SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA
NEUROSC I ENCE
O treinamento físico melhora o aprendizado de habilidades motoras por
meio da ativação seletiva de mTOR
Kai Chen 1, Yuhan Zheng 1, Ji-an Wei 1, Huan Ouyang 1, Xiaodan Huang 1, Feilong Zhang 2,
Cora SauWan Lai 3,4, Chaoran Ren 1,5,6, Kwok-Fai So 1,4,5,6 *, Li Zhang 1,6 *
O exercício físico melhora o aprendizado e a memória, mas poucas evidências in vivo foram fornecidas para ilustrar os
mecanismos moleculares. Aqui, mostramos que o exercício crônico em esteira ativa a via do alvo mecânico da rapamicina
(mTOR) no córtex motor de camundongo. Os registros ex vivo e in vivo sugerem que a ativação de mTOR leva à excitação
pós-sináptica potencializada e à atividade neuronal aumentada dos neurônios piramidais da camada 5 após o exercício, em
associação com o aumento da oligodendrogênese e mielinização axonal. O treinamento físico também aumenta a formação da
coluna dendrítica e o aprendizado motor. Juntos, os exercícios ativam a via mTOR, que é necessária para a espinogênese,
ativação neuronal e mielinização axonal, levando a um melhor aprendizado motor.
INTRODUÇÃO
O exercício físico tem efeitos benéficos nas funções mentais e cognitivas ( 1 - 4). Em particular,
agudo ( 5, 6) ou exercícios aeróbicos crônicos ( 7) melhorar a aquisição ou retenção de habilidades remodelação da rede neural, incluindo a plasticidade da coluna ( 14, 27, 28), transmissão
motoras complexas em humanos, em associação com atividades aprimoradas de regiões
cerebrais relacionadas ao motor ( 8). No entanto, o mecanismo molecular para a aprendizagem
aprimorada com exercícios permanece pouco compreendido e carece de evidências in vivo. A
maior parte do nosso conhecimento atual especifica que o treinamento físico aumenta a
expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) ( 9 - 11), que pode estabilizar as
espinhas dendríticas do córtex do camundongo para melhorar a memória de trabalho
dependente dos sentidos ( 12).
BDNF ativa potencialmente a via do alvo mecanístico da rapamicina (mTOR) ( 13), que é
camada 5 (L5PRN) no córtex motor interno do rato e potencializou a
crucial para a espinogênese ( 14), regeneração axonal ( 15), e transmissão sináptica ( 16). Além
disso, o acúmulo de evidências demonstrou a ativação da via mTOR pelo exercício
físico nos tecidos periféricos ( 17), enquanto seu papel central ainda não está claro. O
estudo neurobiológico da via mTOR, portanto, pode ajudar a elaborar mais os
mecanismos moleculares que regem os aprimoramentos de aprendizagem relacionados
ao exercício.
A memória motora pode ser adquirida e armazenada na forma de plasticidade da coluna
cortical ( 18, 19), e o processo de recuperação da memória é dependente das atividades dos
neurônios corticais, sua conexão com outras corticais ( 20) ou regiões subcorticais ( 21), além da
mielinização axonal ( 22). Entre esses processos celulares, o exercício em esteira de longo
prazo estabiliza as espinhas dendríticas do córtex do barril do camundongo ao regular o
BDNF ( 12). No entanto, o mecanismo molecular do treinamento com exercícios na rede neural
está longe de estar completo. Propomos que a via mTOR pode ser o mediador intracelular
fundamental para funções de aprendizagem aprimoradas por exercícios com base nas
seguintes razões:
1 Laboratório Conjunto de Pesquisa Internacional de Regeneração do CNS, Instituto de Regeneração do CNS de
Guangdong-Hong Kong-Macau, Universidade de Jinan, Guangzhou 510632,
PR China. 2 Universidade de Pequim, Centro de Descoberta de Drogas, Laboratório Principal de Genômica Química, Escola de
Graduação da Universidade de Pequim em Shenzhen, Shenzhen 518055, República Popular da China. 3 Escola de Ciências
Biomédicas, Faculdade de Medicina Li Ka Shing, Universidade de Hong Kong, RA de Hong Kong, República Popular da China. 4 Laboratório
Estadual de Ciência do Cérebro e Cognitiva, Faculdade de Medicina Li Ka Shing, Universidade de Hong Kong, Região Administrativa
Especial de Hong Kong, República Popular da China. 5 Centro de Co-inovação de Neurorregeneração, Universidade de Nantong,
Jiangsu 226019, República Popular da China. 6 Laboratório de Medicina Regenerativa e Saúde de Guangzhou em Guangdong,
Guangzhou 510530, República Popular da China.
* Autor correspondente. Email: hrmaskf@hku.hk (K.-FS); zhangli@jnu.edu.cn (LZ)
Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019
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Primeiro, o treinamento físico ativa o mTOR em vários tecidos periféricos ( 23) como os
músculos esqueléticos ( 24 - 26). Em segundo lugar, a ativação de mTOR medeia a
sináptica ( 29, 30), e mielinização axonal ( 31, 32). Por último, a via mTOR é necessária para
a aquisição e manutenção de paradigmas de memória, incluindo espacial ( 33, 34), social ( 35),
e funções motoras ( 36). Portanto, hipotetizamos que o exercício ativa o mTOR para
melhorar as funções de aprendizagem.
Após o treinamento físico crônico em esteira, descobrimos que a via do
mTOR foi ativada no córtex motor do rato para potencializar a sinaptogênese.
Os ensaios ex vivo e in vivo mostraram que o treinamento físico aumentou a
excitabilidade pós-sináptica e a atividade neuronal do neurônio piramidal da
mielinização axonal. Essas alterações estruturais e funcionais são dependentes
da ativação do mTOR, conforme comprovado pelo ensaio de inibição da
rapamicina. Por último, os camundongos exercitados apresentaram elevada
formação da coluna dendrítica no córtex motor e funções de aprendizagem
motora aprimoradas. Juntos, nossos achados demonstram o papel central do
mTOR na remodelação neural cortical dependente de exercício, que ajuda a
melhorar a aquisição de habilidades motoras.
RESULTADOS
O treinamento de exercício em esteira ativa mTOR e fortalece as densidades
pós-sinápticas no córtex motor-motor
Primeiro, investigamos as vias moleculares após exercícios crônicos em esteira rolante em
camundongos. Ambos os estudos humanos ( 37) e modelos de mouse ( 12) demonstraram o
envolvimento do BDNF na reorganização cortical pelo treinamento físico. Consistente com
esses resultados, o BDNF maturado e o receptor fosforilado da tirosina quinase B (Trkb)
foram regulados positivamente no córtex motor do camundongo após o treinamento em
esteira de 21 dias ( P = 0,0001 e P = 0,0398; Fig. 1, A e B). A jusante de Trkb, mTOR é
conhecido por modular a plasticidade da coluna ( 16).
Encontramos níveis elevados de fosforilação da proteína central mTOR em camundongos runner
( P = 0,0181; Fig. 1C), indicando a ativação de mTOR por exercício crônico. Como evidência
adicional, ratos corredores também tiveram
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Fig. 1. O exercício de longo prazo ativa o mTOR e facilita a formação de PSD no córtex motor do camundongo. (UMA) Bandas representativas de Western blotting usando proteína total

extratos do córtex motor. MW, peso molecular. ( B para D) Quantificação dos níveis de expressão de proteínas entre os corredores ( n = 6) ou não corredor ( n = 6) ratos. (B) Exercício
eleva o BDNF amadurecido (m-BDNF; estudante de duas amostras t teste, t 10 = 7.531, P = 0,0001), Trkb fosforilado / total (p / t) ( t 10 = 2.362, P = 0,0398), e AKT fosforilado / total ( t 10 = 3.391, P = 0,0069). (C) proteína mTOR
fosforilada / total ( t 10 = 2.281, P = 0,0181), proteína S6 ribossomal fosforilada / total ( t 10 = 2.395, P = 0,0376), e inibiu o fator de alongamento 4E-BP2 ( t 10 = 6.543, P < 0,0001) em ratos exercitados. (D) O exercício em esteira
também elevou a proteína PSD95 pós-sináptica ( t 10 = 5.012, P = 0,0005) e vesicular
proteína SNAP25 ( t 10 = 2.401, P = 0,0373). ( E) Imagens EM no córtex motor do rato. Bo, botão axonal; Sp, coluna dendrítica; setas brancas, complexo PSD. Barra de escala, 500 nm. ( F) Histograma para os comprimentos PSD entre

corredores ( n = 105 sinapses de cinco ratos) e não corredores ( n = 107 sinapses de cinco ratos). Detalhe: os comprimentos médios de PSD eram
aumentou em ratos corredores ( t 210 = 5,495, P < 0,0001). ( G) Histograma para espessura PSD. Detalhe: a espessura média de PSD foi maior no grupo de corredor ( t 210 = 5.133, P = 0,0001).
* P < 0,05, *** P < 0,001. Barras de erro, SEM.

fosforilação da proteína ribossomal S6 (p-S6; P = 0,0376) e expressões suprimidas do
fator de alongamento 4E-BP2 ( P < 0,0001; Fig. 1C). O p-S6 elevado foi posteriormente
validado pela coloração de imunohistoquímica (fig. S1). Esses dados demonstraram
coletivamente a ativação de mTOR induzida por exercício no córtex motor de
camundongo.
A via mTOR-S6 facilita a síntese de proteínas sinápticas ( 38) para potencializar as
transmissões sinápticas ( 39). Em camundongos exercitados, a densidade
pós-sináptica de 95 kDa (PSD95) e a proteína pré-sinaptosomal associada 25
(SNAP25) foram substancialmente reguladas para cima ( P = 0,0005 e P = 0,0373; Fig.
1D). Consistente com esses resultados, os comprimentos e espessuras de PSDs no
córtex motor foram aumentados em camundongos runner por estudos de microscopia
eletrônica (EM) (comprimento PSD, 515 ± 14 nm versus 409 ± 13 nm, P < 0,0001;
espessura: 73,68 ± 2,25 nm versus
A transmissão sináptica é potencializada pela ativação
mTOR induzida por exercício
Tendo observado expressões aprimoradas de proteínas sinápticas pelo treinamento de
exercício, investigamos a seguir se a transmissão sináptica também foi facilitada realizando
o registro patch-clamp de células inteiras em L5PRN de fatias cerebrais agudas (Fig. 2, A a
C). Escolhemos L5PRN como o alvo de registro devido ao seu papel como a principal saída
excitatória do córtex motor via projeções contralaterais e subcórticas para modular o
sistema motor e sua maior plasticidade espinhal dentro do tufo apical após a aprendizagem
motora ( 19). O treinamento físico elevou notavelmente a amplitude da corrente pós-sináptica
excitatória em miniatura (mEPSC), e essa potenciação dependeu da ativação de mTOR,
conforme mostrado pela injeção intraperitoneal de inibidor de mTOR rapamicina (3 mg / kg
de peso corporal, a cada 3 dias) durante os 21 paradigma de treinamento de um dia (não
corredor + solução salina, 7,8 ± 0,5 pA; corredor + solução salina, 9,5 ± 0,3 pA; não
corredor + rapamicina, 6,1 ± 0,1 pA;

59,82 ± 1,50 nm, P < 0,0001; Fig. 1, E a G). Juntos, os exercícios crônicos em
esteira ativam a via mTOR e aumentam a sinaptogênese. corredor + rapamicina, 5,2 ± 0,3pA; F 3,27 = 32,64, P < 0,0001; Fig. 2, Dto I). Nenhuma mudança
significativa, no entanto, foi encontrada nas frequências mEPSC

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Fig. 2. O treinamento físico potencializa as transmissões sinápticas por meio da ativação do mTOR. (UMA) Ilustração para gravações de células inteiras de mEPSC de L5PRN em camundongos Thy1-YFP.

( B) Diagrama esquemático para protocolos experimentais. A administração de rapamicina foi realizada a cada 3 dias durante o treinamento em esteira de 21 dias. D0, dia 0. ( C) Imagens de campo claro (esquerda) e epifluorescente (direita) de

um L5PRN rotulado com YFP para a gravação de células inteiras. ( D para G) Da esquerda para a direita, traços representativos de mEPSC extraídos de não corrediço + solução salina ( n = 8 neurônios de quatro ratos), corredor + solução salina ( n

= 7 neurônios de três remédios), não corredor + rapamicina ( n = 8 neurônios de quatro ratos), e grupos corredor + rapamicina ( n = 8 neurônios de três vezes). ( H para K) Distribuições cumulativas de amplitudes mEPSC (H) e frequências mEPSC
(J) foram traçadas. Análise quantitativa (I e K)

mostrou amplitude mEPS elevada em ratos corredores [análise de variância unilateral (ANOVA), F 3,27 = 32,64, P < 0,0001; Comparação de Tukeypost hoc, q 27 = 4,966, P = 0,0081 (I)] que foi posteriormente abolido pela rapamicina ( q 27 = 12,95, P < 0,0001).

Nenhuma mudança significativa foi encontrada nas frequências mEPSC [ q 27 = 0,7616, P = 0,9488 para não corredor + solução salina versus corredor + solução salina e q 27 = 3.112, P = 0,1487 para corredor + solução salina versus corredor +

rapamicina (K)]. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Barras de erro, SEM.

( P> 0,05; Fig. 2, J e K). Esses dados parecem indicar uma resposta pós-sináptica potencializada,
em vez de uma liberação de vesícula pré-sináptica aumentada após o exercício. Nossa infusão
de rapamicina suprimiu efetivamente a via do mTOR, como sugerido pelos níveis mais baixos de
p-S6 no córtex motor (fig. S1). O treinamento crônico em esteira, portanto, potencializa
efetivamente as transmissões sinápticas de L5PRN no córtex motor por meio da ativação de
mTOR.
A ativação do mTOR é necessária para a atividade neuronal intensificada pelo
exercício in vivo
Nós examinamos ainda se essas transmissões pós-sinápticas excitatórias potencializadas por
exercício ex vivo podem ser traduzidas em atividades neuronais in vivo. Usando o gene
precoce c-Fos e Arc como marcadores, as atividades dos neurônios piramidais nas camadas II /
III e V do córtex motor foram elevadas após o exercício de 3 semanas (c-Fos + / CaMKII +, 105
de 376 no grupo não corredor e 275 de 423 no grupo corredor, P < 0,05; Arc + / CaMKII +, 211
de 215 no grupo de corredores apenas, mas nenhum no grupo de não corredores; FIG. S2).
Para fornecer mais evidências in vivo, os camundongos receberam a transfecção mediada por
vírus adeno-associados (AAV) do indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP6s em
L5PRN do córtex motor, seguido por 21 dias de treinamento em esteira (Fig. 3, A a C). Usando
imagens transcranianas de dois fótons em camundongos acordados fixados na cabeça,
registramos os transientes de cálcio de L5PRN de tufos apicais e somas (fig. S3). As
amplitudes de pico de transientes de cálcio foram aumentadas em camundongos corredores
(dendritos apicais: não corredores, 2,0 ± 0,1, corredores, 3,2 ± 0,2; soma: não corredores +
solução salina,
3,2 ± 0,2, corredor + solução salina, 4,6 ± 0,2; tudo em • F / F 0, P < 0,0001; Fig. 3, D e E). Nenhuma
mudança significativa, no entanto, foi encontrada quando
enumerando o número total de transientes de cálcio ( P> 0,05; FIG. S4, A e B). Em
seguida, perguntamos se a ativação de mTOR também estava envolvida na atividade
neuronal induzida por exercício pela administração de rapamicina (Fig. 3B). A inibição
farmacêutica de mTOR eliminou amplitudes de pico de cálcio elevadas no exercício ( P < 0,05;
Fig. 3, D e E), mas não afetou as frequências ( P> 0,05; FIG. S4). Juntas, as gravações ex
vivo e in vivo demonstram o envolvimento do MOTOR ativado por exercício na facilitação
das transmissões sinápticas e atividades neuronais.
O treinamento físico aumenta a mielinização axonal ativando
o mTOR
A mielinização axonal é necessária para o processamento da rede neural e pode ser
conferida por excitação optogenética de neurônios piramidais corticais ( 40). Como nossa
imagem de cálcio in vivo demonstrou atividades neuronais potencializadas após o
treinamento de exercício, investigamos ainda mais o padrão de mielinização (Fig. 4, A e B).
Primeiro, a intensidade da proteína básica da mielina foi elevada nas regiões do corpo
cálido medial (CC), onde L5PRN envia suas fibras de projeção. Este aprimoramento nos
ratos exercitados também seguiu as maneiras dependentes de mTOR ( P = 0,0003; Fig. 4,
C e D). Um estudo de morfometria baseado em EM foi então realizado e encontrou
espessamento da bainha de mielina induzido por exercício, que foi enfraquecido após a
injeção de rapamicina (Fig. 4E). o g- razão, que é calculada como o perímetro axonal

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Fig. 3. O treinamento físico aumenta a atividade neuronal in vivo. (UMA) Ilustrações de registros de cálcio in vivo para dendritos apicais e somas de L5PRN. ( B) Diagrama esquemático de protocolos experimentais. Os camundongos

receberam injeção de vírus AAV-GCaMP6s antes do treinamento em esteira de 21 dias. A rapamicina foi administrada a cada 3 dias. Ao final do treinamento físico, a imagem do cálcio foi realizada. ( C) Seção coronal do córtex motor

primário de camundongo mostrando neurônios transfectados com GCaMP6s após 3 semanas. ( D) Representativo z- planos de imagem empilhados (esquerda) e traços fluorescentes de cálcio (direita) obtidos de dendritos apicais (topo) e

somas (fundo) de L5PRN. Pontas de flechas brancas,

dendrito apical ativo ou somas. ( E) Quantificação do pico de cálcio • F / F 0 valores em dendritos apicais (parte superior) e somas (parte inferior). Camundongos runner mostraram valores de pico significativamente mais elevados (dendrito apical: ANOVA de

uma via, F 3.195 = 16,89, P < 0,0001; Comparação post hoc de Tukey, q 195 = 10,58, P < 0,0001 para não corredor + solução salina versus corredor + solução salina e q 27 = 12,33, P < 0,0001 para corredor + solução salina versus corredor + rapamicina; soma: F 3.456 = 14,78,

P < 0,0001; q 456 = 8.683 e P < 0,0001 para não corredor + solução salina versus corredor + solução salina e q 456 = 12.03, P < 0,0001 para corredor + solução salina versus corredor + rapamicina). *** P < 0,001. n = 6 animais em cada grupo. Barras de erro, SEM.

divide o perímetro da bainha de mielina, também sugeriu mielinização facilitada em
camundongos exercitados (corredor + solução salina, 0,74 ± 0,07; não corredora + solução
salina, 0,82 ± 0,05; P < 0,0001; Fig. 4F). A injeção de rapamicina aboliu esse aumento da
mielinização (corredor + rapamicina,
0,87 ± 0,04; P < 0,0001 em comparação ao grupo corredor + solução salina; Fig. 4F), apoiando o
papel necessário da ativação de mTOR.
Em seguida, exploramos o mecanismo celular para a mielinização intensificada pelo
exercício. A bainha de mielina é formada por oligodendrócitos (OLs) que são diferenciados de
suas células progenitoras (OPCs). Injetamos 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) durante os
últimos 5 dias do paradigma de exercício de 21 dias para marcar células recém-formadas (Fig.
4G). Em ratos runner, encontramos mais células BrdU + na região CC ( P < 0,0001; Fig. 4,
HandI). Essas células BrdU + não eram microgliais ou astrócitos (fig.S5), mas pertenciam
principalmente à linhagem OLs na região CC (Olig2 + BrdU +;
P = 0,0058; Fig. 4, J e N) ou no córtex motor (fig. S6). Camundongos exercitados tiveram mais
OPCs (PDGFR • • BrdU +; P = 0,0002; Fig. 4, K e O] e mais OLs maturados (CC1 + BrdU +; P = 0,0008;
não-corredor: taxas de turnover, 15,1 ± 0,5% versus 10,2 ± 0,4% no dia 3, 22,1 ± 0,6% versus
Fig. 4, L e P). Esses eventos de preenchimento de OL aprimorados pelo exercício eram
dependentes da ativação de mTOR (corredor + solução salina versus corredor + rapamicina, P < 0,001
para Olig2 + BrdU +, PDGFR • • BrdU + e CC1 + BrdU +; Fig. 4, N a P).
Além disso, menos OLs recém-gerados permaneceram na fase de proliferação em
camundongos runner (Ki67 + BrdU +; P = 0,031; Fig. 4, M e Q). Juntos, o exercício em
esteira aumenta a proliferação de OPCs e promove sua diferenciação em direção a OLs
maduros para aumentar a mielinização axonal, que é dependente da ativação de mTOR.
O treinamento físico promove persistentemente a formação da coluna dendrítica
e melhora o aprendizado motor
Depois de demonstrar atividade neural aumentada e mielinização axonal em ratos exercitados,
perguntamos a seguir se a função de aprendizagem pode ser melhorada. Uma única sessão de
tarefa de aprendizagem motora induz a formação de espinhas dendríticas ( 19), que pode
constituir a base estrutural da memória motora ( 18). Assim, examinamos a formação da coluna
dendrítica de tufos L5PRNapicais usando a proteína fluorescente amarela Thhy1 (YFP) em
camundongos transgênicos durante os paradigmas de esteira (Fig. 5, A a C). O treinamento
crônico elevou persistentemente o turnover da coluna e as taxas de formação (corredor versus
14,0 ± 0,7% no dia 7,
e 30,5 ± 0,9% versus 26,5 ± 0,6% no dia 15; F 1,36 = 127,1,
P < 0,0001; Fig. 5D; taxas de formação, 10,2 ± 0,4% versus 5,0 ± 0,2%

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Fig. 4. A ativação do mTOR é necessária para a mielinização axonal intensificada pelo exercício na região do CC. (UMA) Ilustrações de L5PRMielinização axonal, que é formada por

oligodendrócitos maduros (OLs) na região CC. ( B) Diagramas esquemáticos de protocolos experimentais. Os camundongos receberam exercício por 21 dias e rapamicina ou injeção de solução salina a cada três dias. ( C) Imagens representativas da

coloração da proteína básica de ielina (MBP) na região temática CC. Barra de escala, 250 • m. ( D) Análise quantitativa de intensidades fluorescentes de MBP ( n = 4

animais em cada grupo) apresentaram nível de mielinização elevado no grupo corredor + solução salina (ANOVA de uma via, F 3,11 = 3.353, P = 0,0591; Teste post hoc de Tukey, q 11 = 8,721, P = 0,0003)

e diminuição subsequente após a inibição de mTOR ( q 11 = 8.852, P = 0,0003). AU, unidades arbitrárias. ( E) Imagens EM mostrando fibras axonais mielinizadas. Barras de escala, 500 nm. ( F) Distribuição de g- índices. O teste de Kruskal-Wallis mostrou significativamente

menor g- proporções em camundongos corredores + solução salina em comparação ao grupo não corredor + solução salina ( P < 0,0001). ( G) Ilustração esquemática

trations for the experimental design of oligodendrogenesis. Injeções diárias de 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) foram dadas durante os últimos 5 dias de treinamento físico.
( H) Imagens representativas de células incorporadas a BrdU (BrdU +) na região temática CC. Barra de escala, 200 • m. ( EU) O exercício crônico aumentou as células BrdU + ( F 3,40 = 6,727, P < 0,001;

q 40 = 7.519, P < 0,0001), e a injeção de rapamicina diminuiu significativamente as células BrdU + ( q 40 = 13,51, P < 0,0001). ( J para M) Imunocoloração dupla de células BrdU + com marcador de linhagem OL Olig2 (J), marcador de células progenitoras OL

(OPCs) PDGFR • ( K), marcador OL maduro CC1 (L) e marcador de proliferação celular Ki67 (M). Barra de escala, 50 • m. ( N para P) Quantificação

entre os grupos mostrou que o exercício aumentou o número de Olig2 + BrdU + P ( F 3,11 = 20,89, P < 0,0001; q 11 = 6.084, P = 0,0058) (N), BrdU + PDGFR • • • OPCs rotulados ( F 3,11 = 47,05,
P < 0,0001; q 11 = 9,328, P = 0,0002) (O), e BrdU + CC1 + marcado, OL maturado ( F 3,11 = 27,16, P < 0,0001; q 11 = 7,906, P = 0,0008) (P) após o exercício. A proliferação e maturação de OLs foram reduzidas pelo tratamento com rapamicina
(grupo corredor + solução salina versus corredor + rapamicina: BrdU + Olig2 +, q 11 = 10,77, P < 0,0001; BrdU + PDGFR • •• q 11 = 15,27,
P < 0,0001; BrdU + CC1 +, q 11 = 12,13, P < 0,0001). ( Q) O exercício também facilitou a diferenciação OL, conforme sugerido por menos células BrdU + Ki67 + ( F 3,11 = 14,26, P = 0,0004; q 11 = 6,655,
P = 0,0031), que não foi afetado por mTOR (grupos corredor + solução salina versus corredor + rapamicina, q 11 = 1.838, P = 0,5819). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. n = 4 animais em cada grupo. Barras de erro, SEM.

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Fig. 5. O exercício em esteira promove a formação da coluna dendrítica cortical e o aprendizado motor por meio da ativação do mTOR. (UMA) Ilustração de imagens e ratos Thy1-YFP

aviões. ( B) Diagrama esquemático de protocolos experimentais. Os camundongos receberam exercícios em esteira dos dias 0 a 15 e foram fotografados na mesma região do córtex motor primário nos dias 0, 3 e 7 ou 15. ( C) Z- imagens

empilhadas em eixos mostrando os mesmos ramos dendríticos de L5PRNs no dia 0 (primeira imagem), dia 3 (segunda imagem) e dia 7 (terceira imagem) entre camundongos corredores ou não. Pontas de flecha, espinhos eliminados; setas,

espinhos recém-formados. Barras de escala, 5 • m. ( D) Taxas gerais de rotatividade da coluna do corredor

os camundongos foram maiores do que os animais não corredores [ANOVA de duas vias ( efeito de grupo), F 1,36 = 127,1, P < 0,0001]. ( E) As taxas de formação da coluna vertebral de L5PRN foram persistentemente aumentadas em ratos corredores em comparação com

controles não corredores [ANOVA de duas vias ( efeito de grupo), F 1,36 = 184,4, P < 0,0001]. ( F) A eliminação da coluna não foi afetada [ANOVA de duas vias ( efeito de grupo),

F 1,36 = 0,5791, P = 0,4516]. ( G) Espinhas recém-formadas no dia 3 tiveram maiores taxas de sobrevivência em camundongos exercitados nos dias 7 ou 15 [ANOVA de duas vias ( efeito de grupo), F 1,24 = 79,33, P < 0,0001]. ( H) Protocolos experimentais e ( EU)
imagens representativas de EM mostrando complexos pré e pós-sinápticos (na cor rosa) no córtex motor. Barras de escala, 2 • m. ( J) Histo-

grama mostrou mais sinapses em ratos corredores (estudante de duas amostras t teste, t 58 = 5.791, P < 0,001). ( K) Ilustração esquemática estudando o efeito do mTOR na espinogênese. A rapamicina foi aplicada diariamente durante 3 dias entre imagens

repetidas. ( EU) O tratamento com rapamicina reduziu significativamente a formação da coluna vertebral induzida por exercício (ANOVA unilateral,

F 3,18 = 15,75, P < 0,0001; Teste post hoc de Tukey, q 18 = 6.234, P = 0,0018). ( M) A eliminação das espinhas não foi afetada ( F 3,18 = 1.508, P = 0,2465). ( N) Projetos experimentais de rotarodensaio acelerado. ( O) Desempenhos motores semelhantes no
dia 1 (não corredor + solução salina, n = 8; corredor + solução salina, n = 8; não corredor + rapamicina, n = 9; corredor + rapamicina, n = 8).

( P e Q) Melhorias no desempenho motor (em porcentagem) nos dias 2 e 3. O exercício melhorou significativamente o aprendizado motor que foi abolido pela injeção de rapamicina
(dia 2: ANOVA unilateral, F 3,28 = 7,43, P = 0,0008; Teste post hoc de Tukey, q 28 = 4,70, P < 0,05; dia 3: F 3,28 = 10,64, P < 0,0001; q 28 = 3,88, P < 0,05). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001. Barras de erro, SEM.

Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019 6 de 11

SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA
no dia 3, 12,6 ± 0,5% versus 6,3 ± 0,7% no dia 7, e 15,1 ± 0,5%
versus 10,5 ± 0,6% no dia 15; F 1,36 = 184,1, P < 0,0001; Fig. 5E). o
a taxa de eliminação da coluna, no entanto, não foi afetada ( F 1,36 = 0,5791,
P = 0,4516; Fig. 5F). Consistente com nossas descobertas anteriores em barril
córtex ( 12), o exercício físico aumentou a taxa de sobrevivência de espinhas recém-formadas
no dia 3 no córtex motor (corredor versus não corredor,
75,9 ± 3,5% versus 45,0 ± 4,6% no dia 7 e 62,4 ± 3,1% versus
31,3 ± 2,1% no dia 15; F 1,24 = 79,33, P < 0,0001; Fig. 5G). Por exame EM, também
encontramos densidades de sinapses elevadas no motor
córtex de ratos exercitados ( t 58 = 5.791, P < 0,0001; Fig. 5, I e J). Em resumo, o
treinamento físico facilita a formação da coluna dendrítica
ção do córtex motor. A via mTOR pode regular a espinogênese tanto in vitro ( 41) e in vivo
( 14), e, portanto, examinamos o papel do mTOR na formação da coluna induzida pelo
exercício. Após a injeção diária de rapamicina durante o exercício em esteira de 3 dias
(Fig. 5K), abolimos totalmente a formação da coluna vertebral aprimorada pelo exercício
sem sacrificar o nível basal de espinogênese (nonrunner + solução salina,
5,2 ± 0,4%; não corredor + rapamicina, 5,3 ± 0,6%; corredor, 9,5 ± 0,5%;
corredor + rapamicina, 6,4 ± 0,6%; F 3,18 = 15,75, P < 0,0001; Fig. 5L). Nenhum efeito foi
observado nas taxas de eliminação da coluna (Fig. 5M). Estes
dados sugeriram coletivamente que o exercício crônico ativa o mTOR para facilitar a
formação de uma nova coluna no córtex motor.
O aprendizado de habilidades motoras pode ser melhorado por meio da formação de
coluna aprimorada ( 42), atividade da rede cortical ( 43), e mielinização axonal ( 22), todos os quais
foram observados em camundongos exercitados. Assim, perguntamos se o treinamento físico
ajuda a melhorar a função de aprendizagem motora usando o teste de aceleração do rotarod
(Fig. 5N). Desempenhos semelhantes na primeira sessão de teste (Fig. 5O) sugeriram efeitos
mínimos da força muscular que também podem ser aumentados pelo exercício. Com o
treinamento repetido, os ratos exercitados mostraram melhores aquisições, conforme indicado
por maiores percentagens de melhorias de desempenho (corredor versus não corredor, 63,3 ±
8,3% versus
29,5 ± 5,3% no dia 2 e 78,8 ± 9,1% versus 44,5 ± 5,6% no dia 3;
q 28 = 4,94 e 5,32 para os dias 2 e 3, respectivamente, P < 0,01; Fig. 5, P e Q). O ensaio altamente dinâmico que pode ser potencializado por atividades neuronais em camundongos
de inibição da rapamicina demonstrou ainda que
a ativação do mTOR é necessária para este aprendizado motor aprimorado por exercício
(corredor + rapamicina, 30,0 ± 4,0% no dia 2 e 52,9 ± 4,0%
no dia 3; q 28 = 4,70 e 3,89 comparando entre os grupos corredor + rapamicina e corredor +
solução salina nos dias 2 e 3, respectivamente, P < 0,05;
Fig. 5, P e Q). Juntos, o treinamento físico crônico ativa a via mTOR para induzir a
remodelação do córtex motor, incluindo aumento da espinogênese e transmissões
sinápticas, atividades neuronais potencializadas e aumento da mielinização axonal,
todos contribuindo ainda mais para melhores funções de aprendizagem motora.
DISCUSSÃO
O estudo atual, até onde sabemos, fornece a primeira evidência in vivo mostrando
que o treinamento físico melhora o aprendizado de habilidades motoras via
espinogênese dependente de mTOR, atividade neuronal e mielinização axonal.
Apesar de dezenas de estudos relatando os efeitos benéficos do exercício nas
funções de aprendizagem e memória, pouco se sabe sobre sua base molecular
além do modelo BDNF. Nossos resultados, portanto, identificam uma via
intracelular crítica para a mediação de funções cognitivas do exercício e abordam a
questão de longa data para o papel do mTOR nas adaptações estruturais e
funcionais das redes neurais em resposta ao exercício ( 44). Achados anteriores
apoiaram a melhora da neurogênese e espinogênese hipocampal pela corrida
voluntária
Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019
( 45) e aumento da sobrevivência da coluna vertebral no córtex do barril de camundongo após
o exercício em esteira ( 12). Os dados atuais ampliam nosso entendimento sobre os efeitos
centrais do exercício, o que leva à remodelação neural que cobre espinhas ou sinapses,
somas neuronais e axônios. Essas melhorias estruturais e funcionais ajudam a explicar a
melhora no aprendizado após o treinamento físico.
Obtivemos amplitudes mEPSC mais altas, mas frequências inalteradas de L5PRN no
córtex motor de camundongos exercitados, indicando maior transmissão pós-sináptica em vez
de liberação de vesícula pré-sináptica. Esses dados são consistentes com transientes de cálcio
mais fortes de L5PRN em camundongos acordados por gravações in vivo. Essas transmissões
neurais aprimoradas têm uma base estrutural, incluindo a síntese elevada da proteína
pós-sináptica PSD95. Embora a proteína pré-sináptica SNAP25 também tenha sido
modestamente elevada pelo treinamento de exercício, nenhuma mudança foi encontrada na
sinaptofisina (Fig. 1D), que é crítica para a liberação da vesícula pré-sináptica ( 46). A
transmissão sináptica melhorada foi posteriormente substanciada pelo estudo EM, que
mostrou alongamento e espessamento dos complexos PSD (Fig. 1, E toG). Essas alternâncias
estruturais induzidas pelo exercício ajudam a facilitar a transmissão pós-sináptica excitatória
via ativação mTOR. Também concorda com o conhecimento anterior que mostra a facilitação
Baixado de http://advances.sciencemag.org/ em 7 de fevereiro de 2021
da síntese de proteína sináptica pela ativação de mTOR-S6 ( 38), resultando em transmissões
sinápticas potencializadas ( 39). Visto que tanto as transmissões sinápticas melhoradas quanto
as atividades neuronais beneficiam a aquisição de habilidades motoras complexas ( 43, 47), nossos
estudos sugerem fortemente a facilitação das aquisições de memória motora pelo treinamento
de exercícios via atividades neurais mediadas por mTOR.
Além de aumentar as transmissões sinápticas e as atividades neuronais, o exercício em
esteira de longa duração também facilita a mielinização axonal nas regiões CC, onde a maioria
dos L5PRN forma fibras eferentes. Embora a mielinização melhorada possa limitar o
crescimento axonal durante o período crítico de desenvolvimento para prejudicar a plasticidade
neural ( 48), foi relatado que a mielinização aumentada em adultos melhora as funções de
aprendizagem motora ( 22). Descobertas recentes sugerem que a mielinização é um processo
adultos ( 49). Portanto, a mielinização induzida por exercício neste estudo é provavelmente
causada por atividades neuronais aumentadas por mTOR. Uma explicação alternativa também
existe, uma vez que a ativação de mTOR facilita a proliferação e diferenciação de OPCs para
aumentar a mielinização axonal ( 31, 32, 50). Nossos estudos de linhagem celular apoiam
parcialmente este modelo, uma vez que o treinamento de resistência facilita a proliferação e
diferenciação de OPCs de novo que são dependentes da ativação de mTOR. Uma questão
permanece sobre o mecanismo que rege a proliferação de OPCs induzida por exercício, que
pode ser causada pela atividade aumentada dos neurônios como em achados anteriores ( 40), ou
a regulação autônoma da célula por mTOR em OPCs. A privação específica da célula da
atividade de mTOR pode resolver esse problema no futuro. Nota-se ainda que a superativação
de mTOR em Tsc1 camundongos knockout de gene leva à hipomielinização ( 51). Embora
aparentemente contraditório com nossas observações mostrando ativação de mTOR ativada por
exercício para aumento da mielinização, esses dados destacam o papel fundamental de manter
a atividade de mTOR dentro dos intervalos fisiológicos normais para mielinização axonal.
Camundongos corredores + rapamicina apresentaram atividades neuronais ainda
mais baixas (Figs. 2I e 3E) e pior oligodendrogênese (Fig. 4, I a P) em comparação com
animais não corredores + rapamicina. Esta diferença sugere que o exercício pode não
ativar diretamente a via mTOR de uma maneira direta. Estudos acumulados mostraram
que o mTOR funciona como um "sensor de energia" e pode ser ativado em
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SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA
taxas metabólicas das células ( 52). Assim, examinamos o nível de proteína quinase ativada
com 5′-monofosfato de adenosina fosforilada (p-AMPK), que é um marcador sensível para os
requisitos de energia celular ( 53). Apenas camundongos runner + rapamicina apresentaram
maiores níveis de p-AMPK em comparação aos outros três grupos (fig. S7, A e B). Esta
evidência apóia que o exercício aumenta a necessidade de energia, que é
subsequentemente satisfeita pela ativação do mTOR [fig. S7C, cenário (i)], e a inibição
adicional de mTOR pela rapamicina leva ao fornecimento insuficiente de energia nos tecidos
cerebrais exercitados, causando atividades celulares prejudicadas [fig. S7C, cenário (ii)].
Além disso, a fosforilação AMPK pode suprimir ainda mais a via mTOR ( 53), exercendo assim
efeitos sinérgicos com a rapamicina para regular negativamente as atividades celulares. Por
último, camundongos não corredores + rapamicina exibiram atividade celular normal ou
oligodendrogênese porque a ativação de mTOR não é necessária sob necessidades de
baixa energia [fig. S7C, cenário (iii)]. Este modelo de feedback de ativação de exercício de
mTOR suporta seus papéis sob estresse metabólico dos tecidos cerebrais, semelhantes aos
dos órgãos periféricos ( 54).
A aprendizagem motora em cérebros adultos está associada com a plasticidade da coluna cortical
( 19), que pode ser prejudicado por glicocorticóides ou estresse fisicamente contido, causando perda de
memória ( 55, 56), e pode ser melhorado pelo enriquecimento do ambiente ( 56) ou exercícios físicos ( 12). ensaios de imagem da coluna.
No córtex motor, uma única sessão de aprendizagem motora estimula rapidamente a espinogênese ( 57),
que estabelece a base estrutural para consolidações de memória motora ( 18). Nossos dados sugerem
que as espinhas dendríticas podem ser geradas e mantidas durante o treinamento de exercício. Esta
formação de coluna induzida por exercício é diferente de fenótipos relatados anteriormente após
aprendizagem motora de curto prazo, como sendo interpretada a partir de dois aspectos: Primeiro, a
aprendizagem de rotarod pode induzir formações de coluna específicas de ramos ( 57),
enquanto nossos ratos exercitados não apresentaram padrões de espinogênese dependentes de
ramos. Em segundo lugar, a maioria dos espinhos recém-formados induzidos pela aprendizagem
motora desapareceu em alguns dias ( 58), enquanto a espinogênese associada ao exercício pode
ser mantida por até 14 dias. Assim, argumentamos que o exercício físico promove a espinogênese
do córtex motor de forma mais persistente e ampliada. Estudos mecanísticos mostraram que a
ativação de mTOR é necessária para a formação da coluna mediada pelo exercício, mas não para
os níveis basais de formação da coluna ou manutenção (Fig. 5, MandN). Nossos dados, portanto,
estabelecem o papel necessário de mTOR na espinogênese promovida por exercícios, que fornece
a base estrutural para o aprendizado motor aprimorado. No entanto, a modulação do treinamento
de exercício em diferentes subtipos de neurônios corticais além do L5PRN não é investigada aqui e
pode fornecer mais informações para a remodelação neural induzida por exercício.
Em resumo, o exercício ativa o mTOR para melhorar o aprendizado de habilidades
motoras, o que pode ser atribuído ao aumento da espinogênese, transmissões sinápticas,
atividades neuronais e mielinizações axonais. A ativação do mTOR é necessária para a
remodelação neural cortical e melhora o aprendizado motor sob paradigmas de exercício.
Pode-se esperar que a ativação do mTOR direcione as melhorias induzidas pelo exercício de
outros paradigmas de aprendizagem e memória. Nossos resultados coletivamente estabelecem
o papel central da via mTOR para as adaptações da rede neural aos exercícios e fornecem
mais evidências para a intervenção clínica de doenças psiquiátricas e déficits cognitivos usando
o treinamento físico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Design experimental
Camundongos machos C57BL / 6J (4 semanas de idade) foram adquiridos em Guangdong
Medical Laboratory Animal Center e foram usados para Western Bioscience, China) foi lentamente injetado na camada V (500 a 700 • m
Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019
blotting, registro de cálcio in vivo, ensaio de incorporação de BrdU e ensaios comportamentais.
Camundongos transgênicos Thy1-YFP machos (4 semanas de idade) foram obtidos no
Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) e foram criados em casa. Camundongos Thy1-YFP
foram usados para imagens da coluna dendrítica in vivo e gravação de patch-clamp. O exato n
número para cada experimento foi especificado em resultados relevantes ou seções de
legenda de figura. Todos os animais foram alojados em grupo sob ciclo claro-escuro normal
com comida e água ad libitum. Todos os protocolos experimentais com animais foram
pré-aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais da Universidade de Jinan, de
acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional para pesquisa
animal.
O exercício em esteira foi realizado conforme descrito anteriormente ( 12). Um aparelho de
esteira de seis canais (Modelo JD-PT, Jide Instruments, Shanghai, China) foi adotado (12 m /
min, 1 hora por dia, por 3 semanas, a menos que especificado de outra forma). Camundongos
de controle (não corredores) foram colocados no dispositivo de esteira fixa por 1 hora dentro do
mesmo ambiente. Após 21 dias de treinamento em esteira, os animais foram sacrificados para
ensaios posteriores. Para imagens da coluna vertebral in vivo, os animais Thy1-YFP receberam
a primeira imagem antes do início do exercício e foram refeitos no dia 3, 7 ou 14 do exercício. A
Baixado de http://advances.sciencemag.org/ em 7 de fevereiro de 2021
administração de rapamicina (3 mg / kg de peso corporal) foi realizada a cada 3 dias durante o
treinamento de exercício , ou a cada dia dentro do treinamento em esteira de 3 dias para
Western blotting
Os lisados de tecido foram extraídos do córtex motor primário de camundongo em
tampão de ensaio de radioimunoprecipitação contendo inibidores de protease e fosfatase.
Após quantificação usando kit de ácido bicinconínico (Beyotime, Shanghai, China), 10 • g de
amostras de proteínas foram separadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida sob
90 mA por 90 min e foram transferidas para a membrana de fluoreto de polivinilideno a 200
V por 30 min. Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Tween
20 e bloqueio em 5% de serumalbumina bovina (BSA), a membrana foi incubada com o
anticorpo primário (tabela S1) a 4 ° C durante a noite. A membrana foi lavada e incubada
em anticorpo secundário (tabela S1) por 2 horas. Bandas de proteínas foram visualizadas
usando um sistema de imagem (Bio-Rad, Hercules, EUA). Os valores de cinza integrados
de cada banda foram medidos usando ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda,
EUA).
Coloração de imunofluorescência
Os camundongos foram sacrificados com isoflurano e foram perfundidos com para-formaldeído.
Tecidos cerebrais inteiros foram desidratados com sacarose a 30% durante a noite e foram
seccionados em 40 • fatias circulares usando um micrótomo deslizante (Leica, Alemanha). Após
a lavagem com PBS e bloqueio de BSA, as fatias de cérebro foram incubadas com o anticorpo
primário a 4 ° C por 48 horas, seguido pelo anticorpo secundário (tabela S1). As imagens foram
capturadas com um microscópio confocal (ZEISS, Alemanha), e a intensidade fluorescente foi
analisada usando ImageJ.
Injeção de vírus e imagem in vivo de cálcio de dois fótons
Os camundongos foram anestesiados com 1,25% de Avertin. Após esterilização local e
incisão da pele da cabeça, o córtex motor primário (1,0 mm posterior e 1,5 mm lateral de
Bregma) foi localizado sob um instrumento estereotáxico (RWD Life Science Inc., China).
Depois de perfurar um orifício pela microdrill de alta velocidade, 0,1 • l de AAV sorotipo 2/9
carregando o indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP6s sob o promotor
hSyn (título viral,> 1 × 10 13 cópias do genoma / ml; Taitool
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SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA
da pia) usando uma micropipeta de vidro conectada a uma bomba de injeção
ultra-micro (Nanoliter 2010, World Precision Instruments, Sarasota, EUA). A
micropipeta foi retida por 10 min antes da retração. A pele da cabeça foi fechada
para monitor pós-operatório. A imagem do cálcio foi realizada 21 dias depois.
O registro de cálcio in vivo foi realizado conforme descrito anteriormente ( 59). Resumidamente,
a pele da cabeça e o crânio cobrindo o córtex motor foram removidos para criar uma janela
de imagem (2 mm / 2 mm), que foi coberta por uma lamela de vidro. As atividades de
cálcio dos dendritos apicais (0 a 60 • m da pia) e somas da camada V (500 a 600 • m de
profundidade) foram registrados a 2 Hz com uma objetiva imersa em água (20 ×, abertura
numérica de 1,1; ZEISS) durante um período de 2,5 min em um microscópio de dois fótons
LSM780 (ZEISS, Alemanha). Durante a imagem, o laser foi ajustado para 920 nm e a
potência do laser foi restrita abaixo de 25 mW.
As imagens de séries temporais adquiridas foram corrigidas pelo módulo TurboReg da
ImageJ. O valor fluorescente F foi quantificado pela média de pixels extraídos da região
projetada de interesse cobrindo identificáveis
soma ou dendrito apical com> 30 • m de comprimento. O ∆ F / F 0 foi
calculado como ( F - F 0) / F 0, onde o F 0 foi a média F valores durante o primeiro período de registro
de 10% como o nível basal. Um transiente de cálcio
foi definido quando o ∆ F / F 0 é maior do que três vezes o SDs.
Imagem da coluna dendrítica
A imagem in vivo das espinhas dendríticas foi realizada através da criação de uma janela de
imagem de crânio fino, conforme descrito anteriormente ( 60). Resumidamente, camundongos
Thy1-YFP machos foram anestesiados e o crânio foi exposto pela incisão da pele da cabeça. O
córtex motor primário foi identificado como mencionado acima, e uma janela de imagem circular foi
criada por uma micro-broca de alta velocidade. Imagens de espinhas dendríticas apicais foram
capturadas em excitação a laser de 920 nm. Ambos com baixa ampliação z-
A imagem da pilha e o mapa de distribuição vascular foram gravados para reimpressão. Cerca
de sete de alta ampliação z- empilhar imagens (zoom digital 4 ×, 0,75- • intervalo m, 1024 × 1024
pixels) foram obtidos para quantificação de espinhos dendríticos. Após a imagem, os
camundongos foram devolvidos à sua própria casa para recuperação até a nova imagem.
A análise da coluna dendrítica seguiu publicação anterior ( 42).
Resumidamente, as imagens de empilhamento adquiridas foram projetadas em um único
plano com um ou mais dendritos com relação sinal-ruído> 3. O mesmo segmento dendrítico
em diferentes pontos de tempo foi comparado para a formação da coluna e taxas de
eliminação, que são baseadas no número total da coluna na primeira imagem. Todas as
medições geométricas e enumerações da coluna foram realizadas usando ImageJ.
Gravação de patch-clamp de célula inteira
Camundongos machos Thy1-YFP foram profundamente anestesiados com isoflurano. Os tecidos
cerebrais foram extraídos e dissecados em 250 • m fatias coronais em um Vibratome (Leica,
Alemanha). Fatias corticais foram incubadas em líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado
(aCSF; consistindo em 119 mM
NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, Glicose 11 mM, 26,2 mM
NaHCO 3, CaCl 2,5 mM 2, e 1,3 mM de MgCl 2) por 1 hora de recuperação e foram
transferidos para a câmara de registro com
perfusão de aCSF oxigenado contendo 1 • Tetrodotoxina M.
O registro de células inteiras foi realizado em L5PRN cortical conforme indicado por sinais YFP
usando um microscópio de epifluorescência (Olympus, Japão). Uma pipeta de vidro (resistência de 3 a 5
megohm) foi preenchida com solução interna
ções [135 mM CsMeSO 3, 8 mMNaCl, 10 mMNa 2- fosfocreatina,
0,25 mM de EGTA, 2,17 mM de Mg-adenosina 5′-trifosfato, 0,34 mM
N / D 3 –Guanosina 5′-trifosfato e Hepes 10 mM (pH 7,4) com
Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019
CsOH]. Os neurônios foram bloqueados em −70 e 0 mV para registro de mEPSCs excitatórios
em miniatura. Os traços foram coletados por um amplificador MultiClamp 700B (Molecular
Devices, EUA), filtrados a 4 kHz e digitalizados a 10 kHz (Digidata 1550A, Molecular Devices,
EUA). Os eventos foram analisados por Clampfit 10.0 (Molecular Devices, EUA).
Microscópio eletrônico
EM foi realizado conforme descrito anteriormente ( 61). Resumidamente, os tecidos cerebrais de
camundongos foram bloqueados no reagente fixador (G1102, Service-bio) a 4 ° C por 2 horas
e foram pós-fixados com tetróxido de ósmio a 1% por 2 horas. Os tecidos foram desidratados
em soluções graduadas de etanol (50 a 100% e duas vezes de acetona, 15 minutos cada) e
foram incluídos em EMbed 812 (90529-77-4, Structure Probe Inc., West Chester, EUA) a 60 °
C por 48 horas. Os tecidos cerebrais foram preparados em fatias ultrafinas (60 a 80 nm) com
um ultramicrótomo (Leica EMUC7, Leica). As fatias foram coradas com acetato de uranila em
etanol puro por 15 min, em citrato de chumbo por 15 min e secas ao ar. As imagens foram
capturadas com um microscópio eletrônico de transmissão (Hitachi, Japão). A densidade da
sinapse e a mielinização axonal foram contadas sob a ampliação de 13.500 ×, o comprimento
e a espessura pós-sináptica (PSD) foram calculados sob a ampliação de 46.000 × por ImageJ.
Baixado de http://advances.sciencemag.org/ em 7 de fevereiro de 2021
Comportamento de aprendizagem motora
A habilidade de aprendizagem motora foi avaliada por um rotarod acelerador (Ugo
Basile, Comerio, Itália), que iniciou a 5 rpm e acelerou até 80 rpm em 5min. Cada rato
recebeu três sessões de treinamento às 9h00, com cada sessão em um dos três dias
consecutivos.
Análise estatística
Todos os dados foram apresentados como médias ± SEM. Aluno de duas amostras
t teste, análise de variância unilateral (ANOVA) e teste post hoc de Tukey foram usados para
comparar diferenças entre dois ou múltiplos grupos, respectivamente. Para duas variáveis
independentes, ANOVA de dois fatores e comparação post hoc de Bonferroni foram adotadas.
Para comparação de
g- razões, o teste de Kruskal-Wallis foi adotado devido à distribuição não gaussiana dos
dados da amostra. Um nível significativo foi definido quando
P < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas por GraphPad Prism
7.0 (La Jolla, CA, EUA).
MATERIAIS COMPLEMENTARES
O material suplementar para este artigo está disponível em http://advances.sciencemag.org/cgi/ content / full / 5/7 /
eaaw1888 / DC1
Fig. S1. Proteína ribossômica S6 ativada por exercício no córtex motor.
Fig. S2. Atividade neuronal induzida por exercício de neurônios piramidais corticais. Fig. S3.
Dinâmica do pico de cálcio do tufo apical e soma de L5PRN. Fig. S4. Transientes de cálcio de
L5PRN.
Fig. S5. Subtipagem de células BrdU + na região CC.
Fig. S6. Marcação por imunofluorescência de BrdU e Olig2 no córtex motor de camundongo após o exercício. Fig. S7. Necessidade de
energia das células em exercício.
Tabela S1. Anticorpo primário e secundário usado em Western blotting e coloração de imunofluorescência.
REFERÊNCIAS E NOTAS
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9 de 11
SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA

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12 K. Chen, L. Zhang, M. Tan, CSW Lai, A. Li, C. Ren, K.-F. Assim, o exercício em esteira suprimiu a eliminação da coluna dendrítica O polimorfismo val66met está associado à plasticidade dependente da experiência modificada no córtex motor

induzida pelo estresse no córtex do barril do camundongo e melhorou a memória de trabalho por meio da via BDNF / TrkB. Tradução humano. Nat. Neurosci. 9, 735–737 (2006).

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SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA

56 C.-C. Chen, J. Lu, R. Yang, JB Ding, Y. Zuo, A ativação seletiva de interneurônios de parvalbumina impede a perda de sinapse
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57 G. Yang, CSW Lai, J. Cichon, L. Ma, W. Li, W.-B. Gan, o sono promove a formação específica de ramo de espinhos
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M. Hübener, T. Keck, G. Knott, W.-C. Lee, R. Mostany, TD Mrsic-Flogel, E. Nedivi,
C. Portera-Cailliau, K. Svoboda, JT Trachtenberg, L. Wilbrecht, Imagens de alta resolução de longo prazo no
(Peking University Shenzhen Graduate School) para a técnica de imagem de cálcio.
Financiamento: Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China
(2016YFC1306702) para K.-FS e LZ, Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31500842 e 81771455) para LZ e
K.-FS, respectivamente, e Fundação de Ciência Natural de Guangdong (2016A030313082) para LZ Contribuições do
autor: KC e LZ elaboraram o plano de pesquisa. KC, YZ, J.-aW e HO realizaram todos os experimentos. XH realizou
registros eletrofisiológicos. FZ participou do ensaio de registro de cálcio. LZ e KC escreveram o manuscrito. K.-FS, CSWL
e CR revisaram o manuscrito. LZ e K.-FS supervisionaram todos os experimentos. Interesses competitivos: Os autores
declaram não ter interesses conflitantes. Disponibilidade de dados e materiais: Todos os dados necessários para avaliar
o artigo estão presentes no artigo e / ou nos Materiais Suplementares. Dados adicionais relacionados a este artigo podem
ser solicitados aos autores correspondentes.

neocórtex de camundongo através de uma janela craniana crônica.

Nat. Protoc. 4, 1128–1144 (2009).

60 CSW Lai, TF Franke, W.-B. Gan, efeitos opostos do condicionamento do medo e extinção na remodelação da coluna Enviado em 27 de novembro de 2018 Aceito em

dendrítica. Natureza 483, 87–91 (2012). 23 de maio de 2019

61 J. Feng, Y. Xu, M. Wang, Y. Ruan, K.-F. Assim, F. Tissir, A. Goffinet, L. Zhou, A role for atypical cadherin Celsr3 na Publicado em 3 de julho de 2019

maturação e conectividade do hipocampo. J. Neurosci. 32, 10.1126 / sciadv.aaw1888

13729–13743 (2012).

Citação: K. Chen, Y. Zheng, J.-a. Wei, H. Ouyang, X. Huang, F. Zhang, CSW Lai, C. Ren, K.-F. Assim,

Agradecimentos: Agradecemos a W. Gan (New York University) pela sugestão e ajuda neste estudo e na revisão do L. Zhang, O treinamento físico melhora o aprendizado de habilidades motoras por meio da ativação seletiva de mTOR.

manuscrito; A. Li (Jinan University) para ensaios moleculares; e Y. Bai Sci. Adv. 5, eaaw1888 (2019).

Baixado de http://advances.sciencemag.org/ em 7 de fevereiro de 2021

Chen et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaaw1888 3 de julho de 2019 11 de 11

O treinamento físico melhora o aprendizado de habilidades motoras por meio da ativação seletiva de mTOR

Kai Chen, Yuhan Zheng, Ji-an Wei, Huan Ouyang, Xiaodan Huang, Feilong Zhang, Cora Sau Wan Lai, Chaoran Ren, Kwok-Fai So e Li Zhang

Sci Adv 5 ( 7), eaaw1888. DOI: 10.1126

/ sciadv.aaw1888

Baixado de http://advances.sciencemag.org/ em 7 de fevereiro de 2021

FERRAMENTAS DE ARTIGO
http://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaaw1888

SUPLEMENTAR http://advances.sciencemag.org/content/suppl/2019/07/01/5.7.eaaw1888.DC1
MATERIAIS

RELACIONADO
http://stke.sciencemag.org/content/sigtrans/12/594/eaau1468.full
CONTEÚDO

REFERÊNCIAS Este artigo cita 60 artigos, 15 dos quais você pode acessar gratuitamente
http://advances.sciencemag.org/content/5/7/eaaw1888#BIBL

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