

lavagem

lavagem

E E

E
E

anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígeno Substrato anticorpo antígeno anti-antígeno substrato
marcado cromogênico (amostra) marcado cromogênico

WESTERN BLOT Western-blotting

Western-blotting
 Western Blot

HIV-1 Western Blot

Amostra Positiva Amostra Negativa • fita1: controle positivo
• fita 2: controle negativo
• amostra A: Negativa
• amostra B: Indeterminada
• amostra C: Positiva

Dot-blotting

Testes Rápidos
Imunocromatografia