Métodos Instrumentais de

Análise

Técnicas
Espectroscópicas
V
February 17, 2013

Espectroscopia de Emissão Molecular

Ana Rosa Garcia
 ESPECTROSCOPIA DE EMISSÃO MOLECULAR

Introdução
Os métodos designados de luminescência molecular mais correntes em análise
química são:

• Fluorescência
• Fosforescência
• Quimiluminescência

Em cada um destes métodos as moléculas do analito são excitadas produzindo

espécies cujo espectro de emissão pode ser utilizado em análise quantitativa.

Classificação dos tipos de

luminescência
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Bases Teóricas
Principio de Franck –Condon

Sendo o período de vibração dos núcleos (ca. 1

ps) muito superior ao tempo que dura o ato de
absorção do fotão (inferior a 1 fs), a transição
entre dois níveis eletrónicos pode representar-
se por uma linha vertical, pois a distribuição
eletrónica correspondente ao estado excitado
é atingida ainda com os núcleos praticamente
na posição inicial.

Partindo a linha vertical da posição

correspondente à distância internuclear de
equilíbrio intersetam-se vários estados
excitados vibracionais resultantes de várias
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transições possíveis.
Diagrama de energia potencial de acordo com
o principio de Franck-Codon
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Bases Teóricas
O estado eletrónico fundamental da maioria das moléculas orgânicas é um
estado singuleto, S0. Os estados eletrónicos excitados podem também ser
singuletos, Sn, ou tripletos, Tn. Os tripletos têm sempre uma energia inferior à dos
correspondentes singuletos.

______ ______

______ ______ ______

Estado Estado Estado

fundamental excitado excitado
singuleto singuleto tripleto

De acordo com as regras de seleção para as transições eletrónicas (válida tanto

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para a absorção como para a emissão), só são permitidas as transições S0  Sn e

Sn  S0, sendo proibidas as transições Tn S0 (e Tn  S0).
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Bases Teóricas

• O 1º passo de uma transição eletrónica é o processo de absorção do

qual resulta a transição entre o estado fundamental singuleto para o
estado singuleto excitado (So  Sn ), que conduz ao espectro de
absorção.

• Imediatamente após a absorção, a molécula fica num estado excitado

instável (estado de Franck-Condon), cuja energia depende da frequência
do fotão absorvido.

• Uma vez atingido o estado eletrónico excitado Sn (n  1), inicia-se

uma dinâmica de relaxação complexa, cujo termo é o retorno da
molécula ao estado eletrónico fundamental. Eventualmente, a
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molécula no estado excitado pode reagir intramolecularmente ou com

outras moléculas ou pode ainda sofrer fragmentação.

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Bases Teóricas
O Diagrama de Perrin-Jablonski mostra os processos de excitação (absorção de
radiação) e alguns processos de desexcitação (perda de energia após absorção) .

CI – conversão interna;
CIS – cruzamento intersistemas
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Bases Teóricas
Conversão Interna (CI)
(Sn  S1); (S1  S0); (Tn  T1)
Processos não
radiativos
Cruzamento intersistemas (CIS)
(S1  Tn); (T1  S0); (T1  S1)

Processos de
desexcitação Fluorescência
(S1  S0) emissão de um fotão
Tempo de vida ()  ps a ns
Processos
radiativos
Fosforescência
(T1  S0) emissão de um fotão
Tempo de vida ()  s a min
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Bases Teóricas

Se um certo número N0 de moléculas estiver inicialmente num estado

excitado esse número decrescerá com o tempo segundo uma lei exponencial

t
-

-k f t
N  N 0e  I f  I 0e

sendo  o tempo de vida ou tempo de relaxação do estado excitado, dado por

1

k f  k nr

em que kf é a constante de emissão espontânea e knr é a constante de

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decaimento não radiativo.

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Bases Teóricas

O rendimento quântico de fluorescência (f) ou de fosforescência (f) é uma

medida da quantidade de radiação que é emitida em relação ao número de
fotões que são absorvidos, ou seja, é a fração de átomos excitados que perdem o
excesso de energia por fluorescência ou fosforescência.

Nf nº de átomos que emitem

f  
N exc nº de átomos no estado excitado

nº de fotões emitidos If
f  
nº de fotões absorvidos I0
O rendimento quântico pode
variar entre 0,0 e 1,0
Nf kf
f  
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N exc k f  k p  k nr

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Espectros de excitação e de emissão

Em estudos fluorimétricos é possível efetuar dois tipos de espectros,
espectros de excitação e espectros de emissão

Espectros de Excitação  emissão fixo, variando o excitação

(correspondem a um espectro de absorção no
qual se mede a quantidade de radiação emitida
e não a transmitida).
registo emissão máximo

Espectros de Emissão  excitação fixo, variando o emissão (é determinada

a distribuição espectral da radiação emitida a
um dado excitação ).
registo excitação máximo
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Espectros de excitação e de emissão

Lei de Stokes

Quer a fluorescência, quer a

fosforescência, dão-se a partir de
estados em equilíbrio térmico
vibracional, pelo que, tal como na
absorção, o estado vibracional é quase
sempre o de menor energia.
Os estados vibracionais de chegada,
associados ao estado eletrónico
fundamental, podem ser excitados.
Assim, os espectros de emissão estão
normalmente deslocados para o
vermelho em relação à absorção.
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A fosforescência tem um espectro de

emissão a menores energias do que o
da fluorescência.
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Espectros de excitação e de emissão

Bandas de difusão de Rayleigh e de Raman

As bandas de difusão de Rayleigh e Raman resultam da

presença do solvente que na solução em análise está em
quantidade muito superior à do soluto.
São significativas quando há sobreposição elevada dos
espectros de excitação e emissão.

difusão de Rayleigh: re-emissão por moléculas

do solvente de uma fração da radiação de
excitação (ex = em).

difusão de Raman: transferência de parte da

energia da radiação para as moléculas de
solvente, sob a forma de energia vibracional. O
fotão difundido tem uma frequência menor do
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que o fotão incidente (em > ex).

 =Rayleigh - Raman  constante para um dado solvente

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Variáveis que afetam a fluorescência

Tipos de transições em fluorescência

Transições *  (energia de absorção suficiente para provocar desativação

do estado excitado por pré-dissociação ou dissociação)

Transições *  
A eficiência quântica é maior em transições
* 
Transições * n 

As transições *  têm tempos de vida mais curtos (>  ; > kf); os
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processos de desativação que competem com a fluorescência têm

uma menor probabilidade de ocorrer do que nas transições * n
(menor probabilidade de ocorrer CIS).
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Variáveis que afetam a fluorescência

Efeito da estrutura molecular
Moléculas fluorescentes
Fatores que influenciam a fluorescência

• aromaticidade (  * )
•Rigidez estrutural da molécula (anéis
aromáticos conjugados; < kCI) indole
quinolina
•Presença de halogenetos (favorece kCIS)
•Presença de elementos caracterizados por
transições n  *
Moléculas não fluorescentes

piridina furano
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tiofeno pirrole
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Variáveis que afetam a fluorescência

Efeito da estrutura molecular
Efeito dos substituintes na fluorescência do benzeno
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Efeito da rigidez molecular no f 

Fluoreno:   1 Bifenil:   0,2
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Variáveis que afetam a fluorescência

Efeito da temperatura, solvente e oxigénio dissolvido e pH

• Aumento da temperatura

> kCI
• Aumento da viscosidade do solvente
F diminui com:
• Presença de átomos pesados no solvente
> kCIS

•Presença de oxigénio dissolvido

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A intensidade de fluorescência é dependente do pH sempre que na molécula

existem substituintes com características acídicas ou básicas.

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Efeito da Concentração na
Intensidade de fluorescência

A intensidade de fluorescência (If) pode ser relacionada com a radiação absorvida

Intensidade de fotões absorvidos /área; tempo

If
I f  k ( I 0  I) k  f 
( I 0  I)
Lei de Lambert-Beer

I  I 0 .10bc
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I f  kI 0 (1  10bc )
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Efeito da Concentração na
Intensidade de fluorescência

I f  kI 0 (1  10bc )
A exponencial pode ser resolvida em série Maclaurin

I f  2,303kI 0 bc

If  k' I0c
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Representação gráfica da intensidade de

fluorescência em função da concentra-
ção do analito.
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 Na atmosfera, há dois fenómenos
caracterizados por uma emissão de
radiação no visível suficientemente
intensa para serem facilmente
observados, desde que em
condições favoráveis: as auroras
(boreais e austrais) e o brilho
difuso (airglow).
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 Aplicações
Testes Imunológicos

Os fotões emitidos
são medidos por
um fotomultipli-
cador que vai
transformar a luz
emitida em impul-
sos elétricos que
são lidos em
Ensaios imunológicos baseados “contagens” de
na potencialização da emissão fotões/s (cps). Essa
de luz visível, a partir da contagem é propor-
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cional à quantidade
dissociação de lantanídeos (ex:
de Ag presente na
ião európio - Eu3+ )
amostra.
Testes ELISA (enzime-linked immunosorbent assay)
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 Aplicações
Ensaio imunológico com revelação fluorescente (ELFA) do
virus HIV

Microscopia de fluorescência 
Micrografias de células em divisão tiradas com um microscópio de
fluorescência. Foram usados 3 fluorocromos: DAPI (emite luz azul)
para marcar cromossomas, GFP (proteína intracelular que emite luz
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verde) e rodamina (luz vermelha) para marcar microtúbulos. Para

cada fluorocromo são usados filtros específicos, dependendo do
comprimento de onda de excitação necessário.
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Reações com emissão de luz

Emissão de radiação eletromagnética sob a forma de luz, gerada por libertação de

energia numa reação química.

A + B  C* + D

C*  C + h (radiação)

Tipos de reações com emissão de luz

• Quimiluminescência  reações químicas utilizando compostos sintéticos, em

geral espécies muito oxidantes (ex. peróxidos).

• Bioluminescência  reações com emissão envolvendo organismos vivos

• Eletroquimiluminescência  a reação com emissão de radiação ocorre por

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efeito de um estímulo elétrico.

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 Reações com emissão de luz

Quimiluminescência

Análise Forense
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431 nm

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Reações com emissão de luz

Bioluminescência
Lampyris noctiluca
A luciferina é oxidada pelo
oxigénio, com mediação
da enzima luciferase,
resultando em
oxiluciferina que perde
energia, fazendo assim o
inseto emitir luz

Bathocyroe fosteri
dinoflagelados, Noctiluca
É estimado que 90% da vida abissal produz, de algum
modo, bioluminescência. A maioria da emissão de luz
proveniente desses seres pertence ao espectro de luz azul
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e verde, as cores que mais facilmente se transmitem pela

água do mar.

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Síntese final
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