UNIVERSIDADE DO ALGARVE

FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

MESTRADO INTEGRADO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS BIOQUÍMICA CLÍNICA

O LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Rui Manuel Pinto

 Evolução da aplicação ou do desenvolvimento de
métodos utilizados nas Análises Clínicas
Automatização

Execução semi-automática

Execução Manual
Fases da actividade de um laboratório de Análises Clínicas:

Pré-analítica Analítica Pós-analítica

Colesterol = 300 ??
Só como peixe grelhado!

(objectivo: mínimo possível)

Erro Total
 Áreas Analíticas

HEM QCL MBL

IMN BLM QAL

 AA - HEM
ANALISADOR HEMATOLOGICO – Beckman Coulter

Avaliação Automática: Eritrograma, Leucograma e Plaquetas

 AA - HEM
Método Coulter:

A contagem e a avaliação da dimensão dos elementos figurados do sangue

são realizadas através da detecção e da medição de mudanças na
condutividade eléctrica que surgem quando uma partícula (ou célula) num
líquido condutor passa através de uma pequena fenda, existente na célula de
contagem. Este fenómeno origina um impulso eléctrico.

O número de impulsos está relacionado com a quantificação celular.

A amplitude do impulso está relacionada com a dimensão da célula.

 AA - HEM
Método Coulter (variação da impedância)
Electrode interne I= constante

Vide régulé U= R I et R = r l / s
r: résistivité et l: largeur
Bac de
comptage Electrode
externe 1 impulsion U
= 1 particule

Saphir percé
d’un micro-
orifice U

Flux de diluant conducteur

Micro-orifice, Impulsion Temps

surface s
La valeur de l’impulsion de tension U
Diamètre 4mm est proportionnelle au volume cellulaire
 Pentra 60 Horiba-ABX

Sysmex
Pentra 120 Retic Horiba-ABX XT

ACT 5DIFF
Beckman
Coulter

CELL-DYN 3700
Abbot Laboratories

Coulter HMX
CELL-DYN SMS
Beckman Coulter
Abbot Laboratories
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter

CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

 AA - HEM
Análise Diferencial WBC
Impedância / Conductividade de AF / Difracção do laser

Volume

Mo Ne

Eo

Ly Ba

Conductividade

Difracção
 AA - HEM
Exemplo de um hemograma - Beckman Coulter
 AA - HEM
Auto-analisador de coagulação – STA (Stago-Roche)

Avaliação dos factores envolvidos na coagulação: PTT, PT, Fibrinogénio,…

Princípio: Medição da variação da amplitude de oscilação de uma bola de agitação.
 AA - HEM
SISTEMA AUTOMATIZADO PARA CITOMETRIA DE FLUXO
“BECTON DIKINSON”.
 AA - QCL
ANALIZADOR PARA ELECTROLITOS “EASY LYTE PLUS”

Potenciometria

Análise de alguns catiões: Na+, K+ e Li+

Princípio: Eléctrodos Selectivos

 AA - QCL
SISTEMA AUTOMATIZADO PARA DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE
PROTEINAS POR NEFELOMETRIA “BN100 DADE BEHRING”.

Alfa1-antitripsina
IgG 1 Alfa2-macroglobulina
IgG 2 Haptoglobina
IgG 3 Alfa1-glicoproteina acida
IgG 4 Prealbumina
Ceruloplasmina

Nefelometria: é um dos métodos mais usados para a determinação

imunoquímica de proteínas no soro, urina e outros líquidos biológicos

Príncipio: A intensidade de dispersão da luz é proporcional à quantidade de

imunocomplexo existente na amostra.
 AA - QCL
Espectrofotometro – Perkin-Elmer
 AA - QCL
Autoanalisador – Roche Modular

Avaliação: Função hepática (enzimas), Função renal (Metabolitos), Função

cardíaca (proteínas e enzimas), Metabolismo dos hidratos de carbono e dos
lípidos, Avaliação do equilíbrio electrolítico (iões), Proteínas plasmáticas, Drogas
de abuso, Fármacos,...
 AA - IMN
REACÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
(Formas de revelação)
IMUNODIFUSÃO
 AA - IMN
REACÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
(Formas de revelação)

AGLUTINAÇÃO
 AA - IMN
REACÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
(Formas de revelação)

IMUNOFLUORESCÊNCIA
 AA - IMN
Acs. Endomísio em IF no
esófago de macaco

Doença Celíaca
 AA - IMN

REACÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
(Formas de revelação)

REACÇÃO IMUNOENZIMÁTICA (ELISA)

 AA - IMN

R. Antigénio-anticorpo
Doentes,calibradores e controlos

Formação complexo
antigénio, anticorpo e conjugado

R.enzima - substracto
(Colorimétrica)
 AA - IMN
Ensaio Directo “Sandwich”: IgG
Anti-HBs H2O2/TMB

HRP

H2SO4

Positivo
Fase sólida
 AA - IMN
Ensaio Directo “Sandwich”: Detecção de Ag
Ag HBs, Ag HBe, Ag HD H2O2/TMB

HRP

H2SO4

Positivo
Fase sólida
 AA - IMN
Ensaio Competitivo
Anti-HBc Total H2O2/TMB

HRP H2SO4

NEGATIVO

Fase sólida
 AA - IMN
Autoanalisador – Imunoensaios E170
Electroquimioluminescência (EQL)
Processo onde intervêm espécies
altamente reactivas, geradas a partir de
precursores estáveis, à superfície de um
eléctrodo. Estas espécies reactivas
reagem entre si, emitindo luz.
TPA – tripropilamina
(tris(bipirimidil)-ruténio (II)
 AA - IMN
Autoanalisadores – Imunoensaios

ADVIA Centaur Immulite 2000

Quimioluminescência: Reacção química que emite energia sob a forma de luz.

Centaur: Oxidação da forma dimetil do éster de acridina, na presença do
peróxido de hidrogénio. O tempo de reacção rápido e um ruído de fundo muito
baixo tornam a QCL mais rápida do que os métodos RIA ou EIA
Autoanalisadores – Imunoensaios – Aplicações clínicas

Marcadores Tumorais Serológicos

 Autoanalisadores – Imunoensaios – Aplicações clínicas

Resposta imune adaptativa

AgHBs AgHBe AcHBc AcHBs AcHBe Interpretação

Aguda precoce
+ - - - -
IgM Aguda-alta
+ + - - infecciosidade
IgG Crónica-alta
+ + - - infecciosidade
IgG Crónica-aguda
+ - - + tardia ( Infecc.)
IgG Recuperação
- - + +
Imunização
- - - + -
Infecção anterior
Quadro sinóptico da serologia para a HVB
Autoanalisadores – Imunoensaios – Aplicações clínicas

Serologia - HIV
Autoanalisadores – Imunoensaios – Aplicações clínicas

Serologia – Citomegalovirus (CMV)

 Imunoensaios – EIA – Execução Manual

Serologia – Citomegalovirus (CMV)

Avidez das IgG
Low IgG avidity is linked to primary infection
70

60
Avidity index (%)

50

40

30

20

10

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Weeks after beginning of symptoms
Sistema Automatizado Integrado – HEM, QCL e IMN
 AA - QAL

HPLC – Hemoglobinas glicadas, Catecolaminas e seus Metabolitos

 AA - QAL

Espectroscopia de IV – Análise de cálculos renais

 AA - QAL

Espectroscopia de absorção atómica: Doseamento de alguns metais (Al)

 AA - QAL

Espectrofotometro de Emissão por Plasma (ICP-OES): Medição de metais em

líquidos biológicos ou água
NOVAS METODOLOGIAS
 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

A Fertilidade Masculina encontra-se ameaçada?

1974 (USA) – Degradação das características do esperma

1992 (Carlsen, Dinamarca) – 14 947 homens (1938-1990)

Volume: 3,4 mL vs 2,75 mL

Conc. : 113 milhões/mL vs 66 milhões/mL (redução 1% ano)

Degradação confirmada em estudos: França, Belgica e Escócia

1994 – Estudos : Finlândia, Toulouse, Minnesota e Nova York

Ausência da diminuição da qualidade do esperma

Hipótese da diversidade geográfica

 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

Espermograma (OMS)

Esperma:

Mistura de espermatozóides suspensos em secreções com

origem nos testículos e epidídimos e que são misturados, na
altura da ejaculação, com secreções provenientes da
próstata, vesículas seminais e glândulas bulbouretrais.
 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

Espermograma (OMS)
Colheita:
Abstinência sexual: 2 a 7 dias.
Avaliação inicial: 2 colheitas (1 semana a 3 Meses).

Exame macroscópico:
Liquefacção: 60 min. á temperatura ambiente.
Aspecto: Homogéneo, cinza-opaco.
Volume: >2.0 mL
pH: 7.2 – 8.0
 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

Espermograma (OMS)
Exame microscópico:
Concentração: >20 x 106 espermatozóides/mL.
Contagem total: >40 x 106 espermatozóides/mL.
Motilidade: >50% com mobilidade progressiva ou >25%
com mobilidade progresiva rápida.
Categorias motilidade:
a – motilidade progressiva rápida
b – motilidade progressiva lenta
c – motilidade não progressiva
d - imóveis
Vitalidade: >75% vivos.
Morfologia: >30% formas normais.
 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

Espermograma (OMS)

CASA – Hamilton Thorne Research (in silico method)

 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

Espermograma (OMS)

Testes para pesquisa anticorpos anti-espermatozóide

Ac. Anti-espermatozóide: IgG e IgA (+ importante)

MAR (mixed antiglobulin reaction)

IBT (immunobead test)

 APARELHO REPRODUTOR MASCULINO

Avaliação laboratorial da função reprodutora masculina

48
ImmunoCAP™ Rapid

 Doctor´s Office Test

 Sibilância / Rinite Criança
 Asma / Rinite Adulto

 10 Alergénios / teste
 20 min. / teste
 Qualitativo
 110 µl sangue
 ImmunoCAP™ Rapid
Sibilância/Rinite Criança

e1 Gato

t3 Vidoeiro e5 Cão

w6 Artemísia t9 Oliveira

g6 Gramínea w21 Parietaria judaica

d1 Dermatophagoids
f1 Clara de Ovo Pteronyssinus
f2 Leite
 ImmunoCAP™ Rapid
Asma/Rinite Adulto

e1 Gato

t3 Vidoeiro e5 Cão

w6 Artemísia t9 Oliveira

g6 Gramínea w21 Parietaria judaica

d1 Dermatophagoids
i6 Barata Pteronyssinus
m6 Alternaria alternata
 ImmunoCAP™ Rapid –
Procedimento
Picada com Lanceta Colheita do Sangue

Pipetagem no
Dispositivo
 ImmunoCAP™ Rapid –
Procedimento
Aguardar 5 minutos Pipetagem da
Solução
Desenvolvimento

Aguardar 15 minutos Leitura Resultado

ImmunoCAP™ Rapid –
Resultado
ImmunoCAP™ Rapid –
Resultado
Positivo Negativo
ImmunoCAP™ Rapid
Princípio Técnico
Developer
Solution Sample Allergen Control
well well zone zone

Conjugate Nitrocellulose
a-IgE-Gold membrane with
allergens
 ImmunoCAP™ Rapid
Princípio Técnico
110 µl of
whole blood
sample

5 minutes
 ImmunoCAP™ Rapid
Princípio Técnico
500 µl of
Developer
Solution

15 minutes
Luminex assays are based on xMAP technology (multi-analyte profiling
beads) enabling the detection and quantitation of multiple RNA or protein
targets simultaneously. The xMAP system combines a flow cytometer,
fluorescent-dyed microspheres (beads), lasers and digital signal
processing to effectly allow multiplexing of up to 100 unique assays within
a single sample.
Quero ir para
casa