Medicamentos

Biológicos e de Biotecnologia
Introdução
Para compreendermos melhor aquilo que vai ser dado daqui em diante é importante que
consideremos alguns conceitos, como aqueles que estão descritos de seguida:

• Biotecnologia define-se como a ciência que faz uso dos seres vivos, ou de parte deles,
para a produção de bens e serviços. Alguns exemplos de bens produzidos por processos
de biotecnologia, em que “temos animais a trabalhar para nós” são o pão, o iogurte e a
cerveja.
É também importante considerarmos que a biotecnologia combina diversas disciplinas,
algumas mais básicas e outras mais complexas, como é o caso da genética., havendo por
isso uma congregação de conhecimentos.

Nesta cadeira vamos aplicar a biotecnologia à área da saúde (biotecnologia vermelha), mais
concretamente à área do medicamento estudando, por exemplo, proteínas recombinantes e
anticorpos monoclonais, terapia genética e novos alvos terapêuticos, novos fármacos e novas
vacinas.

• Define-se medicamento como “toda a substância ou associação de substâncias apresentada

como possuindo propriedades curativas ou preventivas de doenças em seres humanos ou
dos seus sintomas ou que possa ser utilizada ou administrada no ser humano com vista a
estabelecer um diagnóstico médico ou, exercendo uma ação farmacológica, imunológica
ou metabólica, a restaurar, corrigir ou modificar funções fisiológicas”.

Medicamento

Medicamento biológico: Medicamento de biotecnologia:

Substância de extração obtida a Substância obtida de um
partir de um organismo vivo não organismo geneticamente
modificado. modificado.
Exemplo: Fatores de coagulação Exemplo: Anticorpo Monoclonal
Os dois tipos de medicamentos apresentados divergem dos medicamentos químicos (moléculas de
síntese que não são nem extraídos nem preparados a partir de seres vivos) em vários aspetos,
essencialmente do ponto de vista prático, mais concretamente, em relação ao tamanho (os
medicamentos de biotecnologia ou biológicos são proteínas que apresentam um tamanho muito
superior ao dos medicamentos químicos), à composição, forma de produção, necessidade de
purificação (uma vez que são extraídos de organismos vivos), a nível de contaminações (estas
apresentam um grande impacto a nível da produção e são muito complicadas de controlar), a nível
de estabilidade (pois é mais delicada do que nos medicamentos químicos), a nível de formulação e
também em termos de processos regulamentares.

De forma geral, podemos dizer que os medicamentos de biotecnologia ou biológicos são, à partida,
mais bem aceites, menos tóxicos e apresentam menos efeitos adversos.

Vantagens da biotecnologia no desenvolvimento de novos medicamentos:

• Conceção de novos medicamentos com maior eficácia e especificidade e, consequentemente, menos
efeitos adversos;
• Maior controlo sobre o processo de fabrico (extremamente regulado, com regras muito rigorosas e
vários controlos de qualidade) - isto deve-se essencialmente ao prejuízo monetário de perder um
medicamento deste tipo;
• Permite direcionar a terapêutica para doenças específicas e grupos de doentes (terapia genética e a
maior parte de doenças raras também são tratadas com medicamentos de biotecnologia);
• Permite a produção em larga escala (em reatores de escala industrial, sendo um exemplo de um
medicamento de biotecnologia produzido em larga escala é a insulina).

Falaremos agora um pouco das proteínas terapêuticas e mais especificamente no seu potencial.
Este tipo de proteínas é usado para o tratamento e prevenção de doenças há mais de 100 anos:

• 1890 – Von Behring extraiu o soro de coelhos e cavalos que tinham tido difteria e tétano
e consequentemente aplicar este em pessoas (processo de imunização passiva com o
objetivo de prevenir as doenças em questão);

A insulina, como a conhecemos hoje, é um medicamento de biotecnologia que é produzido por

técnicas de DNA recombinante, no entanto nem sempre foi assim!

• Começou-se por se extrair a insulina do pâncreas do porco ou da vaca (1920- Banting e

Best) para tratar diabéticos do tipo I.
• 1982- Com tudo, graças aos avanços da biotecnologia foi possível substituir a utilização da
insulina animal por insulina industrializada.
 A insulina de porco só difere em 1
aminoácido da humana e a insulina
de vaca difere em 3 aminoácidos.
Posto isto, podemos dizer que o
tratamento com as insulinas animais
foi suportado pelos humanos porque
a sua imunogenicidade não era
muito significativa. Atualmente, a
insulina industrializada ainda
apresenta menos imunogenicidade
pois apresenta a mesma sequência
de aminoácidos que a humana.

Imunogenicidade define-se como a capacidade de o organismo reagir contra algo que lhe é estranho.

Por fim, falaremos agora de como ocorre a produção das proteínas terapêuticas.

Os esquemas acima têm representadas todas as etapas que levam à produção de uma proteína
terapêutica, a partir de uma sequência de DNA que codifica para ela (esta pode ser arranjada por
exemplo, a partir de uma base de dados). Depois da seleção da cadeia de DNA é feita a transcrição
em mRNA e posteriormente, a partir deste último, com ação da transcriptase reversa são
preparados dos cDNA. Por sua vez, os cDNA são amplificados por técnicas de PCR e de seguida,
estes são inseridos num plasmídeo (com capacidade de replicar numa célula, devido à presença de
diversos componentes) que vai servir para transformar as E. Coli e desta forma aumentar a
produção da sequência do cDNA significativamente.

Depois de garantirmos que o processo está a decorrer como previsto vamos realizar a transfeção,
isto é, inserir o plasmídeo numa célula de mamífero (capacidade de fazer modificações pós-
tradução, nomeadamente a glicosilação). A partir daqui, vamos produzir em larga escala e no final
temos de extrair e purificar de forma a obtermos as nossas proteínas terapêuticas.

Importância e principais características

Comecemos por falar daquela que é a segmentação do mercado referente aos medicamentos de
biotecnologia. Esta segmentação compreende o tipo de produto, a aplicação terapêutica e a área
geográfica:

Com base na figura anterior podemos ter uma ideia daqueles que são os valores de mercado
relativamente ao tipo de produto em questão, basicamente os anticorpos monoclonais dominam
em termos de quantidade e de vendas. Já em relação à área geográfica é importante que
consideremos que Ásia-Pacífico é um mercado emergente.

Do ponto de vista económico, os bios farmacêuticos, estão neste momento com taxas de
crescimento enormes (pensa-se que até 2026 o mercado cresça cerca de 7,3% e cerca de 17%
na Ásia-Pacífico). Para além disso, na Europa e EUA, estão mais de 100 substâncias recombinadas
aprovadas para o uso clínico, algo que se justifica pelo aumento da população idosa e consequente
aumento das doenças crónicas e dos cancros que leva a uma necessidade de novas alternativas
terapêuticas. E, o facto destes medicamentos virem tratar doenças que não tinham cura e terem
menos efeitos adversos associados também contribui para o aumento da procura no mercado.

Obviamente, a pandemia que estamos a atravessar trouxe algumas

consequências a nível das empresas de biotecnologia que se
encontram agora muito mais viradas para a produção de vacinas
contra a Covid 19, o que levou a um abrandamento nas outras áreas
terapêuticas. Como podemos ver de seguida, o TOP 7 de vendas no
passado ano comprava isso mesmo:

Mais de 1/5 dos novos medicamentos lançados no mercado mundial a cada ano são derivados da
biotecnologia.

Na américa, o TOP 10 dos medicamentos

mais prescritos no passado ano vêm
comprovar aquilo que foi dito
anteriormente, estamos cada vez perante
uma população mais envelhecida:
Em Portugal, e referente ao ano de 2019 podemos notar algumas diferenças, no entanto, o padrão
não se altera:

Como também já referido os anticorpos monoclonais dominam o mercado em termos de vendas,

no entanto são também eles os medicamentos mais dispendiosos e isso vem se provar num estudo
de 2019, onde foi avaliado o TOP 3 dos medicamentos que mais custam aos estados:

1. Adalimumamab (anticorpo monoclonal);

2. Insulina glargina;
3. Etanercept (fármaco de biotecnologia usado para o tratamento da artrite juvenil e da
psoríase).

A nível do TOP 10 de despesas que os EUA tiveram com prescrições no ano de 2018 voltamos a
ter também uma supremacia dos medicamentos de biotecnologia.:
Vamos agora falar das diferenças de características entre os medicamentos químicos e os
medicamentos de biotecnologia/biológicos:

Medicamentos Químicos Medicamentos de Biotecnologia/Biológicos

Medicamentos biológicos são extraídos diretamente
Pequenas moléculas de síntese (pura ou
dos animais e Medicamentos biotecnológicos
extração);
derivam de técnicas de DNA recombinante;
Natureza proteica (peso molecular elevado,
sequência primária particular, modificações pós-
tradução, localização tecidular, estruturas secundária
e terciária complexas e atividade biológica
dependente da estrutura); *

Sem natureza proteica;

Adaptabilidade funcional- estes tipos de

medicamentos estão sempre sujeitos a que a célula
produtora adicione modificações que podem
Validade de aproximadamente 5 anos.
comprometer o efeito terapêutico, por isso, é de
extrema importância o processo de seleção do
meio de cultura e da célula hospedeira;
Variabilidade biológica; **

Potencial infecciosidade que se pode dever à

presença de vírus endógenos (infeção intrínseca)
-
ou a contaminações no meio de cultura
(infecciosidade extrínseca).
 *Em relação às modificações pós tradução, estas ocorrem sobretudo ao nível do RE e do complexo
de Golgi, sendo as mais comuns a glicosilação, a adição de pontes dissulforeto, fosforilações e
sulfatações (exemplo: em fármacos como o fator VIII da coagulação e os anticorpos monoclonais
predominam as alterações assinaladas, no entanto a insulina não sobre glucosilações). É também
importante considerarmos que a localização tecidular da proteína terapêutica está sempre associada
à sua função. Na tabela também foi referido que a atividade biológica depende da estrutura, isso
ocorre porque apenas quando se verifica a estrutura 3ª (resultante do enrolamento da 2ª) é que
é adquirida a função.

**Como referido na imagem da tabela, dentro de um mesmo lote de medicamentos de

biotecnologia podemos encontrar variabilidade biológica (que se deve ao facto de serem produzidos
em células vivas e por isso é necessário um elevado controlo de forma que a função da proteína
terapêutica seja salvaguardada) pois, apesar de todos os elementos de um mesmo lote
apresentares a mesma sequência de aa as glicosilações podem variar, algo que não compromete
a atividade terapêutica.

Exemplos dos diferentes tipos de medicamentos:

Biológicos:
Químicos: Biotecnológicos:
-Fatores de coagulação;
-Paracetamol (C8H9NO2); -Insulina humana;
-Vacina viral ou bacteriana;
-Aciclovir (C8H11N5O3). -Eritropoietina.
-Insulina porcina.

Falaremos agora das

vantagens que variam
1 entre os medicamentos
2 biológicos e os
3 medicamentos
4 biotecnológicos:

5
6
7
1. Nos medicamentos de biotecnologia não verificamos limitações a nível de produção;
2. A produção dos medicamentos de biotecnologia apresenta um controlo muito apertado,
o que leva a uns menores números de contaminações;
3. O excipiente da albumina humana é usado para estabilizar as proteínas terapêuticas, como
os medicamentos biológicos são mais estáveis não precisam desta adição e por isso, não
correm o risco de toxicidade;
4. Os medicamentos de biotecnologia são mais puros devido a apresentarem um processo
mais controlado;
5. Os medicamentos biológicos são mais eficazes porque a célula hospedeira apresenta nela
todos os mecanismos de reparação ativos, não havendo o risco de no final do processo
termos proteínas não viáveis;
6. Os medicamentos biológicos apresentam menos risco de conter agregados pois as células
vivas apresentam a capacidade de eliminar tudo o que não interessa;
7. Os medicamentos biológicos apresentam um menor custo de produção que os
medicamentos de biotecnologia.

Produtos “naturais”
Biológicas “naturas”
modificados
Desenvolvimento e Processo Geral de Fabrico

Define-se por desenvolvimento tecnológico o conjunto de todos os processos que têm que ser
feitos até à obtenção da SA e que levam a que a produção da proteína terapêutica seja mais
rentável. O aumento da rentabilidade no mesmo período de tempo leva nos à obtenção de uma
proteína mais pura e a um processo de fabrico mais consistente.

Por sua vez, define-se desenvolvimento farmacêutico como todos os passos que têm de ser dados
para garantir que a nossa SA adquire a função desejada. Um exemplo disto, é a vacina da Covid19
que têm como SA RNA viral, no entanto, este é instável e por isso, de forma a garantir que este
chega às células alvo, foi necessário o seu revestimento com lípidos.

Como se pensa /desenha/desenvolve um medicamento de biotecnologia?

1. O processo de desenvolvimento de um medicamento de biotecnologia começa pela

identificação do alvo terapêutico- Onde queremos atuar? O que é que eu quero tratar?;
2. O segundo passo consiste na pesquisa da estrutura da proteína para encaixar no alvo
terapêutico;
3. Por fim, é feito o desenvolvimento da protéina terapêutica.

A nível da interação entre os medicamentos e as células é importante que consideremos que nos
medicamentos tradicionais (químicos) estamos a falar de pequenas moléculas, como já referido,
que têm a capacidade de atravessar a barreira celular através de vários mecanismos,
tais como:

• Através dos poros;

• Processo de difusão passiva;
• Transporte ativo;
• Canais iónicos;
• Por ligação dos fármacos a proteínas membranares;
 • Por ligação a recetores acoplados à proteína G.

Por sua vez, os medicamentos de biotecnologia, devido às suas elevadas dimensões não
conseguem atravessar a membrana das células e por isso, a forma mais comum de produzirem o
seu efeito é por transdução do sinal. É de salientar que nem todos os medicamentos de
biotecnologia exercem efeito através desta via e um exemplo é a vacina da SARS-COV2 em que,
como já referido, o RNA entra na célula envolvido por lípidos.

A. EGF (fator de crescimento epidérmico responsável pelo crescimento de células que

fisiopatologicamente existe no nosso organismo) liga-se ao recetor da superficie da célula, que está
acoplada a uma tirosina cinase. Esta ligação leva a uma alteração conformacional que ativa a tirosina
cinase, desenvolvem-se uma série de fosforilações que, por sua vez, em cascata ativam uma série
de reações até levar ao desenvolvimento de fatores de transcrição (que vão estimular a produção
de mais EGF e consequentemente o crescimento da célula);

Nos tumores há uma produução descontrolada de EGF, logo, existem medicamentos de biotecnologia que
são anti-fator de crescimento (anticorpos monoclonais).

B. Esquema muito semelhante ao anterior mas referente ao fator de necrose tumoral.

As proteínas recombinantes são consideradas uma mais valia, pois são de fácil obtenção, não existe limitação
na quantidade disponível (devido à capacidade reprodutiva) e apresentam mecanismos de ação ao nível dos
alvos terapêuticos muito bem conhecidos e estudados.
 A azul está representada a sequência de aa da insulina humana.
Nas diferentes cores estão representadas modificações, ao nível da
sequência de aa, que foram possíveis através do uso da tecnologia de
DNA recombinante. Desta forma, foi permitido o alcance de insulinas
com vantagens terapêuticas. Por exemplo, a glargina que é uma insulina
de ativação lenta devido à introdução de mais dois aa na cadeia β. Isto
pode ser considerado uma arma terapêutica que permite a obtenção
continua de níveis basais de insulina no organismo.

Falaremos agora daquelas que são as potencialidades dos medicamentos de biotecnológicos. No

organismo humano estima-se que existam entre 3000 e 10000 alvos terapêuticos, logo, uma das
potencialidades passa pela capacidade de tratar doenças. Para além disto, as moléculas terapêuticas
podem ainda interferir com uma determinada proteína (que pode ser responsável pela doença)
bloqueando-a ou inibindo a sua ligação ao recetor.

Contudo, ao administrarmos com características proteicas corremos o risco de interação com

outros alvos terapêuticos, para além do pretendido.

A nível de desenvolvimento e estratégia até à obtenção destes fármacos temos:

1. Cada alvo costuma

apresentar mais do
que uma molécula 3. Confirmam se na prática, as
candidata. interações determinadas
anteriormente, ocorrem.

4. Os estudos em animais permitem-nos ter uma ideia de possíveis

efeitos adversos e implicações dos medicamentos em estudo, devido
às interações não pretendidas.

2. Estudos de homologia/complementaridade são aqueles que nos permitem verificar se a proteína

interage com outro avo terapêutico, para além do de interesse.

Importante referir que nem todas as fases deste estudo têm o mesmo valor! No início temos
muitos dados em estudo, mas pouco valor, por outro lado, quando chegamos aos ensaios clínicos
as moléculas já estão muito bem estudadas, existindo poucos dados mas muito valor.
Como exemplos daquilo que foi referido temos:

1.

Esta hormona nativa apresenta dois domínios, um com a capacidade de ligação à prolactina e outro
que se liga à hormona de crescimento. Através de técnicas de DNA recombinante conseguimos
obter uma molécula que não apresenta local de ligação à prolactina- fármaco usado para o nanismo.

2.

O fator de necrose tumoral é responsável por alguns linfomas, pois trata-se de uma citoquina pró-
inflamatória que dá o sinal à célula para morrer e quando está em défice pode levar então a esta
patologia. Posto isto, foi criado um fator de necrose tumoral para doentes com linfomas.

3.
 A fibrose quística é uma doença genética associada a problemas pulmonares e nutricionais
e que se caracteriza por disfunções ao nível das glândulas endócrinas e à consequente
produção excessiva de muco. Pessoas com esta doença são mais suscetíveis a infeções
bacterianas.

Processo geral de fabrico, culturas celulares e produção

O processo geral de fabrico ocorre em ambientes com os quais não estamos familiarizados e com
os quais não temos contacto durante o nosso percurso universitário. É também de referir que em
nada o ambiente das empresas de biotecnologia têm a ver com o de empresas de medicamentos
químicos.

De forma descritiva, durante este processo temos um fermentador (local onde existe a produção
da proteína terapêutica) e três colunas de filtração que servem para purificar a SA pois ao sair do
fermentador a solução obtida contém o a proteína de interesse e tudo o resto que resulta do
metabolismo das células. Em relação às três colunas:

1) A primeira coluna utiliza a técnica de cromatografia de afinidade e retém as proteínas

terapêuticas (pois encontra-se revestida com um composto que apresenta afinidade para
a nossa proteína de interesse sendo tudo o resto eliminado), num processo que alcança
95% de purificação.

Quando esta 1ª etapa está concluída ocorre lavagem com uma solução salina, que leva à libertação
da proteína terapêutica.

2) e 3) As duas colunas seguintes realizam cromatografias de troca iónica (uma aniónica e a

outra catiónica) e vão completar o processo de purificação.

Durante todo o processo de fabrico é necessário um elevado rigor e, como já referido, as empresas
de biotecnologia são altamente controladas por regras e padrões de qualidade. Existe uma
necessidade de atualização constante daqueles que são os dossiers dos medicamentos, tanto dos
novos medicamentos como daqueles que já estão a ser comercializados (exemplo: um
medicamento que já está no mercado, mas do qual se sabe que existe um processo de purificação
mais eficaz do que o que se encontra descrito no dossier, isto leva à necessidade de revisão e
alteração do processo). Isto, leva então a problemas de consistência pois se estamos
constantemente a fazer alterações nos processos, então temos também de estar constantemente
a validar os mesmos, o que leva a um aumento da complexidade de todo o processo de fabrico
dos medicamentos biotecnológicos.

Para garantirmos a qualidade necessária existem vários aspetos a ter em consideração, tais como:

• O desenho da instalação fabril (as fábricas são normalmente de grandes dimensões e o

desenho não é ao acaso, mas sim de forma que todo o processo siga um determinado
“caminho” e nunca ande para trás-de, ou seja, pretende-se que o fluxo de direção seja
único e desta forma se minimizem as contaminações);
• As matérias-primas usadas (têm de ser de enorme qualidade de forma a não
comprometermos o lote);
• O processo de fabrico é bastante controlado (existe sempre um controlador, humano e
com o auxílio de tecnologia);
• A qualificação e a motivação do pessoal (é preciso uma grande atenção e um grande foco
no trabalho para não errar);
• Enquadramento regulamentar (processo tão rigoroso tem de ter auditorias constantes,
sejam elas externas (feitas por entidades como a EMA/FDA) ou internas, de forma a
perceber se os processos descritos no dossier estão a ser cumpridos).

É importante referir que não é a farmacopeia que está na base dos requisitos para os
medicamentos de biotecnologia, porque ela contém os processos mais básicos e não tão
atualizados.

Isto leva-nos então às cGMP, isto é, Current Good Manufacturing Pratices, que estão sim na base
dos requisitos para o fabrico de medicamentos de biotecnologia prevenindo contaminações, falhas
no processo e assegurando dos padrões de qualidade. Envolvem vários pontos, tais como:

• Desenho, monitorização, controlo e manutenção do processo de fabrico;

• Abrangem todas as etapas da produção;
• Sistemas de gestão da qualidade robustos;
• Procedimentos operacionais standard;
• Deteção de desvios de qualidade no produto;
• Manutenção da fiabilidade dos testes laboratoriais.
 É de salientar que existe uma harmonização entre as cGMP na União Europeia e na América.

As cGMP são considerados os requisitos mínimos nas empresas de biotecnologia e algumas

empresas cumprem mais do que o que está descrito, porque criam as suas próprias normas devido
à preocupação com o processo de fabrico. No entanto, é de ressaltar que as cGMP asseguram a
qualidade e a segurança da produção dos medicamentos de biotecnologia e cumprem tanto as
boas práticas de fabrico como as boas práticas clínicas.

Em relação às regras gerais impostas pelas cGMP temos:

• Gestão da Qualidade Pessoal (em cada processo temos de ter pessoas com a qualificação
e a formação necessária);
• Instalações e equipamentos;
• Documentação (um dos aspetos mais críticos das cGMP e tem que ser muito
salvaguardado e atualizado pois se algum procedimento não corre esperado tem de se
justificar o porquê: “porque é que a caneta está à direita quando devia estar à esquerda?”)
• Produção;
• Controlo de qualidade;
• Contratos para fabrico e análise;
• Queixas e retiradas do mercado;
• Autoinspeção (auditorias internas, feitas por um departamento da própria empresa, para
garantir que tudo está a correr como esperado).

Falaremos agora das instalações necessárias para o processo de fabrico dos medicamentos de
biotecnologia. Estas instalações estão associadas a condições extremas com regras muito rigorosas
sendo na sua maioria “salas limpas” (salas estéreis, com pressão de ar positiva, o que garante que
não entra ar do exterior, presença de filtros HEPA, processos de limpeza e desinfeção constante
e com acesso de pessoas condicionado aos técnicos que lá trabalham, sendo que todos os acessos
ficam registados). Para além disto, em relação aos sistemas de água é importante que consideremos
que temos tanto água purificada (apresenta uma quantidade de iões não controlada) como água
para injetáveis (apresenta um elevado controlo) e por fim, em relação aos armazéns é de salientar
que existe um para as matérias-primas e outro para os produtos acabados, sendo que estes se
encontram em extremidades opostas da fábrica.

Conceitos de fábrica em campanha/em exclusividade: medicamentos para doenças raras a sua produção
não tem que ser muito extensa, há que rentabilizar as instalações, e por isso usam-se fábricas em
campanha, isto é, durante um período produz-se um determinado medicamento, quando se acaba a
produção ocorre uma limpeza e depois vai se produzir outro. Por sua vez, a produção em exclusividade
é quando a empresa só produz um tipo de medicamento de biotecnologia.
 Falaremos agora da documentação, a qual já vimos a importância anteriormente. Esta
documentação baseia-se em registos exaustivos de forma a preveni/minimizar ao máximo os erros,
garantir a traçabilidade de fabrico de cada lote (especialmente por reações de infecciosidade) e
tornar possível a reprodutibilidade do processo de fabrico (cada ciclo de fabrico deve cumprir as
mesmas especificações).

As cGMP dizem-nos quais as documentações que são obrigatórias, tais como as Standard Operating
Procedures (SOP), as especificações em termos de instalações, tecnologia utilizada e materiais, as
fórmulas de fabrico, processamento e embalagens e os registos.

IMP: Definem-se especificações obrigatórias como aquelas que têm que ser cumpridas (ex: em relação às
salas limpas) e especificações de alerta como aquelas que se trata de recomendações, as empresas de
biotecnologia tendem a cumprir ambas.

Vamos agora ver algum dos aspetos mais importantes no processo de produção da proteína
começando pelos sistemas de expressão (que tipos de células vamos utilizar?). A escolha do tipo
de célula a utilizar para a produção da nossa proteína de interesse entre células de procariotas e
de eucariotas (que podem ser de leveduras, insetos, plantas, fungos e maníferos) depende daquilo
que são as suas características, pois grande parte das proteínas terapêuticas necessitam de
modificações pós tradução para adquirirem função (estas normalmente são feitas em células
eucariotas e de mamíferos).

As células de mamífero podem à partida não ser as 1ºas opções porque demoram mais tempo a
dividir-se e necessitam de condições de cultura mais exigentes e consequentemente podem ser
necessários fatores de crescimento que têm que ser usadas no meio de cultura, no entanto,
quando se precisa de fazer modificações pós tradução estas limitações caem por terra
 O quando acima representa-nos os prós e contras dos tipos de células. No caso das células de
mamíferos podemos verificar que um dos contras representados é a dependência do soro fetal
(composto que permite um bom crescimento das células de mamífero, mas apresenta riscos de
contaminação, sobretudo com o prião responsável pela doença das vacas loucas) que apesar de
já não se usar tanto continua a ser uma “tentação” devido ao facto de apresentar um custo mais
baixo do que os restantes soros sintéticos que a indústria possa adquirir. É também de salientar
que as células eucariotas de planta não são opção devido ao facto de serem geneticamente
instáveis.

Ainda em relação aos sistemas de expressão é importante falarmos dos animais transgénicos que
também apresentam capacidade de produzir proteínas de interesse terapêutico, mas têm
desvantagens como a dependência do tempo para que o animal cresça, questões relacionadas com
a saúde do animal e necessidade de elevada purificação. Neste momento, não está autorizada a
produção de proteínas terapêuticas a partir deste tipo de células (um exemplo de um fármaco
produzido por este meio foi a Antitrombina III).

A seleção do sistema de expressão vai depender de vários fatores, tais Curiosidade: As células mais
utilizadas são as células de
como, a natureza da proteína a produzir (nem todo o tipo de proteínas mamífero, mais concretamente as
vai ser produzido em todo o tipo de células), a origem da proteína a células embrionárias de rim e as
produzir, o uso terapêutico, quantidade necessária e o custo. células de ovário de rato.

As principais glicosilações (ligar covalentemente o

oligossacárido a um aa) que ocorrem nas proteínas e
que são responsáveis pela sua ação farmacológica.
Estas modificações pós tradução ocorrem ao nível do
RE e do Complexo de Golgi. É ainda de referir que as
glicosilações diferem entre espécies e entre células da
mesma espécie e afetam a estabilidade, a solubilidade,
biodisponibilidade, farmacocinética, imunogenicidade e
função das proteínas.
Falaremos agora da seleção das culturas de células sendo as mais comuns as E. Coli (em células
procariotas), as Saccharomyces cerevisiae (em células eucariotas de levedura) e as células do ovário
de hamster chinês (em células eucariotas de mamífero). Devido a questões relacionadas com gastos
monetários há sempre a tentação de perceber se não é possível a produção em células de E.Coli
(a inovação tornou já possíveis produções que há partida seriam impossíveis e temos como
exemplo fragmentos de anticorpos monoclonais produzidos em células de E. Coli, mais
concretamente a região variável dos anticorpos que não necessita de glicosilações). No entanto, é
importante referir que nunca podemos comprometer a qualidade dos medicamentos.

A tabela seguinte mostra-nos as principais características dos vários sistemas de expressão que
podemos ter:

Importante salientar que se entende por secreção a capacidade que as células têm de secretar a
proteína que produz. Trata-se de um parâmetro importante porque nós temos a necessidade de
saber onde está a proteína, de forma a podermos encontrá-la e consequentemente purificála.

Falaremos agora do crescimento em células de cultura (focando nas células de mamífero) que
pode ocorrer tanto em suspensão (processo mais desejável e rentável, mas não se pode usar
sempre pois as células não se encontram imobilizadas) como em aderênica (células estão
imobilizadas):

• Monolayer;

Células encontram-se numa única camada.

• Ligadas a microcarriers;
Temos uma espécie de esferas nas quais se promove a aderência das células à superfície, ocorre
um aumento da área de aderéncia.

• Aprisionada em matrizes.

Uma espécie de “sandwich” onde também verificamos um aumento da área de aderência.

Em relação aos tipos de células é importante referir que não se podem usar células estaminais
(porque não são diferenciadas) nem células percursoras (células intermédias que também são
instáveis). Por sua vez, as células diferenciadas (epiteliais, fibroblásticas e linfobásticas) são estáveis,
no entanto não são “universais” e por isso usam-se as células desdiferenciadas, diferenciaram-se
numa função, mas foram desdiferenciadas porque fora sujeitas a um processo que as fez esquecer
as suas funções. A biblioteca de células mais comum é a American Type Culture Collection (ATCC)
onde as empresas adquirem as células para a produção de proteínas terapêuticas.

Em relação aos requisitos para as culturas de células temos de destacar a importância da assepsia
(a nível de todo o equipamento utilizado) e também a importância o meio de cultura. Este último é
normalmente definido como simples devido ao facto de apresentar uma composição muito bem
definida (e que tem de ser adequada ao crescimento das células). A composição dos meios de
cultura incluídos no fermentador está descrita na tabela seguinte:

• A glucose (e os açúcares no geral) tem de ser adicionada de forma controlada para garantir
ativação do metabolismo secundário que vai influenciar a produção da nossa proteína;
• As hormonas funcionam como fator de crescimento;

Muitos dos compostos presentes na tabela aparecem sobre a forma de concentrados ou em

misturas homogéneas de pó que depois são diluídas (em água purificada) e esterilizadas, de forma
a serem utilizadas no meio de cultura final (assepsia). Para além dos compostos apresentados
podemos ainda adicionar ao meio de cultura antibióicos (continuam a ser uma possibilidade apesar
de não ser o ideal, são uma tentação porque são a forma mais fácil de evitar contaminações, mas
exigem um processo mais exigente de purificação para garantir a eleminação de todos os vestígios
de antibiótico), indicadores de pH (o mais frequente é o o vermelho de fenol (amarelo quando está
ácido) e é importante para o controlo das condições de cultura) e tripsina (mas só se costuma
adicionar no fim do processo de produção e serve para desagarrar as células do suporte quando
estas estão em aderência).

As diferentes condições de cultura são controladas e definidas ao nível do desenvolvimento

tecnológico. Temos como exemplos destas condições a agitação (necessária, mas cautelosa, e feita
por um sistema de pás no fermentador ou por uma injeção de ar), a temperatura (normalmente
37ºC e pode haver um bust quando queremos passar do crescimento das células para a produção
da proteína terapêutica), a densidade (as células eucariotas para crescerem precisam de interagir
umas com as outras, logo é necessária uma densidade mínima por ml no fermentador 104 ou 105)
e a área de contacto.

É importante reter que estas condições vão permitir, se forem bem controladas, o crescimento
ótimo das células e a produção otimizada da proteína terapêutica.

Ao longo de todo o processo é importante que ocorra uma monitorização e uma avaliação das
culturas, mais concretamente, devem-se realizar/analisar:

• Observações microscópicas;

De forma a avaliar-mos a morfologia das nossas células, para garantir que está tudo a correr como
suposto.

• Crescimento celular;

Devemos garantir que as células crescem segundo uma taxa que estava prevista.

• Eficiència do plaqueamento;

Determinar quantas células estão a crescer e quantas células estão a morrer.

• Expressão da função celular.

É imortante se as células que estão no fermentador se estão a desenvolver de acordo com o

previsto, por exemplo, se uma célula produz uma determinada enzima então temos de perceber
se na cultura essa enzima está presente. Para isto é importante sabermos todos os metabolitos
que são produzidos pela célula que escolhemos.
Para além da avaliação das culturas deve ser também feita uma avaliação às células e para isso,
com regularidade, são retiradas amostras do fermentador de forma a que sejam feitas contagens
das células totais e viáveis (há medida que a produção avança algumas células começam a morrer)
e para isto adicionamos um corante (azul de tripano) que entra nas células, e se estas estiverem
mortas cora-as de azul.

Produção

O termo de Fermentador é utilizado na prática para antever a produção dos medicamentos

biológicos através do uso de células vivas. No entanto, do ponto de vista teórico o termo de
fermentador utiliza-se quando as células vivas são de bactérias e fungos, por sua vez, em células
de mamíferos e insetos utiliza-se o termo de biorreator.

As proteínas terapêuticas são então produzidas em fermentadores a nível industrial (termo prático)
e temos essencialmente 4 tipos de fermentadores:

• Stirred tank (tanque agitado);

Tratam-se de os mais utilizados e apresentam um sistema de pás que permite a agitação do meio
de cultura.

Neste tipo de fermentador a produção das células em cultura pode ocorrer tanto em supensão,
como em aderência (com recurso a esferas).

• Airlift;
Neste tipo de biorreatores a agitação é conseguida pela entrada de ar, o que também permite a
circulação do meio de cultura pelas células.

• Fixed bed;

No fixed bed o meio de cultura passa pelas células que estão em aderência.

• Biorreator de membrana.

Nos biorreatores de membrana as células encontram-se em aderência nas membranas e por elas
fazemos passar o meio de cultura.

O ideal é que a produção ocorra em suspensão, mas isto nem sempre é possível e por isso usa-
se também a produção em aderência (sendo que o usa de esferas é a forma a mais frequente
de aderência e a melhor maneira de promover a imobilização das células).
Do ponto de vista dos protocolos de fermentação que podem ser utilizados é importante
considerarmos que a cinética de crescimento das células e consequentemente da formação de
produto não depende apenas do tipo de fermentador selecionado, depende também da forma
como o crescimento celular é alcançado (protocolo de fermentação). Na prática, temos 3 tipos de
protocolos que são passíveis e que podem ser utilizados:

• Batch;

Numa fase inicial é adicionado o volume total do meio de cultura ao reator, sem adição de
suplemento, as células vão crescendo e produzindo a proteína de interesse. Esta vai se acumulando
juntamente com os produtos resultantes do metabolismo das células.

Este protocolo leva a células com baixa densidade celular e a um menor rendimento que o processo
seguinte.

• Fed-Batch;

Protocolo de fermentação mais utilizado. Os detritos do metabolismo da célula e a proteína vão se

voltar a acumular, no entanto, como a adição do meio de cultura é gradual vamos verificar um
aumento da densidade celular, um aumento do rendimento da produção da proteína de interesse
e um aumento do tempo de extensão.

• Perfusão.

Protocolo de fermentação mais recente e por isso não tão utilizado. O meio de cultura vai sendo
renovado à medida que o processo vai ocorrendo. As células vão se acumulando na membrana.
Permite-nos uma boa produtividade pois apenas a proteína terapêutica é retida pela membrana.

Basicamente, podemos dizer que estes são os três protocolos que podem ser utilizados na
produção dos medicamentos de biotecnologia e em qualquer um destes as células passam por
fases distintas, algumas em que não estão a produzir, outras em que não estão a crescer e outras
em que estão a fazer tudo. Podemos assim dividir o processo em 4 fases:

1. Fase de adaptação;

Fase de adaptação das células ao meio de cultura.

2. Fase de crescimento exponencial;

Subdivide-se em precoce, médio e tardio. A fase de crescimento exponencial tardio ocorre quando
se atinge o topo do crescimento do número de células e se alcança uma densidade celular
 significativa. Neste momento vamos induzir a produção da proteína de interesse, através da
mudança de uma das condições do meio (por exemplo através do aumento da temperatura).

3. Fase estacionária;

Nesta fase a taxa de crescimento diminui, o meio começa a ser consumido e ocorre um aumento
dos produtos residuais. Podemos verificar que o nº de células mortas é igual ao nº de células vivas.

4. Fase de morte.

Ocorre um aumento dos produtos residuais acumulados, começando estes a tornar-se tóxicos. Para
além disto verifica-se também um decréscimo das concentrações de nutrientes no meio.

É importante percebermos como se chega à produção industrial a partir de um banco de células:

Inicialmente o processo é testado e ocorre uma produção a nível laboratorial → as células resultantes vão ser
conservadas em ampolas e armazenadas nos bancos de células.
O banco de células contém um nº de ampolas para garantir a produção do medicamento para 100 anos (master
cell bank) → as células para serem conservadas têm de ser crio preservadas (através da adição de um crio protetor,
como o DMSO ou o glicerol, seguido de uma congelação lenta e por fim uma conservação em azoto líquido (-
196ºC)). O master cell bank é normalmente dividido em 2/3 working cell bank uma vez que as empresas de
biotecnologia não arriscam a ter toda a possibilidade de produção de um medicamento em apenas um local.
Cada ampola corresponde a um lote, quando este é necessário vamos “ressuscitar as células” o que leva a uma
perda significativa, pois nem todas as células vão ficar viáveis, para isto vamos fazer um rápido aquecimento à
temperatura ambiente e de seguida diluir o crio protetor em meio pré aquecido (este crio protetor é tóxico). Devido
às perdas são necessários ciclos de pré amplificação onde células da ampola vão ser colocadas a crescer para um
volume de 10 ml, depois para 100 ml, e assim sucessivamente até termos um volume de células que nos permitam
transpor para o biorreator em segurança.
É também de considerar o PDL (limite de duplicação celular) que diz respeito ao número de amplificações que se
podem fazer até chegar ao volume que se pretende colocar no reator. Este valor é determinado durante o
desenvolvimento tecnológico.

Purificação da SA

Após a produção ocorre a necessidade de purificar aquelas que foram as proteínas terapêuticas
obtidas. Dentro do fermentador podemos não só encontrar a proteína de interesse terapêutico
como também todas as células que não morreram, os produtos resultantes do metabolismo das
 células e o meio de cultura. Desta forma, a primeira coisa a saber é onde está a nossa proteína
para desta forma determinar a maneira como será feita a purificação.

Há escala laboratorial trabalham-se volumes pequenos, por isso, a purificação pode ser feita por
centrifugação. Já a nível industrial recorremos normalmente a métodos que envolvem mais do que
uma etapa:

1. Como mostra a imagem ao lado, o

primeiro passo de purificação passa
essencialmente por uma filtração, mais
concretamente uma filtração
tangencial, onde se fazem passar as
células em movimento através de um
filtro (impedindo a obstrução deste),
deixando passar o sobrenadante e
retendo as células.
2. O segundo passo consiste na
concentração da proteína de interesse.
Se a proteína estiver no sobrenadante devemos reduzir esse volume para concentrar, por
outro lado, se estiver no interior das células vamos ter de fazer um passo intermédio que
consiste na ressuspensão das células no tampão adequado, seguido da lise da celular com
o objetivo libertarmos as proteínas (só aí podemos passar para o passo da concentração).
3. O passo seguinte é a purificação propriamente dita, que normalmente ocorre por
cromatografia, mas é importante considerarmos que esta etapa se subdivide em purificação
inicial (40-50% da proteína fica purificada na 1ª coluna de cromatografia), intermédia e final
(aprimoram a purificação e eliminam todos os contaminantes e impurezas que possam
existir).

Em relação aos tipos de cromatografia que podem ser usados, temos:

Cromatografia de afinidade (1ª a ser Cromatografia de exclusão

feita): temos uma resina com
afinidade para a proteína de
interesse e desta forma concentra
na coluna a substância ativa. De
seguida ocorre a libertação para a
substância ativa passar para as
colunas seguintes.
molecular (também pode aparecer):
a coluna tem uma resina com umas Cromatografias de troca iónica:
esferas perfuradas, se a proteína permitem a refinação da
passa e tem um diâmetro inferior purificação.
ao das esferas acaba por atrasar na
cromatografia e permite que
façamos a separação.
As cromatografias de afinidade e de troca iónica são as que mais costumam aparecer.

O quadro seguinte apresenta vários métodos de purificação, com base nos critérios FQ das
proteínas (determinadas nos processos de desenvolvimento tecnológico):

São vários os contaminantes que podemos encontrar em todo o processo de produção das
proteínas terapêuticas, o quadro seguinte mostra alguns exemplos:

Na maioria das vezes consegue-se eliminar na

maior extensão possível os contaminantes, mas é
de referir que a purificação não pode ser
agressiva para não danificar a nossa proteína de
interesse. Estes contaminantes podem ter várias
origens e é importante saber como os podemos
eliminar.

Comecemos então por falar dos vírus, que podem ser introzidos pelo meio de cultura, por infeção
na linha celular de produção ou durante o processo de produção (devido ao manuseamento
humano). Estes contaminantes têm de ser sempre inativados ou removidos no processo de
purificação. Para isto é importante sabermos quais os processos a que a nossa proteína possa ser
sujeita para a eliminação de vírus.

Um dos métodos mais frequentes é então a inativação dos vírus por pH extremos (valores ácidos)
e a remoção por meio de cromatografias e filtrações. É também de referir que os métodos de
remoção não compromentem a viabilidade da proteína.

Para além dos vírus, como já vimos, as nossas proteínas podem ainda estar expostas a outros
contaminantes que dependendo da sua natureza são eleminados de formas distintas, temos como
exemplos:

• Bactérias;

Devido à sua dimensão são normalmente removidas por filtração simples, no entanto, queremos
sempre evitar a contaminação e para isso temos de trabalhar sempre em ambiente de esterilização.
Por vezes ocorre a necessidade de adicionar antibióticos ao meio de cultura (apesar de não ser
aconselhado devido à posterior necessidade de processos de purificação mais caros e mais
rigoroso.) Os antibióticos beta lactamicos estão proibidos devido às alergias.

• Pirogénios (endotoxinas de bactérias gram-negativas);

A forma mais comum para eleminar estes contaminantes passa pela cromatografia de troca iónica.

• DNA celular.

O DNA celular trata-se de um contaminante que é sempre possível, e é mais frequente quando
existe necessidade de lise celular para a purificação da proteína. São mais problemáticos quando
podem ter na sua constituição fragmentos de DNA que podem levar à formação de tumores
(oncogenes, risco presente nas células de mamífero). No entanto, nunca houve nenhum
medicamento com este risco pois os protocolos de purificação são muito rigorosos.

A farmacopeia tem determinado um valor máximo de DNA celular que pode estar presente, mas
as empresas de biotecnologia acabam por adotar valores muito mais rigorosos para evitar quaisquer
tipos de risco.

Formulação da SA e produto final

Após o processo de produção e purificação obtemos aquela que é a substância ativa a granel. Esta
precisa de ser formulada de forma a, depois do enchimento, obter aquele que será o produto final
(estável e com capacidade de conservação).

Neste passo de formulação temos de considerar vários aspetos tais como, devemos conhecer
bem as suas propriedades físicas e químicas (que tipo de proteína estamos a falar, hidrofibicidade,
solubilidade, modificações pós tradução) pois isso vai influenciar o tipo de excipientes que temos de
adicionar para garantir que a nossa proteína vai ser estável em solução aquosa (exemplo). Para
além disto também precisamos se considerar a população alvo, o tipo de administração (recipientes
de conservação da insulina são administradas por canetas pelo utente, já as vacinas da COV19 são
armazenadas em frascos de vidro), entre outros aspetos.

É também importante que se conheçam os principais fatores de stress da nossa proteína, isto é,
fatores que devem ser evitados durante o processo de produção e desta forma impedir que a
nossa proteína de interesse deixe de ser viável:
 Na prática, muitas bio farmacêuticas são da América
A proteína é formulada para garantir a estabilidade
e a exportação de medicamentos para a Europa
para a temperatura para a qual ela foi estudada e desta
está sujeita a regras muito rigorosas e custos muito
forma, elevações de temperatura ou alterações de
elevados. Devido a isto é comum que se dê a “falsa
temperatura podem comprometer o produto final. Um
identidade” de que o processo de fabrico (o passo
exemplo disto é a insulina que quando não está em
do enchimento) ocorre na Europa, conseguindo
uso deve ser mantida no frio e quando está a ser
evitar os custos. Isto implica que se a SA conseguir
utilizada é aconselhada a ser mantida à temperatura
ser exportada já conservada é só chegar à europa
ambiente. O congelamento acidental é muito grave,
e esterilizar, mas se esta tiver de ser congelada, na
significando praticamente a destruição da proteína de
europa vamos ter de a descongelar e reformular
interesse,
para garantir o enchimento.
A formulação tem de garantir a segurança
microbiológica, tendo a maior parte que ser estéreis (no caso de administração IV). O enchimento
tem de ser feito em assepsia e para isso tem de haver uma esterilização final por filtração (nano
filtração), em salas de fluxo laminar e na presença de filtros HEPA. Ainda relativo à segurança
microbiológica é comum a realização de testes de descontaminação viral (de forma a garantir que
os contaminantes foram eliminados durante a purificação) e a necessidade de garantir que houve
uma total remoção dos pirogénios.

Em relação ao tipo de excipientes que se devem adicionar às proteínas de interesse de forma a

aumentar a sua estabilidade e a permitir a conservação é importante referir que depende sempre
do tipo de proteína. No quadro seguinte temos alguns exemplos de excipientes:
Em relação ao processo de conservação, o ideal é a refrigeração (2-8ºC). Em alguns casos
particulares isto não é possível e as formulações são conservadas em congelação.

Basicamente, em jeito de resumo, no processo de formulação temos de considerar os excipientes

que vamos adicionar, a conservação e a segurança microbiológica.

Falaremos agora do produto final, e é não esquecer a necessidade de esterelização final em casos
de formulações para adminitasção parenteral antes do processo de enchimento. Por sua vez, este
ocorre de forma automática e pode ser feito em frascos, ampolas ou serigas pré-cheias.

Em relação ao produto final é necessário considerarmos ainda outros pontos, tais como:

• A liofilização do produto final é muito pouco frequente, porque implica retirar água e ao
administrarmos vamos ter a necessidade de ressuspender o que pode alterar a estabilidade
da nossa proteína de interesse;
• Necessidade de fechar e rotular a embalagem 1ª, sendo que tanto a rotulagem como a
cartonagem são definidas durante o processo de desenvolvimento tecnológico, seguindo
regras apertadas pois é necessário garantir todas as especificações de qualidade, dos vidros
e das embalagens.
• Distribuição pelas embalagens secundárias;
• Controlo de qualidade;
• Comercialização / utilização clínica.

É de referir, ainda a cerca das embalagens, que as embalagens primárias dizem respeito a frascos,
seringas, canetas injetoras (multi ou uni dose) e que a escolha do material (vidro ou polímero em
casos de revestimento) depende de vários fatores, tais como se medicamento é para administração
crónica (formulados em canetas injetoras que permitem a administração subcutânea pelo paciente)
ou para administração aguda (seringas (unidose) ou frasco de vidro (multidose)).

No caso do vidro, este trata-se de um material transparente e isso permite observar o produto, ou
seja, permite ver se houve desnaturação da proteína. Por outro lado pode libertar metais pesados
e consequentemente levar a contaminações. Também as seringas apresentamum revestimento
em óleo de silicone que pode ser libertado para a proteína e formar agregados.

Em relação às agulhas é de referir que as de menor diâmetro não cauam tanta dor, no entanto,
estão associadas a uma maior resistência. →Todos estes parâmetros tem de ser ponderados!

Em relação às vias de adminsitração sabemos que a via parenteral é a mais utilizada, no entanto,
existem outras possibilidades:

• Parentérica;

Via mais frequente e a preferencial. É de salientar que dentro desta via se alterarmos de uma
administração IV para uma IM podemos também estar a alterar as propriedades farmacocinéticas
do composto que estamos a administrar.

• Oral;

Esta seria a via preferível, no entanto, não é comum nem frequente pois estamos a tratar de
proteínas que seriam facilmente degradadas se fossem administradas por esta via, çevando a uma
baixa biodisponibilidade. No entanto existem vacinas orais, pois a imunização não necessita que
chegue ao local alvo grandes quantidades da proteína terapêutica.

• Outras vias alternativas (nariz, pulmões, reto, cavidade oral e pele).

Ao longo do tempo tem existido estratégias para aumentar a biodisponibilidade por outras vias para
além da parentérica (que é muito invasiva):

As principais estratégias usadas para aumentar a biodisponibilidade das proteínas administradas por
outras vias passam pela encapsulação em micro ou nano partículas, pela introdução de modificação
químicas que aumentem a permeabilidade e a resistência à degradação e ainda a coadministração
de inibidores das protéases. Obviamente, tudo isto levanta problemas, por exemplo ao aumentarmos
a permeabilidade temos de garantir que a conseguimos reverter pois caso contrário vamos ter
problemas ao nível da segurança. Ainda nenhuma destas alternativas é comercializada como
alternativa terapêutica
Farmacocinética e farmacodinâmica das proteínas terapêuticas

Quando um fármaco é administrado, atinge uma determinada concentração nos fluídos corporais
e em função da concentração, assim se desenvolve o seu efeito terapêutico (eficácia) bem como
a sua toxicidade (potenciais efeitos aversos).

A partir do momento em que a dose de um medicamento é administrada, vai ser processada pelo
organismo envolvendo os fenómenos de farmacocinética. Estes implicam os processos de ADME
(absorção, destribuição, metamoblismo e excreção) e caracteriza-se como “o que o corpo faz ao
fármaco”. Por sua vez, a farmacodinâmica caracteriza-se pela intensidade do efeito terapêutico,
assim como a toxicidade do fármaco, vulgarmente “o que o fármaco faz ao corpo”. O efeito
terapêutico é desenvolvido quando se antinge a concentração terapêutica.

Estes principios gerais são aplicáveis às proteínas terapêuticas. No entanto, referente a estas ultímas,
existem alguns desafios devido às suas características, estes passam por:

• Estrutura e pureza;
• Proteínas terapêuticas são produzidas em organismos vivos e, por isso, não são
homogéneas, acabando por ser mais difíceis de seguir no organismo humano;
• Apresentam similaridade estrutural e funcional com proteínas e nutrientes endógenos;

Exemplo: Insulina → quando adminisrada torn-se muito díficil a destinção entre insulina exógena e
endógena.
 • Envolvimento em processos fisiológicos endógenos a nível molecuar, incluíndo mecanismos
de feedback;

Exemplo: Adminstração da proteína → Aumento da concentração → Descida da concentração.

Se a concentração de proteína se manter constante ao longo do tempo estamos perante um

mecanismo de feedback negativo.

• Apresentam elevado peso molecular, o que dificulta todas as técnicas analíticas de

identificação e quantificação das proteínas terapêiticas na presença de moléculas similares.

Falaremos agora agora, concretamente, das propriedades farmacocinéticas das proteínas

terapêuticas. Comecemos pela absorção, onde é de referir que a biodisponibilidade de uma proteína
terapêutica depende da via de administração:

→ Via oral a biodisponibilidade é reduzida;

→ Via IV a biodisponibilidade é muito superior, conseguindo com doses muito mais baixas
obter o efeito terapêutico desejado. Através desta via de administração é também possível
eleminar o efeito de 1ª passagem.

A nível de destribuição, a taxa e extenção da biodestribuição de uma proteína terapêutica é

determinada pelo seu tamanho, peso molecular, propriedades físico-quimicas e capacidade de
ligação a proteínas estruturais de transporte. Geralmente, o volume de destribuição é baixo.

As proteínas terapêuticas são geralmente administradas por via

endovenosa, passando tendencialmente do espaço
extravascular para o espaço intersticial por fenómenos de
convexão. No espaço intersticial, a proteína só consegue
continuar a ser distribuída através do sistema linfático.
Ao entrarem no sistema linfático, as proteínas viajam até aos
nódulos linfáticos, onde encontram os macrófagos. Estes últimos
vão fagocitar a nossa proteína de interesse, originando
pequenos péptidos que são transportados.
Os péptidos são, posteriormente, apresentados pelas MHCII e
reconhecidos pelos linfócitos TCD4, que desencadeiam uma
resposta imune.
Apesar de todo o processamento da proteína terapêutica ocorrer ao nível dos nódulos linfáticos,
a sua eleminação ocorre pelas mesmas vias catabólicas que as proteínas endógenas/ provenientes
da dieta.

É de referir que o facto do sistema imunitário ser tão importante neste processo justifica a forte
possibilidade dos medicamentos biológicos e de biotecnologia induzirem uma resposta imunitária.

Imunogenecidade

Os medicamentos de biotecnologia podem ser considerados imunogénicos devido ao seu

processamento, uma vez que este ocorre ao nível dos nódulos linfáticos e leva à produção de
uma resposta imune.

No nosso organismo, a resposta imune pode ser provocada por:

• Processamento das proteínas terapêuticas pelo sistema imunitário;

Como referido anteriormente, os macrófagos distroem as proteínas terapêuticas, originando

pequenos péptidos que são colocados na superfície, associadas a MHCII. Ocorre uma posterior
interação com linfócitos TCD4 que libertam citoquinas e levam a uma resposta imune.

• Reação Ag-Ac;

Todas as proteínas terapêuticas apresentam determinados

epítopos (determinantes antigénicos) que podem ser reconhecidos
por anticoirpos do nosso organismo.

Pode ainda existir o risco de desenvolvimento de uma reação cruzada em que um Ac apresenta
a capacidade de reconhecer diferentes Ag, mesmo que se ligue com afinidades diferentes.
Os medicamentos de biotecnologia têm todas as características de um antigénio imunogénico pois
são considerados “estranhos” para o hospedeiro, apresentam um elevado peso molecular,
apresentam complexidade química e degrabilidade enzimática. Posto isto, a questão que surge é, é
desejável que uma proteína terapêutica seja imunogénica?

→ De uma forma geral não, pois queremos que o nosso fármaco seja o menos imunogénico
possível para possibilitar o tratamento a longo prazo. No entanto, existem exceções como
é o caso das vacinas, onde pretendemos que sejam bastante imunogénicas para exercer
o efeito pretendido.

Alguns dos principais fatores que influenciam a imunogenecidade passam por:

• Sequências de aminoácidos;

Quanto menor a similaridade entre as proteínas terapêuticas e as proteínas humanas, maior é a

imunogenecidade.

• Glicosilações;

Quanto mais glicosilada determinada proteína for, maior é a sua imunogenicidade. Isto ocorre porque
a proteína vai ser mais hidrofílica, precisando da ação do sistema imunitário para ser processada.

• Contaminantes e impurezas;

O mais prejudicial passa pela formação de agregados de proteína (proteína agregada é mais
imunogénica). Isto pode ocorrer em situações de má conservação, choque térmico e mudanças
de pH.

• Componentes adicionados para formular a SA;

Junção de componentes que sejam mais imunogénicos.

• Via de administração;

Quando se administra proteínas terapêuticas por via intravenosa, é possível administrar doses mais
baixas, sendo que o tempo o tempo de permanência da proteína no organismo é também menor
(tempo de exposição ao sistema imunitário menor → menor imunogenicidade).

Por sua vez, a administração por via SC tem maior tendência para imunogenicidade, o que justifica
que muitas vacinas sejam administradas por esta via.

• Dose e duração do tratamento;

Não é exatamente claro em que medida a dose influencia a imunogenicidade. Ainda assim, sabe-se
que quanto maior for a duração do tratamento, maior é o risco de imunogenicidade.

Por vezes, ocorre a administração concomitante com imunossupressores de forma a diminuir a

imunogenicidade (principais sinais passam por erupções cutâneas).

• Tecnologia utilizada para detetar a imunogenicidade;

Não é que o método utilizado para detetar a imunogenicidade influencie os resultados, porém, só
é possível quantificar quanto é que um medicamento é imunogénico através da medição dos Ac-
antifármaco (que o nosso organismo desenvolveu após a administração). Os métodos utilizados dão
muitas vezes discrepâncias nos resultados → Em determinados estudos a imunogenicidade de um
fármaco segundo um determinado método é próxima de 0%, enquanto segundo outro método é
perto de 60%.

• Características dos doentes;

Dependendo das características e do estado de saúde dos doentes, assim se pode desenvolver
maior ou menor imunogenicidade. Obviamente, um doente sob tratamento imunossupressor será
menos suscetível a desenvolver uma reação imunogénica.

• Fatores desconhecidos.

Não são possíveis de quantificar.

Algumas das estratégias para diminuir a imunogenecidade passam por alterar a sequência de
aminoácidos da proteína (pode diminuir a eficácia e por isso é importante tentar balancear o
benefício-risco), promover a ligação de polímeros à proteína (por exemplo polietilenoglicol, um
polímero não imunogénico → torna o composto mais hidrofóbico) e uso de tratamentos
imunossupressores como terapêutica adjuvante (aumenta a suscetibilidade a infeções)..

Anticorpos monoclonais

O conceito de anticorpo vem de “anti corpo estranho”, isto é substância contra corpos estranhos.
Estes anticorpos tratam-se de moléculas proteicas que os mamíferos produzem e que participam
na resposta imunitária, responsáveis pela eliminação do organismo dos antigénios estranhos que
com ele contactam.
Anticorpo ~ Imunoglobulina ~
No nosso organismo temos exatamente 5 tipos de anticorpos, IgG, IgM,
Gamaglobulina
IgA, IgE e IgD.

As imunoglobulinas G são as mais utilizadas para a produção de anticorpos monoclonais, pois como
podemos observar na tabela anterior, são as que apresentam um maior tempo de semi-vida, uma
 forma molecular mais fácil de prefundir, apresentam capacidade de ativar o complemento e
apresentam a capacidade de se ligarem a recetores Fc dos fagócitos.

Regiões variáveis

Regiões constantes

Os anticorpos são bivalentes pois ambas as

regiões variáveis têm a mesma capacidade de
se ligar ao Ag.
São também bifuncionais, pois conseguem se
ligar ao Ag, através das regiões híper variáveis,
e identificá-lo. Por outro lado, através do
fragmento constante, onde é induzida uma
alteração conformacional após a ligação ao Ag,
dá-se a interação com células do nosso
organismo, nomeadamente as células do SI.

Ativam o complemento e a MAC

(proteína capaz de destruir a célula)
O fragmento constante é
capaz de se ligar a outras
células efetoras, que
produzem substâncias
capazes de destruir células

Em a) os círculos laranja representam as regiões de compatibilidade ou regiões hipervariáveis, e

são o local onde o antigénio se liga. Por outro lado, é nas regiões constantes que ocorrem sobretudo
as glicosilações.
Em termos de funcionalidade, é de referir que a ligação do anticorpo ao antigénio tem a função
de o neutralizar ou bloquear.

Em teoria, é possível sintetizar tantos anticorpos, quantos antigénios diferentes tenhamos

contactado. O que vai mudar de anticorpo para anticorpo são as regiões hipervariáveis que
reconhecem o antigénio.

Os anticorpos que os linfócitos B produzem têm especificidade aleatória e estão constantemente

a ser produzidos. Os Ac apenas se tornam específicos quando conseguem reconhecer um
antigénio, nesses casos, as células B responsáveis pela produção do Ac tornam-se cada vez mais
específicas e produzem anticorpos mais duradoros e específicos. Após esta especializaão, as células
B são recuperadas do plano de morte, tornando-se imortais, e são geneticamente instáveis sendo
que apenas as mutações favoráveis são preservadas.

Basicamente, as imunoglobulinas com especificidade definida preparadas a partir de uma linha celular
monoclonal. Veremos agora os diferentes mecanismos de ação:

• Modulação direta do antigénio alvo;

O Ac monoclonal identifica, pelas regiões hipervariáveis, o Ag, neutralizando-o e/ou bloqueando-o.

Desta forma, o Ag fica impedido de se ligar ao seu recetor.

• Citotoxicidade dependente do complemento (CDC);

Quando o anticorpo reconhece o antigénio, o seu fragmento constante induz o complemento e

ativa a MAC. Isto é compatível com o que acontece ao nível fisiológico, através das IgG.

• Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC);

O anticorpo reconhece o antigénio através das regiões hipervariáveis e o fragmento constante liga-
se ao recetor nas células efetoras (macrófagos, monócitos, células NK), que destroem a céula com
o antigénio em causa. A destruição pode ser feita pela emissão de perforinas ou através do
processo que veremos de seguida.

• Fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP);

O macrófago engloba o complexo anticorpo-antigénio e destrói-o.

• Apoptose;

Os anticorpos monoclonais são capazes de induzir a cascata das caspases, que vai levar a uma
destruição do DNA e, com isso, levar à morte celular programada.

• Libertação de radionuclidos ou imunotoxinas para as células alvo;

Este mecanismo apenas é possível para alguns anticorpos monoclonais. Consiste na ligação de um
Ac monoclonar a um radionuclido, ou qualquer toxina, e dirigí-lo para a célula alvo.

A vantagem de se utilizar um anticorpo monoclonal é porque ele reconhece o Ag, conseguindo-

se dirigir o agente citotóxico para a célula alvo, provocando a sua destruição.

• Ativação das células T usando construções bi-específicas.

Mecanismo de ação relativamente recente e que consiste num processo é que uma região variável
do anticorpo reconhece o Ag e a outra reconhece os recetores das células, ativando o sistema
imunitário.

A principal vantagem associada a este mecanismo passam por aproximar a célula alvo do linfócito
T, provocando a sua destruição (útil nos processos tumorais).
É de referir que um anticorpo monoclonal pode ter mais do que um mecanismo de ação.

Falaremos agora do processo de obtenção dos anticorpos monoclonais:

• Imortalização de linfócitos B (não foi bem sucedida);

Esta estratégia consistia em infetar os linfócitos B com vírus oncológicos (Epstein-Bar), dando-lhe
características de imortalidade (produziam Ac de forma constante), o mesmo foi tentado com
agentes mitogénicos. O principal problema deste processo passava pelo facto de que os Ac
produzidos não eram específicos.

• Tecnologia de hibridomas (Kohler e Milstein);

Esta estratégia foi apresentada em 1975 e o seu principal objetivo passava por encontrar a
especificidade do anticorpo através da imunização do animal.
Os principais inconvenientes desta técnica passam pelo facto de se usarem animais, ser um
processo moroso, ser díficil produzir anticorpos que também sejam tóxicos o animal e maior
probabilidade de imunogenicidade para o homem.

• Phage display em bacteriófagos ou animais geneticamente modificados;

Tecnologia que permite identificar as sequências de DNA que são específicas para um determinado
Ag. Isto pode ser feito com recurso a bacteriófagos (mais frequente) ou animais transgénicos.

Trata-se de uma técnica aleatória onde partimos de uma biblioteca de cDNAs, selecionamos um
conjunto destes últimos que irão codificar para regiões híper variáveis de Ac e aleatoriamente
coloca-se cada uma dessas sequências num bacteriófago. Este último vai então traduzir a sequência
de DNA em RNA e ainda um péptido que fica à superfície da bactéria → péptido resultante entra
em contacto com o Ag.. Posteriormente, o péptido que melhor reconhece o Ag é selecionado e
colocado na zona híper variável do Ac por tecnologia de DNA recombinante (rDNA). O grande
problema deste processo passa pelo facto de apresentar um custo muito elevado.

Apesar de tudo, foi o phage display que permitiu que hoje em dia existem anticorpos 100% de
origem não animal.

Falaremos agora dos diferentes tipos de anticorpos terapêuticos que existem:

• Murinos;

Produzidos no animal (rato), tanto o fragmento constante como as regiões

híper variáveis são de origem murina. Apresenta uma elevada imunogenicidade.

• Quiméricos;

Fragmento constante humano e modificadas na região híper variável (de

origem murina) e variável. Ainda se encontram no mercado.

Nota: Cerca de 60% das pessoas que tomam Infliximab desenvolvem reações
alérgicas provenientes da imunogenicidade.

• Humanizados;

Quase totalmente humanos, apenas as regiões híper variáveis são de origem

murina.

• Humanos.
Todos os exemplos apresentados dizem respeito a anticorpos monoclonais inteiros, no entanto, já
existe a possibilidade de se ter aplicações terapêuticas com fragmentos de Ac (apresentam menor
peso molecular e, por isso, apresentam maior capacidade de difusão no organismo), são exemplos:

• Fab ou F(ab)2;

Ambos são constituídos por uma cadeia leve e metade da cadeia pesada. Atuam ao nível do
reconhecimento de Ags.

No F(ab)2 ocorre a ligação de 2 fragmentos Fab por um péptido ou uma ponto dissulfúrica.

Exemplo de Fab: Idarucizumab atua na reversão da hipo coagulação induzida pelo Dabigatrano,
utilizado essencialmente em cirurgias de emergência.

• ScFv;

Fragmento variável (metade da cadeia leve + ¼ cadeia pesada) que se podem apresentar sob a
forma de dímeros ou trímeros. Atua no reconhecimento de Ags.

Exemplo 1: Single chain variable fragment → Brolucizumab → pequenas dimensões (25 kD) e pode
ser produzido por E. Coli pois não necessita de glicosilações.

Exemplo 2: Bispecific T-Cell Engager (BiTE) → Blinatumomab → um dos fragmentos variáveis é

específico para o tumor e o outro para a célula T. Este anticorpo permite a ligação à célula tumoral
e a ativação da célula T.

• Bi-específicos;

Fragmento que de um lado da região variável reconhece um antigénio e do outro reconhece, por
exemplo, uma célula T. São muito usados nos processos neoplásicos.

• Proteína de fusão Fc;

Apresenta um maior peso molecular que os anteriormente referidos. → apontamentos da joana.

Exemplo: Aflibercept e Dulaglutido (agonista dos GLP-1 indicado para o tratamento da diabetes do
tipo 2, consiste na terapêutica inicial mais adequada e apresenta um tempo de semi vida longo
(ig4)).

• Nanobodies;

“Single arm”.
Apresentam um peso molecular que varia entre 12 e 15 kD. As suas aplicações são sobreponíveis
aos ScFv.

• Imunoglobulinas conjugadas.

Adiciona-se à imunoglobulina um agente citotóxico. A principal vantagem passa por dirigir o agente
para o alvo.

Exemplos: Agentes radioimunoterapêuticos (RIT)→ Transuzumab emtansina, Gemtuzumab

ozogaminica/ Conjugado anticorpo (ADC)→ Ibritumomab tiuxetano (não é comercializado em
Portugal).

Para além dos anticorpos referidos podemos ainda der outros tipos, tais como:

• Anticorpo bi-específico e tri-funcional;

Exemplo: Catumaxomab (não comercializado em Portugal).

Em termos de nomenclatura:
 À direita temos uma lista de todos os anticorpos monoclonais que são comercializados em Portugal.

Anticorpos monoclonais- aplicações terapêuticas

Os anticorpos monoclonais são muito utilizados em doenças do sistema imunitário e no tratamento

do cancro, como veremos ao longo deste tema.

Como sabemos, a resposta imunitária é constituída por uma resposta inata (imediata e não
específica e que resulta do 1º contacto com o Ag → complemento,
granulócitos/monócitos/macrófagos, células NK, células mastocitárias e basófilos) e uma resposta
adaptativa (específica a um determinado Ag → linfócitos B e linfócitos T).

Na figura seguinte está representado o processamento do antigénio. No caso dos antigénios

extracelulares, primeiro o Ag entra na célula, por endocitose, e é destruído em péptidos, de seguida,
ocorre a fusão dos péptidos com vesículas que vêm do complexo de Golgi e que carregam as
MHCII (vão ligar-se aos fragmentos do Ag extracelular e carregá-los parra a superfície das células
apresentadoras de Ag, como
os macrófagos) → Processo
anteriormente já referido.

As MHCI vão apresentar os antigénios

intracelulares e as MHCII os antigénios
extracelulares.
No caso dos antigénios intracelulares, e também como pode ser observado na imagem anterior,
ocorre uma degradação destes nos proteossomas, originando péptidos. Os péptidos resultantes
são transferidos através da TAP para o RE, entregando depois vesículas juntamente com MHC I,
que se fundem com a membrana.

Em ambos os casos ocorrer o reconhecimento dos antigénios pelos linfócitos T, no entanto a

ativação destes últimos está também dependente de um sinal de co estimulação.

Antigénio extracelular Antigénio intracelular

Apresentado por MHCII Apresentado por MHCI

Reconhecido por linfócitos TCD4 Reconhecido por linfócitos TCD8

Falaremos agora concretamente do

processo de ativação dos linfócitos T,
para que isto ocorra é necessário que o
recetor TCR do linfócito T reconheça o
Ag mas também que o recetor CD28
interaja com CD80 ou CD86 da célula
apresentadora de Ag. A célula ativa
desencadeia uma cascata de reações
que levam à transcrição génica e à
produção de citoquinas (interferão →
interfere na síntese química, IL-2 →
estimula a diferenciação celular dos LT
e TNF → envolvido em diversos
processos inflamatórios do organismo) que vão desencadear a resposta imunitária e o processo
inflamatório.

Desta forma, se um determinado anticorpo monoclonal bloquear o sinal de co-estimulação

(interação do CD28 com CD80 ou CD86) consegue travar a resposta imunitária. Isto apresenta
especial interesse em patologias que induzem uma resposta inflamatória exacerbada.

Observemos agora os seguintes esquemas:

A. Podemos observar a célula T e a célula apresentadora de antigénio. O TCR interage com

o Ag apresentado por MHC e o recetor CD28 não apresenta interação.
B. Observa-se o mesmo que em A, no entanto, o CD28 encontra-se ligado ao CD80/CD86.
Ocorre ativação da célula T. Podem ainda existir outras ligações, como é o caso da
interação entre o recetor CD154 com o ligando CD40, o que também auxilia a ativação da
célula T.
C. Neste caso o processo de ativação é travado por sinais inibitórios.
i) Interação do ligando PD1 do linfócito T e o recetor PD-L1 do APC;
ii) Interação do recetor CD152 do LT e o ligando CD80/CD86 da APC.
D. Anticorpos monoclonais que têm como alvo um destes mecanismos, pois, por um lado,
promovem a ativação e por outro podem inibir a ativação dos LT.

Comecemos agora a falar dos diferentes anticorpos monoclonais que atuam ao nível do
SI/inflamação:
 • Anti-CD3 → Muromonab* (origem murina → muito imunogénico);

O CD3 é fundamental para ativação do LT que este reconheça um antigénio apresentado por
MHC, pois trata-se de um componente do TCR. Ao
bloquearmos o CD3 é induzida a endocitose do
complexo e a consequente inativação da célula T, pois
o TCR não consegue reconhecer o Ag.

Este anticorpo monoclonal atua como imunossupressor,

sendo bastante útil em situações de transplantação.

• Anti-CD52 → Alemtuzumab (humanizado e produzido a partir de IgG1);

O CD52 é uma glicoproteína que existe na superfície dos LT, LB, macrófagos, NK e alguns
granulócitos. O Ac monoclonal ao ligar-se a esta glicoproteína marca a célula para ser destruída,
travando desta forma a resposta imunitária e o processo
inflamatório.

Anticorpo monoclonal bastante usado na transplantação,

porém, em Portugal está aprovado para a esclerose
múltipla surto-remissão.

• Anti recetor IL-2 (Anti-CD25) → Daclizumab*, Basiliximab (quimérico proveniente de IgG1);

Como foi referido, caso a célula T seja ativada ocorre uma cascata de reações que culmina com
a transcrição e codificação de IL-2, que é uma citoquina envolvida nos processos inflamatórios. O
CD25 é um componente do recetor da IL-2.

Este anticorpo monoclonal liga-se à subunidade alfa

do recetor da IL-2, impedindo a ligação ao seu
recetor e desta forma trava a proliferação e a
diferenciação dos LT.

O seu uso terapêutico prende-se sobretudo com os

transplantes de órgãos sólidos (em associação com
a ciclosporina e corticosteroides).
 • Anti-TNF → Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Golimumab e Certolizumab pegol
(fragmento Fab com um PEG associado para estabilizar e aumentar o tempo de semi
vida);

Estes anticorpos monoclonais são extremamente importantes, pois

o TNF-α é uma citoquina pró-inflamatória fundamental no nosso
organismo e que é responsável por induzir a apoptose das células
quando estas terminam a sua função e já não são necessárias. O
principal mecanismo de ação destes Ac passa pela ligação ao fator
de necrose tumoral, bloqueando a interação com o seu recetor.

Para percebermos melhor o mecanismo de ação destes Ac é

preciso que saibamos que o TNF transmembranar é o precursor
(também pode participar no processo inflamatório) do TNF solúvel
e que é este último que desencadeia o processo inflamatório. O Anticorpo monoclonal liga-se ao
TNF solúvel por reconhecimento através das regiões variáveis.

O mecanismo de ação que foi explicado é denominado de neutralização, no entanto existem outros
pelos quais os anti-TNF podem atuar, são exemplo a ligação ao TNF transmembranar com
produção de citoquinas e a morte celular mediada pelo complemento (CDC e ADCC).

Estes anticorpos podem ser utilizados para a artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, doença de
Crohn, colite ulcerosa, espondilite anquilosante, artrite psoriática e psoríase.
Em termos de segurança, o mais seguro é o adalimumab, seguido co certolizumab e, por fim, o
infliximab (apresenta 60% de imunogenecidade).

• Inibidor da integrina ⍺4β7 → Vedolizumab (humanizado e proveniente de IgG1).;

A integrina é uma proteína que existe na superfície dos LT helper de memória (migram para o
epitélio intestinal). Esta apresenta a capacidade de interagir com a molécula MAdCAM-1 (subexpressa
na mucosa intestinal) e desta forma induzir a resposta inflamatória crónica.

O Anticorpo monoclonal inibe a interação/ligação entre a integrina e a MAdCAM-1, travando a

passagem do LT para a mucosa e impedindo a resposta inflamatória.

O principal uso deste Ac monoclonal passa pelo tratamento da doença de Crohn e da colite ulcerosa.

• Anti recetor IL-12 e IL-23 → Ustecinumab (humano, IgG1);

As interleucinas 12 e 23 são citoquinas que ativam as

vias de sinalização que estão envolvidas patogénese
da colite ulcerosa, psoríase e doença de Crohn.

O anticorpo monoclonal atua reconhecendo p-40 da

interleucina, liga-se e impede que as IL-12 e IL-23 se
liguem ao seu recetor, impedindo assim diversas vias
de sinalização (Th1 e Th13) que iriam desencadear os
processos inflamatórios que estão na base das
doenças anteriormente referidas.

• Inibidores da IL-1 → Canacinumab, Rilonacept*;

A IL-1 é uma citoquina cujos níveis elevam em pessoas
com inflamação ativa. Estes anticorpos monoclonais
ligam-se à IL-1, bloqueando a sua interação com o
recetor e a sua consequente ação, bloqueando assim
os processos inflamatórios.

São utilizados sobretudo na síndrome periódica

associada à criopirina (CAPS), sendo esta última uma
proteína que estimula a produção e libertação da IL-1.

• Anti recetor IgE → Omalizumab;

Nota: Temos dois tipos de
A IgE trata-se de um mediador da resposta inflamatória (resposta TH2) e respostas imunitárias, a TH1
(responsável pela eliminação de
este anticorpo monoclonal apresenta uma elevada eficácia em casos de Ag estranhos) e a TH2
asma grave. (eliminação de parasitas.)

Em termos de mecanismo de ação, o anticorpo liga-se à IgE, bloqueando

a sua ligação aos recetores e consequente resposta inflamatória.

Falaremos agora de tumores, sendo importante salientar que estes podem tanto ser benignos
(localizados) como malignos (metastiza e invade vários órgãos). A principal causa dos tumores
prende-se com o crescimento descontrolado, devido à existência de fatores de crescimento em
excesso, descontrolo ao nível do recetor dos fatores de crescimento, diminuição dos fatores de
inibição do crescimento, descontrolo no recetor dos fatores de inibição do crescimento, redução
da resposta imunitária (imunodeficiência, imunossupressão) e angiogénese (origina tumores sólidos).
Os fatores genéricos de causa tumoral nos quais os Ac monoclonais atuam são a redução da
resposta imunitária e a angiogénese.

No nosso organismo ocorrem frequentemente mutações, no entanto, estas não ocasionam células
tumorais pois o nosso SI identifica essas mutações e destrói as células que as transportam. Em
situações de imunodeficiência/imunossupressão esta defesa não está ativa podendo levar ao
aparecimento de tumores.

Muitos tumores tem a capacidade de expressar fatores angiogénicos, que promovem a produção
de novos vasos sanguíneos que vão auxiliar a proliferação e manutenção do tumor.

Pretende-se ainda que o Ac monoclonal utilizado leve à morte da célula tumoral, através de:

• Interferência com a função do recetor celular ou do ligando;

• Formação do complexo antigénio-anticorpo (isto é conseguido pelo recrutamento de
células do sistema imunitário);
• Modulação/Indução do SI;
• Incorporação de toxinas na célula.

O recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)

pertence à família de recetores transmembranares
acoplados à tirosina cinase. Aquando da ligação do fator de
crescimento ao recetor é induzida a dimerização deste
último, levando à ativação da tirosina cinase e posteriores
fosforilações que desencadeiam toda a cascata de
sinalização interna que culmina com transcrição genética.
Esta última leva a uma proliferação celular e uma redução
das sinalizações apoptóticas. Alguns tumores epiteliais
apresentam sobrexpressão deste recetor, como é o caso
do cancro do colon e reto e do cancro do pulmão

• Inibidores EGFR → Cetuximab, panitumumab e necitumumab*;

Estes Ac impedem a ligação do EGF ao seu recetor. Como? Pois bem, ligam-se ao domínio
extracelular do recetor e impedem a ligação do EGF, impedindo desta forma as reações de
sinalização interna que levam à proliferação e ao crescimento celular.
Estes anticorpos têm maior afinidade para o recetor do que o próprio EGF e ainda apresentam a
capacidade de internalização do recetor. São, por tanto, bastante eficazes na travagem do
crescimento das células tumorais.

No caso concreto de cetuximab, este atua ainda por citotoxicidade mediada por anticorpo, sendo
capaz de induzir, através do fragmento constante, a interação com células do SI e também
potenciar a morte celular por essa via.

Em termos de uso terapêutico, estes anticorpos são utilizados

para o tratamento do cancro do colon e reto, pulmão e ainda
carcinoma pavimentocelular da cabeça e do pescoço. Já em
termos de segurança é de referir que o cetuximab é o menos
seguro (podendo causar RAMs como reação cutânea tipo
acneiforme, prurido, pele seca, descamação, alterações nas
unhas e hipomagnesemia) em comparação com o
panitumumab (dor abdominal, hipomagnesemia, reação
cutânea tipo acneiforme e outros rashes, cansaço, náusea,
vómitos e diarreia).

O fator do crescimento epidérmico humano 2 (HER2) apresenta-se sobrexpresso em alguns

tumores, sobretudo no cancro da mama e no cancro gástrico. Está normalmente associado a
tumores mais agressivos, mais difíceis de tratar e com uma maior probabilidade de recaída. É de
referir que basta existir o aumento da expressão deste recetor pata que seja induzindo um
crescimento anormal, sem ser necessário a ligação do ligando → Isto apenas se verifica porque o
HER2 apresenta uma conformação especial, conseguindo ligar-se a sim próprio.
 • Inibidores HER2 → Trastuzumab e Pertuzumab;

O Transtuzumab é uma IgG1, capaz de se ligar ao domínio extracelualr 4 de HER2, impedindo

que o ligando se ligue. Por sua vez, o Pertuzumab atua ligando-se ao domínio extracelular 2 de
HER2 e inibe a dimerização do HER2 com o HER1,3, inibindo desta forma as sinalizações internas
que levam a uma maior transcrição celular e
consequente crescimento e proliferação
tumoral. Outro mecanismo de ação que
estes anticorpos podem apresentar passa
pela ADCC, onde a porção constante do Ac
interage com células efetoras (como
macrófagos) e promove a morte celular.

Em termos de uso terapêutico , e como referido, estes Ac podem ser utilizados para o
tratamento do cancro da mama ou para o tratamento do cancro gástrico. Do ponto de vista
da segurança, ambos apresentam cardiotoxicidade (disfunção ventricular e insuficiência cardíaca
congestiva), podem provocar anemia e leucopenia e ainda alterações GI (como náuseas,
vómitos e diarreia).

O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) trata-se de um

fator angiogénico sobrexpresso em alguns tumores, nomeadamente
sólidos. Este, ao ativar o seu recetor (que tem acoplado uma tiroscina
cinase), induz a cascata de sinalização interna que leva à proliferação
celular, produção de óxido nítrico, estimulação do crescimento e
desenvolvimento das células tumorais.

Tudo isto leva a um aumento da angiogénese, a aum aumento do tumor

e a uma promoção da ocorrência de metástases.

• Inibidores do VEGF → Bevacizumab e Ramucirumab;

Ambos os anticoorpos referidos são considerados complexos, ambos de IgG1 e que divergem
pelo facto de Bevacizumab ser humanizado e o Ramacirumab ser humano.

Em termos de mecanismo de ação é de salientar que existem vários tipos de VEGF, assim
como vários recetores. Desta forma, o Bevacizumab liga-se ao ligando (VEGF) e impende a
 sua interação com o recetor, por sua vez, o Ramucinumab liga-se ao recetor do VEGF e
impede que o ligando se ligue ao recetor. Ambos os Ac também pidem atuar através da
inibição da angiogénese, no entanto os mecanismos divergem:

a) As imagens mostrasm como o VEGF estimulam o crescimento tumoral. O tumor expressa

uma elevada quantidade destes recetores. Dá se a formação de novos vasos sanguíneos,
que não só estimulam o crescimento do tumor como também garantem a sua
metastização;
b) O Anti-VEGF liga-se ao VEGF ou ao seu recetor, impedindo a ligação entre ambos e,
assim, impedido a evolução do tumor.

Em termos de uso terapêutico, estes anticorpos monoclonais podem ser utilizados para o
tratamento do cancro do colon e reto, cancro do ovário, glioblastoma, degenerescência
macular, cancro gástrico, cancro do pulmão de células não-pequenas e cancro hepatocelular.
Em termos de segurança, como estes fármacos levam a uma cessão da produção de óxido
nítrico (vasodilatador) vai ocorrer um comprometimento e aumento da resistência vascular
periférica, podendo causar situações de HTA, diminuição da força de injeção ventricular,
hemorragia e eventos tromboembólicos. Um outro efeito adverso passam pelo atraso da
cicatrização, que ocorre com a toma de ambos os fármacos, mas é mais evidente com o
Bevacizumab.

Falaremos agora do tratamento anti-tumoral com envolvimento do sistema imunitário. Alguns Ac

monoclonais atuam promovendo a destruição da célula tumoral através da exacerbação do SI (mais
concretamente através de uma estimulação excessiva). Este tipo de aticorpos apresentam questões
de segurança que os até agora referidos não apresentam.

Como podemos observar na imagem ao lado, quando está

presente uma célula tumoral (proliferação anormal ou
descontrolada de uma célula) existem marcadores tumorais (Ag)
que são apresentados pelas células apresentadoras de
antigénios, através das MHCs, ao sistema imunitário.

Quando a célula apresenta o Ag tumoral, este vai ser

reconhecido pelo LT CD4, através do recetor TCR. Para além
disso, para ocorrer ativação do LT é necessário existir um sinal
de co-estimulação que resulta de um ligando que interage com
o recetor CD28 desta célula. Após ativação, ocorre a produção
de citocinas que ativam os LT CD8, que vão migrar para a zona
do processo tumoral e vão induzir a morte celular. Isto ocorre
porque o recetor TCR das cálulas CD8 reconhece Ag presentes
na superfície da célula tumoral e liberta porfurinas e outras
substâncias que levam à destruição da célula tumoral.

Basicamente, os Ac monoclonais tiram partido deste processo que já ocorre no organismo e

promovem a exacerbação da resposta imunitária. A maioria dos Ac atuam ligando-se ao ligando
PD-L1 ou ao rector PD1 (recetor da morte celular programada que interage com o ligando existente
na célula tumoral, PD-L1 ou PD-L2, e inibe a célula T de destruir a célula tumoral), inibindo a ligação
entre ambos.. Os anticorpos também podem atuam numa fase mais inicial, ao nível do recetor
CTLA-4 da célula TCD4 que quando ligado ao ligando B7 estimula a inibição da célula T.

Então como referido, o recetor da morte celular programada (PD-1) está presente na superfície
das células T e quando estimulado pelo ligando vai impedir a função dos LT. Falaremos então dos:

• Inibidores PD-1 → Nivolumab e Pembrolizumab (ambos de IgG4);

Estes anticorpos atuam através da ligação ao recetor PD-1 e bloqueio

da sua interação com o ligando PD-L1. Sem a interação, dá-se a
estimulação da célula T, não havendo inativação da mesma.

Em termos de uso terapêutico, estes anticorpos monoclonais podem

ser utilizados para o tratamento do melanoma, linfoma de Hodgkin,
 cancro do pulmão de células não-pequenas, carcinoma das células renais, carcinoma das células
escamosas da cabeça e do pescoço e carcinoma urotelial. Já do ponto de vista da segurança,
o Pembrolizumab tem maior potencial de imunogenecidade, por ser imunizado, podendo haver
com maior frequência situações de rash em doentes com melanoma. Outro tipo de efeitos
adversos que podem advir da toma destes Ac monoclonais passam pelo cansaço, dispneia,
náuseas, obstipação e redução do apetite.

• Antagonistas do PD-L1 → Atezolizumab e Durvalumab (ambos Ac inteiros de IgG1);

O PD-L1 encontra-se expresso nas células tumorais, ao contrário do que acontece com o PD-L2.
As células tumorais tomam partido do PD-L1 para suprimir
a atividade das células T, exressando elevadas quantidades
deste ligando.

Estes anticorpos monoclonais ligam-se ao ligando e

bloqueiam a interação do PD-L1 da célula tumoral com o
PD-1 da cálula T.

Em termos de uso terapêutico, este Ac monoclonais podem ser utilizados para o tratamento do
cancro do pulmão das células não-pequenas e do cancro urotelial. Já em termos de segurança,
quando usados para o tratamento do cancro do pulmão, podem causar reações adeversas como
cansaço, redução do apetite, dispneia, tosse, náuseas, dor músculo-esquelética e obstipação. Por
sua vez, quando usados para o tratamento do cancro urotelial, podem levar ao aparevimento de
infeções no trato urinário.

• Anti-CTLA4 → Ipilimumab;

Este é um grupo terapêutico muito

importante. Quando o CTLA4 se liga ao
ligando B7 ocorre a inibição da célula T.
Desta forma, o Ac monoclonal atua pelo
bloqueio da estimulação do CTLA4 e pela
ativação das células T, seguida da
destruição da célula tumoral.

Em termos de uso terapêutico, este Ac

monoclonal pode ser utilizado para o tratamento do melanoma, carcinoma das células renais e
carcinoma do pulmão de células não pequenas. Em termos se segurança alguns dos efeitos
adversos que se podem fazer sentir passam por diarreia, erupção cutânea, prurido, fadiga, náuseas,
apetite diminuído, vómitos e dor abdominal.

O que diferencia este grupo de anticorpos monoclonais dos restantantes é o problema de

segurança que advém do mecanismo de ação, isto é, a possibilidade de desenvolvimeto de doenças
auto-imunes devido à sobre ativação das células T.

A toxicidade associada aos três anticorpos monoclonais depende de:

• Do doente em si e do seu processo tumoral → existem sempre determinadas

características do indíviduo que podem alterar a resposta ao tratamento e a sua toxicidade;
• Da dose → fator mais agravado nos anti-CTLA4;
• Do cronograma do tratamento → tratamentos que são mais intensivos terão maior risco
de induzir reações de imunogenecidade.

O padrão de toxicidade que se pode observar passa pelo desenvolvimento de reações cutâneas
graves (ex.: Síndrome Stevens-Johnson, necrólise epidérmica tóxica), colite autoimune, hepatite
autoimune, pancreatite autoimune, tiroidite autoimune, problemas neurológicos, pneumonite
autoimune e uveite autoimune.

O que se sabe “by the back” é que os probemas de imunogenecidade causados pelos Ac
monoclonais referidos, podem afetar uma grande variabilidade de orgãos, tal como mostra a figura
seguinte:

A imagem mostra os orgãos que

são mais afetados. A falha renal pode
ser súbita e, nesses casos, não há
nada a fazer. Também é de destacar
a colite ulcerosa e a neuropatia
(bastante comprometedora da
qualidade de vida do paciente). Por
exemplo, a diarreira proveniente da
colite autoimune apresenta um
tratamento completamente diferente das diarreias que normais, que se tratam com a ingestão de
líquidos e loperimida (exemplo). Neste caso, a diarreia não regride com a abordagem comum, tendo
de ser tratada com corticosteróides em doses muito elevadas (via oral ou IV).

O farmacêutico apresenta um papel bastante importante! O farmacêutico que acompanha estes

doentes deve saber todos os efeitos adversos destes fármacos, bem como saber orientar os
pacientes.

Falaremos agora de outro tipo de anticorpos monoclonais que já não atuam pela exacerbação do
SI:

• Inibidores do CD-20 → Rituximab;

O CD-20 é um marcador/antigénio que existe à superficíe das células B. Sabe-

se que cerca de 90% dos neoplasmas de célula B expressam o CD-20. A
função fisiológica deste marcador não está comletamente esclarecida, porém,
sabe-se que tem interferência no crescimento e na diferenciação celular, na
medida em que, alguns processos tumorais que afetam as células B expressam
o CD-20 em quantidades muito elevadas.

O Rituximab foi o primeiro Ac monoclonal a ser aprovado para o tratamento do cancro. Este, atua
reconhecendo o CD-20, ligando-se e induzindo a destruição da celula B por citotoxicidade
dependente do complemento e por
citotoxicidade dependente do anticorpo.

Na imagem ao lado, podemos salientar que

o Rituximab, através das regiões variávies,
reconhece o CD-20, liga-se a ele e através
das alterações que acontecem ao nível do
Fc, interage por um lado com o
complemento (induzindo a MAC que destrói
a célula B) e por outro lado, é capaz de
interagir com o recetor FCR das células
efetoras do SI, ativando-as e levando
também à destruição da célula tumoral.
 Para além dos mecanismos já descritos, o Ac
monoclonal pode também induzir a apoptose.

Em termos de uso terapêutico, este Ac monoclonal, é

utilizado para o tratamento do linfoma não Hodgkin,
linfoma das células B, leucemia linfocítica crónica e
doenças autoimunes (ex.: artrite reumatoide, esclerose
múltipla).

O principal problema deste Ac monoclonal prende-se

com a resitência ao mesmo, devido a polimorfismos
que podem existir nos dois recetores do fragmento
constante, o que pode comprometer a interação do
fragmento constante com o recetor. Se a ligação fica
comprometida, logicamente também o mecanismo de ação ficará.

Em termos de segurança é de salientar a elevada imunogenicidade (anticorpo quimérico) o que

pode levar a reações de infusão (febre, arrepios, irritação da garganta, urticária e hipotensão ligeira)
que em casos mais graves podem colocar em risco a vida (é normalmente feita uma pré-medicação
com anti-histamínicos e caso esta não seja viável podem se usar corticosteróides) Outras reações
adversas podem passar por síndromes de Stevens-Johnson e reativação da hepative B viral.

O R.ituximab pode aparecer em associação com o

Ibritumomab tiuxetano (não comercializado em
Portugal), cuja principal vantagem passa pelo facto de
primeiro se administrar o rituximab, o que leva a que o
ibrutumomab seja dirigido para a célula tumoral,
poupando-se células saudáveis.

Falaremos agora dos anticorpos monoclonais conjugados que interagem com o CD33 (antigénio
expresso na superfície dos blastos leucémicos mieloides), como é o exemplo do Gemtuzumab
ozogamicina.
Este Ac monoclonal é derivado de uma IgG4 e como o próprio nome indica apresenta-se ligado a
uma ozogamicina (derivado semi sintético da caliqueamicina) de forma covalente. Em termos de
mecanismo de ação, este Ac forma um complexo Ag-fármaco que leva à endocitose do complexo
e libertação da caliqueamicina (no interior da célula tumoral promove a destruição da mesma). Este
Ac monoclonal pode ainda atuar por ADCC e CDC.

A. O Ac monoclonal reconhece o Ag CD33 e

interage com ele;
B. Internalização do Ac em lisossomas de CD33 que
vão destruir a ligação covalente entre o Ac e a
ozagamicina, libertanto a caliquiamicina. Esta última vai
interagir com o DNA da célula e estimular a sua
apoptose/destruição.

Em termos de uso terapêutico, este Ac é utilizado para o

tratamento da leucemia mieloide agua. Por sua vez, em
termos de segurança algumas das principais RAMs podem
passar por hemorragia, hepatotoxicidade e infeções.

Vacinas

Em 1978, Edward Jenner, descobriu a vacina contra a varíola e, a partir daí, começou a surgir o
conceito de “medicamento preventivo”, algo que era desconhecido até então. A partir deste
momento, começou-se também a perceber que sempre que existiam surtos (de varíola) havia
sempre um determinado grupo da população que não ficava doente, as leiteiras que ordenhavam
vacas, isto acontecia porque elas desenvolviam a varíola das vacas, menos grave, e ganhavam uma
espécie de “imunidade”.

Apenas em 1989 é que as vacinas passaram a ser consideradas medicamentos. A biotecnologia

moderna veio trazer um grande avanço para a tecnologia das vacinas.

Falaremos agora daquelas que são as principais diferenças entre as vacinas e os medicamentos de
biotecnologia:
 • Doses → as vacinas apresentam doses muito baixas (na gama dos microgramas), enquanto
os restantes apresentam doses bem superiores (gama dos miligramas);
• Frequência → As vacinas apresentam baixa frequência de administração, com
espaçamentos de variam de meses (influenza) a anos (tétano);
• Tipo de formulação → As vacinas são na sua grande maioria suspensões e emulsões, por
sua vez, a maioria dos restantes medicamentos de biotecnologia apresentam-se sob a
forma de soluções;
• Indicação terapêutica → As vacinas são profiláticas enquanto os restantes apresentam
todos propriedades/indicações terapêuticas;
• Público-alvo → As vacinas podem ser administradas em qualquer pessoa. Os restantes
medicamentos são normalmente administrados em tratamentos dirigidos.
• Número de ingredientes ativos → As vacinas podem ter vários (exemplo: epídotos), os
restantes medicamentos apresentam apenas 1.

Falaremos agora daquele que é o princípio da vacinação:

a) Encontra-se representado o que acontece no SI perante um agente infecioso.

Ocorre primeiramente a infeção do organismo, seguida do desenvolvimento da resposta imunitária.

Primeiro, ocorre a resposta inata pela ação dos macrófagos, células dentríticas, neutrófilos, entre
outros. Esta primeira resposta do organismo é não específica e evolui para uma resposta imune
adaptativa, caracterizada pelo envolvimento das células B e T e pelo desenvolvimento da memórica
imunológica (base da vacinação). Isto leva a que numa 2ª esposição ao mesmo Ag patogénico já
não ocorra doença.
 b) Podemos observar o que ocorre aquando da vacinação, que tem como principal objetivo
quebrar as cadeias de transmissão.

Basicamente, este processo de vacinação consiste na inoculação do indivíduo com um Ag (faz

com que ocorra resposta imunitária), seguido do envolvimento das células B e T e o
desenvolvimento de memória imunológica. Quando o doente está realmente em contacto com
o agente patogénico já não desenvolve a doença.

Na resposta imune dependente de um Ag, ocorre um ataque a este último mediado pelas células
APC (células apresentadoras de Ag profissionais). Estas últimas, reconhecem o Ag exónego,
fagocitam-no, processam-no e apresentam-no às células efetoras da resposta adaptativa (células
T) através das MHC II.

Após o reconhecimento, os LTsão

ativados e produzem citocinas que
vão ativas as células B, T citotóxicas,
outras células T responsáveis por
reações de hipersensibilidade
atrasada e macrófagos que vão
apresentar mais Ag e ativar um ciclo
de resposta imune.

No processo descrito, é de destacar que as células B irão desenvolver imunidade humoral através
do seguinte processo:

1. Ativação dos LB pelas citocinas produzidas peos LTCD4;

2. Ocorre produção de Ac. Todos os LB com Ac capazes de reconhecer o Ag apresentado
vão ser recuperados do seu plano de morte;
3. Ocorre um processo de multiplicação sucessiva, com também sucessivas mutações
(contribuem para a imortalidade do LB);
4. Os LB diferenciam-se em células plasmáticas e células de memória → imunidade humoral.

No caso dos LT citotóxicos, após a sua ativação pelas citoquinas, estes passam a conseguir
reconhecer Ag que são apresentados pelas MHC I (reconhecem o Ag proveniente do Ag infecioso)
e, consequentemente, produzem porfirinas que destroem a célula infetada.

Falaremos agora das etapas da imunização.

A vacina começa por ser inoculada nos tecidos
periféricos (ex: músculo), o Ag é reconhecido
pelas APC e ocorre a resposta imune inata. De
seguida, As APC vão migrar para os tecidos
linfóides e onde o Ag já processado é
apresentado aos LT CD4. A ativação dos LB
pode ocorrer pelo processo já referido ou por
apresentação do Ag → de referir que as células
B só reconhecem o Ag apresentado se este
estiver intacto.

Agora surge a questão, quando é que o Ag está intacto? Pois bem, quando é suficientemente
pequeno para chegar por si aos tecidos linfóides e ser reconhecido ao nível dos recetores dos LB
e quando são transportados pelas APC intactas.

Existem alguns aspetos relevantes para o desenvolvimento das vacinas, sendo de referir que, para
que uma vacina seja capaz de desenvolver resposta imunológica é necessário garantir que o
organismo reage à vacina como se estivéssemos a apresentar um agente infecioso. Posto isto:

• Ativação da resposta imune inata → passo fundamental;

➢ As APC’s são fundamentais no transporte dos Ag da vacina até aos órgãos linfóides.

Como é que as APC distinguem algo que é prejudicial de algo que é endógeno? Através de
recetores de reconhecimento padrão associados ao patogénico (PAMPs). Na membrana das APC
podemos encontrar os PRRs que vão então reconhecer os PAMPs.

Desta forma, as vacinas vão ter de ter PAMPs para que ocorra resposta imunitária.

➢ Ativação PRRs;

Este processo vai levar a um aumento das moléculas de

co-estimulação necessárias para a ativação das células T
e indução do aumento de formação de citoquinas.

• Apresentação do Ag;
• Ativação das células B e T.

Na imagem, as bolas coloridas representam a produção

de citoquinas → 3º sinal necessário para a resposta imune.
Em função da ligação a diferentes citoquinas aos LT, podem surgir diferentes respostas imunes
(Th1, Th2 e Th17):

• Th1 → Desenvolvimento de resposta imune celular mediada por células T. É necessária a

presença de IL2 para que ocorra a diferenciação em LT citotóxicos;
• Th2 → Resposta concorrente da Th1. Mediada por IgE e que se encontra associada a
reações alérgicas.

As vacinas devem inibir a todo o custo esta resposta!

• Th117 → Resposta imunitária associada às mucosas e a doenças inflamatórias

(nomeadamente intestinais). As vacinas que reduzem o estado de inflamação de doenças
autoimunes estimulam esta resposta.

É importante conseguirmos perceber quais as respostas que devem estar ativas para a vacina que
queremos produzir.

Numa vacina atenuada as PAMPs já se encontram presentes, no entanto, numa vacina de

subunidade isso não é garantido.

Quando falamos em vacinação estamos

sempre a falar em imunização ativa! A
imunização passiva é aquela em que se
obtém imunidade sem a indução da
resposta imune (administração de Ac).

Em termos de vacina ideal, esta não existe, no entanto: seria 100% eficiente para indivíduos de
todas as idades; iria provocar uma proteção pela vida fora apenas com uma administração; não iria
provocar reações adversas; seria estável a condições variadas; fácil administração
(preferencialmente oral); seria produzida em quantidades ilimitadas e seria barata.

Em termos de classificação, as vacinas podem ser classificadas de acordo com o modo de

administração, a doença para a qual são dirigidas e ainda de acordo com a fonte do Ag:
 Vacinas Vivas Vacinas Inativas Vacinas de subunidades Vacinas de ácidos nucleicos
O agente infecioso é inoculado São inoculados elementos
atenuado, sendo capaz de se O organismo infecioso não é do agente infecioso
replicar no organismo, mas capaz de se replicar no indivíduo (proteínas, polissacarídeos e Mais recentes.
não causa doença. inoculado. péptidos). As de proteínas
são muito imunogénicas.

Existem situações em que podem ser

utilizados vetores virais para a produção de
vacinas, sendo dos mais comuns os
adenovírus (menores dimensões) e o vírus
vaccinia (maiores dimensões).

A desvantagem é comum aos dois tipos de

vetores, existe sempre a possibilidade de a pessoa inoculada já ter tido contacto com aquele vetor
viral. Caso tenha sido desenvolvida imunidade a vacina administrada não obtém efeito. Devido a isto,
é comum modificação genética dos vetores virais.

Em termos de vacinas vivas atenuadas, a forma clássica para a atenuação dos agentes patogénicos
passa pela passagem do agente infecioso por diversas células de macaco, de forma a sofrerem
mutações que os torna incapazes de se ligarem a proteínas das células dos hospedeiros humanos.
→ obviamente todo este processo apresenta riscos, tais como o facto de a atenuação poder ser
revertida. Os agentes patogénicos podem ainda ser atenuados por modificações genéticas, através
da eliminação/modificação daquela que é a sequência responsável pela virulência.

Falaremos agora das vacinas recombinantes, cuja estratégia está na base das vacinas de
subunidades. Como podemos observar, após a identificação das proteínas responsáveis pela
patogenicidade ocorre a sua inserção num
plasmídeo, seguido da transfeção de uma
célula hospedeira. A célula vai produzir
proteínas responsáveis por induzir a
resposta imune e as proteínas
recombinantes vão ser isoladas.

Ex: Vacina Hepatite B

Existem vários complexos imuno-estimuladores, dos quais é importante termos conhecimento:

 • Estrogénios → melhoram a resposta imunológica;
• ISCOM → lípidos que envolvem o Ag para fundir com as membranas celulares e desta
forma permitir a entrada do Ag na célula. Ocorre apresentação pelas MHC I;

Falaremos agora daquelas que são as vacinas de ácidos nucleicos:

• Vacinas de DNA;
➢ Vacinas de DNA “nu” → DNA vinculado através de um plasmídeo, mas apresenta
um “sistema de entrega à célula”;

Tipicamente administradas em células musculares porque apresentam um toomover baixo

(multiplicam-se lentamente). O plasmídeo entra na célula muscular e é traduzido a proteína, sendo
que esta é interpretada como sendo endógena e por isso é apresentada por MHC I. Os LT CD8
vão reconhecer e seguidamente sofrer um processo de expansão clonal (responsável pela
formação de células de memória e pela eliminação da célula muscular). Após este processo, são
expulsos péptidos recombinantes do DNA de interesse, sendo que vão ser considerado estranhos
e vão ser apresentados pelas MHC II.

Ocorre então o desenvolvimento de imunidade humoral e celular, ou seja, uma boa resposta
imunológica.

➢ Vacina de DNA de vetor → Utiliza-se o vetor viral para fazer chegar o DNA dentro
da célula.

Ocorre o isolamento do gene que codifica para a proteína de interesse e a sua inserção num gene
de plasmídeo. Seguidamente, ocorre transfeção do plasmídeo na célula hospedeira em conjunto
com o vírus (vetor) → a célula hospedeira vai produzir o vírus recombinado, que expressa à sua
superfície a proteína contra a qual se quer induzir a resposta imunitária.

• Vacinas em RNAm;

Trata-se de vacinas mais recentes e que apresentam um excelente perfil de segurança, uma
expressão proteica temporária (não integrativa) e uma melhor imunogenicidade em comparação
com as vacinas em DNA plasmídeo.

Estas podem ser utilizadas para a terapêutica oncológica, nos casos de vacinas personalizadas e no
combate à atual pandemia. A principal dificuldade relacionada com este tipo de vacinas prende-se
com a estabilidade e os fracos níveis de expressão (desvantagem).
De uma forma geral, em termos das vacinas de ácidos
nucleicos podemos ter:

Falaremos agora daquelas que são as vacinas anti

tumorais (terapêuticas).

O princípio destas vacinas prende-se com um individuo

com processo tumoral em decurso, do qual são
extraídas células do tumor e do sangue envolvente à
lesão (sangue apresenta LT CD8). De seguida, junta-se sangue extraído às células do cancro,
extraídas na biopsia, para promover ativação dos linfócitos T citotóxicos que vão reconhecer as
células de cancerígenas e os seus marcadores tumorais, sendo depois estes linfócitos ativados,
levando a expansão clonal que permite, posteriormente, o seu isolamento. Das células cancerígenas
podemos também extrair RNAs mensageiros, que passam cDNA pela ação da transcriptase reversa.
Cada um dos cDNAS vai ser inserido num plasmídeo diferente que serão transfretados em células
hospedeiras que vão expressar à sua superfície aquela proteína que funciona como marcador
tumoral do tumor de interesse. Chegando a esta fase, em que as células hospedeiras expressam a
proteína de interesse à sua superfície através da MHC I, vamos juntar os LT citotóxicos que vão
reconhecer o marcador tumoral.

Todo este processo é feito para identificar qual o marcador tumoral em causa. A partir daqui vamos
produzir o marcador e inocular os indivíduos de forma a reforçar a resposta imunitária,

Falaremos agora do coronavírus (ssRNA+). Este vírus foi descoberto pela primeira vez nos anos
60 (morcegos, aves e répteis) apresentando até aos dias de hoje 4 estirpes conhecidas.

A proteína de interesse deste vírus diz respeito à proteína Splike (S→

dímero que quando interage com o recetor ACM das nossas células,
induz alterações conformacionais que levam a aproximação do vírus com
a membrana célula humana e a sua posterior fusão) e como sabemos
foram desenvolvidas várias vacinas profiláticas no combate à pandemia.

• Vaxzevria (Astrazenca);

Modo de ação: É introduzida na célula hospedeira um adenovírus (vetor viral) modificado e não
replicante. Este expressa a proteína S na sua conformação (trimérica pré-fusão → + estável) e
estimula tanto os Ac neutralizantes como a resposta celular.
 Composição: Frascos para injetáveis multidose que contém 8 doses ou 10 doses de 0,5 ml por
frasco para injetáveis;

Indicação terapêutica: Imunização ativa para prevenir a COVID-19 causada pelo vírus SARS-CoV-2,
em indivíduos com idade igual ou superior a 18 anos;

Posologia e modo de administração: Imunização ativa para prevenir a COVID-19 causada pelo vírus
SARS-CoV- 2, em indivíduos com idade igual ou superior a 18 anos; IM (deltóide);

Processo de inoculação e resposta humoral e celular: O Adenovirus entra na célula do hospedeiro

vacinado → Dirige-se para núcleo da célula onde liberta genoma → Transcrição do DNA inoculado
em RNAm da SPIKE → Tradução da proteína Spike considerada endógena → Degradada em
péptidos → Apresentados pelas MHC I → Reconhecimento das MHC I pelos LT citotóxicos que
irão sofrer uma expansão clonal → Promovem a destruição da célula, processo do qual são
libertados péptidos spike que serão considerados exógenos e por isso vão ser apresentados por
MHC II e reconhecidos pelos LT CD4 → Ocorre a ativação dos LT CD4, sofrem expansão clonal
e produzem citoquinas → Por fim, as citoquinas vão ativar os LB que desenvolvem os Ac
específicos para a splike.

Desta forma, uma pessoa imunizada, quando contacta com vírus vai ter anticorpos que se vão ligar
ao vírus impedindo que este interaja com a nossa célula e para além disso, os anticorpos
neutralizantes vão marcar o agente infecioso para a destruição, indo depois as células natural Killer
(NK) destruir o agente infecioso.

• Vaccine Janssen;

Composição ➔ Frasco para injetáveis multidose que contém 5 doses de 0,5 ml;
➔ Uma dose (0,5 ml) contém:
- Adenovírus tipo 26 (humano) que codifica a glicoproteína S (spike*) do SARS-CoV-2 (Ad26.COV2-S), não
inferior a 8,92 log10 unidades infeciosas (U.Inf.)
* Produzida numa linha celular PER.C6 TetR e por tecnologia de DNA recombinante
Indicação Imunização ativa para prevenir a COVID-19 causada pelo SARSCoV- 2 em indivíduos com idade igual ou
superior a 18 anos
Posologia e modo ➔ Administrada em regime de dose única de 0,5 ml;
de adm. ➔ IM (de preferência no deltoide);
Mecanismo de ação Igual ao enteriormente descrito, apenas muda o tipo de Adenovírus que é utilizado.
 • Vaccine Moderna (vacina em mRNA → nucleósido modificado para aumentar a
estabilidade);

Não é estável, por isso muito difícil de conservar.

Composição ➔ Frasco para injetáveis multidose que contém 10 doses de 0,5 ml;
➔ Uma dose (0,5 ml) contém:
- 100 microgramas de RNA mensageiro (mRNA) (encapsulado em nanopartículas lipídicas SM-102 → estas
dão estabilidade e permitem que a vacina entre na célula por fusão);
- RNA mensageiro (mRNA) de cadeia simples, com estrutura 5’-Cap, produzido utilizando transcrição in vitro
num sistema livre de células a partir dos moldes correspondentes de DNA, que codifica a proteína S (Spike)
do vírus SARS-CoV-2.. Esta proteína S vai estar na estrutura de pré-fusão.

Indicação Imunização ativa para prevenir a COVID-19 causada pelo SARSCoV- 2 em indivíduos com idade igual ou
superior a 18 anos
Posologia e modo ➔ Administrada num esquema de 2 doses (0,5 ml cada) e recomenda-se que a segunda seja administrada
de adm. 28 dias após a primeira.
➔ IM (de preferência no deltoide);
Mecanismo de ação Ocorre a entrada na célula, no entanto, não existe interação com o genoma do hospedeiro. Os os
ribossomas traduzem a proteína no citoplasma e a Spike é interpretada como endógena, forma péptidos.
A partir daqui o processo é igual ao já referido.

• Comirnaty (Pfizer-BioNTech vaccine);

Composição ➔ Um frasco para injetáveis contém 6 doses de 0,3 ml após a diluição;

➔ Uma dose (0,3 ml) contém 30 microgramas de vacina de mRNA contra a COVID-19 (incorporados em
nanopartículas lipídicas);
➔ RNA mensageiro (mRNA) de cadeia simples com estrutura 5-cap, produzido usando transcrição in vitro
sem células a partir dos moldes de DNA correspondentes, codificando a proteína S (Spike) do vírus
SARS-CoV-2.
Indicação Imunização ativa para prevenir a COVID-19 causada pelo SARSCoV- 2 em indivíduos com idade igual ou
superior a 16 anos
Posologia e modo ➔ Administração por via IM após diluição num esquema de vacinação de 2 doses (0,3 ml cada) →
de adm. recomenda-se que a segunda dose seja administrada três semanas após a primeira.
Mecanismo de ação Igual.

Basicamente, o mecanismo de ação das vacinas é sempre o mesmo em todas. A única coisa que
varia é a forma como chegamos à Splike. De uma forma geral é preciso termos em atenção que
as vacinas em mRNA são sempre mais dificilmente conservadas que as vacinas em DNA e por isso
desenvolveram-se técnicas como a proteção/incorporação em nanopartículas lípicas:

Como podemos observar pela imagem da

direita existem neste momento muitas vacinas a ser desenvolvidas.

Falaremos agora do Papiloma vírus humano (HPV) que se trata de um vírus

em DNA, sem envelope e de pequenas dimensões. Existem mais de 40
tipos deste vírus que infetam na sua grande maioria a região ano genital
(causa cancros como o do cólo do útero, vaginal, pénis…).

A imagem ao lado mostra-nos aquelas que são as proteínas sintetizadas pelo

vírus, especial atenção para a L1 que está na base da formação das vacinas.
A primeira vacina que saiu era contra o HPV 16 e 18 por serem os mais
prevalentes. Atualmente, existem três vacinas aprovadas, no entanto, apenas uma é comercializada
(Guardasil 9 ®) por ser mais abrangente, engloba 9 tipos de HPV.

• Guardasil 9 ® → Administração ocorre por volta dos 11/12 anos, imunização a cada 10 anos;

Esta vacina é contra a L1 dos vários tipos de HPV e faz uso de uma tecnologia denominada de
partícula tipo vírus- VLP. Estas VLPs são nada mais que vírus sem material genético (apenas
apresentam a cápside) e são apresentadas às células como o agente infecioso tendo a capacidade
de gerar resposta imunitária de uma forma mais eficaz.

A proteína L1 é produzida por DNA recombinante e neste caso a célula hospedeira em que o
plasmídeo é introduzido é uma levedura.
Basicamente vamos obter uma resposta anti tumoral, pois ocorre a produção de anticorpos
neutralizantes, uma vez que as partículas são consideradas exógenas e apresentadas pelas MHC II.
Esta apresentação leva à ativação de LT CD4 que produzem citoquinas e ativam LB, responsáveis
por desenvolver Ac específicos neutralizantes contra os vários tipos de HPV.

Falaremos agora do vírus Influenza pertencente à família Orthomyxoviridae, este apresenta um

genoma em ssRNA -, e é constituído por 8 segmentos e apresenta-se sob a forma de Influenza
A, B e C. As principais gp de superfície são a Hemaglutinina (HÁ)
e a neuramidase (N). É ainda de acrescentar que a variabilidade
genética associada a este vírus se encontra associada a processos
de Ag Shift (originam subtipos de vírus diferentes) e Ag Drift (são
mais frequentes e menos significativas).

A vacina utilizada no combate à influenza trata-se de vacinas:

➔ Tetravalentes → Mais frequentes atualmente. Contra 4 estirpes do vírus. Sendo as estirpes

são escolhidos com base nas principais estirpes observadas no hemisfério sul, na época gripal
anterior. São vacinas produzidas em ovos (processo barato) ou em cultura de células.
➔ Trivalentes.

Ambos os tipos de vacina são inativados. O ovo é inoculado com estirpe viral, o vírus cresce, é
isolado, inativado por via química, fracionado e são as componentes resultantes do fracionamento
(contendo Hemaglutinina e neuraminidase) que são utilizados para inoculação. A utilização de ovos
é vantajosa pois trata-se um método bastante acessível.

Em termos de mecanismo de ação é desencadeada uma resposta humoral (os Ag são

considerados exógenos), existindo por isso, produção de Ac específicos neutralizantes contra as
estirpes.

O vírus da hepatite B trata-se de um vírus com genoma em DNA (circular, parcialmente cadeia
dupla com fragmentos de RNA) que se replica copiando o RNA anti-Ag em DNA (TR). Este vírus
apresenta um invólucro lipídico e trata-se de um vírus oncogénico.

As principais proteínas de superfície são as S, M e L, sendo que, a mais

importante é S e a mais prevalente também. Esta proteína constitui o antigénio
de superfície para a qual queremos induzir a imunização (HBsAg - antigénio de
superfície).
Em termos de vacina utilizamos uma imunização ativa através de uma vacina recombinante. Esta
vacina, apresenta uma sequência de DNA que codifica para a proteína de superfície e que é
colocada num plasmídeo, posteriormente colocado numa célula de levedura, onde se produz
ABsAg. O hidróxido de alumínio é um adjuvante, também presente na vacina do HPV, que leva à
precipitação da proteína, ficando exposta ao sistema imunitário durante mais tempo, potenciando
a resposta imunitária. A resposta imunitária é do tipo Humoral.

Falaremos, por fim, do vírus Ébola, pertencente à família

Filoviridae e que se apresenta sob a forma de 3 géneros
(Marburgvirus, Cuevavirus Ebolavirus). Trata-se de um vírus
em ssRNA – e não segmentado. Dentro do género
Ebolavírus podemos encontrar 5 espécies, onde é de
destacar a Zaire pois é a mais frequente.

Este vírus transmite-se de uma forma muito facilitada sendo que o seu principal reservatório diz
respeito a animais selvagens (primatas e morcegos). Entre os humanos a transmissão ocorre em
contacto com fluidos infetados ou órgãos e pode ou não se manifestar através de sintomas. Apenas
os indivíduos sintomáticos transmitem a doença.

Em termos de vacina, utiliza-se, o vetor viral da

estomatite vesicular, substitui-se a sequência de RNA
do VSV que codifica para a proteína de superfície,
pela sequência de RNA do Ébola que também
codifica para a sua proteína de superfície. Obtém-se
um VSV recombinante que expressa a proteína de
superfície do Ébola.

Mais recentemente, apareceu uma outra vacina contra o Ébola

(Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo) em DNA. Esta é ativa contra várias espécies de
Ébola e consistem em duas imunizações.

Fatores de crescimento hematopoiético

A hematopoiese consiste num processo extremamente bem regulado a partir

de células que são imaturas (da medula óssea que não são diferenciadas). Estas
vão-se diferenciando até chegarem a células maduras como g.v., glóbulos
brancos, plaquetas, entre outras. Todo este processo está sujeito e dependente
de vários fatores, os fatores de hematopoiese, como as citoquinas, interleucinas, alguns minerais
(ex.: ferro) e vitaminas (ex.: vit B12, ácido fólico).

A produção das nossas células sanguíneas acontece de acordo com as nossas necessidades basais
e, em determinadas situações há um aumentar do processo hematopoiético, no sentido de produzir
maior quantidade de células sanguíneas, nomeadamente, os g.v. na gravidez, “quando o organismo
não reage” por situações de hipoxia e em infeções sistémicas (aumento dos fatores estimuladores
das colónias de granulócitos).

A tabela seguinte apresenta representado ps principais fatores de crescimento hematopoiético:

• Eritropoietina (EPO) → uma glicoproteína (hormona) secretada pelas células renais. Tem erca
165 aminoácidos, 2 pontes dissulfureto, 4 glicosilações (3 na aspargina e 1 na serina). O gene
que codifica para a EPO está localizado no cromossoma 7.;

A principal função da EPO é do ponto de vista regulatório. Falaremos da Epo recombinante que
pode aparecer sob a forma de epoetina alfa, epoetina beta e epoetina zeta (esta última é o bio
similar da epoetina alfa). Estas, apresentam exatamente a mesma sequência de aminoácidos que a
EPO humana e em termos de efeito a alfa e a beta também são iguais à endógena.

Relativamente aos sistemas de expressão, as Epos recombinantes são produzidas em células de

mamíferos (células de ovário de hamster chinês), devido às glicosilações porque as pontes de
dissulfureto podiam ser em E.coli. Em termos de indicações, estes compostos são utilizados para o
tratamento da anemia associada a cirurgia (hemorragia), SIDA, quimioterapia, prematuridade e
algumas doenças inflamatórias crónicas que não estão especificadas em RCM. A administração é
normalmente é feita semanalmente.

➢ Análogo da epoetina alfa;

-Darbepoetina (análogo mais recente) → denominada também de chamada de epoetina
hiperglicosilada, porque tem mais 2 glicosilações que a humana e isso faz com que aumente a sua
semivida, maior potência, intervalo maior entre cada administração (pode ser até mensal).

Este composto é utilizado no tratamento de doenças renais ou IR, IRC (clearance da creatinina
reduzida) e ainda anemia induzida por quimioterapia. Em Portugal aparece comercializada sob a
forma de Aranesp.

➢ Epoetina beta peguilada (ligação covalente com o etilenoglicol) →

Metoxipolietilenoglicol-epoetina beta;

O facto de per peguilada aumenta o seu tempo de semivida, no entanto, apresenta menos afinidade
para o recetor EPO (compensação).

A sua comercialização em Portugal é indicada para a anemia em DRC, em fases mais avançadas.

• Fatores de crescimento hematopoiético mieloides;

Em Portugal apenas temos comercializado o G-CFS por isso é aquele sob o qual vamos falar mais
concretamente.

➢ Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF) → Filgastrim, Lenograstim e

Pegfilgastrim;

Este fator trata-se de uma proteína com cerca de 174 aa

e o gene que a codifica encontra-se ao nível do
cromossoma 17.

Só o lenogastrim é glicosilado (na serina) e por isso tem

sistema de expressão. Necessita células de ovário de
hamster chinês/mamífero para ser glucosilados. Ao
contrário dos outros 2, que podem ser produzidos por
E.coli (não são glucosilados e adição da ligação covalente
polietilenoglicol, maior semivida)

➢ Granulocyte-Macrophage Colony-
Stimulating Factor (GM-CSF);
Falaremos agora concretamente daqueles que são os medicamentos hemoderivados. Existem
atualmente vários produtos hemolisados no âmbito da biotecnologia, sendo que estes trouxeram
vantagens, pois antes do seu aparecimento antes a única opção terapêutica era a extração de
plasma humana (medicamento biológico), porém a administração continuada de um medicamento
biológico extraído a partir do plasma humano pode gerar resistências por parte do organismo que
recebe o fármaco. Nesse sentido, os fatores de coagulação recombinantes vieram constituir uma
outra alternativa. Também apresentam menor imunogenicidade

Desta forma, em primeira alternativa devem ser usados sempre fatores recombinantes. Apenas as
pessoas que já usavam biológicos é que os usam, a não ser que desenvolvam reações de
imunogenicidade e aí passa-se para fatores recombinantes. É de referir que um dos excipientes
que pode ser utilizado para a produção destes compostos recombinantes passa pela albumina.

Sistema hemostático: quando há lesão de um

vaso e risco de hemorragia, a hemóstase para
se gerar implica a interação entre as plaquetas
que são ativadas, os fatores de coagulação e
as paredes do vaso. Isto para se formar o
tronco que vai resolver a lesão e evitar a
hemorragia. Para que o sistema seja equilibrado
temos de dissolver o trombo quando resolvido,
senão passa a trombose.

Quando há deficiências ao nível dos fatores de coagulação ou ao nível do sistema fibrinolítico ocorre
um desequilíbrio. Deste desequilíbrio pode ocorrer, por um lado, hemorragia e por outra trombose.

Os fármacos existentes atuam

quando há distúrbios
hemostáticos como fatores
deficientes ou ausentes
(Hemofilia A e B são frequentes).
Não existem medicamentos
biológicos para todos os
distúrbios existentes, no entanto, existem sim medicamentos recombinantes.
Falando concretamente na Hemofilia, esta trata-se de um
distúrbio hereditário mais frequente em homens:

• Hemofilia A → Deficiência ao nível do fator VIII;

Este fator VII apresenta cerca de 26 exões e trata-se

polipeptídeo com aproximadamente 2351aa.

A estrutura apresenta 3 domínios (A, B e C), sendo que a maior parte das glicosilações ocorre ao
nível do B. As sulfatações dos resíduos de tirosina ocorrem entre o domínio A e B → Devido às
glicosilações os sistemas de expressão tem de ser sempre células de mamífero (CHO, BHK e HEK).

Neste momento, em Portugal, este fator pode ser obtido através do plasma humano ou a partir
de tecnologia de DNA recombinante.

No caso do fator recombinante, apesar do domínio B ter muitas glicosilações, estas não são
importantes para a atividade biológica. Desta forma, começou-se a eliminar de forma a melhorar a
sua expressão. Este composto, apresentam uma semivida curta e, por isso, tentaram-se estratégias,
no entanto, não existiram muitas alterações.

Os fatores recombinantes apresentam um prazo de validade de 24-36 meses (2-8ºC) e são

compostos liofilizados. Em termos de impurezas, estas podem estar presentes e são causa de
algumas reações de hipersensibilidade nos doentes, sobretudo quando os sistemas de expressão
são de origem humana.

• Hemofilia B → Deficiência ao nível do fator IX.

Este fator trata-se de uma proteína madura com cerca de 416 aa com o domínio Gla na sua região
N-terminal.

Este fator é dimórfico (um apresenta na

posição 148 uma alanina e o outro uma tirosina). Podemos ter as 2 formas alélicas comercializadas.

A carboxilação é fundamental e se não houver, não se criam locais de ligação específico de iões
cálcio. Estes como são carregados positivamente vão promover a ligação com a parede do vaso
(membranas lipídicas), que são carregadas negativamente. Isto ocorre porque quando há lesão
vascular, para a formação do trombo é necessário a ativação dos fatores de coagulação, plaquetas
e vaso lesionado.

Este fator pode ser obtido através do plasma humano ou através de técnicas de DNA recombinante.
Nestas últimas é necessário a presença de sistemas de expressão (células de mamífero) que façam
esta carboxilação, se não, o fator IX não é ativo.

No caso do fator recombinante, este apresenta uma sequência idêntica à do fator humano,
apresenta um tempo de semivida curto (utilizam-se estratégias, bem-sucedidas, que consistem na
fusão entre o fator IX e a Fc da IgG, a fusão entre o fator e a albumina e a peguilaçao). Em termos
de considerações farmacêuticas (forma, prazo de validade e impurezas) é igual ao anterior.

Falaremos agora do fator VIIa que se trata de uma glicoproteína com +/-57kDa e que apresenta
uma estrutura semelhante ao fator IX. É composto por dois domínios de crescimento e um domínio
catalítico. Os principais desafios na produção deste fator prendem-se com a necessidade de
carboxilações, sendo obtido por estratégias de DNA recombinante.

Um exemplo de um fator VIIa recombinante é o Eptacog alfa, liofilizado e com um prazo de validade
de aproximadamente 3 anos. É essencialmente utilizado para o tratamento de hemorragias em
doentes com anticorpos contra os fatores VIII e IX.

A doença de Von Willebrand resulta de uma deficiência/disfunção ao nível do fator de Von

Willebrans. Este fator trata-se de uma das moires proteínas em circulação e apresenta funções de
promoção de adesão entre as
plaquetas e as proteínas do vaso.
Para além disto, este fator
transporta consigo o fator VIII
protegendo-o da clearance.

Este fator pode ser obtido através de derivados do plasma humano ou técnicas de DNA
recombinante.

• Vonicog alfa;

É utilizado concomitantemente com o fator VIII para o tratamento da hemorragia em doentes com
deficiência ao nível do fator. O seu prazo de validade é de 36meses quando conservado entre 3º-
5ºC e de 12 meses quando conservado à temperatura ambiente.

Não é comercializado em Portugal.

Falaremos agora do fator XIII que se trata- de tetrâmero com duas subunidades (A e B) e é
ativado pela trombina para reforçar e estabilizar os polímeros de fibrina e contribuir para o tampão
hemostático.

Este fator só aprece originado por técnicas de DNA recombinante.

• Catridacacog;

Utilizado para o tratamento profilático

prolongado da hemorragia com
deficiência congénita da subunidade A do
fator XIII. Apresenta uma validade de 24
meses quando conservado entre 2º-8ºC.

A antitrombina trata-se de um inibidor do fator IXa, Xa, XIa e da trombina. Este composto trata-se
de uma glicoproteína de cadeia simples potenciada pela ligação à heparina e outros
glicoaminoglicados. Uma deficiência ao nível da trombina aumenta o risco de trombose.

A antitrombina apenas pode ser obtida através do plasma humano e é utilizada na profilaxia da
trombose venosa em pessoas com deficiência congénita de antitrombina.

Os agentes trombolititos são usados em casos de AVC e EAM. O primeiro agente trombolitito que
apareceu diz respeito à Estreptoquinase, um ativador de plasminogénio humano (de origem
bacteriana), apresenta uma elevada imunogenicidade o que pode por em risco uma utilização futura.

Como podemos observar

pela imagem ao lado, o
ativador do plasminogénio
humano, o domínio Finger foi
retirado, o que levou a uma
maior resistência à
degradação (maior semivida).
Não é comercializado em
Portugal.

Outros ativadores de
plasminogénio humano:

• Reteplase;
 Proteína truncada, de cadeia simples e não glicosilação, o que permite a expressão em E.Coli. Este
composto apresenta uma menor afinidade para a fibrina comparativamente com outros ativadores.
É muito resistente à degradação.

• Altepese, Tenecteplase e Reteplase;

Estes apresentam um prazo de validade de pelo menos 2 anos, quando conservados a

temperaturas inferiores a 25ºC. Apresentam impurezas.

De uma forma geral os medicamentos derivados de plasma humano são preparados a partir de
mais de 12 dádivas, no entanto, é de salientar o risco para difusão da infecciosidade.

Hemoderivados
Fração líquida do sangue Tipos
➔ O que resta depois de separados os elementos figurados ➔ Albumina e soluções de proteínas plasmáticas;
do sangue, recolhido num anticoagulante; ➔ Imunoglobulinas;
➔ O que é separado por filtração ou centrifugação contínua ➔ Fatores de coagulação e antiproteases;
do sangue, tornado incoagulável. ➔ Outras frações plasmáticas ou combinações.

Algumas das estratégias desenvolvidas para reduzir o nível de infecciosidade no sangue humano
passam pela seleção de dadores, análise de dádivas, dista de dadores, quarentena de sangue não
testado e investigação de problemas.

Falando concretamente dos dadores, existem algumas exigências em matéria de informação:

A. Informações a prestar aos candidatos a dadores de sangue;

B. Informações que devem ser prestadas pelos dadores aos serviços de sangue aquando de
cada dádiva: Identificação do dador; História clínica (extremamente importante); Assinatura
do dador (é fundamental um consentimento informado para que o seu sangue seja
utilizado.)

A dadiva em Portugal é benévola, no entanto, por exemplo nos EUA é paga e há um negócio do
sangue muito significativo à volta disso

Do ponto de vista dos critérios de elegibilidade dos dadores, é importante termos a noção que
existem vários critérios que estão definidos e que são classificados uns critérios mínimos para que
a pessoa possa ser dadora, tais como a idade (18-65 anos sendo que pode ser dador um individuo
 com mais de 65 ano se o seu médico de família atestar essa possibilidade) e o peso (acima de
50kg).

Do ponto de vista da análise que é feita sangue do dador (mais concretamente à hemoglobina)
estão definidos valores mínimos, quer para homens quer para mulheres assim como a quantidade
total de proteínas e as plaquetas.

Existem situações, em que os dadores podem ser excluídos da possibilidade de doar sangue:

Exclusão definitiva Exclusão temporária

Doenças CV graves, diabéticos insulinodependentes, portadores Febre (2 semanas), gripe (2 semanas após a sintomatologia),
de doenças malignas, comportamentos sexuais de risco e algumas infeções, transplantes, algumas cirurgias, gravidez
consumidores de drogas. (durante os primeiros 6 meses).
Não está especificado se após os 10 dias de infeção por covid
continua a dar positivo no teste de PCR é ou não condicionada
a suspensão da dádiva. A professora acha que devia ser
condicionada.

É também de salientar a importância das análises das dádivas, sendo que a cada uma é avaliado o
grupo sanguíneo e a presença das principais infeções virais (HIV, Hepatite B e Hepatite C).

Oligonucleótidos

Existe alguma investigação ao redor destes compostos, no entanto, na prática não existe muita
aplicação.

Os oligonucleoótidos são pequenas cadeias de ribo- ou desoxiribonucleótidos, RNA ou DNA, e que

tem a capacidade para se ligar ao DNA cromossomal, mRNA ou a RNA não codificante por
emparelhamento de bases. Desse emparelhamento de bases resultam as suas aplicações
terapêuticas sejam elas a edição do genoma, transcrição de genes, tradução de mRNA ou vias de
regulação do RNA

Como são obtidos? Basicamente, pegamos em pequenas cadeias de nucleótidos (DNA ou RNA) de
forma que estas interajam com o nosso alvo terapêutico. Daqui, surge outra questão, como é que
conseguimos identificar esta sequência que tem de ser de tal forma específica para interagir com
o alvo e não com outras regiões? → O conseguir da especificidade para determinado alvo
terapêutico está relacionado com facto sabermos que do ponto de vista estatístico, ao nível do
genoma aleatório, nós só temos sequências específicas de 15 a 17 bases, algo que só ocorre 1x no
genoma humano, ou seja, isto que dizer que do ponto de vista estatístico nos sabemos que 1
determinada sequência de nucleótidos de DNA ou RNA só acontece 1x no genoma humano o que
significa que se eu a identificar eu consigo dirigir para aquele alvo e não para outro.

Os efeitos terapêuticos que conseguimos obter a partir da técnica descrita passam pela ligação a
biomoléculas, alterando a sua função, e a ligação a determinados recetores específicos da célula.
Podem também existir determinados efeitos não intencionais, tais como a complementaridade
parcial com outros ácidos nucleicos e a ligação a proteínas e péptidos.

Estes oligonucleoótidos são sensíveis a reações nucleares, ou seja, são instáveis e podem ser
degradados facilmente. Outras características que também dificultam a sua utilização ou a sua
administração terapêutica têm a ver com a difícil aplicação intracelular e com as características
físico-químicas que vão condicionar a expressão e acumulação no tecido alvo, ou seja, os
oligonucleoótidos são moléculas polares pequenas cuja expressão a nível renal é muito rápida por
outro lado uma vez administrados os macrófagos do sistema imunitário facilmente.

Os oligonucleoótidos ligam-se a proteínas (aptâmeros), e podem também ligar-se a ácidos nucleicos

(Antisenso (ASO), Ribozimas, Desoxiribozimas, Sequências guia externas, indutores de tripla hélice,
siRNA, miRNA e Decoys). Os aptâmeros apresentam cadeias simples, com estrutura particular
suscetível de se ligar a moléculas com
elevada afinidade e especificidade,
geralmente apresentam ao redor de 60
nucleótidos que se envolvem numa
estrutura tridimensional bem definida:

Obtenção dos aptâmeros:

O processo é muito simples consiste em ter

um conjunto sequências de é RNA, obtidas a
partir de uma biblioteca de sequências de RNA,
e que são incubadas com nosso alvo
terapêutico em determinadas condições. Vão
ser rejeitadas aquelas sequências de RNA que
não foram capazes de se ligar ao nosso alvo
terapêutico, enquanto que as que se ligam vão
ser amplificadas por RT-PCR e vão constituir uma pool, um conjunto de RNA’s, que são capazes
de ligar ao meu alvo terapêutico. De seguida, são feitos vários círculos idênticos (8-12) até encontrar
o vencedor, ou seja, até encontrar aquele que liga melhor ao meu alvo terapêutico e aquele que
ligar melhor constitui o oligonucleotido que eu andava à procura.

Do ponto de vista dos aptâmeros terapêuticos o que temos hoje em dia são aptâmeros que
interagem com recetores, que interagem com o domínio ativo de enzimas inibindo a sua atividade,
podem também atuar por sequestro de ligandos e podem também ser utilizados em imagiologia
(apesar de não existir nenhum com esta finalidade).

• Pegaptanig;

Aptâmero modificado e conjugado com PEG. Trata-se de um Anti-VEGF e encontra-se indicado

no tratamento da degenerência macular neovascular (húmida) associada à idade.

As principais RAMs, no momento da administração, associadas a este aptâmero passam por

hemorragia (estão na origem da suspensão do mercado) e endoftalmite (reação ocular de
emergência médica).

• Pengnivacogin;

Aptâmero modificado e conjugado com PEG. Atua como inibidor do fator IXa da coagulação e
encontra-se indicado na trombose. As principais RAMs associadas à toma deste composto passam
por reações alérgicas com características comuns.

(Em Portugal, atualmente, nenhum aptâmero se encontra comercializado).

É de referir que todos os oligonucleoótidos apresentam

um antídoto fácil, a sequência contrária à sua que impede
a ligação ao alvo terapêutico. De seguida podemos
encontrar uma lista com outros aptâmeros:

Existem ainda oligonucleoótidos que interferem com a

expressão génica., sendo de destacar os Antisensos (ASO).
A imagem seguinte representa o mecanismo de ação:
 No caso do exemplo tamos a olhar para um
RNAm, o antisenso (uma pequena sequência
nucleótidos complementar de uma sequência
especifica do senso). Quando as células têm ou
quando são identificados RNAs de cadeia dupla,
estes são identificados como estranhos e
destruído → antisenso funciona assim, sempre
que um oligonucleoótidos antisenso se liga à
sua sequência complementar, neste caso do
RNA mensageiro, por um lado é bloqueada a
tradução associada aquele RNA mensageiro e a tradução da proteína e por outro lado o facto de
termos uma dupla cadeia vai levar ao recrutamento de ribonucleases H que vão destruir aquele
RNA.

No esquema também estão representados outros oligonucleoótidos que interferem com

expressão genética, as ribozimas e as DNAzimas que são RNA’s ou DNA’s que tem capacidade
enzimática, capacidade de destruir um RNA, e depois os SI RNA’s que correspondem a pequenas
sequências de RNA’s que levam ao recrutamento de complexos enzimáticos que também se ligam
em determinadas sequências de RNA e o destroem impedindo mais uma vez a tradução da
proteína. (mecanismo comum a vários tipos de oligonucleoótidos).

Moléculas de DNA ou RNA de cadeia simples, que geralmente consistem 13-25 nucleótidos A maioria atuam por
recrutamento de RNase H

Por fim, a tabela seguinte mostra alguns

antisensos que estão a ser estudados e outros
que já estão aprovados em Portugal. No nosso
caso, temos 2: o spinraza e o inotersen que
estão para alguns nichos terapêuticos.
Biossimilares

Definem-se biossimilares como medicamentos biológicos (no sentido de derivarem de uma fonte
biológica) altamente similar a outro já existente no mercado e aprovado pela EU há pelo menos 10
anos. De uma forma geral, a aprovação destes medicamentos é centralizada.

O primeiro biossimilar aprovado na EU foi em 2006. Em termos de principais características, estes

fármacos são altamente similares a um medicamento de referência (do ponto vista estruturar e de
características físico químicas), não apresentam diferenças significativas em relação a um
medicamento de referência, a sua variabilidade é mantida dentro de limites rigorosos e apresentam
normas de qualidade, segurança e eficácia rigorosas.

Tal como descrito na imagem ao lado,

existe uma variabilidade aceitável desde
que isso não comprometa a eficácia e
segurança do fármaco. A estrutura do
biossimilar e do medicamento de
referência tem de ser a mesma, no
entanto, podem existir variações ao nível
dos locais das glicosilações (tal como
acontece entre lotes dos mesmos
medicamentos de biotecnologia).

Em termos de categorias, como podemos observar na tabela seguinte, podemos ter heparinas e
biossimilares produzidos por tecnologias de DNA recombinante (proteínas). Este último grupo pode
se subdividir em fatores de crescimento, hormonas, proteínas de fusão e Ac monoclonais.

Lista de biossimilares aprovados no nosso país:

Um medicamento biossimilar não é um “genérico” de um medicamento de biotecnologia, pois
quando falamos em medicamentos genéricos, falamos de um medicamento de síntese química, na
qual conseguimos produzir outras moléculas exatamente iguais (genéricos), sem tirar nem por →
é possível “clonar”. No caso dos medicamentos de biotecnologia, nem dentro do mesmo
medicamento, mas em lotes diferentes é possível produzir o mesmo medicamento, quanto mais
entre o medicamento biotecnológico e o seu biossimilar. Para além disto, a aprovação de um
biossimilar apresenta diferenças a nível regulamentar, em comparação com um medicamento
genérico.

Falaremos agora da aprovação de biossimilares ao nível da EU. Sempre que cai a patente de um
medicamento biológico de referência e há uma determinada empresa que pretende desenvolver
e produzir um biossimilar, deve fazer um pedido de aprovação à EMA. Esta não tem poder de
decisão, mas tem o poder de emitir pareceres. Assim, o pedido é avaliado pelos vários comités
científicos da EMA, avaliando o dossier que foi submetido de forma a emitirem depois um parecer
científico. Esse parecer científico vai para a UE e é ela que aprova, tomando a decisão se entra ou
não no mercado.
Para a aprovação dos biossimilares são necessários determinados
estudos, tais como: prova de qualidade, eficácia e segurança (não
só p/ biossimilares, mas para todos no geral); estudo de qualidade
farmacêutica completo dele próprio e estudos comparativos de
qualidade (são estes estudos que comprovam a similaridade do
biossimilar com o de referência, é de referir que são muito
exaustivos).

O biossimilar é mais barato, levando a uma maior gestão dos recursos públicos. Ainda assim, continua
a ser um processo bastante moroso e dispendioso, continuando a ser considerado caro. Fica mais
barato até 20%.

Em termos de estudos de comparabilidade, estes são definidos “step

by step”, sendo que a primeira etapa se inicia nos estudos comparativos
de igualdade. Em função da informação aqui obtida, são delineados os
estudos clínicos e não clínicos comparativos. Quando se compara,
verifica-se caraterística a caraterística a sua similaridade. Quando se
observa diferenças, nos estudos não clínicos faz-se verificação se a
diferença pode causar alterações farmacodinâmicas ou toxicologias, e
só depois se não se verificar é que se passa para a etapa 3.

É de salientar que estes estudos não são esecíficos dos medicamentos biossimilares, pois já existiam
antes mesmo do seu aparecimento. Alterações maior (ao nível da dormulaçao) são aquelas que
podem, eventualmente, alterar a segurança ou a eficácia do fármaco. Também é de referir que
quanto maiores forem as diferenças entee o biossimilar e a proteína humana que ele mimetiza,
mais imunogénico pode ser.
A monitorização da segurança dos biossimilares obedece aos mesmos requisitos aplicáveis a todos
os medicamentos biológicos, nomeadamente: plano de gestão de risco (PGR), estudos de segurança
pós .autorização (podem ser solicitados pela EMA, de forma a monitorizar de forma mais apertada
as possíveis reações adversas → se este estudo foi pedido ao medicamento de referência tem,
na maioria dos casos, de cer feito no biossimilar), recolha espontânea de reações adversas e RPS
e monitorizaçao adcional.

A monitorização adicional (triângulo preto invertido) trata-se de uma ferramenta de

farmacovigilância que se aplica em substâncias ativas que entraram no mercado a partir de
2011, medicamentos biológicos (geral), medicamentos que se entenda que o seu perfil de
segurança à data de aprovaçao não é completo e todos os medicamentos com autorização
condicional (exemplo: vacinas COVID).

O aspeto crítico da segurança dos biossimilares prende-se com a rastreabilidade. É sempre

necessário saber o nome comercial do biossimilar e o qual o lote que determinado indivíduo
administrou, pois exisem variações entre os lotes que podem justificar algumas reações adversas
→ tem de nos ser permitido a traçabilidade completa do medicamento suspeito. Também é de
referir que, de uma maneira genérica, não existe identificação do lote.

Nos medicamentos medicamentos biológicos não se pode usar um ou outro, como se se tratasse
do mesmo medicamento, como ocorre entre medicamento genérico e de marca. Tem de ver
decisão positiva de intercambialidade. Esta, é tomada a nível nacional, pelas comissões de farmácia
e terapêutica., sendo de referir que o médico pode aconselhar a mudança do fármaco, no entanto,
o farmacêutico não pode.

A tabela ao lado apresenta

algumas normas orientadoras da
prescrição de medicamentos
biossimilares para determinada
patologia:
São vários os biossimilares comercializados em Portugal, as tabelas seguintes são representativas
disso mesmo:

Farmacovigilância

Define-se farmacovigilância como a ciência e atividades relacionadas com a deteção, avaliação,

compreensão e prevenção de efeitos adversos ou quaisquer outros problemas relacionados com
medicamentos. Esta faz parte daquilo que é o ato farmacêutico.

No portal RAM podem ser feitas as notificações espontâneas das RAMs, sendo que se deve sempre
adicionar determinados parâmetros, tais como a suspeita de RAM, a evoluçao da reaçao, o
medicamento causador e o ID profissional. No caso dos biossimilares é ainda importante referir a
rastreabilidade dos lotes.