Protocolos de Laboratório

Extração de DNA plasmidial – MINIPREP

Método de lise alcalina

- Transferir 1,5 mL da cultura bacteriana para um tubo de micro-centrífuga de 1,5 mL;

(por inversão, não é necessário pipetar o volume)
- Centrifugar por 3 minutos a 12.000 g (= r.c.f.)
- Descartar o sobrenadante em um frasco contendo água sanitária (frasco de descarte!);
Obs.: para um maior rendimento, caso o precipitado bacteriano tenha sido pequeno, podem ser adicionados mais 1.5 mL de cultura ao mesmo tubo e
realizar-se uma nova centrifugação!
- Suspender o precipitado bacteriano em 100 µL de tampão TE ou água
(agitar no vórtex até completa suspensão das bactérias)
- Adicionar 100 µL do Tampão de lise
- Fechar o tubo e agitar 4 a 5 vezes por suaves inversões, até a solução ficar homogênea
(a agitação suave visa minimizar a quebra do DNA genômico!);
- Aguardar até 5 minutos ou até a solução bacteriana ficar transparente e viscosa;
- Adicionar 300 µL da Solução de Neutralização
- Agitar 4 a 5 vezes por suaves inversões
(a solução deverá ficar homogênea e ocorrer à formação de um floculado branco);
- Centrifugar 5 minutos a 12.000 g;
- Transferir, por inversão, a totalidade do sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga,
(não use pipeta e tome o cuidado para também não transferir o material precipitado);
- Adicionar 2 volumes (~ 1,0 mL) de EtOH 95% (gelado ou temperatura ambiente);
- Centrifugar 15 minutos a 12.000 g
- Descartar o sobrenadante no frasco de descarte;
- Adicionar 1.0 mL de EtOH 70% e agitar 4 a 5 vezes por suaves inversões
(etapa de lavagem do precipitado de DNA para retirada de sais);
- Centrifugar por 5 minutos a 12.000 g;
- Descartar o sobrenadante e procurar retirar todo o resíduo líquido
(pode-se bater a boca do tubo invertido sobre papel-higiênico)
- Deixar secando a temperatura ambiente em sistema a vácuo;
- Solubilizar o precipitado de DNA+RNA em 50 ou100 µL de Tampão TE
Obs. Na análise do DNA plasmidial haverá a presença de RNA, que pode ser eliminado por incubação com RNAse-A 0,1 a1 mg/mL
por 15 a 30 minutos a 37º C

Soluções necessárias para a realização da técnica:

Tampão de Lise: NaOH 0,2 N :: SDS 1%
Preparar uma solução nova para cada novo procedimento!Após o uso descartar.
Para preparar 10 mL de tampão de lise adicione em 9,3 mL de H2O
200 µL de NaOH 10N, homogeneizar a solução e então adicionar
500 µL de SDS 20%
Solução de Neutralização: Acetato de potássio 3 M pH 4,8-5,3
Tampão TE (Tris-EDTA): Tris-HCl pH 8,0 10 mM, EDTA 1 mM
Versão 02_2007