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Artigos
Científicos
Índice
ARTIGO 1
Os radicais livres e o dano muscular produzido pelo exercício:
papel dos antioxidantes
ARTIGO 2
Glutationa - Envolvimento em defesa antioxidante, regulação
de morte celular programada e destoxificação de drogas
ARTIGO 3
Effect of single and combined supply of glutamine, glycine,
N-acetylcysteine, and R,S-a-lipoic acid on glutathione content
of myelomonocytic cells
ARTIGO 4
Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores
modulatórios
Artigo 1
ARTIGO
DE REVISÃO
Archivos de Medicina del Deporte
Os radicais livres e o dano muscular produzido

pelo exercício: papel dos antioxidantes
Alfredo Córdova e Francisco J. Navas
Departamento de Fisiologia e Bioquímica. E.U. Fisioterapia da Universidade de Soria – Espanha
RESUMO bico), junto com minerais como o zinco (Zn), atuam como
agentes protetores antioxidantes.
O exercício físico intenso e contínuo é acompanhado pela
produção de radicais livres, que provocam uma alteração Palavras-chave: Antioxidantes. Ácido ascórbico. Beta-carotenos.
das membranas celulares, o que causa uma lesão acompa- CK. Exercício. LDH. Mioglobina. Tocoferol. Trei-
nhada por um processo inflamatório ao nível das fibras namento.
musculares. Várias causas foram sugeridas para estas alte-
rações, entre as quais o alto grau de estresse provocado
INTRODUÇÃO
pelo exercício, alterações da microcirculação, produção de
metabólitos tóxicos e depleção intramuscular dos substra- O oxigênio, no processo de respiração celular, é utiliza-
tos energéticos. do no interior das mitocôndrias, onde intervém no metabo-
O rápido desenvolvimento da lesão das fibras muscula- lismo de gorduras, proteínas e carboidratos, liberando-se
res e do tecido conjuntivo é acompanhado por uma disfun- água, dióxido de carbono e catabólitos diversos, além da
ção e migração de componentes intracelulares para os es- energia calórica produzida.
paços intesticial e plasmático. O dano muscular está asso- Os radicais livres são moléculas instáveis ou fragmen-
ciado com aumentos dos níveis plasmáticos de creatino- tos de moléculas sem um par de elétrons nas suas órbitas
quinase (CK) e de lactato desidrogenase (LDH), o que serve exteriores. Os radicais livres do oxigênio incluem o radi-
como indicador do aumento da permeabilidade celular re- cal superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidró-
sultante. xilo. Os radicais livres são altamente reativos. A sua ativa-
A formação de radicais livres e o desencadeamento do ção pode causar processos traumáticos nos tecidos pelo
processo de peroxidação também contribuem para o dano desencadeamento de diversas cadeias de reações. Se um
muscular. Embora o papel do exercício na produção da ra- radical reage com um não-radical, é produzido um novo
dicais livres não esteja ainda bem esclarecido, um grande radical livre.
número de autores sugerem que a elevação do consumo de Atualmente, sabe-se claramente que o exercício físico
oxigênio durante o exercício induz a produção de radicais intenso e contínuo é acompanhado pela produção de radi-
livres e outras substâncias oxidantes. cais livres que causam alterações das membranas celula-
Recentemente, na literatura foi demonstrado que as vi- res. Isto provoca uma lesão de fibras musculares, acompa-
taminas A (beta-caroteno), E (tocoferol) e C (ácido ascór- nhada por um processo inflamatório, o que conduz a uma
redução da função muscular com a liberação de enzimas
Endereço para correspondência: musculares, alterações histológicas evidentes e dor mus-
Prof. Dr. Alfredo Córdova cular1-4.
Departamento de Fisiologia e Bioquímica
E.U. Fisioterapia
Campus Universitario de Soria Traduzido, com permissão por escrito, do original: Córdova A, Navas FJ.
C/ Nicolás Rabal, 17 Los radicales libres y el daño muscular producido por el ejercicio. Papel de
42003 – Soria – Espanha los antioxidantes. Arch Med Deporte 2000;76:169-75.
204 Rev Bras Med Esporte _ Vol. 6, Nº 5 – Set/Out, 2000

Foram sugeridas diferentes causas para explicar essas qüências; entre outros, coloca-se o estresse mecânico, o
alterações: a) o alto grau de estresse provocado pelo exer- estresse metabólico e as alterações da microcirculação.
cício; b) alterações da microcirculação2; c) produção de
metabólitos tóxicos; e d) depleção intramuscular dos subs- 2.1) Fatores metabólicos
tratos energéticos5. O dano muscular inicial é seguido por Em geral, os fatores estressantes favorecem a liberação
alterações secundárias entre as quais estão incluídos dese- de metabólitos tóxicos que afetam a estabilização da mem-
quilíbrios eletrolíticos, do metabolismo mineral, dos regu- brana celular e a distribuição de energia às células2,5. As
ladores metabólicos (vitaminas) e uma resposta inflamató- alterações da miopatia metabólica conduzem a uma difi-
ria celular1,2. culdade na capacidade de liberação de ATP, com o que pos-
sivelmente se favorece o mecanismo causal da lesão mus-
1) ALTERAÇÕES ESTRUTURAIS cular10. Sem dúvida, embora se tenha demonstrado em di-
NO MÚSCULO LESADO ferentes estudos uma correlação inversa entre as concen-
As alterações da ultra-estrutura muscular são seguidas trações de ATP e fosfocreatina (CP) e a fadiga e o dano mus-
por uma resposta inflamatória que é habitualmente repara- cular, ainda se duvida se esse fenômeno é causal ou mera-
da6; quando o exercício é mantido e não são desencadea- mente coincidente, já que as reservas musculares de ATP e
dos os processos reparadores adequados, ocorre um proces- CP nunca estão completamente reduzidas, circunstância que
so de rabdomiólise. Inicialmente, os focos de lesão estrutu- parece atuar como um mecanismo protetor na manutenção
ral estão localizados nas microfibrilas e no citoesqueleto7,8. da integridade celular.
Este estado de rabdomiólise é acompanhado pela libera-
ção de enzimas musculares, aumento da mioglobinemia e 2.2) Alterações da microcirculação
mioglobinúria9. Se além desse estado há ainda um deter- A microcirculação também foi colocada como uma cau-
minado grau de desidratação, aumentam o risco e as con- sa que contribui para a produção de alterações locais13. Foi
seqüências da rabdomiólise. Além disso, observa-se um cer- proposta uma hipótese segundo a qual o edema observado
to grau de desestruturação celular nas células lesadas com nas fibras musculares durante a atividade física conduz a
uma degradação dos lipídios e das proteínas estruturais10. um aumento da pressão nos tecidos que provoca uma difi-
O rápido desenvolvimento da lesão muscular ao nível culdade na microcirculação14. Esses autores14 observaram
das fibras e do tecido conjuntivo é acompanhado por uma em ratos que, na área afetada, os capilares não estão blo-
alteração dos componentes intracelulares, que extravasam queados e que o edema ocorre principalmente no espaço
para os espaços intersticial e plasmático. Muitas dessas intersticial. Esses dados sugerem que as alterações da mi-
substâncias incluem as prostaglandinas que atraem os neu- crocirculação não são a causa principal do dano muscular,
trófilos e os monócitos3. embora o comprometimento da microcirculação produza
1.1) Tipos de fibras alterações metabólicas e liberação de radicais livres15, que
A principal característica das fibras musculares de con- podem ativar as enzimas proteolíticas16.
tração rápida é a sua capacidade de produzir contrações
2.3) Estresse mecânico
musculares máximas repetidas, ou seja, são fibras que pro-
duzem maior potência muscular. Tesch11 em 1980 obser- É um dos fatores dominantes que induzem dano muscu-
vou que o perfil metabólico e a atividade glicogenolítica lar, já que afeta todo o aparelho contrátil. Em exercícios
desse tipo de fibra nos homens eram fundamentais tanto excêntricos são recrutadas um menor número de unidades
pela capacidade geradora de potência muscular como para motoras, em comparação com os exercícios concêntricos,
a capacidade de endurance muscular durante o exercício. fato que evidencia que o estresse mecânico originado pelo
Tanto as fibras de contração rápida como as fibras de dano muscular é maior nos exercícios excêntricos17. As
contração lenta são afetadas pelo dano muscular, predomi- contrações excêntricas têm um gasto energético mais bai-
nando no homem a lesão das fibras do tipo II12. Além dis- xo do que as concêntricas, embora a tensão gerada através
so, sabe-se que um dos efeitos da lesão muscular é a redu- do número reduzido de fibras recrutadas seja maior do que
ção da organização sarcomérica normal com retração das para as contrações concêntricas18 e suficientemente gran-
miofibrilas. de para produzir o dano mecânico nas bandas Z, no retícu-
lo sarcoplasmático ou no aparelho contrátil19.
2) FATORES DESENCADEANTES Por outro lado, a ação lisossomal e a inflamação tam-
DA LESÃO MUSCULAR bém estão implicadas no músculo lesado7. Assim, imedia-
Já foram propostas diferentes hipóteses para explicar o tamente após a fadiga devido a um trabalho excêntrico, as
dano muscular induzido pelo exercício e as suas conse- micrografias eletrônicas mostram uma desorganização das
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proteínas contráteis dentro das fibras fatigadas e roturas droxiprolina excretada e a liberação retardada das enzimas
nas bandas Z a intervalos regulares7. A perda de força é CK e LDH do músculo sugerem que ocorreu uma lesão no
maior para o trabalho excêntrico do que a observada com tecido7, e constituem uma prova da lesão do sarcolema19.
igual quantidade de trabalho concêntrico, ou seja, temos D) Magnésio
um músculo mais fraco mas não mais fatigável18. Sem dú- O magnésio (Mg) interfere nos fenômenos de excitação-
vida, isso se reflete em uma redução da força durante vá- contração muscular, razão pela qual a atividade do sistema
rios dias12. de transporte de cálcio através das membranas do retículo
sarcoplasmático depende da presença de íons Mg29,30. A
2.4) Alterações secundárias
deficiência de Mg também produz alterações no músculo
a) Cálcio esquelético de tal forma que quando tal carência é crônica
As alterações iniciais do dano muscular são seguidas por ocorre uma complexa série de alterações bioquímicas, ele-
uma resposta celular inflamatória. São muitos os autores trofisiológicas e morfológicas nas fibras musculares29,30. A
que indicam que o cálcio desempenha um papel fundamen- rabdomiólise, que é a destruição fisiológica de determina-
tal na indução dessas alterações secundárias20,21. Assume- do percentual de células musculares originada pelo exercí-
se que a sobrecarga induz um aumento da concentração de cio, depende do tipo e da duração do mesmo e é um dos
cálcio intracelular que pode desencadear uma seqüência fatores limitantes no esforço prolongado, provocando um
de eventos até o término do exercício6. O aumento da con- substancial aumento das enzimas e proteínas musculares
centração do cálcio sarcoplasmático conduz a um melhor descritas anteriormente31.
relaxamento que pode ser a base de uma rigidez transitória E) Radicais livres
e uma redução do movimento. Além disso, esse aumento A formação de radicais livres e o início de peroxidação
do cálcio sarcoplasmático faz com que este se acumule nas são também fatores que contribuem para as alterações que
mitocôndrias, o que pode reduzir a capacidade de regene- levam ao dano muscular5. Embora o papel do exercício na
ração do ATP6,21, fato que pode afetar as bombas da mem- produção de radicais livres não esteja ainda bem esclareci-
brana. do, um grande número de autores sugerem que o aumento
Ainda, o aumento do cálcio sarcoplasmático livre pode do consumo de oxigênio durante o exercício intenso induz
alterar as enzimas proteolíticas como a fosfolipase A2 que a produção de radicais livres e outras substâncias oxidan-
afeta a integridade da membrana, resultando em um au- tes32.
mento da sua permeabilidade22. Os processos que se se-
guem a esses eventos catabólicos conduzem à regeneração 3) FISIOLOGIA DOS RADICAIS LIVRES
muscular envolvendo células mononucleares23.
Foram sugeridos muitos fatores relacionados com a pro-
B) Glicogênio dução de radicais livres e com a peroxidação lipídica sub-
As biópsias musculares obtidas antes, durante e após o seqüente ao exercício físico. Como já foi citado anterior-
exercício indicam que a concentração de glicogênio é um mente, o aumento do consumo de oxigênio, a depleção dos
importante determinante da resistência muscular, tanto nas substratos energéticos, a diminuição da cadeia respirató-
fibras rápidas (tipo II) como nas lentas (tipo I), e que o seu ria, a elevação da temperatura corporal e a isquemia relati-
consumo é seletivo para as fibras musculares envolvidas va que se produz durante a contração muscular estão rela-
no exercício que se esteja realizando24,25. cionados com a peroxidação5,33,34.
Devido ao processo inflamatório originado pelo dano A produção de radicais livres é uma seqüela do aumento
muscular é produzida uma redução dos níveis musculares do consumo de oxigênio que ocorre com o exercício e guar-
de glicogênio26; de fato, foram encontradas também redu- da uma estreita relação com o dano muscular5,35,36. Para
ções de glicogênio sem alterações inflamatórias27. vários autores, a produção de radicais livres ocorre tanto
C) Enzimas musculares durante o exercício como durante o estado de repouso no
O dano muscular está associado com aumentos dos ní- período de recuperação37,38.
veis plasmáticos das enzimas creatino-quinase (CK) e de- O aporte energético ao músculo durante o exercício deve
sidrogenase lática (LDH). O aumento dessas enzimas vem ser fornecido de modo rápido e coordenado, o que exige
sendo utilizado como indicador do aumento da permeabi- variações precisas do fluxo de oxigênio através dos teci-
lidade celular resultante do dano muscular28. Em vários dos e da cadeia respiratória mitocondrial. O aumento da
estudos foi utilizada a avaliação dessas enzimas após um utilização de oxigênio durante o exercício conduz a um
longo período de recuperação, de mais de 72 horas, para aumento da utilização mitocondrial que não é acompanha-
observar o grau de lesão7,19. O surgimento retardado de hi- do de um aumento do aporte de oxigênio, o que pode con-
duzir à produção de radicais livres e ao dano muscular5, dade da mesma. O período precedente à oxidação, no qual
34,36. é consumido primeiro o tocoferol e depois o beta-carote-
De fato, devido à redistribuição do débito cardíaco du- no, é denominado fase de intervalo. Esta fase parece servir
rante o exercício, alguns tecidos podem permanecer tran- como medida da proteção das lipoproteínas pelos antioxi-
sitoriamente em estado de hipóxia durante a contração dantes e a sua duração está determinada pelo conteúdo de
muscular, razão pela qual durante o relaxamento o proces- antioxidantes43,44.
so de reperfusão com oxigênio pode ser incompleto e por- Os tocoferóis atuam como primeira barreira defensiva
tanto suscetível da peroxidação 5,35,36. Apesar de se produ- contra os radicais lipofílicos, enquanto que o ácido ascór-
zir uma reoxigenação, parece que o dano muscular é evi- bico intervém como primeira barreira diante dos radicais
dente e é acompanhado de um aumento da produção de hidrofílicos42,45.
radicais livres39,40. Além da forma química desses compostos do sistema
Por outro lado, o exercício influi na redução dos níveis defensor diante dos oxidantes, existem outras enzimas en-
de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NADH) e de nico- dógenas antioxidantes que possuem grande importância na
tinamida-adenina-dinucleotídeo fosfatase (NADPH), que são proteção celular, como a superóxido-dismutase, a catalase
necessárias como cofatores essenciais para a atividade de e a glutation-peroxidase. A superóxido-dismutase catalisa
algumas enzimas aceptoras de radicais livres1. O ácido se- a redução de superóxido a oxigênio e peróxido de hidrogê-
midihidroascórbico é reduzido enzimaticamente a ácido nio, enquanto que a catalase converte o hidrogênio peróxi-
ascórbico (vitamina C) por uma reação sistêmica de uma do em água e oxigênio39,42-48.
nicotinamida dinucleotídeo, mecanismo que poderia faci-
litar a contínua regeneração de alfa-tocoferol pelo ácido 5) EFEITO DO EXERCÍCIO
ascórbico (função antioxidante contínua)36,37,41. SOBRE OS ANTIOXIDANTES
4) ANTIOXIDANTES Diferentes componentes do sistema de defesa contra os
Os antioxidantes são substâncias que ajudam a reduzir radicais livres aumentam nos tecidos através da realização
os efeitos do estresse e da falta de oxigênio, formando com- de exercícios regulares49. Nesse sentido, vários autores têm
plexos que atenuam as reações produtoras de radicais li- relatado que o treinamento promove um aumento da ativi-
vres37. A capacidade de defesa do sistema antioxidante de- dade enzimática antioxidante muscular. De fato, ainda não
pende de uma dieta adequada em micronutrientes (vitami- está claro qual é a duração e a intensidade ideais de exer-
nas, minerais, aminoácidos) e a produção endógena de an- cício que conduzem à máxima estimulação dessas enzi-
tioxidantes como o glutation1,37. mas50.
Recentemente foi descrito na literatura que as vitaminas O treinamento induz a produção de enzimas como a glu-
A (beta-caroteno), E (tocoferol) e C (ácido ascórbico), junto tation-peroxidase, superóxido-dismutase e catalase. Tam-
com minerais como o zinco (Zn)31, atuam como agentes bém, depois do exercício foi observado um aumento plas-
protetores antioxidantes35. O ácido ascórbico pode reduzir mático de tocoferol, ácido úrico e ácido ascórbico, subs-
o radical livre do tocoferol e regenerá-lo. O radical de as- tâncias que possuem uma potencial atividade antioxidan-
corbato, que é estável ou ao menos não reativo, pode ser te33. O exercício parece perturbar o equilíbrio do sistema
reduzido enzimaticamente a ácido ascórbico por uma rea- defensivo antioxidante, mas quando a fração antioxidante
ção sistêmica de nicotinamida dinucleotídeo41,42. é comprometida aumenta a suscetibilidade ao dano mus-
Os tocoferóis e os beta-carotenos estão incluídos dentro cular. De fato, parece que o exercício regular de intensida-
dos antioxidantes que protegem a membrana celular dian- de moderada é necessário para manter o sistema de defesa
te dos radicais que atacam as lipoproteínas de baixa densi- antioxidante51.
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Editor-Chefe da Revista Brasileira de Medicina do Esporte
1988.
Vice-Presidente da Sociedade de Medicina Desportiva do Rio de Janeiro
30. Córdova A, Navas FJ, Escanero JF. Magnesium levels and dynamomet- Professor do Depto. de Morfologia e da Disciplina de Medicina do Exercício e do
ric parameters in relation with postoperative fatigue. Magnesium Bull Esporte, da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ
1992;14:98-102. Diretor do ERGOCENTER – Instituto Petropolitano de Ergometria, Petrópolis, RJ

Artigo 2
Ana Soares da Silva Rodrigues Neto
Glutationa
Envolvimento em defesa antioxidante, regulação de morte celular
programada e destoxificação de drogas
Universidade Fernando Pessoa
Faculdade Ciências da Saúde
Porto 2010
Glutationa: Envolvimento em defesa antioxidante, regulação de morte celular programada e destoxificação de
drogas.
UFP-FCS
Dissertação de Mestrado
Ana Neto Porto 2010
drogas.
UFP-FCS
Glutationa
Universidade Fernando Pessoa
Faculdade Ciências da Saúde
Porto 2010
Ana Neto Porto 2010
drogas.
UFP-FCS
Glutationa

Discente:
Trabalho apresentado à Universidade

Fernando Pessoa como parte dos requisitos
para obtenção do grau de Mestre (mestrado
integrado) em Ciências Farmacêuticas
Orientadora:
Professora Doutora Anabela Castro
Ana Neto Porto 2010
drogas.
UFP-FCS
Sumário
A glutationa (GSH) está profusamente distribuída em tecidos animais, vegetais e em

microorganismos. Encontra-se presente em elevadas concentrações intracelulares (0.1-
10 mM) e é consequentemente o tiol mais prevalente e o mais abundante péptido de
baixo peso molecular. A GSH foi adaptada por processos evolutivos para realizar uma
gama diversa de funções. Por exemplo, a glutationa mantém um adequado potencial de
oxidação-redução nas células. A glutationa interfere na catálise, metabolismo e
transporte; participa em reacções que envolvem a síntese de proteínas e ácidos nucleicos
e também em reacções de metabolização de peróxidos e de inactivação de radicais
livres. É frequente a formação de conjugados de glutationa com uma grande variedade
de compostos de origem endógena e exógena e a glutationa é também um co-factor para
diversas enzimas. A GSH é sintetizada intracelularmente e é exportada das células; a
sua degradação é iniciada por y-glutamil transpeptidase, uma enzima conjugada à
superfície externa de certas membranas celulares.
Alterações no metabolismo de glutationa em associação com um aumento do stress

oxidativo tem sido relacionado com a patogenicidade de diversas doenças. Contudo, é
ainda desconhecido se estratégias que tenham como objectivo restaurar a concentração
de glutationa e a homeostasia são eficientes na melhoria ou modificação destes estados.
Nesta revisão é focado o papel patogénico de alterações no metabolismo de glutationa
em diversas doenças.
A apoptose representa um mecanismo fisiológico conservado de morte celular

programada, que é essencial ao normal desenvolvimento e à homeostasia dos tecidos em
todos os organismos, afirmando-se assim o papel crítico da GSH como modelador-
chave das funções celulares. Desta forma, uma alteração da GSH celular para glutationa
oxidada (GSSG) leva a que a alteração do balanço redox favoreça a permanência de
espécies reactivas de oxigénio. Com isto a glutationa oxidada constitui um marco
importante no destino da célula. Esta revisão aborda a descrição das diferentes vias
apoptóticos, a compartimentalização celular de GSH e as proteínas redox de sinalização
apoptótica assim como o papel dos mecanismos redox nas fases de iniciação e execução
da apoptose.
Ana Neto Porto 2010
drogas.
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Abstract
Glutathione (GSH) is widely distributed in animal tissues, plants, and microorganisms.

It is present in high (0.1-10 mM) levels and is thus both the most prevalent cellular thiol
and the most abundant low molecular weight peptide. GSH has been adapted through
evolution to perform many diverse functions. Glutathione maintains proper oxidation-
reduction potential inside cells. Redox affects the oxidation state of sulfur in enzymes,
and thus affects the rates of biochemical reactions in cells. GSH functions in catalysis,
metabolism, and transport; it participates in reactions involving the synthesis of proteins
and nucleic acids and in those that scavenges peroxides and oxidizing free radicals.
GSH forms conjugates with a variety of compounds of endogenous and exogenous
origin and is a cofactor for various enzymes. GSH is synthesized intracellularly and is
exported from cells; its breakdown is initiated by y-glutamyl transpeptidase, an enzyme
attached to the external surface of certain cell membranes.
Altered glutathione metabolism in association with increased oxidative stress has been
implicated in the pathogenesis of many diseases. However, whether strategies aimed at
restoring glutathione concentration and homeostasis are effective in ameliorating or
modifying the natural history of these states is unknown. In this review we focus the
pathogenic role for altered glutathione metabolism in several diseases.
Apoptosis represents a physiologically conserved mechanism of cell death that is

pivotal in normal development and tissue homeostasis in all organisms. As a key
modulator of cell functions, GSH, plays a critical role. Thus, a shift in the cellular GSH
to oxidized glutathione (GSSG) redox balance in favour of the oxidized species, GSSG,
constitutes an important signal that could decide the fate of a cell. This review focus
general description of cellular apoptotic pathways, cellular compartmentation of GSH
and redox proteins to apoptotic signalling and the role of redox mechanisms in the
initiation and execution phases of apoptosis.
Ana Neto Porto 2010
drogas.
UFP-FCS
Agradecimentos/Dedicatória
Acabar algo que num tempo passado iniciei, independentemente do teor de

responsabilidade e importância, é, e será sempre desde de logo uma fulcral motivação.
No âmbito do término de um Curso superior, verifica-se uma motivação exacerbada
pela importância de um ciclo que se finaliza. A maior ambição não é por certo apenas
encerrá-lo, é bem mais encerrá-lo com valor, mérito, credibilidade e com o devido
sucesso pelo qual me empenhei e depositei confiança. Este documento surge como o
culmino de um longo percurso de 5anos de intensa aprendizagem.
Queria agradecer em primeira instância à faculdade por todo o apoio que ao

longo destes 5 anos me foi prestado e por nela poder tido a possibilidade de me formar
profissionalmente. Foi um longo percurso na qual sem o apoio da faculdade teria sido
um trajecto bem mais difícil e com menos vontade de o acabar com sucesso. Obrigado
pela oportunidade.
Queria agradecer à minha orientadora, Professora Anabela Castro por todo o

apoio, por toda ajuda e por toda a disponibilidade que sempre demonstrou para comigo.
Sem dúvida que foi um pilar muito importante para a execução desta dissertação. O meu
sincero obrigado pelas horas de trabalho cedidas a esta dissertação.
Gostaria também de agradecer a todos os meus amigos e eternos companheiros

de vida, por todo o apoio que ao longo da execução deste documento sempre mostraram
disponível e toda a alegria e vivacidade que me dão para ultrapassar todos os obstáculos
que se vão colocando ao longo da vida.
Agradeço também a todos que contribuíram directa ou indirectamente para que

esta dissertação fosse possível.
Por fim queria dedicar este documento aos meus pais. Não pelo conteúdo do
documento mas pela importância associada à dissertação. Sem eles não sou o que sou
hoje, sem eles não teria tirado um curso e sem eles era metade de mim. Pelo enorme
exemplo que sempre me deram como excelentes seres humanos e educandos, serei
eternamente grata pelo facto de ter o privilégio de serem meus pais. Ao meu pai José
Neto e à minha mãe Filomena Cunha, dedico esta dissertação.
Ana Neto Porto 2010
drogas.
UFP-FCS
Índice de figuras
Figura 1: Síntese de GSH 4
Figura 2: Fórmula estrutural de GSH e GSSG respectivamente. 6
Figura 3: Representação esquemática das reacções intervenientes da biossíntese da

glutationa a partir dos seus aminoácidos constituintes 12
Figura 4: Reacções de biossíntese de GSH: a) γ-glutamilcisteína sintetase; b) glutationa

sintetase; c) γ-glutamilciclotransferase; e BSO, inibidor da síntese de GSH 14
Figura 5: Esquematização do ciclo do γ-glutamilo 14
Figura 6: Esquematização do processo de compartimentação e exportação 15
Figura 7: Esquematização metabólica do processo de catabolismo 17
Figura 8: GSH na destoxificação de xenobióticos: via ácidos mercaptúricos 22
Figura 9: GSH na destoxificação de xenobióticos: Exemplos da actuação da glutationa

transferase na destoxificação celular de xenobióticos 23
Figura 10: Activação/desactivação metabólica do acetoaminofeno 24
Figura 11: Bioactivação do diclorometano através da GSH 25
Figura 12: 4 mecanismos possíveis de transporte de GSH 27
Figura 13: Vias do estado homeostático da glutationa nas células (Síntese, reacções
redox e conjugação) 32
Figura 14: Sequência de eventos apoptóticos 47
Ana Neto Porto 2010
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Abreviaturas
ABCC – Família de proteínas transportadoras de glutationa; em inglês, ATP- binding

cassete carriers
ADP – Adenosina difosfato
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
AP – Proteína activadora
Apaf-1 – Em inglês, apoptosis protease activating-factor 1
ARE – Em inglês, antioxidant responsive element
ATP – Adenosina trifosfato
BSO – Butionina sulfoximina
Ca2+ – Ião cálcio
CFTR – Proteína reguladora de condutância de fibrose cística
CH2Cl2 – Diclorometano
Cl - – Ião cloreto
Cys-SR – conjugado com a cisteína
Cu+ – Ião cobre
DMI – Degeneração macular relaciona com a idade
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DPOC – Doença pulmonar obstrutiva crónica
Epre – Elemento de resposta antioxidante; em inglês, Electrophile response element
GCS – γ-Glutamilcisteína sintetase
GGT – γ-Glutamiltransferase ou γ-Glutamiltranspeptidase
GPx – Glutationa peroxidase
Ana Neto Porto 2010
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GR – Glutationa redutase
GS – Glutationa sintetase
GS- – Anião tiolato
GSH – Glutationa reduzida
GSSG – Glutationa oxidada
GST – Glutationa-S-transferase
HIV – Em inglês, Human immunodeficiency virus
IAP – Proteínas inibidoras da apoptose
K+ – Ião potássio
Mg2+ – Ião magnésio
mM – Milimolar
mRNA – RNA ( Ácido ribonucleico) mensageiro
MRP – Família de proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos
NAPQI – N-acetil-p-benzoquinona imina
NMDA – N-metil-D-aspartato
Nrf2 – Factor de transcrição, em inglês: NF-E2-related factor 2
OPA – o-ftaldialdeído
PGHS – Prostaglandina H sintetase
pKa – Constante de acidez
.
R – Radical livre
XH – Xenobiótico
RLO – Radicais livres de oxigénio
ROS – Espécies reactivas de oxigénio
Ana Neto Porto 2010
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SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido dismutase
Zn2+ – Ião zinco
γ-Glu – Resíduo γ-glutamilo
hGSTT1-1 – Em inglês, Human glutathione S-transferase theta 1-1
rGSTT5-5 – Em inglês, Rat glutathione S-transferase theta 2-2
µM – Micromolar
Ana Neto Porto 2010
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Capítulo I: Apresentação da Dissertação
Ana Neto 1 Porto 2010
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1.1) Enquadramento do trabalho e objectivos
O progresso económico e o desenvolvimento de novas técnicas científicas no

decorrer das últimas três décadas, e até mesmo a consciência do Homem para uma
atenção privilegiada para a saúde, têm demonstrado uma melhoria global na Saúde e na
esperança média de vida. Novas doenças surgem e a preocupação para as suas causas
bem como o seu comportamento no organismo humano é sempre uma questão
prevalente. Tem-se verificado que a incidência de doenças mediadas por espécies
reactivas de oxigénio é frequente e notória para que se desenvolvam estudos
importantes nesta área.
Como tal, o conhecimento aprofundado dos fenómenos oxidativos e contribuições

de substâncias antioxidantes é uma mais-valia, tanto pelo número de anomalias
relacionadas, como, no caso da glutationa, ser uma substância intrínseca e inerente às
células.
No Homem, o decréscimo de glutationa no organismo está relacionado com

doenças incluindo cancro, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares. Os
níveis de glutationa são um indicador muito sensível da funcionalidade e viabilidade
celular.
Estudos recentes acerca desta importante molécula têm vindo a ser desenvolvidos,
surgindo desta forma dados novos, relevantes e promissores sobre a mesma que vêm
despertar um interesse acrescido para o conhecimento mais aprofundado sobre o papel
da glutationa nos processos celulares. O carácter benéfico desta molécula já é de
conhecimento geral, no entanto a sua potencial relação com fenómenos apoptóticos,
envolvimento em fenómenos oncológicos e prevenção da degeneração celular são
assuntos ainda em estudo.
Esta dissertação tem por objectivo fazer uma revisão de carácter geral sobre esta
notória e essencial molécula, reconhecendo as características benéficas para o
organismo, assim como apresentar informação mais actual sobre o seu envolvimento
tanto na apoptose como na destoxificação celular.
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Capítulo II: Revisão estrutural, bioquímica e funcional da

Glutationa
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2.1) Glutationa: Introdução à molécula
A importância biológica da glutationa (GSH) tem sido apreciada desde que foi
descrita pela primeira vez, em 1888 por Rey-Pailhade, como “philothion”, designando
simplesmente algo que continha enxofre (Penninckx, 1999).
Este tripeptídeo linear de aminoácidos foi posteriormente cristalizado por diversos

investigadores, onde se verificou a presença relevante de enxofre, sendo assim
designada de glutationa (L-gama-glutamil-L-cisteinilglicina) (Tew, 2007).
Figura 1: Síntese de GSH; Adaptado de: Misra, I., Griffith, O.W. (1998) Expression
and Purification of Human γ-Glutamylcysteine Synthetase., Protein Expression and
Purification, 13(2), pp. 268-275
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Legenda:
A glutationa é sintetizada em duas etapas consecutivas (Figura 1) (Mary, 1983). A

γ-glutamilcisteína sintetase (GCS), também designada de glutamato cisteína ligase, usa
o glutamato e a cisteína como substratos formando o dipeptídeo γ-GluCys (1), o qual se
combina com a glicina numa reacção catalisada pela glutationa sintetase (GS) para a
geração de GSH (2). A adenosina trifosfato (ATP) é co-substrato para ambas as
enzimas. O nível intracelular de GSH é regulado por feedback, sendo a actividade da
GCS inibida pelo seu produto final (Meister, 1974; Misra, 1998). Assim, a síntese e o
consumo de GSH vigoram de uma forma equilibrada.
Esta molécula é sintetizada no interior das células. A sua síntese irá variar de
acordo com a biodisponibilidade dos aminoácidos, mais concretamente da cisteína, uma
vez que este aminoácido é dos três o mais escasso nos alimentos. Para além desta
limitação na sua biodisponibilidade, este aminoácido apresenta na sua estrutura um
componente que o caracteriza bioquimicamente, o enxofre, designado de grupo tiol.
Este grupo vai conferir à glutationa a capacidade de desempenhar as funções que lhe são
características e de importância vital no organismo (Höehr, 2001).
Nas células, a glutationa pode encontrar-se sob a forma de glutationa reduzida

(também denominada de monomérica), na forma oxidada (também designada de
dimérica (GSSG)), e ainda sob a forma de glutationa conjugada (GS-R) (Glutationa
Project [Em linha]).
Nos tecidos saudáveis cerca de 90% da glutationa existente encontra-se na forma

reduzida (Henry Okigami, 2009 [Em linha]).
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C10 H17 N3 O6 S
C20 H32 N6 O12 S2
Massa Molar: 307,33 g/mol Massa Molar: 612,66 g/mol
Figura 2: Fórmula estrutural da GSH e GSSG respectivamente. Adaptado de Kronos

Science Laboratory – Glutathione [Em Linha] Disponivel em
<http://www.kronoslaboratory.com/dotnetnuke/FeaturedAssays/GlutathionePanel/tabid/
137/Default.aspx> [Consultado em Setembro 2010]
A glutationa na sua forma reduzida protege as células através da remoção de

metabolitos reactivos pela sua conjugação com as formas reactivas. A conjugação com a
GSH pode ser uma reacção catalisada enzimaticamente ou simplesmente uma reacção
química. Existem muitos tipos de substratos para a conjugação da glutationa incluindo
aromáticos, alifáticos, epóxidos, compostos heterocíclicos e alicíclicos, alifáticos
halogenados e aromáticos nitrados, compostos alifáticos insaturados e haletos de alquilo
(Meister, 1974).
A glutationa na forma reduzida é o tiol não proteico mais prevalente nas células
animais. A síntese de GSH associada com a redução de GSSG, promove a manutenção
do estado redox intracelular, funcionando este tripeptídeo como co-factor para enzimas
citoplasmáticas e indutor de certas modificações translacionais em diversas proteínas
(Tapiero, 2003).
A GSH tem um papel importante no armazenamento e transporte de cisteína, na

defesa celular contra radicais livres, peróxidos e xenobióticos, actuando em conjunto
com as enzimas glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST). Além
destas funções, a GSH também participa na modulação da transdução de sinal,
regulação da proliferação celular, regulação da resposta imune (Sies, 1999),
metabolismo de leucotrienos e prostaglandinas, entre outras (Forman, 2009).
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É uma molécula a que se pode chamar de “natural”, estando presente em células

animais, vegetais, em cianobactérias e proteobactérias (Anderson, 1998; Arisi, 1998;
Ayer, 2010). Está distribuída livremente em cerca de 85-90% no citoplasma, mas pode
estar compartimentada em estruturas celulares, após síntese citosólica, como por
exemplo mitocôndrias, peroxissomas, núcleo e retículo endoplasmático (Bounous,
1989).
Na generalidade dos seres vivos, a GSH apresenta-se em concentrações entre 0,1-

10 mM (Bounous, 1989). Os glóbulos vermelhos, apesar de não conterem a enzima
responsável pela síntese de GSH, apresentam concentrações significativas de GSH no
seu meio intracelular. No plasma humano, os níveis de glutationa variam entre 10 a 30
µM, com uma taxa de fluxo para o rim 1 L/min ~ 60 µM, sendo verificada a entrada da
GSH pelo túbulo proximal (Abraham, 1996). Com uma concentração na urina de 1-3
µM e uma taxa de excreção inferior a 1 nmol/h, implica que 99% da GSH seja
reabsorvida (Tew, 2007).
2.2) Espécies reactivas de oxigénio
Define-se como radical livre toda e qualquer espécie que apresenta um ou mais
electrões desemparalhados. Como o nome sugere, existe um electrão que se apresenta
livre e é característico em átomos como hidrogénio, enxofre, nitrogénio, oxigénio,
carbono ou nos metais de transição. No entanto, basicamente existem apenas duas
espécies, oxigénio e monóxido de azoto, capazes de no estado fundamental gerar
espécies reactivas de oxigénio (Bonnefoy, 2002).
Outra maneira de formação deste tipo de compostos consiste na redução

unielectrónica de oxigénio a água, que com a entrada de 4 electrões na molécula de
oxigénio faz com que surja o radical superóxido (O2.-), peróxido de hidrogénio (H2O2) e
do radical hidroxilo (HO.), exemplificado através de reacções (Höehr, 2001):
O2 O2-. H2O2 HO-. H2O
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O peróxido de hidrogénio atravessa as membranas celulares e capta um electrão,

podendo originar o radical hidroxilo. Este radical é das espécies mais reactivas
(Timbrell, 2000).
Estas moléculas produzem-se por exemplo no processo respiratório e apresentam

uma existência independente. De todo o oxigénio que diariamente é consumido, 2 a 5%
é convertido em radicais livres, o que não significa que seja inteiramente prejudicial,
antes pelo contrário, em doses pequenas e moderadas combatem bactérias e vírus
(Carney, 2004). Contudo, devem ser neutralizados quando existam em doses elevadas
pois de adjuvantes passam a agentes tóxicos.
2.3) Funções
A GSH é uma molécula que intervêm em diversos processos, como antioxidante e

destoxificante, no transporte de aminoácidos, síntese de proteínas e ácidos nucleicos,
manutenção da forma activa de certas enzimas, protecção do organismo contra a
exposição a radiações solares e, estudos recentes apontam para uma participação
importante da GSH na regulação da morte celular programada (Dringen, 1999; Forman,
2009; Park, 2010).
A glutationa participa em inúmeros processos metabólicos no organismo. O

conteúdo em glutationa no organismo é um forte indicador do respectivo estado
fisiológico (Tapiero, 2003), onde a sua depleção pode ocasionar danos celulares
irreversíveis (Forman, 2009).
O nível intracelular de glutationa pode ser preditivo para a longevidade dessa

célula (Park, 2010). Face ao papel da GSH na protecção contra o stresse oxidativo e
destoxificação de xenobióticos, a disponibilidade desta na forma reduzida é um factor
chave para a manutenção da saúde. Quanto menor o conteúdo em glutationa numa
célula, menor a probabilidade de sobrevivência dessa célula (Forman, 2009).
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Voltando ao conceito primordial, a glutationa é o principal antioxidante produzido

pela célula, sendo esta a sua função principal – poder antioxidante – protegendo-a de
radicais livres. Estes radicais livres são compostos extremamente reactivos podendo
danificar ou destruir componentes celulares importantes (membranas, DNA, entre
outros) em microsegundos (Lomaestro, 1995). A glutationa age como agente
neutralizador, desactivando-os, mantendo em simultâneo a funcionalidade de
antioxidantes exógenos como por exemplo as vitaminas C e E. Esta propriedade só é
possível de ser concretizada num enquadramento enzimático, onde regem ciclos
funcionais enzimáticos que as células desenvolveram contra espécies reactivas de
oxigénio (ROS), na qual é crucial a presença de enzimas como GPx e glutationa
redutase (GR) (Penninckx, 1999).
Para que melhor se possa proteger, a própria célula tem estratégias de combate à
agressão por parte dos ROS, nomeadamente organelos, como mitocôndria e núcleo, que
têm a sua própria reserva de GSH, protegendo individualmente estas estruturas contra a
acção destas espécies. Esta protecção é fulcral pois a alteração do estado redox
intracelular pode implicar processos pré-mutagénicos no DNA (Lu, 2009).
A previsão quantitativa da molécula permite correlacionar a diminuição da

actividade de enzimas antioxidantes, como a GPx, e o aumento dos níveis de bases de
DNA lesadas devido ao dano oxidativo, confirmando a hipótese de que as reacções que
levam à formação de radicais livres podem induzir aparecimento de células malignas
(Carney, 2004).
O par redox GSH/GSSG poderá ser um importante indicador do estado redox

celular (Ballatori, 2009) e, alterações neste par redox demonstram estar relacionadas
com a proliferação celular, diferenciação e/ou apoptose (Park, 2010). Como tal, a
glutationa desempenha assim um papel crucial na manutenção de um equilíbrio normal
entre espécies oxidantes e antioxidantes, regulando muitas das funções vitais da célula,
tais como síntese e reparação de DNA, síntese de proteínas e activação e regulação de
enzimas (Tapiero, 2003). A título de exemplo, Newsholme e Leech em 1995,
verificaram que na córnea a GSH pode ter um papel relevante para a manutenção de
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grupos sulfídrilo reduzidos em proteínas, na remoção do H2O2, reparação de lípidos

peroxidados por radicais superóxido e hidroxilo (Bonnefoy, 2002).
A existência de patologias associadas a radicais livres demonstra que este tipo de

espécies não apresenta nenhuma componente etiológica na globalidade das doenças mas
sim uma responsabilidade directa na alteração fisiopatológica dos mecanismos que
determinam a proliferação da anomalia.
Outra funcionalidade de extrema relevância da glutationa é o facto de participar

como agente fulcral na destoxificação do organismo face a tóxicos orgânicos e
inorgânicos (Anderson, 1998). Actua na desintoxicação de uma multiplicidade de
xenobióticos que vão-se associar ao tripeptídeo e são excretados na urina e nas fezes.
Forma-se um composto solúvel juntamente com o tóxico, de forma que este seja
passível de ser excretado face a solubilidade do intestino. Desta forma, é plausível que
os rins e o fígado sejam órgãos que apresentam altos níveis em glutationa uma vez que
têm uma elevada incidência de exposição a xenobióticos. Os pulmões também revelam
índices elevados de glutationa com o intuito de combater as espécies reactivas que
através da respiração se formam. Assim, muitos produtos resultantes da presença de um
tumor, metais pesados, metabolitos e xenobióticos, são eliminados por esta via
(Almeida, 2001).
A glutationa tem também um papel determinante na resposta imune. A título de

exemplo, ela é necessária para a ocorrência da proliferação linfocitária conducente a
uma resposta imunológica capaz de eliminar células indesejáveis, tais como células
cancerígenas ou células infectadas por vírus (Carolis, 2009). A glutationa na relação que
estabelece entre a sua forma oxidada e reduzida, vai ditar a entrada de linfócitos na fase
de síntese do ciclo celular. Existem mecanismos propostos para melhorar a resposta
imune que assentam na optimização das funções dos macrófagos, compensando danos
oxidativos associados com a expansão monoclonal de linfócitos, e estabilização da
membrana mitocondrial, para assim diminuir o processo de apoptose em linfócitos (Lu,
2009).
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A glutationa está também relacionada com o metabolismo do ácido ascórbico,

manutenção da comunicação das células, prevenção da oxidação de grupos tiol
presentes nas proteínas e no transporte do cobre intracelular (Sies, 1999). A glutationa é
importante para a síntese de DNA, síntese proteínas, síntese de prostaglandinas, para o
transporte de aminoácidos, e activações enzimáticas (Park, 2010). Diversos estudos
descrevem o decréscimo dos níveis de glutationa com o aumento da idade de uma
pessoa, estando assim implicado com o aparecimento de certas doenças associadas ao
envelhecimento (Forman, 2009).
2.4) Síntese
A glutationa nas células está presente maioritariamente na sua forma reduzida,

que é a sua forma biologicamente activa. Em condições de stresse oxidativo, a GSH
converte-se em GSSG, o que leva a uma diminuição da razão GSH/GSSG.
A síntese de GSH ocorre no citosol em duas reacções enzimáticas principais. Em

células de mamíferos, existem três mecanismos que sustentam a manutenção da
homeostasia da GSH, nomeadamente, síntese de novo, a captação de fontes exógenas
através da membrana plasmática e redução de GSSG catalisada pela GR (Chen, 2007).
A primeira reacção que sustenta a biossíntese da GSH é a formação de uma

ligação peptídica entre os aminoácidos glutamato e a cisteína. Entre estes dois primeiros
resíduos de aminoácidos estabelece-se uma ligação do tipo gama. Esta ligação
estabelece-se entre o grupo carboxílico do glutamato e o grupo amina da cisteína. A
ocorrência desta ligação é fundamental para que não se verifique a degradação da
glutationa através de peptidases intracelulares (Chang, 1987). A enzima interveniente é
a γ-glutamilcisteína sintetase, gerando-se a γ-L-glutamil-L-cisteína. Por sua vez este
dipeptídeo liga-se à glicina pela acção da glutationa sintetase (Anderson, 1998).
UFP-FCS drogas
Figura 3 - Representação esquemática das reacções intervenientes na biossíntese da

glutationa a partir dos seus aminoácidos constituintes. Adaptado de Arisi et alii (1998)
Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in
transformed plants. Journal of Experimental Botany, 49 (321), pp.623-647
A síntese de novo ocorre exclusivamente no compartimento citosólico, em duas

etapas sequenciais dependentes de ATP. A GCS catalisa a formação de γ-
glutamilcisteína que surge como o primeiro factor limitante durante o processo de
síntese de GSH, sendo um processo fulcral para a regulação das concentrações celulares
de GSH (Chen, 2007). Esta limitação surge no seguimento da cisteína ser um factor
limitante para a síntese de novo de GSH. Este aminoácido pode ser obtido através da
degradação de GSH extracelular através da acção da γ-glutamiltransferase (GGT), e/ou
através da via de conversão cistationina, ou a partir de metionina (Lu, 2009). Esta via de
conversão é característica de células hepáticas, ao contrário da clivagem da GSH que
ocorre na superfície externa de membranas plasmáticas de certas células epiteliais,
como, por exemplo, rins, pâncreas, vias biliares e intestino delgado (Chen, 2007).
UFP-FCS drogas
A enzima GCS sofre então uma regulação pela GSH através de um feedback
negativo. Este facto faz com que se evite a acumulação excessiva do produto de reacção
ou do intermediário γ-glutamilcisteína. Em contrapartida, a enzima responsável pela
segunda reacção não está sujeita à inibição por feedback de GSH.
Face ao facto da γ-glutamilcisteína se encontrar em concentrações extremamente

baixas na presença da enzima GS, conclui-se que GCS é um factor limitante para a
síntese de GSH. Outro dado que sustenta esta conclusão, é a observação de que quando
se aumenta a concentração em GS, os índices de GSH não se elevam. Em contrapartida,
acontece o inverso quando se aumenta a concentração de GCS, os níveis de GSH
aumentam (Lu, 2009). Contudo, uma deficiência em GS nos humanos pode levar, de
uma forma geral, a níveis baixos de GSH resultando em danos metabólicos de
consequências comprometedoras, uma vez que ao ocorrer uma acumulação em γ-
glutamilcisteína, esta pode ser convertida a 5-oxoprolina (Forman, 2009). Este último
pode causar acidose metabólica grave, anemia hemolítica e danos no sistema nervoso
central (Nishimura, 1999).
A GS apesar de não ter um papel determinante na biossíntese de GSH, a sua

acumulação está associada a situações de stresse. A título de exemplo, no trauma
cirúrgico, os níveis de GSH e a actividade da enzima GS no músculo-esquelético
declinam enquanto os valores de GCS se mantêm. Como tal, é pertinente considerar a
GS na regulação da síntese de GSH, como também em situações de stresse oxidativo e
(Lu, 2009).
Desta forma a glutationa é sintetizada por duas etapas principais na qual os seus
aminoácidos constituintes interagem e se ligam para formar uma nova molécula. Este
processo pode ser inibido pela butionina sulfoximina (BSO) que a nível estrutural
apresenta-se idêntico a um intermediário na reacção catalisada pela GCS, provocando
assim um decréscimo na concentração em GSH (Almeida, 2008).
UFP-FCS drogas
Figura 4: Reacções de biossíntese de GSH. a) γ-glutamilcisteína sintetase; b) glutationa

sintetase; c) γ-glutamilciclotransferase; e BSO, inibidor da síntese de GSH. Adaptado de
Almeida, P., Fátima, A., Huber, P.C. (2008) Glutationa e enzimas relacionadas: papel
biológico e importância em processos patológicos. Química Nova, 31, pp.1170-1179
2.5) Ciclo do γ-glutamilo
A síntese e a degradação de GSH têm lugar num conjunto de reacções, designado

de ciclo do γ-glutamilo, que inclui a presença de 6 enzimas. Durante o ciclo verifica-se
duas etapas importantes: exportação de glutationa celular e incorporação do resíduo γ-
glutamilo em aminoácidos mediado por transpeptidases. Este ciclo vem suportar a ideia
de que umas das finalidades da GSH é proporcionar a formação de γ-glutamil
aminoácidos, constituindo uma forma de transporte de aminoácidos (Larsson e Ristoff,
1998).
UFP-FCS drogas
Figura 5 – Esquematização do ciclo do γ-glutamilo Adaptado de Portal bioquímica04-

Metabolismo de aminoácidos [Em linha] Disponível em
<http://www.ufpe.br/dbioq/portalbq04/metabolismo_de_aminoacidos.htm> [Consultado
em Setembro 2010]
2.6) Compartimentação e exportação
Após a síntese, parte da GSH sintetizada é encaminhada para compartimentos

intracelulares específicos, incluindo mitocôndrias e retículo endoplasmático, mas muita
da GSH é enviada para espaços extracelulares, inclusive o plasma sanguíneo, secreções
exócrinas, fluido de revestimento do pulmão e fluido cerebrospinal. Em células
polarizadas, o transporte de GSH e dos seus conjugados é realizado em toda membrana
apical, e é mediado essencialmente por transportadores específicos: MRP1, MRP2 e
Oatp1 que podem contribuir para o efluxo através da membrana plasmática basolateral
para o plasma sanguíneo. Apesar da exportação e compartimentação intercelular ser
mediada por proteínas específicas, tais fenómenos ainda não estão totalmente
esclarecidos (Forman, 2009).
Figura 6: Esquematização do processo de compartimentação e exportação. Adaptado

de Ballatori et alii (2009) Glutathione dysregulation and the etiology and progression of
human diseases. The Journal of Biological Chemistry, 390, pp. 191-214
UFP-FCS drogas
2.7) Catabolismo: degradação da GSH
A degradação da GSH ocorre exclusivamente no meio extracelular por

reconhecimento da ectoenzima γ-glutamiltranspeptidase (GGT), que se encontra à
superfície das células. Esta enzima está presente na membrana apical de muitas células
epiteliais (Bertini, 2003). Após a exportação do conteúdo das células, existem intra e
inter ciclos de degradação e de utilização da GSH e dos conjugados da GSH, que
consistem em:
1) Catabolismo extenso dentro dos espaços apicais (por exemplo, bile e líquido tubular
renal), bem como no interior de compartimentos sinusoidais de algumas espécies
(Ballatori, 2009);
2) Recaptação celular de alguns produtos de degradação (Bertini, 2003);
3) Utilização intracelular destes produtos de degradação, ou conversão de S-conjugados

de cisteína (Cys-SR) em ácido mercaptúrico (Bonnefoy, 2002). Como se pode visualizar
na Figura 7, o catabolismo de conjugados de glutationa leva à formação de conjugados
com a cisteína (Cys-SR). Estes conjugados, Cys-SR, são transportados de novo para as
células, onde podem funcionar como substrato para as N-acetiltransferases, com o
intuito de gerar conjugados com a N-acetilcisteína (N-Acetil-Cys-SR), ou ácidos
mercaptúricos. Estes ácidos são depois exportados a partir de células com o objectivo de
serem eliminados através da urina ou fezes (Anderson, 1998).
UFP-FCS drogas
Figura 7: Esquematização metabólica do processo de catabolismo. Adaptado de

Ballatori et alii. (2009) Glutathione dysregulation and the etiology and progression of
human diseases. The Journal of Biological Chemistry, 390, pp. 191-214.
UFP-FCS drogas
Capítulo III: Destoxificação: papel da GSH
UFP-FCS drogas
3.1) Destoxificação
Em condições fisiológicas, o rim é o principal órgão excretor do organismo.

Excretam preferencialmente substâncias polares e hidrófilas, onde a afinidade e
compatibilidade facilitam a eliminação (Flanagan, 2007).
Xenobióticos lipofílicos que se encontram fortemente ligados a proteínas

dificultam a absorção e, consequentemente, a excreção glomerular fica comprometida.
Mesmo que sofram filtração, vão ser prontamente reabsorvidos ao nível do túbulo renal.
Desta forma, este tipo de substâncias devem ser devidamente metabolizadas em
compostos polares para que possam ser excretadas (Bertini, 2003). Em determinadas
moléculas a metabolização faz com que a substância perca a sua actividade. Noutras
moléculas, como por exemplo fármacos, apresentam acção farmacológica após a
metabolização e, por último, existem compostos em que se verifica que a metabolização
potencia o seu efeito podendo mesmo tornar-se tóxicos, como o caso do metabolito do
paracetamol, N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) (Alberts, 1994).
O fígado é o principal órgão de metabolização de xenobióticos, no entanto a

maioria dos tecidos tem a capacidade de metabolizar drogas por hidrólise através de
esterases plasmáticas, o que em determinadas situações é uma solução eficiente, bem
como o metabolismo efectuado ao nível da flora intestinal que muitas vezes é crucial
para a biodisponibilidade oral de muitos fármacos (Kaplowitz, 1981).
O metabolismo de xenobióticos manifesta-se em duas categorias reactivas:

reacções de fase I e fase II (Timbrell, 2000). Nas reacções de fase I, o componente a ser
excretado sofre uma acção que visa a alteração química da molécula. Essa alteração
pode ser provocada por oxidação, redução ou hidrólise (Flanagan, 2007). Nas reacções
de fase II, a molécula vai ser “preparada” de forma a poder sair do organismo. Como
tal, copula-se à molécula um “meio de transporte” para que seja possível ao componente
ser expelido do organismo. Neste caso intitula-se de reacções de conjugação em que há
uma segunda molécula (por exemplo, o ácido D-glucorónico), de carácter hidrófilo, que
é adicionado à molécula a excretar, tornando-a passível de se difundir para ser
eliminada. A fase II só se torna funcional caso haja um grupo reactivo adequado para a
UFP-FCS drogas
conjugação. Esse grupo reactivo necessário à fase II é adquirido com a fase I. As

alterações estabelecidas à molécula na fase I, configuram-na para que seja possível
acontecer a fase seguinte. Assim, seguindo a mesma lógica pela qual se designa
“conjugação” à fase II, pode-se designar de “funcionalização” ao processo de fase I
(Flanagan, 2007).
3.1.1) Conjugação com a GSH
A glutationa é uma molécula que estabelece reacções de conjugação com vários

tipos de compostos. Este tipo de reacções são fundamentais durante o processo de
destoxificação do organismo. Ela intervém de uma forma activa e fundamental para a
protecção do organismo contra xenobióticos. No entanto, em alguns casos, discutidos
mais à frente, um conceito dúbio permanece, destoxificação ou bioactivação? Algumas
substâncias revelam, interessantemente, um potencial mais elevado ou mesmo
toxicidade até então inexistente, após da conjugação com a GSH (Alberts, 1994).
A conjugação com aminoácidos e dipéptidos estabelece-se de uma forma

completamente diferente no que se refere à conjugação com xenobióticos. Os substratos
para a conjugação com a glutationa englobam uma enorme série de xenobióticos
electrofílicos ou xenobióticos que podem ser biotransformados em electrófilos. Em
oposição ao que sucede com as amidas formadas pela conjugação de xenobióticos com
outros aminoácidos, os conjugados de glutationa são tioéteres, que se formam pelo
ataque nucleofílico do anião tiolato da glutationa (GS-) a um átomo de carbono
electrofílico no xenobiótico. A glutationa pode também conjugar os xenobióticos
contendo heteroátomos electrofílicos (O, N, S) (Dickinson, 2002).
A conjugação dos xenobióticos com a glutationa é catalisada por uma família de

GST. Estas enzimas estão presentes na maioria dos tecidos, embora em concentrações
mais elevadas no fígado, intestino, rim, testículos, glândula supra-renal e pulmão, onde
se localizam no citoplasma numa percentagem de 95%, e no retículo endoplasmático
cerca de 5%.
UFP-FCS drogas
Os substratos da GST apresentam 3 características em comum: são hidrofóbicos,

contêm um átomo electrofílico e reagem não enzimaticamente com a glutationa a uma
taxa mensurável. O mecanismo pelo qual a GST aumenta a taxa de conjugação com a
GSH envolve a desprotonação de GSH para GS- através de um tirosinato (Tyr-O-) do
centro activo, que funciona como a base geral catalítica (Arisi, 1998). Quando a
concentração de GSH é extremamente elevada, a conjugação não enzimática de alguns
xenobióticos com GSH pode ser um processo significativo. Contudo, alguns
xenobióticos são conjugados com a GSH estereosselectivamente, mostrando que a
reacção é largamente catalisada pela GST (Dringen, 1999). Esta enzima, tal como se
verifica com a GSH, encontra-se também em quantidades abundantes constituindo mais
de 10% da totalidade das proteínas celulares. Este tipo de enzimas não só liga/reage
como também armazena e transporta um número de componentes que não são de
carácter catalítico, isto é, não são substratos na qual se estabelecem uma reacção
enzimática (Arisi, 1998). Por sua vez, os substratos para as reacções de conjugação com
a GSH podem ser divididos em dois grupos distintos. O primeiro grupo consiste em
substratos que são suficientemente electrofílicos para a biotransformação em
metabolitos electrofílicos antes de serem submetidos à conjugação. O segundo grupo de
substratos para a conjugação com a GSH inclui intermediários reactivos produzidos
durante a fase I ou a fase II da biotransformação, e incluem oxiranos (óxidos areno e
epóxidos alceno), iões nitrenium, iões carbónio e radicais livres. As reacções de
conjugação também podem ser divididas em dois tipos diferentes: reacções de
transferência, em que a GSH desloca um grupo de electrões removíveis, e as reacções
de adição, em que a GSH é adicionada a uma ligação dupla activada, ou a um sistema
em anel aberto (Höehr, 2001).
O deslocamento de um grupo de electrões removíveis pela glutationa ocorre

tipicamente quando o substrato contém grupos sulfato, sulfonato, fosfato ou de nitro,
isto é, bons “grupos abandonantes”, ligados a um átomo de carbono alílico ou benzílico.
A adição de glutationa a uma ligação dupla de carbono-carbono é facilitada pela
presença de um grupo próximo de electrões removíveis. Consequentemente, os
substratos para esta reacção contêm tipicamente uma ligação dupla fixa a -CN, -CHO, -
COOR, ou -COR (Forman, 2009).
UFP-FCS drogas
Os conjugados da glutationa formados ao nível do fígado, têm a particularidade de

poderem ser excretados totalmente intactos através da bílis, ou então, serem convertidos
a ácidos mercaptúricos, mas neste caso falamos a um nível de excreção renal e não
hepática. Posteriormente estes ácidos formados serão excretados pela urina (Höehr,
2001).
Para que ocorra a conversão de GSH a ácido mercaptúrico é necessário que ocorra
a clivagem sequencial do ácido glutâmico e glicina a partir do grupo glutationa, seguido
da N-acetilação do conjugado de cisteína resultante. As duas primeiras etapas da síntese
do ácido mercaptúrico são catalisadas pelas γ-glutamiltranspeptidase e aminopeptidase
M (Almeida, 2008).
Figura 8- GSH na destoxificação de xenobióticos: via ácidos mercaptúricos. Adaptado

de Almeida, P., Fátima, A., Huber, P.C. (2008) Glutationa e enzimas relacionadas:
papel biológico e importância em processos patológicos. Química Nova, 31, pp.1170-
1179
A conjugação com a GSH representa uma reacção de destoxificação bastante

importante, uma vez que os electrófilos são espécies potencialmente tóxicas. Estes
podem-se ligar a nucleófilos críticos intracelulares, tais como proteínas e ácidos
nucleicos, podendo provocar lesões celulares e mutações génicas. Por outro lado, todas
as enzimas responsáveis da biotransformação dos xenobióticos têm o potencial de gerar
UFP-FCS drogas
intermediários reactivos, que vão ser são destoxificados pela conjugação com a
glutationa. A glutationa é também um co-factor para a sua respectiva peroxidase. Esta
desempenha um papel importante na protecção das células contra a peroxidação
lipídica. A resistência a compostos tóxicos é diversas vezes associada a uma expressão
exacerbada da GST (Bertini, 2003).
Legenda:
1- Substância antineoplásica;
2- Intermediário durante a conjugação com

GSH;
3- Catião sulfónico;
4/ 5-Óxidos arenos;
6/7- Álcoois Isoméricos;
8- Conjugação com GSH;
9- Conjugado resultante da interacção com GSH;
10- Quinona;
11- Conjugado excretado.
Figura 9- GSH na destoxificação de xenobióticos: Exemplos da actuação da glutationa

transferase na destoxificação celular de xenobióticos. Adaptado de Almeida, P., Fátima,
A., Huber, P.C. (2008) Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico e
importância em processos patológicos. Química Nova, 31, pp.1170-1179
UFP-FCS drogas
O acetoaminofeno (ou paracetamol) é um analgésico usado em grande escala por

toda a faixa etária populacional, sendo um fármaco seguro quando usado em doses
terapêuticas. Em sobredosagem, o seu uso pode causar danos a nível hepático e renal.
Este componente é metabolizado de acordo com a figura 10, gerando um metabolito
tóxico designado de N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) (A8) (Flanagan, 2007).
Isto advém da descoberta de concentrações elevadas da enzima prostaglandina H
sintetase (PGHS) a nível renal, que actuando sobre o acetoaminofeno em situações de
sobredosagem, gera a principal contribuição para a toxicidade do respectivo
componente sobre o órgão em questão. Esta toxicidade atribuída, deve-se ao facto de
quando ocorre a redução da prostaglandina PGG2 à PG2, catalisada pela PGHS, ocorre
em simultâneo a oxidação do acetoaminofeno a NAPQI. A GSH entra nesta fase
metabólica do processo no sentido de destoxificar o metabolito formado (NAPQI),
através da conjugação deste metabolito reactivo com a GSH, originando um conjugado
(B8) desprovido de toxicidade (Almeida, 2008).
A8 B8
Figura 10 - Bioactivação/destoxificação do acetoaminofeno. Adaptado de Almeida, P.,

Fátima, A., Huber, P.C. (2008) Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico e
UFP-FCS drogas
Em determinados casos, a conjugação com a GSH leva ao aumento da toxicidade do

xenobiótico de partida. É o caso de haloalcanos e alil, benzil e feniletil-isocianatos. O
diclorometano (CH2Cl2), haloalcano, é um potente genotóxico, levando ao aparecimento
de cancro de pulmão e hepático em ratos. Esta genotoxicidade é atribuída à bioactivação
deste composto por meio de GST citosólicas (hGSTT1-1 e rGSTT5-5). Inicialmente
ocorre uma substituição nucleofílica, “sai” um átomo de cloro e “entra” GSH, gerando-
se o conjugado S-clorometilglutationa reactivo e instável, que ataca locais nucleofílicos
intracelulares como as bases nitrogenadas do DNA, provocando a despurinação da
molécula de DNA. Desta forma o DNA fica comprometido podendo mesmo levar à
morte da célula em causa (Almeida, 2008).
Figura 11- Bioactivação do diclorometano através da GSH. Adaptado de Almeida, P.,

Fátima, A., Huber, P.C. (2008) Glutationa e enzimas relacionadas: papel biológico e
Relativamente à activação de conjugados, foram identificados quatro mecanismos

de activação dependentes da glutationa:
1) Formação de conjugados com a glutationa de haloalcanos, tiocianatos orgânicos, e

nitrosoguanidas, onde o metabolito formado apresenta toxicidade.
2) Formação de conjugados de GSH de di-haloalcanos proximais, que são

inerentemente tóxicos, uma vez que podem formar mostardas sulfuradas electrofílicas.
UFP-FCS drogas
3) Formação de conjugados de GSH de alcenos halogenados, que são degradados e

produzem metabolitos tóxicos através da β-liase no rim.
4) Formação de conjugados de quinonas, quinoneiminas e isotiocianatos com a

glutationa, que são degradados a metabolitos tóxicos pelas GGT e endopeptidase M no
rim (Alberts, 1994).
3.2) Excreção e transporte
A excreção e o transporte de GSH são dois processos intimamente ligados, uma

vez que a glutationa para ser excretada necessita de ser transportada para o meio
extracelular. Esta sai do organismo através de mecanismos de destoxificação de
substâncias tóxicas, na qual esta funciona como um meio de excreção para este tipo de
substâncias. No entanto, existe um mecanismo geral de degradação da GSH a partir do
momento que esta sai do interior das células. A GSH sofre a acção de GGT a nível
plasmático, enzimas estas que estão localizadas na superfície exterior das células. Estas
enzimas vão catalisar a GSH e/ou glutationa S-conjugados, originando γ-glutamil
aminoácidos. A maioria destas transpeptidases encontram-se ao nível do rim, sendo os
compostos resultantes excretados na urina (Bertini, 2003).
Para que a GSH e glutationa S-conjugados atinjam o meio extracelular, sangue e

bílis, é necessário que haja um processo responsável pelo transporte. Apesar da pouca
literatura sobre esta abordagem e de dados conclusivos, actualmente sabe-se que
existem pelo menos duas classes de exportadores membranares. A primeira classe são
MRP, nomeadamente MRP1 e MRP2. Ambos realizam transporte de GSH e glutationa
S-conjugados e MRP1 está presente em todas as células tendo um papel omnipresente
no transporte. MRP2 não é encontrado em todas as células mas é responsável pelo
transporte de GSH e seus conjugados na bílis. Ambas as proteínas transportadoras são
dependentes de ATP (Ballatori, 2009).
Novos estudos indicam que para o transporte de xenobióticos associados à GSH

existam pelo menos 4 mecanismos (Ballatori, 2008).
UFP-FCS drogas
Figura 12: Quatro mecanismos possíveis de interacção da GSH com as proteínas MRP.
1- GSH propriamente dita como substrato para a proteína MRP; 2- O transporte de GSH
é promovido pela presença de outros substratos, mas estes não são transportados, apenas
a GSH; 3- A GSH é co-transportada juntamente com outro substrato; 4- O transporte de
alguns substratos é estimulado e/ou é dependente de GSH, mas GSH em si não é
transportada. Adaptado de Ballatori N., Hammond C.L., Krance S.M., Marchan R.
(2008) Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and
pathophysiology. Elsevier, Aspects of Medicine, pp.3-10
A conjugação da GSH é fundamental para a eliminação de muitos tóxicos mas essa

função está cada vez mais associada à presença de MRP. Estudos revelam que foi
verificado que os transportadores MRP têm mais afinidade para a glutationa quando
esta se encontra conjugada (Ballatori, 2005).
3.3) Poder antioxidante
A GSH é a primeira linha de defesa contra ROS que o organismo humano

concretiza a favor da sua homeostasia. Consiste na neutralização de radicais livres e
redução do peróxido de hidrogénio. A glutationa é solúvel em água e é o principal
antioxidante no citoplasma. Como se não bastasse a forma directa de actuação de GSH,
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verifica-se uma segunda linha de defesa contra a oxidação, estando a cargo de enzimas
glutationa-dependentes que atingem principalmente subprodutos nocivos gerados por
ROS e evitam em simultâneo a propagação de radicais livres. Enzimas como a GST,
catalisam a conjugação de GSH com diversificados compostos que são produzidos in
vivo na presença de stresse oxidativo (Franklin, 2010)
Na célula existem duas formas principais de defesa antioxidante: enzimática e não

enzimática. A defesa enzimática compreende várias enzimas do ciclo redox da
glutationa (glutationa redutase e glicose-6-fosfato-desidrogenase), sendo a mais
importante a GPx. Existem ainda outros sistemas enzimáticos intervenientes na defesa
antioxidante na qual inserem no seu mecanismo a enzima superóxido dismutase (SOD)
e a catalase. A primeira faz com que ocorra a dismutação do radical superóxido em
peróxido de hidrogénio e oxigénio. A segunda converte o peróxido de hidrogénio em
água e oxigénio molecular. É através destes sistemas que muitas das reacções
radicalares prejudiciais que decorrem in vivo são evitadas ou alteradas (Beattie, 2010).
As enzimas glutationa-dependentes são coordenadamente induzidas à expressão

em resposta ao stresse oxidativo, designada cientificamente de antioxidant responsive
element (ARE). Estas espécies radicalares vêm-se envolvidas em mecanismos reactivos
inflamatórios ou podem actuar como segundos mensageiros de variadas funções
celulares. Desta forma, a taxa de formação e remoção de espécies reactivas deve ser
realizada de forma equilibrada e compensatória para que os processos metabólicos
dependentes das mesmas possam decorrer numa proporção adequada para o bom estado
fisiológico das células (Franklin, 2010).
3.4) Manutenção do estado tiol
Como referido anteriormente, o quociente GSH/GSSG reflecte o estado redox

intracelular. Este ambiente redox está envolvido na regulação de processos celulares
importantes, incluindo a diferenciação celular, proliferação e apoptose. A capacidade de
sinalização redox vai depender da disponibilidade de grupos tiol activos. Alguns dos
mecanismos possíveis na qual a GSH afecta a sinalização celular incluem a eliminação
UFP-FCS drogas
de radicais livres, manutenção do estado tiol das proteínas e a ligação covalente da

cisteína a porções de proteínas citosólicas (S-glutationilação). A S-glutationilação
apresenta-se como um mecanismo viável de regulação do estado redox. Regula
proteínas sinalizadoras, factores de transcrição, canais e bombas iónicas, proteínas
mitocondriais, proteínas do citoesqueleto, onde desempenha um papel na diferenciação
celular. Neste contexto, é importante a manutenção de um equilíbrio intracelular do
estado redox. A GSH é o tiol não proteico dominante no organismo e, como tal, surge
como factor essencial na manutenção do potencial redox celular através das suas acções
como antioxidante e modulador do equilíbrio sulfidrilo-dissulfureto proteico, tal como
representado na seguinte reacção (Lu, 2009):
Proteína-SSG + GSH Proteína-SH + GSSG
Como esta reacção é reversível, o equilíbrio é determinado pelo estado redox

celular, o que vai sempre depender das concentrações existentes de GSH e GSSG
(Ballatori, 2008).
Estabelecendo-se um equilíbrio redox na célula, esta apresenta melhores

prestações na sua proliferação e proporciona maior resistência a danos oxidativos.
UFP-FCS drogas
Capítulo IV: Relação da Glutationa em Doenças Humanas
UFP-FCS drogas
4.1) Introdução ao tema
A glutationa é uma molécula determinante em diversos processos celulares e

como tal, qualquer alteração na sua homeostasia pode influenciar a etiologia e/ou
progressão de diversas doenças humanas. O par redox GSH/GSSG nas células funciona
como bioindicativo da sua respectiva vitalidade (Ballatori, 2009).
Cada vez mais existem estudos que sustentam a evidência de que a formação
reversível de moléculas contendo GSH e resíduos cisteínicos de proteínas com pka
baixo são uma importante contribuição para a regulação metabólica, estrutural e
dinâmica translacional das proteínas, e ainda, para a regulação da sinalização das vias
metabólicas em sistemas celulares intactos. Como tal, é visível o “poder” que a
glutationa tem sob o organismo humano a nível metabólico. Sendo uma molécula que
desempenha múltiplas funções, é difícil atribuir uma causa directa para determinada
doença por alteração dos níveis de GSH ou do estado redox. Apenas se pode inferir que
existe uma participação da GSH para a manifestação e progressão da patologia
(Bonnefoy, 2002).
4.2.) Glutationa e o seu estado de homeostasia
Os níveis de GSH, em condições normais, podem ser regulados através do

controlo da taxa de síntese na célula, controlo da taxa de exportação a partir de células e
da redução da GSSG.
No entanto, os níveis de GSH não podem ser apenas resumidos a estes três
mecanismos, porque também são influenciados por condições que podem alterar o seu
estado redox, formando-se conjugados S-glutationa, ou complexos que afectam a
distribuição de GSH no organismo (Chen, 2004).
O estado nutricional, hormonal e situações de stresse, são condicionantes dos

níveis de GSH, verificando-se a existência de variações entre o estado diurno e nocturno
bem como situações de exercício físico e gravidez (Beattie, 2010).
UFP-FCS drogas
A síntese de GSH varia em função do tipo de célula e tecido. Após a sua síntese,
como já mencionado, parte é compartimentalizada intracelularmente, para mitocôndrias,
reticulo endoplasmático e núcleo. Outra parte vai para o espaço extracelular, inclusive o
plasma sanguíneo, secreções exócrinas, fluido de revestimento do pulmão, e fluido
cerebrospinal. O conteúdo de GSH que segue para o núcleo é efectuado por difusão
passiva através dos poros nucleares (Lu, 2009).
Ao contrário do que se verifica durante a síntese, na degradação de GSH, todo o

processo decorre no meio extracelular. A exportação de GSH é considerado o passo
inicial para a regulação das taxas de equilíbrio homeostático em todas as células de
mamíferos (Lu, 2009).
Figura 13: Vias do estado homeostático da glutationa nas células (Síntese, reacções
redox e conjugação). Adaptado de Ballatori, N., et alii. (2009) Glutathione
dysregulation and the etiology and progression of human diseases. The Journal of
Biological Chemistry, 390, pp. 191-214.
4.3) Relação da Glutationa com doenças humanas
A elevação do estado oxidativo ou dos níveis normais de GSH podem levar ao

desencadeamento de diversas patologias. A diminuição nos níveis de GSH implica um
UFP-FCS drogas
aumento na susceptibilidade ao stresse oxidativo. Em contrapartida, valores superiores

ao normal, aumentam a resistência ao ambiente oxidativo, devido a uma capacidade
antioxidante acrescida. Este fenómeno já foi observado em células cancerígenas
(Anazetti, 2007). Talvez a melhor forma para a compreensão de que a GSH está
relacionada com determinadas doenças, é determinar os níveis de GSH durante a
ocorrência da patologia. Nestes casos e em determinadas doenças verifica-se a presença
de falhas no metabolismo da GSH (Abraham, 1996; Park, 2010).
Estudos anteriores indicam que durante o ciclo do γ-glutamilo, das 6 enzimas

integrantes, 5 poderão despoletar doenças, caso se verifique alguma anomalia em: γ-
glutamilcisteína sintetase, glutationa sintetase, 5-oxoprolinase, γ-glutamiltranspeptidase
e dipeptidase (Carolis, 2009).
No caso de se verificar uma deficiência em γ-glutamilcisteína sintetase, pode

condicionar a síntese de GSH e representar uma rara doença autossómica recessiva,
denominada de anemia hemolítica. Esta pode manifestar-se através de sintomas
neurodegenerativos e em alguns pacientes é notória uma degeneração espinocerebelar,
neuropatia periférica, miopatia e aminoacidúria (Chen, 2004).
Uma leve deficiência na GS, acompanhada por mutações de estabilidade na

enzima, provoca uma anemia hemolítica compensada. Pacientes com deficiência
moderada a grave de GS revelam mutações que afectam as propriedades enzimáticas. A
anomalia moderada leva a anemia hemolítica e acidose metabólica, enquanto numa
situação mais agravada, leva à oxoprolinúria, infecções bacterianas e disfunção
progressiva do sistema nervoso central, provocando uma degeneração e recessão mental
e motora. Em alguns casos é ainda verificado a pigmentação da retina. Esta é uma
doença que não tem cura. É recomendado a administração de vitamina C e E para
aumentar os níveis de antioxidantes e de bicarbonato de sódio para o combate da
acidose metabólica. A acidose metabólica é explicada pela diminuição do feedback
inibitório de γ-glutamilcisteína sintetase, proveniente dos baixos níveis de GSH. Nestas
condições a enzima γ-glutamilcisteína sintetase continua a produzir grandes quantidades
de γ-glutamilcisteína, que é depois convertido em 5-oxoprolina. A 5-oxoprolina vai
estar em excesso, sendo eliminada depois pela urina (Nishimura, 1999).
UFP-FCS drogas
A enzima 5-oxoprolinase catalisa a abertura do anel da 5-oxoprolina com a

intenção de fornecer glutamato à reacção. Uma deficiência nesta enzima não é normal
acontecer e corresponde a uma rara doença recessiva autosomática designada de 5-
oxoprolinúria. Esta doença manifesta-se por ser clinicamente heterogénea, com a
formação de cálculos renais, enterocolite, degeneração mental, hipoglicemia neonatal,
anemia microcítica e microcefalia (Nishimura, 1999).
As propriedades multifuncionais da GSH estão reflectidas num interesse crescente

desta molécula como parte integrante das mais diversas investigações (Ballatori, 2008).
De seguida, descreve-se alguns casos onde essa influência é visível.
4.3.1) Glutationa vs Doenças Cardiovasculares
O stresse oxidativo pode resultar do excesso da produção de espécies oxidantes ou

da depleção das defesas antioxidantes. As principais doenças cardiovasculares
associadas a este desequilíbrio redox são a hipertensão e aterosclerose.
Polimorfismos em enzimas antioxidantes, incluindo a GPx e a GST, estão

associados a aumento do risco da doença cardiovascular, devido à acumulação de ROS.
Numa visão mais particular, um polimorfismo ao nível da glutationa peroxidase,
significa um risco aumentado para a doença cardíaca coronária, derrame e trombose
venoso cerebral. No caso de um polimorfismo ao nível da glutationa S-transferase,
verifica-se a elevação de marcadores inflamatórios e um aumento do risco de uma
doença coronária em tabagistas (Ballatori, 2008). A fim de contrariar o fenómeno, as
enzimas tioredoxina e glutarredoxinas desempenham uma função importante na
protecção contra este tipo de doenças, através de melhoria dos efeitos causados pelos
ROS, atenuando os efeitos da inflamação (Bruguera, 2002).
O desenvolvimento da hipertensão está fortemente associado ao aumento das

espécies reactivas em células endoteliais, assim como ao aumento de angiotensina II,
uma vez que é um forte estímulo para a produção de novas espécies reactivas de
oxigénio. Estudos efectuados em ratos revelam que a angiotensina II induz a
UFP-FCS drogas
hipertensão arterial mas é possível de ser impedida por MRP1. Esta característica foi
designada pelo aumento dos níveis de GSH nas células do endotélio vascular,
provocado pela diminuição da exportação de GSH. Uma hipótese terapêutica sugerida
para atenuar estes efeitos é a administração de GSH em lipossomas (Bruguera, 2002;
Ballatori, 2008).
4.3.2) Glutationa vs Doenças Pulmonares
Diversas células do parênquima pulmonar são capazes de gerar radicais livres de

oxigénio (RLO), como células endoteliais, células alveolares tipo II, células ciliadas da
via aérea, e macrófagos alveolares. Estes sistemas geradores de RLO no pulmão são
semelhantes aos dos outros tecidos (Ballatori, 2008).
Um desequilíbrio na homeostasia da GSH e no seu estado redox, contribuem para

a etiologia e progressão de doenças pulmonares como por exemplo doença pulmonar
obstrutiva crónica (DPOC), enfisema pulmonar, asma e insuficiência respiratória aguda.
Por outro lado, as contribuições do meio ambiente para a destabilização do equilíbrio
interior do organismo, não podem ser ignoradas afectando a homeostasia da GSH. A
regulação dos níveis de GSH no pulmão consiste num sistema bastante complexo
(Bruguera, 2002).
O factor de transcrição Nrf2 desempenha um papel fundamental na regulação da

expressão de numerosos genes de compostos antioxidantes, incluindo GCS, GST e GPx,
e verifica-se ainda que o Nrf2 e a GPx apresentam níveis reduzidos em doentes com
enfisema pulmonar. Este factor, Nrf2, na DPOC, intervém na regularização dos níveis
de GSH que se encontram diminuídos. Esta proteína, Nrf2, aparece também como
controlador do conteúdo da GSH por regularização da expressão de MRP1 (Rahman,
2005).
Fenómenos de polimorfismo em enzimas integrantes da actividade da GSH, são

também responsáveis pelo desenvolvimento de doenças pulmonares. Se se verificar
polimorfismo na γ-glutamilcisteína sintetase e glutationa S-transferase, podem
UFP-FCS drogas
contribuir para o aumento do risco de DPOC. Decorrem assim vários estudos no sentido
de verificar os benefícios de compostos antioxidantes, tais como a N-acetilcisteína e o
polifenol resveratrol, em doenças pulmonares. No futuro, o uso de substâncias
neutralizantes dos RLO pode fazer parte do arsenal terapêutico no combate às principais
doenças pulmonares (Carolis, 2009).
Outra alternativa a ser estudada é a administração directa de GSH, que revela ser
uma alternativa terapêutica bastante benéfica, uma vez que vai proteger e “revitalizar”as
células epiteliais na prevenção contra a asma (Rahman, 2005).
4.3.3) Diabetes mellitus
A diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por uma elevação

crónica e prolongada da glicose sérica. Esta elevação deve-se à ineficiência de insulina
capaz de compensar os valores de glicose, podendo manifestar-se em dois tipos
diferentes de diabetes (Ballatori, 2009).
As concentrações de GSH em eritrócitos e plasma sanguíneo são mais baixas em

diabéticos e pacientes com síndrome metabólica e, consequentemente, os níveis
reduzidos de GSH potencializam os efeitos causados pela presença de ROS. Os níveis
de GSH podem ser diminuídos de duas formas: efeito directo da glicose e insulina na
síntese de GSH ou pelo consumo de um co-factor essencial na regeneração de GSH
através da GSSG, através da via poliol (Lu, 2009). Esta via pode levar a uma redução
de GSH, uma vez que é dependente de NADPH para conseguir estabelecer a conversão
de glicose em sorbitol, catalisada pela aldose redutase. Em condições normais de
glicose, esta via é pouco usada, no entanto, em casos de hiperglicemia, esta via é
recorrente provocando uma diminuição nos níveis de NADPH. Desta forma, a
conversão de GSSG a GSH fica comprometida, uma vez que o NADPH está a ser usado
para a conversão de glicose e não se encontra disponível para a conversão da glutationa.
Em condições severas de stresse oxidativo isto leva a uma diminuição acentuada de
GSH (Kharb, 2000).
UFP-FCS drogas
4.3.4) Efeitos da insulina e da glicose na síntese de GSH
A exposição prolongada a níveis elevados de glicose promove a diminuição dos

níveis celulares de GSH e diminuição do mRNA para as subunidades reguladoras da
GCS. Esta enzima tem demonstrado uma diminuição de actividade em eritrócitos de
pacientes diabéticos. No entanto, a actividade da GS, parece não ser afectada pela
diabetes. Ao contrário do que se verifica com a glicose, níveis elevados de insulina
promovem a actividade catalítica da GSH e verifica-se o aumento da actividade,
experimentalmente, em culturas de eritrócitos de doentes diabéticos. A relação entre
níveis altos de glicose e baixos de insulina, vai proporcionar a formação de ROS. A
diminuição da síntese de GSH e os baixos níveis da GSH promovem um
enfraquecimento das defesas celulares contra o stresse oxidativo (Kharb, 2000).
Actividade da glutationa peroxidase em células-β pancreáticas:
As células β-pancreáticas são fundamentais na regulação dos níveis de insulina no

organismo. Estas, em situações de stresse oxidativo, ficam expostas a danos oxidativos.
A exposição a altas concentrações de glicose não aumenta a expressão da enzima
glutationa peroxidase em células ilhota. Os baixos níveis iniciais de glutationa
peroxidase e a incapacidade das células ilhota em aumentar a expressão da respectiva
enzima durante o processo de stresse oxidativo, leva a que as células produtoras de
insulina – células β-pancreáticas – fiquem mais vulneráveis. Os baixos níveis de GSH
nos diabéticos, fazem com que existam valores baixos de substrato disponível para a
enzima glutationa peroxidase, contribuindo para uma baixa actividade das células
produtoras de insulina e, consequentemente, estas células tornam-se menos activas
contra o peróxido de oxigénio. Exemplo disso é a exposição prolongada de glicose que
diminui a actividade da glutationa peroxidase no endotélio vascular, células do rim e
mitocôndrias presentes no cérebro (Ballatori, 2009).
UFP-FCS drogas
4.3.5) Glutationa na terapia da diabetes
Estudos revelam que a GSH pode melhorar o desempenho do organismo no

combate à diabetes. A infusão de GSH em não-insulina dependentes melhora a captação
de glucose mediada pela insulina e os níveis de GSH nos eritrócitos. A N-acetilcisteína
também tem sido estudada verificando-se que o seu uso melhora o estado redox das
células (Ballatori, 2009). Estudos em modelos de ratos de laboratório, verificaram que a
administração de N-acetilcisteína reduzia a apoptose de células β-pancreáticas (Kharb,
2000). Com estes dados sugere-se que a N-acetilcisteína pode assim diminuir a
probabilidade de um estado hiperglicémico crónico evoluir para o estado de diabetes,
evitando ao mesmo tempo também danos noutros tecidos periféricos (Chen, 2004).
Outros estudos em modelo de ratos, revelam que este tipo de terapia sugerido para
o tratamento de diabetes, pode também ser útil para diabéticas grávidas. Verificou-se
que durante este estado os níveis de GSH encontram-se igualmente baixos bem como a
taxa de síntese. Após a administração de GSH, observou-se que os valores de GSH
foram recuperados parcialmente e, a actividade da γ-glutamilcisteína sintetase é possível
mesmo em estados de hiperglicemia, melhorando assim o crescimento do embrião e a
ocorrência de malformações (Ballatori, 2009).
4.3.6) Glutationa em infecções virais
Alguns estudos incidem na associação que a GSH pode ter durante o processo de
infecção viral e, de que forma a GSH melhora essa infecção (Obert, 1994; Franklin,
2010).
Durante infecções virais como HIV, verifica-se que os níveis de GSH se

encontram diminuídos, e podem estar associados com a diminuição da capacidade de
sobrevivência em indivíduos infectados. Os níveis de GSH encontram-se diminuídos no
plasma sanguíneo, no líquido epitelial de revestimento, nas células mononucleares de
sangue periférico e em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV. No entanto, o
mecanismo de depleção de GSH nestes casos ainda não é conhecido (Cohen, 1997;
UFP-FCS drogas
Ballatori, 2009). O mesmo estudo revela a existência de uma associação entre os níveis
baixos de GSH com a replicação do vírus. Sabe-se que um défice de GSH em doentes
infectados por HIV, vai favorecer a replicação viral e consequentemente a progressão da
doença. Os mecanismos subjacentes a este processo não estão ainda esclarecidos, no
entanto há evidências de que há diminuição de GSH e que durante a progressão do HIV
o número de linfócitos CD4+ vai diminuindo, sendo que a diminuição de GSH contribui
para a apoptose dessas células CD4+ (Ballatori, 2009).
4.3.7) Doenças neurodegenerativas
O cérebro é bastante sensível à alteração da homeostasia da GSH. Disfunções do

sistema nervoso estão relacionadas com erros inatos do metabolismo da GSH. Duas
hipóteses foram levantadas na tentativa de explicar a sensibilidade das células cerebrais
às oscilações dos níveis de GSH. A primeira baseia-se no facto de este órgão consumir
altas concentrações de oxigénio. A segunda baseia-se no facto da GSH poder funcionar
como neuromodulador ou neurotransmissor, sendo assim essencial para a actividade do
sistema nervoso central (Dringen, 1999; Ballatori, 2009).
Apesar de o cérebro representar apenas 2% do peso corporal nos humanos, este

órgão consome cerca de 20% do oxigénio total, e cerca de 90% desse oxigénio é usado
por mitocôndrias para produzir ATP (Ballatori, 2009). Como tal, é de prever que o
stresse oxidativo seja considerado por muitos autores, um dos mecanismos mais
implicados no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, nomeadamente,
doenças como Parkinson, Huntington e doença de Alzheimer (Kryzhanovsky, 2004).
Os níveis de GSH no cérebro são baixos comparativamente com outro tipo de

tecidos e/ou células. Por exemplo, as concentrações de GSH nos neurónios são de
aproximadamente 2,5 M (Ballatori, 2009). Estes valores diminuídos podem ser causa de
uma menor actividade específica para GCS em neurónios, tornando o cérebro mais
sensível a substâncias tóxicas. Neste tipo de células a expressão do MRP1 é baixa, o que
condiciona o transporte de GSH para estas células (Wilson, 2003).
UFP-FCS drogas
A doença de Alzheimer é uma das principais doenças neurodegenerativas a ser

estudada devido à controvérsia de resultados obtidos acerca do papel da GSH nesta
doença (Bannister, 1974). O stresse oxidativo é proposto como um importante
mecanismo patogénico causal da doença. Diferentes investigadores, para iguais zonas
do cérebro, obtiveram dados diferentes em termos quantitativos de níveis GSH,
demonstrando a complexidade desta abordagem, no esclarecimento do papel da GSH.
No entanto, sabe-se que níveis baixos de GSH potenciam os efeitos nefastos da
patologia (Tapiero, 2003).
Outros estudos demonstraram que doentes parkinsónicos têm falta de dopamina

no circuito neuronal nigroestriado (Wilson, 2003). No entanto esta é uma doença que
actualmente não está devidamente esclarecida na qual as causas efectivas não são ainda
exactas. O papel do stresse oxidativo é realçado pela determinação do conteúdo em
GSH nos diversos estados patológicos. Verifica-se que os níveis de GSH são menores,
aproximadamente 40%, na substância nigra em doentes parkinsianos. A nível celular, as
células dopaminérgicas demonstram perder valores significativos de GSH, realçando a
importância desta molécula no organismo. Devido ao facto da região nigraestrial ser
abundante em GSH, é provável que a oxidação da dopamina leve à depleção de GSH.
Contudo, este efeito de diminuição dos níveis de GSH, não se supõe ser a principal
causa para o despoletar da doença, como também a grande evidência de depleção surge
na substância nigra e não de forma generalizada a todos os tecidos. No entanto, o facto
de ocorrer decréscimo em GSH, leva a um ambiente propício à ocorrência de morte
celular programada e como tal, existe uma associação indirecta da depleção de GSH
com a morte celular programada nestas células (Bannister, 1974).
Numa vertente mais especulativa, existe outra hipótese de explicação para a

sensibilidade do sistema nervoso central face à diminuição da GSH. Esta pode funcionar
como um neuromodulador ou neurotransmissor e, como tal, qualquer alteração que
ocorra nos níveis de GSH, taxas de rotatividade, ou estado de oxidação, pode prejudicar
a actividade do sistema nervoso central (Bernard, L.P., 2008). A GSH é composta por
três aminoácidos neuroactivos (glutamato, cisteína e glicina) e, devido a este facto, esta
molécula pode ser considerada como uma forma de armazenamento ou precursor para
estes aminoácidos biologicamente activos. O glutamato e glicina, funcionam como
UFP-FCS drogas
neurotransmissores excitatórios e inibitórios, respectivamente. A cisteína apresenta

também um efeito excitatório na N-metil-D-aspartato (NMDA), componente de uma
classe de receptores de glutamato (Lomaestro, 1995). Quando se verifica a degradação
da GSH extracelular através da GT, libertam-se os seus aminoácidos respectivos
(Bernard, 2008; Augustine, 2004).
O papel crítico verificado pelo desempenho da GSH na sobrevivência neuronal

fornece uma razão bastante sustentável para o desenvolvimento de terapias destinadas a
restabelecer os níveis cerebrais de GSH. Contudo, as tentativas no sentido de fazer a
esta terapia um sucesso têm sido ineficazes. Existem obstáculos nos quais fazem com
que a entrega de GSH não seja tão imediata como se pretende. A impermeabilidade
relativa da barreira hemato-encefálica (BHE) e o facto da cisteína, que é o aminoácido
limitante da síntese de GSH, poder ser citotóxica quando administrado em doses
elevadas, fazem com que esta terapia seja inviabilizada (Tapiero, 2003).
Como na ciência tudo é certo até se provar o contrário, é de se prever que para
breve estas limitações possam ser ultrapassadas e se verifique um grande avanço no
meio terapêutico no âmbito da utilização da GSH, visto ser uma molécula com extremas
potencialidades.
É de prever que com a progressão da idade, os níveis de GSH tendam a ser

progressivamente mais reduzidos e, por sua vez, os níveis de antioxidantes e defesas
contra estímulos exógenos tendem a ser mais escassos. Por exemplo, é um facto
adquirido que com o avanço da idade ocorra uma diminuição da actividade da GCS, GS
e GR. Esta redução talvez esteja envolvida numa série de factores que contribuem para
a redução não só da sanidade mental, como também para toda a redução sentida a nível
sensorial. É usual a audição e a visão sofrerem de forma progressiva uma redução na
sua eficácia, e, lentamente sofrerem danos que podem ser ou não prevenidos (Tapiero,
2003). A GSH está normalmente presente em valores elevados na lente ocular, córnea,
humor aquoso e na retina, onde irá executar diversas funções, incluindo a manutenção
da hidratação do tecido normal, manutenção da transparência da lente e protecção
contra danos oxidativos (Giblin, 1983). Prevê-se que o declínio de GSH ocular esteja
implícito no desenvolvimento de doenças oculares relacionadas com a idade,
UFP-FCS drogas
nomeadamente cataratas nucleares, glaucoma e degeneração macular (Ballatori, 2009).

A visão depende em primeira instância da retina. Esta é um órgão sensorial
especializado que transforma os estímulos luminosos em estímulos eléctricos. Devido à
sua importância sensorial, à sua função, à extensa exposição solar e consumo de
oxigénio, este órgão demonstra ser especialmente susceptível ao stresse oxidativo. Da
mesma forma que neste caso a GSH funciona como um adjuvante no sentido de
prevenir as lesões na retina, esta tem sido associada também com a etiologia das duas
principais retinopatias, glaucoma e degeneração macular relaciona com a idade (DMI)
(Tapiero, 2003).
A suplementação com antioxidantes tornou-se uma estratégia terapêutica para

prevenir ou retardar as anomalias oculares, obtendo-se resultados benéficos e
sustentadores para a particular relevância que existe inerente à GSH (Kryzhanovsky,
2004).
A deficiência auditiva é outra doença crónica comum associada à idade. Esta

anomalia sensorial está também relacionada com a produção de ROS. Teste efectuados
em modelos de ratos demonstram que esta patologia desenvolve-se mais cedo e é mais
severa, quando se verifica a deficiência da superóxido dismutase, da mesma forma que
uma mutação no gene da glutationa peroxidase (GPx1) aumenta o ruído provocado pela
perda auditiva. Estes dados apenas são válidos em modelos de ratos usados em
investigação, contudo, prevê-se que o funcionamento humano passa também por estes
fenómenos (Tapiero, 2003).
Outras patologias poderiam ser abordadas no contexto de patologias de avanço

com idade. Na osteoporose estima-se que a GSH também seja benéfica como forma de
terapia. Face a esta realidade, seria interessante examinar e analisar se o tratamento
clínico com precursores de GSH e derivados, ou suplementos antioxidantes, em
mulheres pós-menopáusicas, surtiria resultados significativos para a saúde e, numa
vertente mais capitalista, benefícios de carácter económico (Ballatori, 2009).
UFP-FCS drogas
4.3.8) Neoplasias
Seria um grande avanço na ciência e na história da humanidade reverter a

mortalidade associado a uma das grandes doenças, senão a maior, do século XXI: o
cancro. Várias doenças já foram abordadas mas talvez o cancro demonstre uma
“emergência” mais evidente no sentido de obtenção de alternativas terapêuticas.
É sabido que ROS e espécies electrofílicas podem danificar o DNA e que a GSH
tem capacidade protectora face a esses agentes tóxicos. A GSH pode ainda destoxificar
directamente substâncias cancerígenas através da Fase II do metabolismo e subsequente
exportação destes produtos da célula. Por outro lado, índices elevados de GSH
verificados em vários tipos de células cancerígenas e em tumores sólidos conferem a
essas células e tecidos uma resistência acrescida face à quimioterapia. Outros dados
demonstram que este tipo de células patogénicas também apresenta uma actividade
superior em GCS e GST, e uma maior expressão do transportador para a glutationa
MRP/ABCC, como bombas de exportação (Tapiero, 2003).
O teor em GSH pode, em algumas células cancerígenas aumentar a resistência à

quimioterapia, funcionando assim como um factor limitante à eficácia da terapêutica. A
sobrexpressão específica de glutationa-S-transferase pode igualmente afectar a
resistência à quimioterapia. Uma elevada expressão desta enzima acompanhado com
altos níveis de GSH pode aumentar a taxa de conjugação de agentes quimioterápicos,
reduzindo assim a sua eficácia. Os níveis elevados que podem surgir da expressão de
transportadores como MRP/ABCC podem ser ainda outro factor que sustente a
quimioresistência. O MRP1 tem sido observado numa variedade de tumores sólidos e
hematológicos e o aumento de níveis da expressão de outros transportadores MRP são
encontrados em reduzidos tecidos cancerosos (Tapiero, 2003). No sentido de tentar
contornar os efeitos que a GSH tem perante a quimioterapia, sugere-se a depleção da
mesma ou a inibição da síntese como reversão do processo de resistência
quimioterápica. Contudo, não se consegue ainda direccionar selectivamente esta
depleção apenas às células oncogénicas, e como tal, todas as células iriam sofrer com
esta diminuição dos índices de GSH (Forman, 2009).
UFP-FCS drogas
Em termo de conclusão deste capítulo, expõe-se uma tabela resumo de doenças

associadas à molécula em estudo, GSH.
Tabela adaptada: Ballatori, N., et alii. (2009) Glutathione dysregulation and the etiology
and progression of human diseases. The Journal of Biological Chemistry, 390, pp. 191-
214.
GSH/Proteínas associadas Patologia associada
γ–Glutamilcisteína Anemia hemolítica, esquizofrenia, enfarte do

sintetase miocárdio, sintomas neurológicos, DPOC
Glutationa sintetase Anemia hemolítica, acidose metabólica, disfunção do

SNC
γ– Glutamiltranspeptidase Glutationúria, arteriosclerose
Dipeptidase Sintomas neurológicos
5-Oxoprolinase Sintomas neuronais, hipoglicémia, pedra renal
N- Acetiltransferases Sensibilidade a drogas
Glutationa-S-transferase Cancro, DPOC, doença cardiovascular, diminuição

auditiva
Glutationa redutase Anemia hemolítica , doença cardiovascular
Glutationa peroxidases Osteoporose, enfisema, doença cardiovascular
Peroxirredoxinas Anemia hemolítica, cancro, doença cardiovascular,

disfunção SNC
Glutarredoxina Doença cardiovascular
Tiorredoxina Doença cardiovascular
Transportadores :
MRP1/ABCC1 Redução da resposta inflamatória, resistência a

diversos fármacos
MRP2/ABCC2 Síndrome de Dubin-Johnson
CFTR/ABCC7 Fibrose cística
UFP-FCS drogas
Capítulo V : Apoptose: Intervenção da GSH
UFP-FCS drogas
5.1) Apoptose
A morte celular programada é um processo biológico altamente organizado que se

desencadeia de forma não acidental, induzido por uma infinidade de estímulos.
Caracterizada por um desencadear de processos bioquímicos específicos e por ocorrer
alterações morfológicas em células individualizadas. Necessita de energia e síntese
proteica para a sua execução e realiza-se em diversas etapas. Oposto à mitose, o seu
termo provém do grego “apoptwsiz” que compreende a queda das folhas das árvores no
Outono (Grivicich, 2007).
A ocorrência deste fenómeno no organismo é frequente e surge em diversas

situações não sendo implícito a existência de um agente patológico. É visível a sua
ocorrência no processo de organogénese e hematopoiese normal e patológica, durante o
processo de atrofia de órgãos, durante o processo de destoxificação por eliminação de
células e na reposição fisiológica de determinados tecidos maduros (Grivicich, 2007).
É desta forma que se obtém um equilíbrio homeostático que sendo afectado pode
promover o aparecimento de lesões proliferativas e degenerativas como enfarte do
miocárdio e doença de Alzheimer (Cohen, 1997).
Para desencadear um fenómeno desta natureza existem estímulos, tanto

intrínsecos como extrínsecos, que podem despoletar a morte celular programada. Entre
muitos podemos enunciar: agentes oxidantes, glicocorticóides, neurotransmissores,
factores de crescimento, toxinas bacterianas, cálcio, radicais livres e agentes
mutagénicos (Kiechle, 2002).
Da mesma forma que existem factores que promovem a apoptose, existem outros
que a suprimem e muitas vezes inibem o processo. Entre eles destacam-se: hormonas
androgénicas e esteroídes, ião de zinco e factores da matriz celular (Anazetti, 2007).
É um processo que contempla a sucessão de determinadas etapas. Inicia-se pela

perda da coesão da célula (perdendo aderência à célula vizinha) como se desintegrasse
do seu plano estrutural. No entanto os organelos celulares ainda se mantêm íntegros. De
UFP-FCS drogas
seguida a cromatina começa a condensar e a localizar-se junto da membrana nuclear que

nesta fase ainda se mantém coesa (Kannan, 2000).
Legenda:
A- Desagregação do núcleo com condensação nuclear.

B- Diminuição da célula.
C- Condensação celular e inicio de formação de vesículas.
D- Formação de corpos apoptóticos.
E- .
F-
Figura 14: Sequência de eventos apoptóticos. Adaptado de Reproductive and
Cardiovascular Disease Research Group – Apoptosis [Em linha]. Disponível em <
http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/> [Consultado em Julho
2010]
A partir desta etapa começam-se a formar prolongamentos membranares

designados de bleds e ocorre a desintegração do núcleo em fragmentos circunscritos
através da membrana nuclear. O DNA fragmenta-se (cariorexis). Como consequência da
sua degradação, o núcleo cinde-se em vários corpos cromatínicos. Estas etapas
prosseguem em termos de sucessão às anteriores onde, a esta instância inicia-se o
processo de formação de corpos apoptóticos que consiste no aumento dos bleds
acabando por rebentar. A membrana celular desagrega-se onde os corpos apoptóticos
contêm citoplasma, organelos e fragmentos nucleares. Face à resposta imunitária eficaz
do organismo, estes fragmentos vão ser fagocitados por macrófagos. Este processo de
reconhecimento procede-se rapidamente por parte dos fagócitos uma vez que durante a
formação dos corpos apoptóticos ocorre em simultâneo um processo de sinalização. A
fosfatidilserina transacciona-se do interior para o exterior da membrana plasmática,
ficando exposta à superfície externa da célula “marcando” desta forma as células que
deverão ser fagocitadas (Alberts, 1994).
UFP-FCS drogas
5.1.1) Intervenientes essenciais para a apoptose
Agregado Bcl-2 e IAP
A família Bcl-2 consiste numa família de proteínas que induzem ou suprimem a

apoptose. Os membros desta família têm um papel activo e determinante na apoptose
daí ser relevante e importante a sua menção num vertente não só informativa como de
contextualização da temática.
Mediante a sua expressão e o tipo de célula, apresentam um papel ou de indução

ou de inibição da apoptose. Proteínas como Bcl-2 e Bcl-XL inibem a apoptose
impedindo a libertação de citocromo c da mitocôndria, sendo assim designadas de
proteínas anti-apoptóticas, podendo mesmo inibir a formação de espécies reactivas de
oxigénio e consequente acidificação do meio intracelular. Por sua vez, Bax, Bid e Bak
são proteínas pró-apoptóticas. A sua localização no citoplasma da mitocôndria também
difere sendo que Bcl-2, Bcl-XL e Bax encontram-se nas membranas intra
citoplasmáticas, Bad e Bid estão definitivamente no citosol. Esta diferente localização
indica mecanismos distintos de participação na regulação da apoptose,
independentemente do seu papel em todo o processo (Grivicich, 2007).
Outra particularidade desta família é que Bax e Bcl-2 conseguem formar

homodímeros – Bax-Bax e Bcl-2-Bcl-2 – e heterodímeros – Bax-Bcl-2. É assente neste
equilíbrio entre homodímeros e heterodímeros que se define o balanço pró-apoptótico e
anti-apoptótico. Todas as proteínas bloqueadoras parecem funcionalmente equivalentes
nas formas de homodímeros ou de heterodímeros, enquanto a Bax só promove a
apoptose na forma de homodímero. Face a um estímulo de morte, a Bcl-2 “sequestra”
Bax ou ocupa locais por ele supostamente ocupados e inibe a permeabilização na
membrana externa da mitocôndria. Mediante outro tipo de estímulos desta vez
representativos para Bax, este interage com a mitocôndria, de forma independente da
interacção de proteínas anti-apoptóticas (Kiechle, 2002).
A família IAP é constituída exclusivamente por proteínas inibidoras de apoptose,

que inibem a actividade das caspases efectoras 3 e 7, a actividade da caspase iniciadora
UFP-FCS drogas
9, e ainda modulam o factor de transcrição NF-KB. Actualmente estão descritos a

existência de cinco membros pertencentes ao agregado IAP: NAIP, XIAP, c-IAP-1, c-
IAP-2 e survivina. Esta última tem sido visivelmente destacada ao longo dos estudos
efectuados na medida em que está associada fortemente à regulação e progressão da
mitose, inibição da apoptose e resistência ao tratamento por radioterapia e quimioterapia
em alguns cancros. No percurso apoptótico, as IAP são incapacitadas de efectuar a sua
ligação inibitória com as caspases, por meio de proteínas mitocondriais libertadas para o
citosol, na mesma instância em que é libertado o citocromo c que activa o Apaf-1
(apoptosis protease-activating factor-1) para interagir directamente com a caspase 9.
Tudo isto potencia a eficiência do processo de activação de morte celular programada
(Kiechle, 2002; Debatin, 2004).
5.2) Papel da glutationa na regulação da apoptose
Com o decorrer evolutivo da ciência, novos dados são identificados acerca de

numerosos processos, inclusive na apoptose. Sendo este um fenómeno deveras
determinante no organismo, é natural existir uma incidência forte de estudos e
investigações sobre todo o fenómeno, no sentido de se obter toda a informação possível
de maneira a que brevemente se obtenha um mecanismo capaz de intervir e manipular
de bom grado o fenómeno da apoptose. Por outro lado a glutationa é uma ferramenta
multidisciplinar no organismo intervindo nos mais diversos processos celulares,
verificando-se a sua actuação benéfica na maioria deles. Como tal, associar esta
molécula à apoptose e tentar interpretar diferentes situações comuns a ambas, é de todo
inteligente e merecedor de empenho e interesse sobre o mesmo (Kannan, 2000).
Dados recentes afirmam processo apoptótico não se sucede apenas da forma como
até agora tem sido descrito: um desencadear de activações em cascata que culminam na
morte celular. Existe antes e durante o fenómeno, todo um ambiente intracelular que
promove a apoptose, isto é, para este processo se efectuar é necessário que o interior da
célula tenha condições favoráveis para tal. O estado redox e alterações fisiológicas do
meio intracelular são essenciais para que a “célula pré-apoptótica” obtenha a sinalização
adequada (Grivicich, 2007).
UFP-FCS drogas
Apesar do papel da GSH na apoptose não estar plenamente esclarecido, os estudos

revelam que é um factor de início da progressão da morte celular em virtude a uma série
de estímulos apoptóticos (Franklin, 2010).
A GCS é um factor que relaciona a GSH à apoptose uma vez que pode proteger as
células de estímulos extrínsecos e intrínsecos que levam à activação das vias de
sinalização. Níveis elevados de GCS inibem a activação de apoptose porque a GSH em
excesso protege a célula de estímulos apoptóticos Por outro lado, níveis reduzidos de
GCS levam à activação do fenómeno em diversos tipos de células. Outra informação
interessante é o facto do promotor desta enzima apresentar locais de ligação para o
reconhecimento de proteínas como a proteína activadora-1 (AP-1 ou TRE), AP-2, factor
nuclear kB(NF-kB) e EpRE (elemento de resposta antioxidante). Este elemento
encontra-se localizado no flanco 5’ da sequência de genes em ambas as subunidades
estruturais (catalítica e reguladora) da GCS. Esta informação isolada não demonstra ter
directamente interferência com a apoptose. No entanto, o EpRE, mediante o gene
expressado, regulada a funcionalidade do factor Nrf2. Este quando em concentrações
baixas, reduz consequentemente a expressão de GCS, o que leva à diminuição de GSH e
enzimas GSH-dependentes. Este ambiente em défice de GSH leva à progressão de um
ambiente propício aos radicais livres, e posterior apoptose. Por conseguinte, o Nrf2 é
relacionado com a resistência à apoptose e protecção contra a oxidação. (Friesen, 2004;
Kiechle, 2002).
Uma questão lógica e pertinente é qual será a mais-valia, GSH no meio interno
citosólico ou no meio interno mitocondrial? Visto que ambos os meios se vêm
envolvidos com diferentes vias de activação apoptótica, será interessante saber se é mais
vantajoso existir uma saturação de GSH num meio do que no outro e qual será a
consequência inversa.
Alguns estudos apontam para o facto de a apoptose estar directamente relacionada

com o declínio de GSH no meio citosólico mas não no mitocondrial (Franklin,
2010).Por outro lado, existem estudos que demonstram que valores baixos de GSH
mitocondrial são um promotor de activação da cascata das caspases. Patologias e
tratamentos que provoquem o decréscimo de GSH surgem como evidências para a
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disfunção de GSH mitocondrial, em vez da citoplasmática. Outro dado indicativo da

GSH mitocondrial como interveniente na apoptose é o facto de tióis situados na
mitocôndria, agirem como reguladores do respectivo fenómeno. De facto a mitocôndria
é um organelo essencial na célula e a sua intervenção directa na respiração aeróbia faz
com que estas estruturas sejam preventivas face a situações de oxidação e que uma
depleção de GSH, torne a célula mais susceptível à lesão oxidativa. Como tal, não é
fácil debater qual o mais importante e mais relevante para a apoptose, se a GSH
mitocondrial ou a citosólica, dado tratar-se de sistemas indissociáveis visto que a GSH
citosólica, juntamente com reservas de GSSG e glutationa redutase em toda a membrana
externa, são componentes necessários para que a mitocôndria permaneça funcional e
com níveis estáveis de GSH (Friesen, 2004).
A GSH é transportada do citoplasma para a mitocôndria, sendo necessária a

intervenção de transportadores monocarboxilatos, hidróxido de glutamato, entre outros.
Assim sendo, se existir uma abundância de transportadores, é provável que também seja
um factor de protecção contra a apoptose. Já foi comprovado experimentalmente que a
inibição do transporte de GSH para a mitocôndria leva a que o dano oxidativo seja
induzido pelo citocromo c e consequentemente há a activação da caspase 9 e posterior
apoptose (Franklin, 2010).
Toxicidade induzida por citotóxicos (xenobióticos, quimioterápicos e metais),

leva à oxidação da GSH a GSSG mediada por espécies reactivas de oxigénio,
diminuindo a biodisponibilidade de GSH e, em situações deste tipo, o resultado final é a
apoptose (Kannan, 2000). Estudos revelam que a diminuição de GSH intracelular,
concomitante a um aumento de ROS, são fenómenos característicos no fenómeno de
apoptose. Neste contexto, a perda de GSH é um dos eventos característicos de morte
celular por apoptose, uma vez que torna a célula intolerante à presença de agentes
oxidantes. Quando ocorre uma diminuição dos níveis de GSH mitocondrial, a produção
de energia é afectada e a célula incha sofrendo “necrose secundária” – apoptose tardia.
Ocorrendo uma diminuição na produção de ATP causada por agentes oxidantes, a
mitocôndria fica com um défice em energia, levando à libertação de citocromo c,
alterando a permeabilidade da membrana mitocondrial. Como é visível, existe uma
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panóplia de evidências que realçam a influência da GSH mitocondrial na apoptose

(Anazetti, 2007)
Transporte de GSH na Apoptose
As proteínas MRP são responsáveis pelo transporte da GSH, GSSG e conjugados

de glutationa para o meio extracelular e requerem ATP para efectuarem essa função.
Quando ocorre morte celular programada, verifica-se que a célula liberta GSH para o
meio extracelular através de transportadores específicos. Tanto o MRP como famílias de
Oatp1 estão a ser implicados na exportação de GSH durante a apoptose, no entanto
apenas existem dados conclusivos para a directa participação de MRP no respectivo
transporte (Ballatori, 2005).
Um estudo colocou em termo de comparação duas linhagens de células; células

que libertam GSH durante a apoptose, e células que não libertam. Ambas as linhagens
foram marcadas com calceína, complexo fluorescente, para a qual os MRP apresentam
capacidade de transporte. Foi verificado que o transportador apresenta diferente
localização e funcionalidade em cada uma das linhagens. Nas células onde se verificava
a libertação de GSH durante a apoptose, o MRP1 estava amplamente localizado na
membrana plasmática e em condições funcionais, uma vez que houve transporte de
calceína. Em contraste, nas células que não libertavam GSH verificou-se que continham
poucos MRP1 pois não ocorreu exportação de calceína, quer em condições normais,
quer em condições apoptóticas. Foi também comprovado que em situações de
sobrexpressão de MRP1, ocorria um aumento na libertação de GSH, tanto em condições
normais como em condições apoptóticas. Uma maior libertação de GSH juntamente
com uma redução de GSH intracelular, parece ser necessária para a progressão da
apoptose. Outros estudos têm associado também aumentos de citotoxicidade para as
células com sobrexpressão de MRP1 devido à perda de GSH intracelular (Ballatori,
2008). Por sua vez, o facto de sair GSH da célula faz com que o meio extracelular fique
saturado da mesma. Através de mecanismos específicos que envolvem a GGT, a GSH
pode ser regenerada no meio intracelular. Com isto e de uma maneira geral, a
sobrexpressão de GGT pode ser outra alternativa na prevenção da apoptose induzida
pelo stresse oxidativo (Kannan, 2000).
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5.3) A GSH na cascata de sinalização
A progressão da apoptose depende de um ciclo de amplificação de clivagens de

caspases. Estas são clivadas por activação de outras através de sinais e interacção com
receptores apropriados (Sies, 1999).
A diminuição dos níveis de GSH está envolvida na regulação tanto da via

extrínseca como intrínseca da sinalização apoptótica das caspases em pontos de
actuação e controlo distintos. A GSH modula a permeabilidade membranar e a
activação de caspases predispondo a célula para a ocorrência de apoptose. Índices
reduzidos desta molécula proporcionam a formação de poros membranares –
apoptossoma e activam a via intrínseca por dimerização oxidação dependente do
mediador Bax. Este ambiente com níveis reduzidos em GSH não só activa o Bax como
liberta o citocromo c da mitocôndria que para aceder às suas funções pró apoptóticas
necessita de ser oxidado. Para isso suceder leva a que os índices de GSH se tornem
escassos. Através da via das pentoses fosfato, a GSH pode elevar os seus valores e
tornar inactiva a libertação do citocromo c. Este fenómeno foi comprovado em células
cancerígenas e neurónios saudáveis (Kiechle, 2002).
Também para Bcl-2 se verificou uma relação com a GSH. Este regula de certa
forma o conteúdo de GSH em diferentes localizações na célula. Ao nível da mitocôndria
este interactua de uma forma directa com o conteúdo em GSH, mediando a sua função
antioxidante. Assim, o facto de existir um decréscimo de GSH faz com que a resistência
que Bcl-2 oferece à apoptose não seja suficiente para a evitar. Contudo, o contexto desta
situação só foi reportado em células de carácter específico e em circunstâncias atípicas
do “ambiente” normal (Kannan, 2000).
Outro dado relatado é o facto da proteína Bcl-xl ser mencionado como

salvaguarda para a GSH, isto é, estabelece um equilíbrio dinâmico na regulação da
homeostasia, permitindo que não se perca GSH. Quando se verifica um elevado stresse
oxidativo ao nível do reticulo, há a activação de cinases que induzem proteínas
específicas a dificultar o trabalho das anti-apoptóticas. Como tal, há activação dos pró-
apoptóticos que realizam a sinalização respectiva ao accionamento das caspases que
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levam a célula à destruição. Conclui-se assim que alterações quantitativas e qualitativas

de GSH ao nível do retículo podem exacerbar a possibilidade da célula entrar em
apoptose (Debatin, 2004).
Relativamente a lesões específicas de DNA, englobando ligações cruzadas e

ruptura de ligações de cadeia dupla, a sua activação é promovida pelo p53 e pela
actividade da caspase 2, que accionadas geram dano oxidativo, dificultando a respectiva
reparação. A difusão de GSH ao nível do núcleo é proporcionada através de poros
nucleares localizados na membrana. Visto a característica funcional do núcleo de uma
célula, é pertinente que se tente a todo o custo manter esta manutenção fisiológica de
GSH. No entanto, conjugados e derivados da glutationa também favorecem a
manutenção do núcleo. A glutationa S-transferase constitui uma classe de enzimas
especializadas que geram um grande conjunto de tioésteres, os designados S-
conjugados. Estes em conjunto com GST protegem o DNA contra a apoptose induzida
na medida que inviabilizam acção do stresse oxidativo. O DNA mitocondrial é também
protegido pela GSH que reduz a susceptibilidade de ser atingida por agentes apoptóticos
como a cisplatina, BSO e doxorrubicina (Debatin, 2004; Franklin, 2010).
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Capítulo VI: Conclusão da abordagem sobre a temática
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6) Conclusão
Muito para além do que foi discutido ao longo desta dissertação podia ter sido
abordado, muitos outros dados podiam ter sido mencionados, no entanto, optou-se por
uma panóplia de informação que se pensa ser mais relevante. Não é de todo uma
temática fácil. Por um lado torna-se difícil apenas restringir o projecto num só tema,uma
vez que existe uma variedade de informação num largo espectro de campos de actuação
e, de igual forma torna-se complexo criar algo inteiramente novo, onde não exista
confronto de informação e repetição de conceitos.
Relativamente à glutationa, esta tem um papel fundamental na resistência celular

ao dano oxidativo. É um dos principais antioxidantes do organismo e tem um papel
importante na metabolização/excreção de xenobióticos (Franklin, 2010).
Muitas doenças agudas e crónicas apresentam um desequilíbrio na expressão de

GCS e GS. Alguns estudos demonstram que existe uma ligação entre determinadas
doenças e o facto de existir um polimorfismo numa subunidade da GCS (Dickinson,
2002). No futuro é pertinente aprofundar estes dados, identificando polimorfismos
associados a doenças, que também estão associadas ao stresse oxidativo. A identificação
desses mecanismos permitirá o desenvolvimento de terapias dirigidas à prevenção e
combate dessas doenças.
Futuramente, se se conseguir perceber e conhecer todos os locais de actuação e

ligação da GSH e a formar como ela actua, podar-se-á ter um grande avanço na terapia
de diversas patologias associadas ao stresse oxidativo. A diminuição de GSH na
apoptose é um facto confirmado. Se o processo apoptótico for controlado e as vias
bioquímicas envolvidas estiverem completamente esclarecidas sabendo-se de que
maneira é que se pode manipular a concentração de GSH a fim de se evitar o processo
apoptótico, doenças neurodegenerativas, por exemplo poderiam vir a ser minimizadas.
Desta forma, conclui-se que é uma molécula em ascensão potencial na terapêutica

por todas as suas funções, características fortificantes e intervenção metabólica. A sua
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profusão é notória e torna-se mais empolgante o seu estudo e criação de motivos de

utilidade visto que a sua produção é inata no organismo. No entanto, estudos descrevem
o interesse de se produzir GSH industrialmente, uma vez que por ser um tripeptídeo
simples, a sua produção em modelo biotecnológico heterólogo em culturas vegetais
seria uma mais-valia. No entanto, este tipo de produção seria demasiado dispendioso,
tornando o processo inviável. Futuramente, se esta alternativa for conseguida, a adição
de GSH a géneros alimentícios ou a terapias farmacológicas podiam constituir anti-
cancerígenos e antioxidantes de elevada potência, se ao mesmo tempo também se
evoluir no conhecimento do metabolismo da GSH (Arisi, 1998).
A título de conclusão e apenas a menção de mais um contributo que a glutationa

pode suplementar. Faz sentido pensar-se nela como meio preventivo de um dos vírus
mais letais e complexos do nosso século, HIV. O HIV é predominantemente mais
extensível em casos em que se verifique estados oxidativos sendo agravado em
situações de deficiência de cisteína e glutationa. Linfócitos T e B exigem níveis
adequados de GSH intracelular para se poderem diferenciar, e em indivíduos saudáveis
com níveis relativamente baixos de GSH, os níveis de células CD4 encontra-se baixo. A
diminuição dos níveis de GSH induzida experimentalmente, inibe o funcionamento das
células do sistema imunológico, mostrando que o status de GSH intracelular
desempenha um papel central neste domínio. Em recém infectados com HIV, os valores
de GSH nos monócitos são anormais. Quando a infecção progride esses valores voltam
ao normal, ao mesmo tempo que o equilíbrio GSH/GSSG é perturbado. Os níveis
plasmáticos de cisteína são baixos em pacientes infectados com HIV. A suplementação
com N-acetilcisteína ajuda os doentes com HIV a restaurarem os níveis normais de
GSH no sangue. Como tal, esta molécula pode ser peremptoriamente uma mais-valia
futura (Anderson, 1998).
A glutationa é um dos mais potentes antioxidantes existentes no organismo. Todas

as grandes patologias advêm de estados oxidativos.Dá que pensar.
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Capítulo VII: Bibliografia
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UFP-FCS drogas
Índice
Sumário V
Abstract VI
Agradecimentos VII
Índice geral VIII
Índice figuras X
Abreviaturas XI
Anexos XV
Capítulo I: Apresentação da Dissertação ......................................................................... 1
1.1) Enquadramento do trabalho e objectivos............................................................... 2
Capítulo II: Revisão estrutural, bioquímica e funcional da Glutationa ........................... 3
2.1) Glutationa: Introdução à molécula ....................................................................... 4
2.2) Espécies reactivas de oxigénio .............................................................................. 7
2.3) Funções .................................................................................................................. 8
2.4) Síntese.................................................................................................................. 11
2.5) Ciclo do γ-glutamilo ............................................................................................ 14
2.6) Compartimentação e exportação ......................................................................... 15
2.7) Catabolismo: degradação da GSH ....................................................................... 16
Capítulo III: Destoxificação: papel da GSH .................................................................. 18
3.1) Destoxificação ..................................................................................................... 19
3.2) Excreção e transporte........................................................................................... 26
3.3) Poder antioxidante ............................................................................................... 27
3.4) Manutenção do estado tiol ................................................................................... 28
Capítulo IV: Relação da Glutationa em Doenças Humanas .......................................... 30
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4.1) Introdução ao tema .............................................................................................. 31
4.2.) Glutationa e o seu estado de homeostasia .......................................................... 31
4.3) Relação da Glutationa com doenças humanas ..................................................... 32
4.3.1) Glutationa vs Doenças Cardiovasculares .................................................... 34
4.3.2) Glutationa vs Doenças Pulmonares............................................................. 35
4.3.3) Diabetes mellitus ......................................................................................... 36
4.3.4) Efeitos da insulina e da glicose na síntese de GSH .................................... 37
4.3.5) Glutationa na terapia da diabetes ................................................................ 38
4.3.6) Glutationa em infecções virais .................................................................... 38
4.3.7) Doenças neurodegenerativas....................................................................... 39
4.3.8) Neoplasias ................................................................................................... 43
Capítulo V : Apoptose: Intervenção da GSH ................................................................. 45
5.1) Apoptose .............................................................................................................. 46
5.1.1) Intervenientes essenciais para a apoptose ......................................................... 48
5.2) Papel da glutationa na regulação da apoptose ..................................................... 49
5.3) A GSH na cascata de sinalização ........................................................................ 53
Capítulo VI: Conclusão da abordagem sobre a temática ................................................ 55
6) Conclusão ................................................................................................................... 56
Capítulo VII: Bibliografia .............................................................................................. 58
7) Bibliografia ................................................................................................................ 59
UFP-FCS drogas
Artigo 3
ARTICLE IN PRESS
Clinical Nutrition (2003) 22(6): 515–522
r 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/S0261-5614(03)00053-0
ORIGINAL ARTICLE
Effect of single and combined supply of glutamine, glycine,

N-acetylcysteine, and R,S-a-lipoic acid on glutathione
content of myelomonocytic cells
B.WESSNER, E.-M. STRASSER, A. SPITTLER, E. ROTH
Department of Surgery, Research Laboratories, University of Vienna, Austria (Correspondence to: BW, Surgical Research Laboratories,
General Hospital, University of Vienna,Waehringer Guertel18-20, A-1090 Vienna, Austria)
Abstract,Background & aims: Several diseases are characterised by decreased glutathione (GSH) levels due to an
enhanced formation of oxygen radicals.To increase GSH levels, the additional supply of GSH precursors was suggested.
In this study we evaluated the potency of a single and combined administration of the GSH modulating substances
glutamine (GLN), N-acetylcysteine (NAC), and glycine (GLY) as well as R,S-a-lipoic acid (LA) to enhance intracellular
GSH content in a well-de¢ned model system. Results: Exposure of myelomonocytic U937 cells for 24 h to GLN revealed
a 1.5-fold enhancement of GSH levels with a concomitant decrease in the formation of reactive oxygen species and lipid
peroxidation. Addition of NAC stimulated GSH formation only at subphysiological GLN levels. GLYenhanced GSH levels
under GLN starvation, but caused a diminution of GSH content under optimal GLN supply. LA in combination with
2 mmol/l GLN evoked a 3.6-fold enhancement of GSH content compared to GLN starved cells. Conclusion: These
results demonstrate that the GSH content of U937 cells is dependent on the supply of GLN, NAC, LA, and GLY.
Combinations of the single substances can enhance but also decrease the intracellular GSH content, which is of clinical
importance when supplying GSH-modulating substances to patients.
r 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Key words: glutathione; glutamine; N-acetylcysteine; cysteine and GSH deficiency in HIV infection (4).
a-lipoic acid; glycine Several clinical studies, especially with HIV patients,
have been performed, but the results are controversial
and single experiments even reveal pro-oxidative effects
Introduction of NAC (5–8).
Another thiol compound, R,S-a-lipoic acid (LA), is
The redox state of the local microenvironment repre- effective in the upregulation of intracellular GSH
sents a fine-tuned balance between oxidant and anti- content. Packer et al. demonstrate that LA and its
oxidant activity, whereby the tripeptide glutathione reduced form dihydrolipoic acid are able to scavenge
(GSH), consisting of l-glutamate, l-cysteine, and various ROS. Moreover, the LA/dihydrolipoic acid
GLY, constitutes about 90% of the factors determining redox couple is capable of recycling other antioxidants
the intracellular redox balance (1). Several diseases are like vitamin E, vitamin C, and GSH, thus forming a so-
associated with lowered GSH levels caused by stimu- called ‘antioxidant defence network’ (9). In 1959,
lated oxidative stress (2). Therefore, recent therapies Rosenberg and Culik found that in vitamin C- or
focus either on reducing the formation of reactive vitamin E-deficient animals a combination of LA with
oxygen species (ROS) or on improving the defence vitamin C or vitamin E, respectively, is more effective
system against oxidative stress mainly by enhancing than either compound alone (10). Recently, Liu et al.
intracellular GSH content. Up to the present, the most have reported that LA acts synergistically with acetyl-l-
applicable therapy seems to be the stimulation of GSH carnitine in preventing age-associated memory loss,
synthesis by providing the patients with one or several of mitochondrial oxidative decay, and reduction of meta-
the precursor substances. bolic function in rats (11–13).
For many years, cysteine has been considered to be Decreased GLN concentrations found during cata-
the rate-limiting precursor of in vivo GSH synthesis as bolic stress raised the hypothesis that GLN as well as
the physiological concentration of glutamine (GLN) cysteine could become rate limiting for GSH synthesis.
far exceeds that of cysteine (3). Droege et al. propose The potency of GLN in enhancing intracellular GSH
a treatment with N-acetylcysteine (NAC) to ameliorate content is shown in vitro and partly confirmed in animal
the immunological consequences of the virus-induced models and in clinical trials. GLN supplementation
515
ARTICLE IN PRESS
516 GSH MODULATING SUBSTANCES
prevents loss of lymphocytes, and GSH depletion in whereas LA was directly dissolved into the medium. As
Peyer’s Patches of endotoxemic mice (14), reduces the indicated in the particular figure legends, cell suspen-
toxicity of radiochemotherapy of patients with esopha- sions were incubated with different concentrations of
geal cancer (15), and increases the T cell mitogenic GLN (0.05–2 mmol/l), GLY (0.1–5 mmol/l), 0.5 mmol/l
response in patients undergoing colorectal resection or NAC, 100 mmol/l LA, and various combinations of the
patients with severe acute pancreatitis (16). GLN- substances. Respective controls were treated with an
containing solutions are already used as infusion equal volume of PBS. Cells were incubated for 24 h at
therapeutics, especially for the treatment of intensive standard conditions.
care unit (ICU) patients where GLN supply improves
clinical outcome by reducing the infection rate of the
Flow cytometric determination of intracellular GSH levels
patients (17). It is assumed that this therapeutical effect
is associated with a modulation of the cellular redox Intracellular GSH levels were measured by flow
potential of immune cells. cytometry according to a method described by Sen
So far, the GSH precursor GLY is disregarded with et al. (22). To achieve reproducible results, the method
respect to GSH metabolism. Although GLY has been was slightly modified. Briefly, the thiol probe mono-
used in many experimental and clinical studies as bromobimane (MBB) was dissolved into acetonitril
‘control’ amino acid for many years, recent experiments (Fluka, Buchs, Switzerland) to obtain a 40 mmol/l stock
reveal that GLY is cytoprotective in a variety of solution. After 24 h of incubation with supplements,
experimental models, most of them associated with the cells were pelleted (300 g 10 min, 41C) and resus-
generation of ROS (18–20). Furthermore, GLY is pended in PBS at 106 cells/ml. Then MBB was added to
suggested to exert immunoenhancing effects (21). the cell suspension such that the final concentration of
The apparent importance of GSH deficiency in the the bimane reagent was 40 mmol/l. After a 10 min
etiology of many diseases increases the interest to incubation period at room temperature in the dark,
evaluate the effect of single and combined administra- cells were washed twice to prevent further reaction of
tion of GSH precursors, such as NAC, GLN, GLY, and the thiol probe with cellular sulfhydryl groups and
LA on the redox potential of cells. This is the first study resuspended in cold PBS at a concentration of 106 cells/
quantifying the impact of different substrates and ml. As MBB binds to intracellular GSH as well as to
substrate combinations on GSH levels using a well- other intracellular thiols it was necessary to treat
defined model system. additional control cells with 150 mmol/l l-buthionine-
[S,R]-sulfoximine (BSO), a specific inhibitor of GSH
synthesis, for 24 h. These GSH-depleted cells allow for
Materials and methods the estimation of unspecific background staining.
Bimane-loaded cells were excited using a 20 mW-
Chemicals powered UV line (350 nm) of an Innova 90-4 argon
ion laser (Coherent, Dieburg, Germany) in an EPICS
Chemicals were purchased from Sigma Chemical Co (St. Altra flow cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA,
Louis, MO, USA) unless otherwise indicated. All USA). Fluorescent emission from cellular sulfhydryl
reagents were of the highest grade obtainable. reacted bimane was recorded using a 450 nm bandpass
filter. A morphometrically homogenous cell population,
Cell culture typically representing 80–90% of the total cell popula-
tion, was gated. Data were collected from at least 10,000
The human myelomonocytic cell line U937 was obtained cells at a flow rate of 400–600 cells/s. In order to
from the German Collection of Microorganisms and standardise the assays and to correct for day-to-day
Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). Cells variations in instrument performance, the mean channel
were maintained in continuous cell suspension at 371C fluorescence (MCF) of calibration beads (Immuno-
under 5% CO2 and humidified air in RPMI 1640 check, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) was
medium (BioWhittaker, Verviers, Belgium) supplemen- recorded previously to each measurement. MCF of
ted with 2 mmol/l GLN and 10% fetal bovine serum calibration beads was adjusted by tuning the high
(FBS, Linaris, Bettingen, Germany). The same serum lot voltage to 2170.5. GSH content was calculated by
containing 5 mmol/l GLN was used in all experiments. subtracting MCF of BSO-treated cells from MCF of the
respective probe.
Cell treatment with GSH regulatory substances
Determination of GSH by HPLC
Cells were harvested (300 g 10 min), washed twice
with phosphate buffered saline (PBS, Gibco BRL, After the indicated incubation time, cells were harvested
Paisly, Scotland) and resuspended at 2 105 cells/ml in and washed twice with cold PBS. 2 106 cells were
RPMI 1640 (w/o GLN) containing 10% FBS. GLN, mixed vigorously with 1 ml of an aqueous 6.5% (w/v)
NAC, and GLY stock solutions were prepared in PBS, sulfosalicylic acid (Merck Inc., Darmstadt, Germany).
ARTICLE IN PRESS
CLINICAL NUTRITION 517
After 15 min incubation on ice, the supernatant was acid, 0.375% (w/v) TBA, 0.25 mol/l HCl). The samples
snap frozen in liquid nitrogen and stored at 701C until were heated on a thermoblock for 15 min at 1001C,
further analysis by HPLC. Hundred microliters of the cooled down to room temperature, and after centrifuga-
neutralized sample or GSH standard were mixed with tion at 15,000 g 10 min, the absorbance of the
100 ml MBB (0.57% (w/v) in acetonitril and sodium supernatant was measured using a U-3000 spectro-
N-ethylmorpholine, pH 10.1), and allowed to react in photometer (Hitachi High Technologies, Finchamp-
the dark for 5 min before the reaction was stopped by the stead, UK). Absorbance was converted to pmol
addition of 10 ml 50% (w/v) sulfosalicylic acid (23). The malondialdehyde/106 cells.
HPLC separation of low molecular mass thiol–bimane
adducts was achieved on a Supelcosil LC-18 octadecyl-
silyl silica column (150 mm 4.6 mm, 3-mm particle size; Intracellular amino acids
Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA) reversed-phase resin, Following treatment, 3 106 cells in 0.5 ml PBS were
followed by fluorimetric detection (FP920 fluorescence deproteinized with 50 ml of sulfosalicylic acid (30%
detector; Jasco, Tokyo, Japan) at an excitation wave- (w/v)) containing 1 mmol/l b-(2thienyl)-DL-alanine as
length of 394 nm and an emission wavelength of 480 nm. internal standard. The samples were kept at –201C for
Elution solvent A was composed of aqueous 9% (v/v) 30 min and then centrifuged at 15,000 g 5 min after
acetonitril, 0.25% (v/v) acetic acid (Merck Inc., Darm- equilibration to room temperature. The supernatant was
stadt, Germany), and 0.25% (v/v) perchloric acid stored at –701C until HPLC analysis (26). Therefore, the
(Merck Inc., Darmstadt, Germany). The pH was probes were mixed 1:1 with o-phtalaldehyde (OPA)
adjusted to 3.7 with 40% (w/v) sodium hydroxide reagent, consisting of 0.125% (w/v) OPA and 0.5% (v/v)
(Merck Inc., Darmstadt, Germany). Elution solvent B 2-mercaptoethanol. The separation of the amino acids
was based on a 75% (v/v) aqueous solution of was obtained by HPLC (Beckman, Fullerton, CA, USA)
acetonitrile. The elution program consisted of 100% equipped with an ODS Hypersil column (150 mm
solvent A for 7 min, followed by 100% solvent B to elute 3.0 mm, 3 mm particle size; Thermo Hypersil-Keystone,
matrix interferences, and returning to solvent A for re- Cheshire, UK) and a chromguard HPLC column, SS
equilibration for 12 min at a flow rate of 1.0 ml/min. The 10 mm 3 mm (Chrompack International, Middleburg,
resultant profiles were quantified on the basis of peak Netherlands) at 221C using a step gradient formed by
areas and compared with those of authentic external the following buffers: Buffer A consisted of aqueous
standards of GSH (usually 0.625–10 mmol/l). 0.096% (w/v) sodium acetate, 0.058% (v/v) acetic acid,
and 0.28 (v/v) tetrahydrofuran (Fluka, Buchs, Switzer-
Intracellular ROS land). Buffer B was based on aqueous 55.7% (v/v) aceto-
nitrile and 0.8% (v/v) tetrahydrofuran. The flow rate
The production of ROS was measured using 6-carboxy- was 0.5 ml/min. Detection was performed fluorometri-
20 ,70 -dichlorodihydrofluorescein-diacetate, di(acetoxy- cally (Jasco, Tokyo, Japan) with an excitation wave-
methylester) (c-H2DCFDA, Molecular Probes, Eugene, length of 330 nm and an emission wavelength of 440 nm.
OR, USA) as indicator, which forms fluorescent Data acquisition and evaluation were carried out by
carboxy-dichlorofluorescein upon oxidation by intracel- the Beckman System Gold software (Beckman, Full-
lular ROS. Cells were incubated in medium containing erton, CA, USA).
different concentrations of GLN (0.05 and 2 mmol/l) in
the absence or presence of 150 mmol/l BSO. After 24 h,
cells were loaded with 5 mmol/l c-H2DCFDA and Statistical analysis
incubated at 371C for another hour. Cells were washed Data are presented as mean7standard deviation.
twice with cold PBS and the fluorescence emission from Statistical analysis was performed using the Student’s
carboxy-dichlorofluorescein was detected by flow cyto- t-test. In the case of multiple comparisons, one-way
metry at a wavelength of 530730 nm (24). analysis of variance (ANOVA) with Tukey post-test was
applied. Regression analysis was performed using the
Lipid peroxidation SPSS software package (SPSS for Windows, Release
8.0.0, Chicago, IL, USA). A probability of Po0:05 was
Lipid peroxidation was measured by the previously considered statistically significant.
described thiobarbituric acid (TBA) assay with certain
modifications as specified below (25). After 24 h of
incubation, GLN- and BSO-treated cells were washed,
Results
counted, and resuspended in 0.5 ml PBS w/o Ca2+ and
Mg2+. To avoid lipid peroxidation during the assay,
Measurement of GSH by flow cytometry vs HPLC
butylated hydroxytoluene (0.6 mmol/l final concentra-
tion) and EDTA (0.3 mmol/l final concentration) were We compared two different methods (flow cytometry
added to the sample prior to the precipitation with 1 ml and HPLC) for the determination of intracellular GSH
TCA–TBA–HCl reagent (15% (w/v) trichloroacetic levels. Staining of intact cells with MBB for flow
ARTICLE IN PRESS
25
30 + 0.5 mmol/l NAC
Glutathione - FC [MCF]
Glutathione [ ∆ MCF]
20
20
15
2 10
10 R = 0.7859
p < 0.001
5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0
0.05 0.3 0.6 2
Glutathione - HPLC [nmol/106 cells]
Glutamine [mmol/l]
Fig. 1 Correlation of GSH determination by flow cytometry (FC)
and HPLC. Different GSH concentrations were obtained by incubat- Fig. 2 Effect of GLN and NAC on GSH levels. U937 cells were
ing cells with different GSH modulating substances (150 mmol/l BSO, incubated with different concentrations of GLN and with (black
2 mmol/l GLN, or 2 mmol/l GLN+100 mmol/l LA) for 24 h. Determi- columns) or without (gray columns) 0.5 mmol/l NAC for 24 h. GSH
nation of GSH levels was performed by HPLC and FC as described in content was measured by flow cytometry. Results were expressed as
the Materials and methods section. Data obtained by both methods D mean fluorescence (probeBSO control)7SD calculated from
were plotted against each other. five independent experiments. *Po0:05 and **Po0:01 vs treatment
without NAC and oPo0:05 and oooPo0:001 vs 0.05 mmol/l GLN.
cytometry revealed that up to 50% of the resulting

fluorescence is due to background staining but can be
corrected by including the BSO control treatment (data Effect of thiol-containing substances7GLN on
not shown). In this study, the MCF of cells treated GSH levels
either with GLN, GLN þ LA, or BSO for 24 h was
Effect of NAC
correlated with data obtained by HPLC. We found a
We found that under GLN-deficient conditions,
highly significant correlation (Po0:001; R2 ¼ 0:7859)
0.5 mmol/l NAC represents the optimum to enhance
between these two methods (Fig. 1).
GSH levels of U937 cells (data not shown). The addition
of 0.5 mmol/l NAC to culture media containing rising
Effects of GLN supply concentrations of GLN (0.05, 0.3, 0.6, 2 mmol/l)
revealed that NAC is able to enhance GSH content
Influence on GSH content significantly only at 0.05 (139710%, Po0:01) and
Flow cytometric analysis revealed that intracellular 0.3 mmol/l GLN (115710%, Po0:05). At 0.6 and
GSH content of myelomonocytic U937 cells, incubated 2 mmol/l GLN, no difference between NAC-supplemen-
in medium containing 0.05, 0.3, 0.6, or 2 mmol/l GLN ted and untreated cells could be detected (Fig. 2).
for 24 h, was dependent on GLN concentrations, as
shown in Figure 2. GSH content was significantly
enhanced at 0.3 mmol/l GLN (136716%, Po0:05), Effect of LA
but reached its optimum at 0.6 mmol/l GLN Dose-finding experiments revealed that the optimal dose
(150716%, Po0:001). Further enhancement of GLN to enhance the intracellular GSH content of U937 cells
supply to 2 mmol/l did not lead to an additional increase was 100 mmol/l LA (data not shown). Incubating U937
of GSH levels. cells with 0.05, 0.3, 0.6, or 2 mmol/l GLN and 100 mmol/l
LA for 24 h showed that the GSH modulating effect of
LA is GLN dependent. As shown in Figure 3, the
Intracellular markers of oxidative stress maximal GSH stimulating effect of LA was found when
The supply of 2 mmol/l GLN to U937 cells caused a cells were cultivated together with 2 mmol/l GLN (1.9-
significant reduction of intracellular ROS formation fold, Po0:01). However, already a cocultivation of cells
from 22.672.2 to 17.873.7 MCF (Po0:05) (Fig. 6A). with 0.6 mmol/l GLN and LA caused a 1.3-fold increase
In contrast, treatment of cells with 150 mmol/l BSO, an (Po0:05) of GSH content compared to cells treated
inhibitor of GSH synthesis, caused an increase in the with 0.6 mmol/l GLN alone (data not shown). The
concentration of intracellular ROS up to 30.974.3 addition of LA to media containing 0.3 or 0.05 mmol/l
MCF (Po0:01) and 31.374.3 MCF (Po0:001), which GLN did not enhance intracellular GSH levels signifi-
was independent of GLN supplementation. As shown in cantly.
Fig. 6B, the supply of 2 mmol/l GLN resulted in a
reduction of thiobarbituric acid reactive substances
Effects of GLY supply
(TBARS) from 15.873.6 to 11.774.2 pmol/106 cells
(Po0:05), whereas the addition of BSO led to an Influence on GSH content
increase up to 26.774.2 and 23.776.4 pmol/ 106 cells Different doses of GLY (0.1, 0.3, 1, 2, and 5 mmol/l)
(Po0:01), respectively. were investigated in the presence of 0.05, 0.3, 0.6, or
ARTICLE IN PRESS
15 25 0.05 mmol/l Gln

w/o supplement ,
20
+ 100 µ mol/l LA
Glutathione
[nmol/10 cells]
15
10 10
6
5
0
5 (A)
0.1 0.3 1 2 5
0 25 0.3 mmol/l Gln

0.05 2
20
Glutamine [mmol/l]
15
Fig. 3 Effect of LA on GSH content. U937 cells were treated with 10
0.05 or 2 mmol/l GLN with (black columns) or without (gray columns)
Glutathione [∆ MCF]
5
100 mmol/l LA for 24 h. GSH content was measured by HPLC. Results
were expressed as nmol/106 cells7SD calculated from four indepen- 0 (B)
dent experiments. *Po0:05 and **Po0:01 vs 0.05 mmol/l GLN and 0.1 0.3 1 2 5
1Po0:05 vs 0.05 GLN+LA.
25 0.6 mmol/l Gln

20
2 mmol/l GLN concerning their GSH modulating 15
ability. At 0.05 mmol/l GLN, high doses of GLY (2 10

and 5 mmol/l) were able to significantly (Po0:05) 5
enhance the intracellular GSH content of U937 cells 0 (C)
to 123.4711.1% and 138.8713.6%, respectively 0.1 0.3 1 2 5
(Fig. 4A). This effect was diminished at 0.3 mmol/l
GLN (Fig. 4B) and reversed at 0.6 mmol/l GLN 25
2 mmol/l Gln
(Fig. 4C), where 5 mmol/l GLY caused a significant
20
reduction of GSH content to 83.679.9% (Po0:05).
15
However, the concomitant presence of 2 mmol/l GLN
10
and various concentrations of GLY led to a highly
significant and dose dependent decrease of GSH content 5
to 21.2710.4% (Po0:001) of control at 5 mmol/l GLY 0 (D)

(Fig. 4D). 0.1 0.3 1 2 5
Glycine [mmol/l]
Influence on intracellular GLN levels
Fig. 4 Effect of Glycine on GSH levels. U937 cells were incubated
Incubating U937 cells for 24 h with 2 mmol/l GLN and with the indicated concentrations of glycine and 0.05 (A), 0.3 (B), 0.6
various concentrations of GLY (0.1–5 mmol/l) showed (C), or 2 mmol/l (D) GLN for 24 h. GSH content was measured by
that intracellular GLN levels were dependent on the flow cytometry as described in the Materials and methods section.
Results were expressed as D mean fluorescence (probeBSO con-
extracellular GLY concentration (Fig. 5). The addition trol)7SD calculated from five independent experiments. *Po0:05;
of GLY to the culture medium containing 2 mmol/l **Po0:01; and ***Po0:001 vs 0.1 mmol/l GLY.
GLN resulted in a dose-dependent decrease of intracel-
lular GLN to only 41712% reaching significance at
2 mmol/l GLY (Po0:05).
functions such as signal transduction, cell proliferation,
and immune response.
Discussion We modified a previously described method for the
detection of GSH in human cells by means of flow
Our results revealed that the GSH content of U937 cells cytometry to yield an accurate and fast tool for the
was affected by the supply of GLN, NAC, GLY, and measurement of intracellular GSH levels. We could
LA. Combinations of the various GSH-modulating show that the flow cytometric method correlates
substances were able to enhance but could also decrease significantly with the standard HPLC method. The
the intracellular GSH content when administered in main advantage of using flow cytometry for determina-
particular concentrations. GSH is the main component tion of GSH content is that morphological homogenous
of the intracellular redox state. Therefore, changes of cells can be gated. Therefore, it will be possible to regard
GSH concentrations mainly influence the intracellular the GSH content of different subpopulations in further
redox state and subsequently many important cellular investigations.
ARTICLE IN PRESS
Intracellular Glutamine 15 40
40
** ˚˚˚
Intracellular ROS [MCF]

[nmol/10 6 cells]
30
30
10
* 20
20 *
5 *
10
10
9.1 8.0 7.1 4.8 3.7
0
00
0.1 0.3 1.0 2.0 5.0
Glycine [mmol/l] control 2
0.05 +B
O
S
0.05 2 mmol/l GLN
(A) + BSO
Fig. 5 Effect of GLY on intracellular GLN concentrations. U937
cells were incubated with the indicated concentrations of GLY and 40
40
TBARS [pmol/106 cells]

2 mmol/l GLN for 24 h. Intracellular GLN levels were determined by
HPLC. Values are the mean7SD (n ¼ 4). Po0:05 vs 0.1 mmol/l **
GLY. 30
30
˚˚
20
20
*
In our model system, we found that intracellular GSH
10
10
levels were dependent on GLN supply reaching a
maximum at 0.6 mmol/l GLN which reflects the normal
00
human plasma concentration of this amino acid. These
conto
0.05 rl 2 +S
0.05O
B 2 mmol/l GLN
data suggest that our model system agrees very well with
human in vivo conditions. Previous results reveal that (B) + BSO
GLN increases GSH both in PHA-stimulated CD4+
Fig. 6 Effects of GLN and BSO on ROS formation (A) and lipid
and CD8+ lymphocyte subsets leading to enhanced peroxidation (B). U937 cells were treated with 0.05 or 2 mmol/l GLN
proliferation rates and a propagation of the cell cycle with or without 150 mmol/l BSO for 24 h. ROS formation was
from the G1 to S and G2/M phases (27). In a previous measured using c-H2DCFDA oxidation (A). Lipid peroxidation was
quantified by the TBA assay (B). Values are the mean7SD calculated
study, we found a significant correlation of GLN from five independent experiments. *Po0:05 and **Po0:01 vs
supply, lymphocyte proliferation and cellular GSH 0.05 mmol/l GLN and 11Po0:01and 111Po0:001 vs 2 mmol/l GLN.
content. These data demonstrate that a GLN-enriched
diet fed to endotoxemic mice leads to the enhancement
of lymphocyte numbers in Peyer’s Patches and spleen,
which is associated with an increase of GSH content (14, pathways within cells. Oxidative stress induces for
28). Furthermore, another experimental study shows example the transcription factor NF-kB in many cells,
that GLN-supplemented nutrition preserves hepatic but especially lymphocytes, leading to enhanced cyto-
GSH levels leading to an improved survival during kine formation which is an important immunological
acetaminophen toxicity (29). In our study, we obtained response to prevent immunosuppression (31).
the highest GSH levels by supplementing the cells with Several clinical studies applying NAC to ameliorate
0.6 mmol/l GLN. Enhancing the dosage up to 2 mmol/l the GSH deficiency in HIV infection failed in enhancing
resulted in a slight, but not significant, decrease of GSH GSH levels of lymphocytes from HIV-infected patients
content. GLN-starved U937 cells (GLN supply of (7, 32, 33). Breitkreutz et al. suggested that the negative
0.05 mmol/l) exhibited the lowest GSH content in our results could be due to relatively low doses of NAC or to
model system. This starvation effect may also be a relatively short observation period (5). In our study,
responsible for an impaired stress response of the cells we compared the effect of NAC under low and normal
as we showed in a recent publication (30). We suggest GLN conditions. The results revealed that NAC given in
that the physiological concentration of 0.6 mmol/l GLN a state of low GLN concentration was able to enhance
is sufficient to obtain a maximal increase in GSH levels. GSH levels of myelomonocytic cells, whereas supplying
Moreover, our study demonstrated that GLN deficiency the cells with NAC under optimal GLN levels, did not
resulted in an enhanced production of ROS and a affect GSH content. We therefore propose that plasma
concomitant increase in the amount of lipid peroxida- GLN concentrations could be an important factor in the
tion (see Fig. 6). Therefore, the ROS-diminishing effect response of patients to NAC.
of GLN seems to be associated with a stimulating effect When using LA as SH-donor, GSH levels were
of GLN supply on GSH synthesis. Low GLN levels as increased only when cells were supplied with optimal
detected under various clinical conditions, such as GLN concentrations. This was in strong contrast to
prolonged starvation, severe injury, or sepsis may lead supplementation with NAC. As LA needs to be actively
to an increase of ROS due to low intracellular GSH reduced by the cells to exert some of its antioxidant
content. However, it should be mentioned that ROS properties (34), we hypothesise that under GLN
generation is important for the initiation of signalling deficiency cells might have a decreased reducing capacity
ARTICLE IN PRESS
leading to the loss of GSH-enhancing effects by LA. severe illness. Therefore, combined infusions of these
Other experimental studies—conducted with optimal substances should be applied with care.
GLN levels—show that LA also increases intracellular
concentrations of GSH in human Jurkat T cells, red
blood cells, peripheral blood lymphocytes, glia and References
neuroblastoma cell lines (35). Recently, several clinical
and experimental investigations have revealed that LA is 1. Deneke S M. Thiol-based antioxidants. Curr Top Cell Regul 2000;
effective in preventing diabetes complications that arise 36: 151–180
2. Exner R, Wessner B, Manhart N, Roth E. Therapeutic potential of
from an overproduction of ROS, such as cataract glutathione. Wien Klin Wochenschr 2000; 112: 610–616
formation, vascular damage, and polyneuropathy (36). 3. Lu S C. Regulation of glutathione synthesis. Curr Top Cell Regul
Moreover, a combined supply of acetyl-l-carnitine and 2000; 36: 95–116
4. Droege W, GroX A, Hack V et al. Role of cysteine and glutathione
R-LA improves performance on memory tasks by in HIV infection and cancer cachexia: therapeutic intervention
lowering oxidative damage and improving mitochon- with N-acetylcysteine. Adv Pharmacol 1997; 38: 581–600
drial function of old rats (11–13). From our data, we 5. Breitkreutz R, Pittack N, Nebe C T et al. Improvement of immune
functions in HIV infection by sulfur supplementation: two
hypothesise that a combined supply of GLN and LA randomized trials. J Mol Med 2000; 78: 55–62
may substantially increase the resistance of cells against 6. De Rosa S C, Zaretsky M D, Dubs J G et al. N-acetylcysteine
oxygen radicals by increasing GSH levels and could be replenishes glutathione in HIV infection. Eur J Clin Invest 2000;
30: 915–929
tested in pathologies such as diabetes, cancer, cardio- 7. Akerlund B, Jarstrand C, Lindeke B, Soennerborg A, Akerblad A
vascular diseases, Alzheimer’s disease, Parkinson’s C, Rasool O. Effect of N-acetylcysteine (NAC) treatment on HIV-
disease, protein energy malnutrition, ageing, infection 1 infection: a double blind placebo-controlled trial. Eur J Clin
Pharmacol 1996; 50: 457–461
and other chronic diseases. 8. Kleinveld H A, Demacker P N M, Stalenhoef A F H. Failure of
As GLY, the smallest amino acid, consists only of a N-acetylcysteine to reduce low-density lipoprotein oxidizability in
single carbon molecule attached to an amino and a healthy subjects. Eur J Clin Pharmacol 1992; 43: 639–642
9. Packer L. a-lipoic acid: a metabolic antioxidant which regulates
carboxyl group, it is very remarkable, that GLY exerts NF-kB signal transduction and protects against oxidative injury.
numerous clinical effects. In this respect, GLY mini- Drug Metab Rev 1998; 30: 245–275
mises ischemia/reperfusion injury of kidneys and the 10. Rosenberg H R, Culik R. Effect of a-lipoic acid on vitamin C and
vitamin E deficiencies. Arch Biochem Biophys 1959; 80: 86–93
liver (20, 37), protects rats against shock caused either 11. Liu J, Head E, Gharib A M et al. Memory loss in old rats is
by blood loss or endotoxin (38), and is protective against associated with brain mitochondrial decay and RNA/DNA
oxidant-mediated damage in human umbilical vein oxidation: partial reversal by feeding acetyl-l-carnitine and/or
R-a-lipoic acid. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 2356–2361
endothelial cells (39). However, a clinical study per- 12. Liu J, Killilea D W, Ames B N. Age-associated mitochondrial
formed on a large collective of ICU-patients has not decay: improvement of carnitine acetyltransferase substrate-bind-
been able to exert an improvement of clinical outcome ing affinity and activity in brain by feeding old rats acetyl-l-
carnitine and/or R-a-lipoic acid. Proc Natl Acad Sci USA 2002;
(40). Our results demonstrated that GLY acted in a two- 99: 1876–1881
sided manner on GSH metabolism. Under low GLN 13. Hagen T M, Liu J, Lykkesfeldt J et al. Feeding acetyl-l-carnitine
concentrations, the supply of GLY increased the GSH and lipoic acid to old rats significantly improves metabolic
function while decreasing oxidative stress. Proc Natl Acad Sci
content of U937 cells. But under optimal GLN USA 2002; 99: 1870–1875
conditions, increasing GLY supply caused a sharp 14. Manhart N, Vierlinger K, Spittler A, Bergmeister H, Sautner T,
decline of intracellular GSH, whereby this dependency Roth E. Oral feeding with glutamine prevents lymhocyte and
glutathione depletion of Peyer’s patches in endotoxemic mice. Ann
already reached significance at a physiological concen- Surg 2001; 234: 92–97
tration of 0.3 mmol/l GLY. Furthermore, in the current 15. Yoshida S, Matsui M, Shirouzu Y, Fujita H, Yamana H, Shirouzu
study the decline in GSH content was accompanied by a K. Effects of glutamine supplements and radiochemotherapy on
systemic immune and gut barrier function in patients with
decrease in intracellular GLN content. We suggest that advanced esophageal cancer. Ann Surg 1998; 227: 485–491
the addition of GLY leads to a lowered uptake of GLN 16. O’Riordain M G, De Beaux A, Fearon K C. Effect of glutamine
as these amino acids share the same transporter systems on immune function in the surgical patient. Nutrition 1996; 12:
S82–S84
for their uptake into the cell (41). 17. Griffiths R D, Allen K D, Andrews F J, Jones C. Infection,
In summary, our study introduces a useful model multiple organ failure, and survival in the intensive care unit:
system to test various substances on their GSH influence of glutamine-supplemented parenteral nutrition on
acquired infection. Nutrition 2002; 18: 546–552
modulating ability. Our results reveal that GLN, 18. Hall J C. Glycine. J Parenter Enteral Nutr 1998; 22: 393–398
NAC, GLY, and LA are able to modulate intracellular 19. Mauriz J L, Matilla B, Culebras J M, Gonzalez P, Gonzalez-
GSH levels of myelomonocytic cells. We are aware that Gallego J. Dietary glycine inhibits activation of nuclear factor
kappa B and prevents liver injury in hemorrhagic shock in the rat.
our experiments have been confined to myelomonocytic Free Radic Biol Med 2001; 31: 1236–1244
cells which may not necessarily reflect the effects on 20. Yin M, Zhong Z, Connor H D et al. Protective effect of glycine on
other human cell types. However, our data demonstrate renal injury induced by ischemia-reperfusion in vivo. Am J Physiol
Renal Physiol 2002; 282: F417–F423
for the first time that administration of combined GSH 21. Wheeler M D, Ikejema K, Enomoto N et al. Glycine: a new
precursor substances may either stimulate or inhibit anti-inflammatory immunonutrient. Cell Mol Life Sci 1999; 56:
GSH content when compared to single precursor 843–856
22. Sen C K, Roy S, Han D, Packer L. Regulation of cellular thiols in
supply. Moreover, the investigated GSH precursors human lymphocytes by alpha-lipoic acid: a flow cytometric
are already used as infusion substrates, especially in analysis. Free Radic Biol Med 1997; 22: 1241–1257
ARTICLE IN PRESS
23. Luo J L, Hammarqvist F, Cotgreave I A, Lind C, Andersson K, 33. Look M P, Rockstroh J K, Rao G S et al. Sodium selenite and
Wernerman J. Determination of intracellular glutathione in N-acetylcysteine in antiretroviral-naive HIV-1-infected patients:
human skeletal muscle by reversed-phase high-performance liquid a randomized, controlled pilot study. Eur J Clin Invest 1998;
chromatography. J Chromatogr B 1995; 670: 29–36 28: 389–397
24. Tanaka M, Miyazaki T, Tanigaki S et al. Participation of reactive 34. Biewenga G P, Haenen G R, Bast A. The pharmacology of the
oxygen species in PGF2alpha-induced apoptosis in rat luteal cells. antioxidant lipoic acid. Gen Pharmacol 1997; 29: 315–331
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Hum Retroviruses 1995; 11: 141–143
Submission date: 8 October 2002 Accepted: 31 March 2003

Artigo 4
ESTRESSE OXIDATIVO | 629
COMUNICAÇÃO | COMMUNICATION
Estresse oxidativo: conceito, implicações

e fatores modulatórios
Oxidative stress: concept, implications

and modulating factors
Kiriaque Barra Ferreira BARBOSA 1

Neuza Maria Brunoro COSTA2
Rita de Cássia Gonçalves ALFENAS2
Sérgio Oliveira DE PAULA3
Valéria Paula Rodrigues MINIM4
Josefina BRESSAN1
RESUMO
O estresse oxidativo decorre de um desequilíbrio entre a geração de compostos oxidantes e a atuação dos
sistemas de defesa antioxidante. A geração de radicais livres e/ou espécies reativas não radicais é resultante do
metabolismo de oxigênio. A mitocôndria, por meio da cadeia transportadora de elétrons, é a principal fonte
geradora. O sistema de defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou reduzir os danos causados pela ação
deletéria dos radicais livres e/ou espécies reativas não radicais. Esse sistema, usualmente, é dividido em enzimático
(superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase) e não-enzimático. No último caso, é constituído por
grande variedade de substâncias antioxidantes, que podem ter origem endógena ou dietética. Objetivou-se
revisar os principais mecanismos de geração de radicais livres, bem como a ação dos agentes mais relevantes
do sistema de defesa antioxidante, ressaltando suas implicações sobre os marcadores do estresse oxidativo.
Também serão abordados os principais fatores exógenos moduladores do estresse oxidativo.
Termos de indexação: Antioxidantes. Espécies reativas de nitrogênio. Espécies reativas de oxigênio. Estresse
oxidativo. Radicais livres.
ABSTRACT
There is evidence that oxidative stress, defined as a persistent imbalance between the production of highly
oxidative compounds and antioxidant defenses, leads to tissue damage. Oxygen metabolism generates free
1
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos. Av. P.H. Rolfs, s/n., Campus Universitário, 36570-000, Viçosa, MG, Brasil. Correspondência para/Correspondence
to: J. BRESSAN. E-mail: <jbrm@ufv.br>.
2
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Nutrição e Saúde. Viçosa, MG, Brasil.
3
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia Geral. Viçosa, MG, Brasil.
4
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Tecnologia de Alimentos. Viçosa, MG, Brasil.
Rev. Nutr., Campinas, 23(4):629-643, jul./ago., 2010 Revista de Nutrição

630 | K.B.F. BARBOSA et al.
radicals and/or non-radical reactive oxygen species. The mitochondria, through the electron transport chain,
are the main generator of these species. The antioxidant defense system has the function of inhibiting and/or
reducing the damage caused by the deleterious free radicals and/or non-radical reactive oxygen species. This
system is divided into enzymatic (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase), and nonenzymatic.
The nonenzymatic system consists of a variety of antioxidant substances, which may be endogenous or dietary.
This study proposed to review the main mechanisms of reactive oxygen species generation and the role of the
most relevant agents of the antioxidant defense system on the biomarkers of oxidative stress. The main exogenous
factors that modulate oxidative stress will also be discussed.
Indexing terms: Oxidative stress. Free radicals. Reactive oxygen species. Antioxidants. Reactive nitrogen species.
INTRODUÇÃO estão envolvidos nos processos cardiovasculares,

carcinogênicos e neurodegenerativos.
A geração de radicais livres constitui, por
Diante do exposto, objetivou-se nesse es-
excelência, um processo contínuo e fisiológico,
tudo revisar os principais mecanismos de geração
cumprindo funções biológicas relevantes. Durante
de radicais livres, bem como a ação dos agentes
os processos metabólicos, esses radicais atuam
mais relevantes do sistema de defesa antioxidante,
como mediadores para a transferência de elétrons
ressaltando suas implicações sobre os marcadores
nas várias reações bioquímicas. Sua produção, em
do estresse oxidativo. Também serão abordados
proporções adequadas, possibilita a geração de
os principais fatores exógenos intervenientes no
ATP (energia), por meio da cadeia transportadora
processo de instalação do estresse oxidativo.
de elétrons; fertilização do óvulo; ativação de
genes; e participação de mecanismos de defesa Essa revisão de literatura foi realizada utili-
durante o processo de infecção. Porém, a produ- zando-se os termos “estresse oxidativo”, “radicais
ção excessiva pode conduzir a danos oxidativos1,2. livres”, “espécies reativas”, “antioxidantes”,
A produção contínua de radicais livres du- “dano oxidativo” e “biomarcadores”, bem como
rante os processos metabólicos culminou no seus correspondentes em inglês. A variedade dos
desenvolvimento de mecanismos de defesa an- termos utilizados permitiu uma abrangência signi-
tioxidante. Estes têm o objetivo de limitar os níveis ficativa, com o intuito de realizar uma ampla busca
intracelulares de tais espécies reativas e controlar sobre o tema. Procedeu-se à consulta por meio
a ocorrência de danos decorrentes1,3. das bases de dados PubMed, HighWire e SciELO,
A instalação do processo de estresse oxida- abrangendo os anos de 2000 a 2009, incluindo
tivo decorre da existência de um desequilíbrio também os artigos relevantes ao tema, publicados
entre compostos oxidantes e antioxidantes, em anteriormente, citados nos artigos previamente
favor da geração excessiva de radicais livres ou selecionados. Foram incluídos, sobretudo, estudos
em detrimento da velocidade de remoção desses. de intervenção, randomizados e controlados, além
Tal processo conduz à oxidação de biomoléculas de estudos com animais de experimentação. Os
com consequente perda de suas funções bioló- estudos com desenhos metodológicos distintos
gicas e/ou desequilíbrio homeostático, cuja mani- foram utilizados, predominantemente, para a ela-
festação é o dano oxidativo potencial contra célu- boração de conceitos, bem como para a descrição
las e tecidos4. A cronicidade do processo em de mecanismos de ação.
questão tem relevantes implicações sobre o pro-
cesso etiológico de numerosas enfermidades
MECANISMOS DE GERAÇÃO
crônicas não transmissíveis, entre elas a ateros- DE RADICAIS LIVRES
clerose, diabetes, obesidade, transtornos neuro-
degenerativos e câncer5. Ferrari6, em estudo de Os mecanismos de geração de radicais li-
revisão, ratifica que a geração de radicais livres vres ocorrem, normalmente, nas mitocôndrias,
desencadeia eventos patológicos que, por sua vez, membranas celulares e no citoplasma. Tais meca-
Revista de Nutrição Rev. Nutr., Campinas, 23(4):629-643, jul./ago., 2010

nismos podem, especialmente, ser favorecidos meio da reação com o radical livre óxido nítrico
pelos íons ferro e cobre7. A mitocôndria, por meio (NO•), gerar a espécie reativa de nitrogênio, pero-
da cadeia transportadora de elétrons, é a principal xinitrito (ONOO), também potencialmente reati-
fonte geradora de radicais livres5. va5,8 (Figura 1).
Em condições fisiológicas, os organismos Os íons ferro e cobre são muito ativos em
aeróbicos metabolizam 85% a 90% do oxigênio reações de óxido-redução, o que os capacitam
(O2) consumido na mitocôndria, por meio da ca- como potentes catalisadores das reações de gera-
deia transportadora de elétrons. Os restantes 10% ção de radicais livres. A participação desses metais
a 15% são utilizados por diversas enzimas se dá, especialmente, por meio das reações de
oxidases e oxigenases e, ainda, por reações quí- Fenton e Haber-Weiss. A primeira diz respeito à
micas de oxidação direta8. geração de radical OH•, por meio da reação do
H2O2 com os íons em questão, ao passo que, na
Na mitocôndria, o O2 sofre redução tetra-
segunda, estes íons catalisam a reação entre o
valente, com aceitação de quatro elétrons, resul-
H2O2 e o radical O2•, a fim de gerar, da mesma
tando na formação de água (Figura 1). A enzi-
forma, o radical OH•7,8 (Figura 1).
ma catalisadora dessa reação é a citocromo oxi-
dase. Na parte terminal da cadeia transportadora A ligação do ferro e cobre às proteínas
de elétrons, a referida enzima oxida quatro molé- específicas: transferrina, ferritina e ceruloplas-
culas de citocromo c removendo um elétron de mina, por meio da quais estes são transportados,
cada uma delas. Esses elétrons são adicionados utilizados e estocados, previne e/ou minimiza as
ao O2 para formar água. A ação da citocromo reações de geração de radicais livres catalisadas
oxidase controla a geração de radicais livres, por esses metais. No citoplasma de células hepá-
impedindo sua geração excessiva na mitocôndria. ticas, o ferro livre (não ligado à ferritina) é facil-
No entanto, cerca de 2% a 5% do oxigênio meta- mente dissociado na forma de íon, o que o torna
bolizado nas mitocôndrias são desviados para cataliticamente ativo e apto para participar de
outra via metabólica, e reduzidos de forma univa- reações de óxido-redução e, consequentemente,
lente, dando origem aos radicais livres2,7,8. de geração de radicais livres7,9.
Em face da redução univalente do O2 são Os ácidos graxos poli-insaturados contidos
gerados os radicais superóxido (O2•), hidroxila nas membranas celulares fazem com que essas
(OH•) e, ainda, peróxido de hidrogênio (H2O2). Esse sejam potentes geradoras de radicais livres, alco-
processo se dá mediante reações específicas, cata- xila (LO•) e peroxila (LO2•), por meio da lipopero-
lisadas por enzimas e com a participação dos íons xidação. Tal processo constitui-se de reações em
ferro e de cobre (Figura 1). O H2O2, apesar de cadeia, representadas pelas etapas de iniciação,
não ser um radical livre, por não ter um elétron propagação e terminação2.
desemparelhado na sua última camada eletrônica, O radical OH•, por meio da retirada de um
é uma espécie com alto potencial reativo. Por átomo de hidrogênio dos ácidos graxos poli-
participar da reação de geração de OH• tem ação -insaturados da membrana celular, desempenha
deletéria potencial, uma vez que esse se constitui importante papel na lipoperoxidação, sendo consi-
no mais reativo dos radicais livres, pois pode alterar derado o principal iniciador de tal processo9.
qualquer estrutura celular que se encontre próxi- Entretanto, a participação do ferro também é con-
ma. Diferente dos radicais livres, o H2O2 tem vida siderada fator determinante, ressaltando-se a im-
longa e é capaz de atravessar as membranas portância da relação equimolar entre Fe3+/ Fe2+,
celulares apresentando-se potencialmente tóxico para possibilitar a iniciação desse processo. Os íons
para as células. Esta toxicidade pode ser aumen- ferro agem como catalisadores da conversão de
tada em dez mil vezes pela presença de ferro2,8. hidroperóxidos lipídicos (LOOH) em radicais LO• e
Além da capacidade do O2• em participar LO2•, que, por serem potencialmente reativos,
de reações de geração de OH•, pode ainda, por iniciam uma nova cadeia de reações, as quais po-

dem ser rápidas ou lentas, de acordo com a valên- pela ação deletéria dos radicais livres ou das espé-
cia do ferro2. cies reativas não-radicais. Tais ações podem ser
Outra importante fonte geradora de radi- alcançadas por meio de diferentes mecanismos
cais livres são as enzimas NADPH oxidases de ação: impedindo a formação dos radicais livres
(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate ou espécies não-radicais (sistemas de prevenção),
Oxidases). Essas se referem a proteínas transmem- impedindo a ação desses (sistemas varredores) ou,
brana que têm, por excelência, a função de trans- ainda, favorecendo o reparo e a reconstituição
ferir os elétrons através das membranas celulares. das estruturas biológicas lesadas (sistemas de
Geralmente, o aceptor de elétrons é o oxigênio reparo)7,11.
e, dessa forma, em decorrência desse processo, Usualmente, esse sistema é dividido em
gera-se o radical O2•. Tais enzimas existem em
enzimático e não-enzimático. No último caso, é
pelo menos seis isoformas, diferindo quanto ao
constituído por grande variedade de substâncias
local de expressão e co-fatores necessários para
antioxidantes, que podem ter origem endógena
a sua ativação10.
ou dietética (Tabela 1). Os antioxidantes são defi-
nidos como qualquer substância que, presente
Sistema de defesa antioxidante em menores concentrações que as do substrato
oxidável, seja capaz de atrasar ou inibir a oxidação
O sistema de defesa antioxidante tem a deste de maneira eficaz. Tais substâncias podem
função de inibir e/ou reduzir os danos causados agir diretamente, neutralizando a ação dos radi-
Tabela 1. Ações e mecanismos de diversas substâncias antioxidantes.
Antioxidantes Ação Referências

Não enzimáticos (de origem dietética)
Vitamina A (β-caroteno) Proteção contra a oxidação de lipídeos e DNA Rodrigo et al.12
Vitamina C (ácido ascórbico) Inibição das EROs (agente reductor). Estimula o poder antioxidante Rodrigo et al.12
da vitamina E e selênio. Proteção contra danos causados pela
LDL-ox
Vitamina E (α-tocoferol) Protección contra la peroxidación de los ácidos grasos insaturados Rodrigo et al.12
de la membrana celular y de las LDL. Converte O2• e H2O2 em for-
mas menos reactivas
Cu, Zn, Mn, Se Cofatores das enzimas antioxidantes SOD-Cu/Zn, SOD-Mn e Vincent et al.13
GSH-Pox
Otros carotenóides (licopeno) Proteção contra a oxidação de lipídeos, LDL, proteínas e DNA. Se- Visioli et al.14
(Autor, é otros em español ou outros em por- questra e inativa os radicais livres
tuguês?)
Fitoquímicos (resveratrol, catequinas, querce- Proteção contra a oxidação de lipídeos e DNA Fito et al.15
tinas, ácidos fenólicos e outros)
Enzimáticos
SOD SOD-Cu/Zn (citoplasma), SOD-Mn (mitocôndria). Catalisa a con- Vincent et al.13
versão do radical superóxido (O2•) em peróxido de hidrogênio (H2O2)
CAT Catalisa a conversão de H2O2 em O2 e H2O Vincent et al.13
GPx Catalisa a redução do H2O2 a H2O Vincent et al.13
DNA: ácido desoxirribonucléico; CAt: catalase; GPx: glutationa peroxidase; Cu: cobre; ERO’s: espécies reativas de oxigênio; H2O2: peróxido de
hidrogênio; LDL: lipoproteína de baixa densidade; LDL-ox: lipoproteína de baixa densidade oxidada; Mn: magnésio; O2•: radical superóxido; Se:
selênio; SOD: superóxido dismutase; Zn: zinco.
Fonte: Adaptado de Barbosa et al.16.

cais livres e espécies não-radicais, ou indireta- O referido radical (OH•) vem sendo indica-
mente, participando dos sistemas enzimáticos do como o de maior potencial reativo e com extre-
com tal capacidade4. ma instabilidade (vida média de 10-9 segundos).
Essas características os capacitam como o radical
livre mais propício na produção de danos oxida-
Sistema enzimático tivos. Além de ser o principal iniciador do processo
de peroxidação lipídica, tendo como consequência
O sistema de defesa enzimático inclui as a alteração da função biológica das membranas
enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase celulares, esse radical é capaz de agir sobre as
(CAT) e Glutationa Peroxidase (GPx) (Tabela 1). proteínas, alterando-as em relação à sua estrutura
Essas enzimas agem por meio de mecanismos de e/ou função biológica. Seu ataque ao DNA possi-
prevenção, impedindo e/ou controlando a forma- bilita a ocorrência de mutações9.
ção de radicais livres e espécies não-radicais, Considerando a potencialidade do radical
envolvidos com a iniciação das reações em cadeia OH• e o fato da não existência de defesa enzi-
que culminam com propagação e amplificação mática especializada, é de extrema importância a
do processo e, consequentemente, com a ocor- manutenção do perfeito equilíbrio entre as enzi-
rência de danos oxidativos2,8. mas antioxidantes, com o propósito de promover
a manutenção da integralidade celular. Assim, a
As enzimas CAT e GPx agem com o mesmo GPx merece atenção especial, uma vez que sua
propósito, ou seja, o de impedir o acúmulo de ação depende da manutenção do ciclo redox da
peróxido de hidrogênio. Tal ação integrada é de glutationa, por meio do controle da relação entre
grande importância, uma vez que essa espécie glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG)2,8,17
reativa, por meio das reações de Fenton e Haber- (Figura 2).
-Weiss, mediante a participação dos metais ferro A atividade das enzimas em questão
e cobre, culmina na geração do radical OH• (Figura muitas vezes depende da participação de cofa-
1), contra o qual não há sistema enzimático de tores enzimáticos, especialmente antioxidantes de
defesa2,8. origem dietética. Tais co-fatores podem diferir de
acordo com os compartimentos celulares de ação
- +
1) O2+ 4e + 4H 2H2O + energia das enzimas. A SOD pode ser encontrada sob duas
-
2) O2 + e O2 • formas: no citoplasma, é dependente de cobre e
SOD
3) 2O2• + 2H+ H2O2 zinco (SOD-Cu/Zn), enquanto na mitocôndria, ne-
2+ + -
4) Fe /Cu + H2O2 OH• + OH + Fe3+/Cu2+ cessita do manganês como co-fator (SOD-Mn). A
Fe/Cu • -
5) H2O2 + O2 OH + OH + 02 GPx também existe sob duas formas: dependente
-
6) O2• + NO• ONOO e independente de selênio e pode apresentar-se
no citoplasma ou na mitocôndria2,5.
Figura 1. Formação mitocondrial de radicais livres via cadeia trans-
portadora de elétrons.
Nota: 1) Redução tetravalente do oxigênio, por meio da qual recebe
quatro elétrons (e-) e quatro íons de hidrogênio (H+), formando
Sistema não-enzimático
duas moléculas de água (H2O) e liberando energia. 2) Geração
do radical superóxido (O2•) pela adição de um elétron a uma O sistema de defesa não-enzimático inclui,
molécula de oxigênio no estado fundamental (O2). 3) Por meio
de um processo denominado dismutação, o radical O2•, ao rece- especialmente, os compostos antioxidantes de ori-
ber íons de hidrogênio, gera peróxido de hidrogênio (H2O2). Tal gem dietética, entre os quais se destacam: vita-
reação é catalisada pela superóxido dismutase (SOD), que acele-
ra a reação na ordem de 104 vezes. 4) Reação de Fenton: quando
minas, minerais e compostos fenólicos. O ácido
o H2O2 reage com íons ferro (Fe2+) ou cobre (Cu+) é gerado o ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol e β-caroteno,
radical hidroxila (OH•). 5) Reação de Haber-Weiss: os referidos precursores das vitaminas E e A, respectivamente,
íons também podem catalisar a reação entre H2O2 e O2• gerando,
da mesma forma, OH•. 6) O radical O2• pode também reagir com
são compostos vitamínicos potencialmente an-
o óxido nítrico (NO•) gerando peroxinitrito (ONOO)8. tioxidantes. Outros carotenóides sem atividade de

vitamina A, como licopeno, luteína e zeaxan-tina, ação oxidante, tornando-a capaz de produzir es-
também o são. Entre os minerais destacam--se o pécies radicais (OH•) e não-radicais (H2O2)3.
zinco, cobre, selênio e magnésio3,18 (Tabela 1). Estudo realizado com cultura de células
Usualmente, os estudos que se referem à mostrou que essas, quando incubadas em H2O2,
ação de compostos antioxidantes limitam-nos à sofreram danos em resposta à ação oxidativa
avaliação de nutrientes e/ou alimentos isola- dessa espécie. A vitamina C, em presença de ferro,
dos19-28, em detrimento da consideração dos pa- aumentou a expressão dos danos referidos. Os
drões dietéticos. Tal fato consiste em relevante li- autores sugerem o envolvimento da vitamina C
mitação metodológica, uma vez que não se consi- na regulação do metabolismo de ferro, aumen-
dera a interação entre os vários nutrientes e ali- tando sua absorção e tornando-o mais apto a de-
mentos que podem atuar em sinergia na proteção sempenhar sua ação catalítica sobre as reações
de Fenton, resultando na conversão do H2O2 em
contra os danos oxidativos às células e aos tecidos.
radicais OH•, potencialmente mais reativos. Tam-
Assim, pode-se incorrer em erros na interpretação
bém ressaltaram que, concomitantemente, ocorre
dos resultados referentes ao potencial antioxi-
a modulação da expressão de dois genes rela-
dante dos compostos estudados.
cionados aos receptores de transferrina e ferri-
A vitamina C é, por excelência, um antioxi- tina29.
dante em potencial. No entanto, a presença de
Outra interação diz respeito ao composto
metais de transição como o ferro possibilita sua
quercetina, flavonóide amplamente encontrado
no vinho tinto. Tal composto é potencialmente
antioxidante. Entretanto, pode reagir com ferro
e tornar-se um pró-oxidante3.
SOD REAÇÃO DE FENTON
O2" H2O2 OH
"
As vitaminas C e E, por sua vez, demons-
REAÇÃO DE HABER-WEISS
tram interação cooperativa na inibição da peroxi-
dação lipídica e na proteção contra danos oxida-
H2O2 + H2O2
H2O2
2GSH NAPDP+ tivos ao DNA3. No entanto, Huang et al.22 não
CAT GPX encontraram efeito sinérgico (p=0,12) entre a
Grd
O2 2H2O ação das vitaminas C (500mg/dia) e E (400 IU de
2H2O GSSG NADPH
α-tocoferol/dia) suplementadas durante dois me-
ses, nos níveis urinários de PGF2-alfa-8-isopros-
DANOS tano, marcador da peroxidação lipídica.
OXIDANTES
A avaliação do potencial antioxidante in
Figura 2. Integração dos sistemas de defesa enzimático. vivo dos compostos não-enzimáticos depende de
Nota: Por meio da reação de dismutação, a superóxido dismutase (SOD) algumas variáveis, entre elas: absorção e biodispo-
catalisa a geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) a partir do
radical superóxido (O2•). As enzimas catalase (CAT) e glutationa nibilidade em condições fisiológicas; concentração
peroxidase (GPx) se integram para impedir o acúmulo de H2O2 plasmática ideal para desempenhar sua atividade
que, apesar de não ser um radical livre, é igualmente reativo e
capaz de promover danos potenciais. O acúmulo dessa espécie
antioxidante; tipos de radicais livres gerados no
reativa (H2O2) possibilita, por meio das reações de Fenton e Haber- processo oxidativo; em qual compartimento celu-
Weiss, a geração do radical hidroxila (OH•), contra o qual não
lar foram gerados e como foram gerados3.
existe defesa enzimática. A GPx reduz o H2O2 à água, no entanto
o faz à custa da conversão da glutationa reduzida (GSH) em oxi- A ação de determinado antioxidante pode,
dada (GSSG), essa última que promove ação oxidante em função
da ligação dissulfeto existente em sua estrutura. Assim, é de ex-
portanto, variar de acordo com o compartimento
trema importância a ação da glutationa redutase (GRd), respon- celular ou tecido no qual atua. A vitamina C apre-
sável pela recuperação da glutationa reduzida (GSH), possibili- senta intensa atividade antioxidante contra radi-
tando a manutenção da integralidade do ciclo redox da glutationa
e, consequentemente, do equilíbrio adequado entre os sistemas cais livres gerados em meio hidrofílico. No entan-
de defesa enzimáticos17. to, tal vitamina pode não ser capaz de inibir os

radicais livres que propagam as reações de pero- Marcadores do estresse oxidativo

xidação lipídica em meios lipofílicos. Já os flavo-
nóides são capazes de agir como antioxidantes, Quando a produção de radicais livres e/ou
inativando radicais livres em ambos os compar- espécies reativas supera a capacidade de ação dos
timentos celulares, hidrofílico e lipofílico3. Moreira antioxidantes, se favorece a oxidação de biomo-
& Mancini Filho30 sugerem que a atividade antioxi- léculas, gerando metabólitos específicos, os mar-
dante de compostos fenólicos presentes em espe- cadores do estresse oxidativo, que podem ser
ciarias (canela, erva doce e mostarda) difere entre identificados e quantificados. Tais marcadores são
sistemas aquoso e lipídico. derivados, sobretudo, da oxidação de lipídeos,
Segundo Huang et al.,22 a vitamina C proteínas e Ácido Desoxirribonucléico (DNA), sen-
(p=0,01) mostrou-se capaz de aumentar a capa- do os primeiros os de maior expressão4,13,31. Outra
cidade antioxidante total do soro (serum oxygen- forma de abordar a avaliação do estresse oxidativo
radical absorbance capacity - ORAC), o que não é a que emprega métodos indiretos, baseados na
ocorreu com a vitamina E (p=0,52). Os autores capacidade antioxidante32 (Tabela 2).
ressaltam que esse resultado reflete o fato de a Cada vez há maior evidência científica de
vitamina C, ao contrário da E, desempenhar me- que o estresse oxidativo desencadeia relevantes
lhor atividade antioxidante em meios hidrofílicos. implicações sobre os mecanismos que culminam
Tabela 2. Alguns dos marcadores do estresse oxidativo: descrição e fundamento.
Marcadores Descrição/Fundamento Referências
Derivados da oxidação de lipídeos

MDA Aldeídos: produtos da oxidação de lipídeos, o mais abundante, o Halliwell & Whiteman4;
MDA, resulta da oxidação dos ácidos graxos AA, EPA e DHA Mayne31
TBARS Quantificação da formação de MDA Vincent et al.13
8-epiPGF2α F2-isoprostanos: derivados del AA, o mais representativo é o Mayne31
8-epiPGF2α
Etano e Pentano Hidrocarbonetos voláteis, produtos da oxidação dos ácidos graxos Mayne31
n-3 e n-6
LDL-ox Dano oxidativo à molécula transportadora de colesterol Mayne31

Derivados da oxidação de proteínas
Carbonilos Resultado da ação das espécies reativas sobre as cadeias laterais Halliwell & Whiteman4
dos aminoácidos
3-Nitrotirosina Resultado da ação das ERON’s sobre as proteínas Halliwell & Whiteman4;
Mayne31
Derivados da oxidação de DNA
8-OHdG Resultado da oxidação do ácido nucleico, guanina Halliwell & Whiteman4;
Vincent et al.13; Mayne31
5-HMdU Resultado da oxidação do ácido nucleico, timina Mayne31
Capacidade antioxidante
TAS Antioxidantes totais presentes na amostra Vincent et al.13
FRAP Antioxidantes que não contêm ligações S-H Vincent et al.13
ORAC Antioxidante específico, avaliado por meio de provas de Vincent et al.13
fluorescência
5-HMdU: 5-Hidroxymetil-2’-Desoxyuridine; 8-epiPGF2α: Prostaglandin F2-Alfa-8 Isoprostane; 8-OHdG: 8-Hidroxyl-2’-Deoxyguanosine; AA ácido

araquidônico (C20:4); DNA: ácido desoxirribonucléico; DHA: ácido docosahexanóico (C22:6); EPA: ácido eicosapentanóico (C20:5); ERON’s: espé-
cies reativas de óxido de nitrogêno; FRAP: ferritin-reducing antioxidant power; LDL-ox: lipoproteína de baixa densidade oxidada; MDA: malondialdeído;
n-3: ácidos graxos da série ômega 3; n-6: ácidos graxos da série ômega 6; ORAC: oxygen-radical absorbance capacity; S-H: pontes de hidrogênio;
TAS: total antioxidant status; TBARS: thiobarbituric reactive acid susbstances.
Fonte: Adaptado de Barbosa et al.16.

com o desenvolvimento da sindrome metabó- concentração plasmática de malondialdeído, tam-

lica33. Dentre os vários fatores que modulam o bém marcador da peroxidação lipídica26.
estresse oxidativo, destaca-se a dieta31. Assim, os Huang et al.22 avaliaram, em adultos não
marcadores do estresse oxidativo constituem fumantes, o efeito isolado das vitaminas C
ferramentas notáveis na avaliação dos possíveis (500mg/dia) e E (400 IU de α-tocoferol/dia), suple-
efeitos e implicações da dieta sobre o referido
mentadas durante dois meses, bem como o efeito
processo.
da interação entre elas. Não foi observado efeito
sinérgico entre a ação das vitaminas C e E em
nenhum dos marcadores avaliados: malondial-
FATORES EXÓGENOS
MODULADORES DO deído (p=0,46), F2-isoprostanos (p=0,23) e capa-
ESTRESSE OXI DATIVO cidade antioxidante total do soro (ORAC)
(p=0,13). Em relação ao efeito isolado, a vitamina
Dieta C e não a E se mostrou capaz de agir em pelo
menos um dos marcadores em questão, aumen-
Paniz et al.25 demonstraram que os níveis
tando a ORAC (M=194, DP=75µmol Trolox/L;
plasmáticos de vitamina C correlacionaram-se
p=0,01).
positivamente com os de albumina (r=0,317;
p=0,009) e com a ALA-D (δ-aminolevulinate Meagher et al.20 avaliaram, em adultos
dehydratase activity) (r=0,308; p=0,011). Confor- saudáveis, o efeito da suplementação de vitamina
me supõem esses autores, a vitamina C tem ação E durante oito semanas, em diferentes dosagens:
protetora sobre os grupos tiol (-SH) dessas pro- 200, 400, 800, 1.200 e 2.000 IU/dia. Nenhuma
teínas, uma vez que esses são suscetíveis de oxi- das dosagens relacionadas foi capaz de exercer
dação. Observou-se, ainda, correlação negativa efeito sobre os níveis urinários de F2-isoprostanos.
(r=-0,241; p=0,042) entre a ALA-D e os grupos Roberts et al.27 observaram que, em indiví-
carbonila. Esses últimos, segundo Halliwell & duos hipercolesterolêmicos (colesterol total
Whiteman4, consistem nos marcadores de maior >200mg/dL), a vitamina E (3.200 IU/dia) reduziu
relevância da oxidação de proteínas. os níveis plasmáticos de F2-isoprostanos após 16
A suplementação de vitamina C (1,5g/dia) semanas de suplementação (p<0,005). Diante
em indivíduos diabéticos, por três meses, não desse resultado, os autores testaram diferentes
foi capaz de reduzir os níveis plasmáticos de doses de vitamina E (0, 100, 200, 400, 800, 1.600
PGF2-alfa-8-isoprostano (Média-M=95, Desvio- e 3.200 IU/dia), durante 16 semanas de suplemen-
-Padrão-DP=4 versus M=99, DP=5pg/mL; tação, e verificaram uma tendência linear entre o
p>0,05), apesar do aumento significativo nos aumento das doses e a redução percentual nos
níveis plasmáticos da referida vitamina (M=58, níveis de F2-isoprostanos. Tal tendência alcan-
DP=6 versus M=122, DP=10µmol/L; p<0,01)21. O çou significância estatística a partir da dose de
PGF2-alfa-8-isoprostano é o composto mais abun- 1.600 IU/dia (35 ± 2%; p<0,03), seguida da de
dante entre os F2-isoprostanos, marcadores da 3.200 IU/dia (M=49, DP=10%; p<0,005).
peroxidação lipídica, derivados da ação de radi- Ainda em relação à vitamina E, Devaraj et
cais livres sobre os ácidos graxos poli-insatu- al.24 testaram a suplementação de 1.200 IU/dia,
rados, especialmente o ácido araquidônico34. durante dois anos, em indivíduos com doença
Em estudo com cultura de células, foram arterial coronariana. Seus níveis plasmáticos corre-
administradas as vitaminas C (60mM) e E (2mM) lacionaram-se negativamente com os níveis uriná-
a eritrócitos de ratos previamente incubados com rios de F2-isoprostanos (r=-0,57; p<0,0001) e
H2O2. Os resultados mostraram que ambas as liberação de radicais superóxido pelos monócitos
vitaminas diminuíram efetivamente (p<0,05) a (r=-0,57; p<0,0001).

Prasad et al.18 referem-se ao zinco como TBARS, teste das substâncias que reagem com o
um agente antioxidante altamente eficiente. Estes ácido tiobarbitúrico, dosa os aldeídos, substâncias
autores testaram, em indivíduos entre 55 e 87 que se destacam como metabólitos secundários
anos de idade, o efeito antioxidante da suple- da oxidação de lipídeos. Dentre esses, o malon-
mentação de zinco (45mg de zinco elementar). dialdeído é um dos mais abundantes4,31,36.
Após seis meses de suplementação, o zinco Karlsen et al.28 avaliaram o efeito da inges-
mostrou-se capaz de diminuir os níveis plasmáticos tão diária de uma taça de vinho tinto sobre mar-
de malondialdeído (M=1,66, DP=0,34 versus cadores do estresse oxidativo. Sugere-se que a
M=1,35, DP=0,18; p=0,002) e 8-hidroxil-2’-deoxi-
ação protetora do vinho sobre o estresse oxidativo
guanosina (8HdG) (M=0,63, DP=0,16 versus
se dá, especialmente, pela presença dos compos-
M=0,50, DP=0,14; p=0,030). O composto 8-OHdG
tos fenólicos. O estudo foi realizado com 94 indi-
tem sido apontado como o marcador de maior
víduos (31 homens e 57 mulheres) com idade
relevância na avaliação do dano oxidativo ao
entre 37 e 70 anos. Estes foram divididos em dois
DNA4,31,35.
grupos: teste (150mL/dia de vinho tinto) e contro-
Bruno et al.23 testaram, em ratos Sprague le. Independente do sexo, o vinho tinto não foi
Dawley, o efeito de dietas adequadas (AZ; 50mg capaz de exercer efeito sobre nenhum dos mar-
de Zn/kg de dieta; n=12) e deficientes em zinco cadores avaliados: FRAP e níveis plasmáticos dos
(DZ; <0,05mg de Zn/kg de dieta; n=12), admi- antioxidantes, α-tocoferol, β-caroteno, gluta-
nistradas por 21 dias. O grupo DZ mostrou meno- tiona e compostos fenólicos totais. Cabe ressaltar
res níveis plasmáticos de F2-isoprostanos (p<0,05) que tal estudo teve os seguintes critérios de exclu-
e menor Ferritin-reducing Ability of Plasma (FRAP) são: presença de doenças crônicas não transmis-
(p=0,039). Além do efeito sobre esses marcadores, síveis, tabagismo, uso de medicamentos (estatinas
associaram-se à DZ menores níveis plasmáticos e aspirinas) e consumo de álcool além do presente
dos antioxidantes: vitamina C (p=0,003) e α-toco- no vinho. Estes foram estabelecidos com o obje-
ferol (p<0,001). O FRAP diz respeito a uma medida tivo de promover maior homogeneidade da
da capacidade antioxidante do plasma, pois me- amostra e minimizar os efeitos de possíveis vieses.
nor FRAP indica menor capacidade de ligação da
Destaca-se, aqui, a ampla faixa etária da popu-
ferritina ao ferro e, consequentemente, maior
lação estudada e a ausência de controle dos hábi-
quantidade de ferro livre, capaz de catalisar a
tos dietéticos e de atividade física.
geração de radicais OH•, por meio das reações
de Fenton e Haber-Weiss7,9. Outros fatores dietéticos que não a suple-
mentação de antioxidantes também se mostraram
Oteiza et al.19 também testaram em ratos
capazes de exercer efeitos sobre o estresse oxi-
Sprague Dawley o efeito de dieta deficiente em
dativo. Dentre esses, o de maior expressão é a
zinco (DZ; 0,5µgZn/g de dieta; n=10) sobre mar-
adequação da ingestão energética37,38.
cadores do estresse oxidativo. Após 14 dias, o
grupo DZ, quando comparado ao que recebeu Burneiko et al.37 destacam que a ingestão
dieta adequada em zinco (AZ; 25µgZn/g de dieta; de dietas hiperenergéticas se associa com o de-
n=10), mostrou maiores níveis plasmáticos de senvolvimento de câncer, doenças degenerativas
grupos carbonila (M=3,6, DP=0,2 versus M=2,4, relacionadas ao envelhecimento, dislipidemia, ate-
DP=0,2; p<0,05) e TBARS (Thiobarbituric Acid- rosclerose e doenças cardiovasculares. Os autores
Reative Substances) (M=39, DP=3 versus M=25, ressaltam que o estresse oxidativo vem sendo
DP=2; p<0,05). No entanto, não houve efeito considerado importante elo em tais associações
significativo sobre o marcador da oxidação ao e que os efeitos benéficos da restrição energética
DNA, o composto 8-hidroxil-2’-deoxiguanosina podem estar associados à redução do peso
(M=8,9, DP=1 versus M=6,8, DP=1; p>0,05). O corporal.

Avaliou-se em ratos Wistar o efeito de oxidativos causados pela ação de tais agentes.
Dieta Hiperenergética (DH) sobre marcadores do Esses mecanismos estão relacionados ao sistema
estresse oxidativo. Após oito semanas de experi- de defesa enzimático e não-enzimático8.
mentação, comparam-se os grupos DH e controle, Em decorrência da resposta adaptativa
não havendo diferenças em relação aos marca- mediada pela atividade física, as espécies reativas
dores avaliados: níveis plasmáticos totais de com- geradas têm ação de sinalizadores celulares capa-
postos antioxidantes e atividades das enzimas zes de ativar vias de regulação de genes rela-
catalase e glutationa peroxidase. Nesse mesmo cionados à expressão de enzimas e proteínas
estudo, os autores encontraram que a interação específicas responsáveis por manter o equilíbrio
entre DH e atividade física (natação 2 e 3 vezes/ intracelular entre oxidantes e antioxidantes. A
semana) tiveram efeito pró-oxidante, diminuindo enzima xantina oxidase está envolvida na produ-
a atividade enzimática da catalase mediante aná- ção do radical superóxido (O2•). No entanto, a
lise do fígado dos animais37. geração de proteínas com atividade quinase36,
entre outras ações, é responsável pelo aumento
Johnson et al.38 investigaram o efeito da
da expressão da superóxido dismutase, defesa
ingestão de dieta com restrição energética sobre
antioxidante contra o radical O2•.
marcadores do estresse oxidativo. Participaram do
estudo dez indivíduos obesos (IMC>30 kg/m2), os Souza et al.36 ao testar o efeito da atividade
quais receberam, em dias alternados, Dieta Res- física intensa sobre marcadores do estresse oxida-
tivo, observaram que, comparado ao repouso, a
tritiva (DR) com 20% de redução da ingestão ener-
corrida em esteira rolante determinou aumento
gética normal e Dieta Normal (DN), irrestrita. O
nos níveis plasmáticos de malondialdeído, princi-
grupo DR, comparado ao DN, mostrou meno-
palmente decorridos 23 (M=0,21m DP=0,012
res níveis plasmáticos de grupos carbonila e
versus M=1,5, DP=0,009; aumento de 714%;
F2-isoprostanos, após 2, 4 e 8 semanas de inter-
p<0,01) e 26 minutos (M=0,21, DP=0,012 versus
venção.
M=1,6, DP=0,013; aumento de 761%; p<0,01).
Os autores ainda ressaltaram que os níveis de
Atividade física malondialdeído relacionaram-se negativamente
com a capacidade total do plasma, sendo que
Durante uma atividade física intensa, o esta sofreu redução de 52% (M=483, DP=88
consumo total de oxigênio é aumentado em, versus M=233, DP=12); p<0,01) e 59% (M=483,
aproximadamente, dez a vinte vezes. A captação DP=88 versus M=200, DP=14; p<0,01), aos 23 e
do oxigênio pelo tecido muscular também sofre 26 minutos, respectivamente.
aumento relevante, da ordem de cem a duzentas Clarkson & Thompson11 ressaltam que a
vezes. Tais alterações no metabolismo de oxigênio atividade física intensa exerce efeitos sobre os
favorecem a geração de radicais livres e/ou espé- aumentos dos níveis plasmáticos de malondial-
cies reativas não-radicais. A atividade física intensa deído e concentração de pentano exalado no ar
expirado. Esse último marcador, segundo Knutson
é capaz de gerar as espécies em questão, por meio
et al.39, decorre da quantificação de compostos
da ativação de, pelo menos, três mecanismos
voláteis que constitui em outra técnica de aferição
principais: produção mitocondrial, citoplasmática
da oxidação lipídica. Entre tais compostos des-
e favorecida pelos íons ferro e cobre7. tacam-se, principalmente, os hidrocarbonetos
A atividade física intensa, em razão do etano e pentano, formados mediante peroxidação
incremento do consumo de oxigênio, é um fator lipídica dos ácidos graxos poli-insaturados da série
que predispõe à geração de agentes oxidantes. ômega 3 e 6, respectivamente.
No entanto, é também hábil em promover meca- Burneiko et al.37 estudaram, em ratos
nismos de adaptação capazes de mitigar os danos Wistar, o efeito da atividade física sobre o estresse

oxidativo. Os ratos foram distribuídos em três confirmaram a presença de níveis consideráveis

grupos (n=8): sedendário (S), praticantes de ati- de peróxido de hidrogênio na fumaça do cigarro.
vidade física por dois dias/semana (AT2) e cinco Esta ainda, por ser rica em ferro, pode catalisar a
dias/semana (AT5). A atividade física eleita foi a oxidação da Lipoproteína de Baixa Densidade
natação. Após oito semanas de experimentação, (LDL)43. A presença da LDL oxidada (LDLox), agen-
independentemente da frequência de realização te pró-aterogênico, é evidenciada desde a pri-
da atividade física, o grupo dos ratos ativos mos- meira fase da lesão aterogênica (formação das
trou maiores níveis séricos totais de substâncias estrias gordurosas) até a ruptura das lesões na
antioxidantes: AT2 versus S (M=24,5, DP=2,8 parede vascular, por meio da produção de citoci-
versus M=18,9, DP=1,4; p<0,05) e AT5 versus S nas específicas que sinalizam a expressão de pro-
(M=30,4, DP=4,4 versus M=18,9, DP=1,4; teínas quimiotáticas, fatores de crescimento e
p<0,05). Tais resultados (aumento dos níveis séri- moléculas de adesão, fatores que implementam
cos totais de substâncias antioxidantes) sugerem o processo inflamatório crônico, característico da
a ocorrência da resposta adaptativa mediante a aterosclerose44.
realização de atividade física. Park et al.40, testaram, em ratos Sprague
11
Clarkson & Thompson ainda destacam Dawley, o efeito do fumo sobre marcadores do
que, mediante a realização de atividade física estresse oxidativo. Os ratos foram submetidos à
intensa, a suplementação de antioxidantes, espe- inalação de fumaça de cigarro, durante um mês,
cialmente as vitaminas C e E, é capaz de exercer com a frequência de três vezes ao dia. A análise
efeitos sobre a redução de marcadores do estresse de tecidos de pulmão de ratos do grupo-teste,
oxidativo. No entanto, esses autores discutem a quando comprado ao controle, mostrou maiores
necessidade de tais suplementos diante da exis- níveis de glutationa oxidada (GSSG; M=0,74,
tência de resposta adaptativa mediada pela ati- DP=0,06 versus M=0,09, DP=0,05; p<0,001), con-
vidade física, hábil em promover mecanismos de trastando com menores níveis de glutationa redu-
proteção contra a geração excessiva de espécies zida (GSH; M=7,92, DP=0,83 versus M=14,40,
reativas capazes de causar danos às células e aos DP=0,58; p<0,001). O composto 8-hidroxil-2’-
tecidos. deoxiguanosina esteve presente em maiores
quantidades nos tecidos de pulmonares (p<0,05),
hepáticos (p<0,005) e cardíacos (p<0,05) de ratos
Tabagismo, álcool e outros fatores do grupo teste.
Segundo Park et al.40, o fumo é capaz de Lykkesleldt41, em estudo de revisão, apon-

alterar os marcadores da peroxidação lipídica, tou que os níveis dos marcadores de peroxidação
oxidar os grupos tiois das proteínas e aumentar lipídica, Thiobarbituric Acid-Reative Substances
os níveis plasmáticos dos grupos carbonila. Sua (TBARS) e malondialdeído, correlacionaram-se po-
ação sobre a oxidação do DNA promove o aumen- sitivamente com o hábito de fumar. Entre os 45
to da geração dos compostos 8-hidroxil-2’-deoxi- estudos revisados, 33 revelaram resultados com
guanosina. Ressaltam ainda que os níveis plasmá- significância estatística, a pelo menos, 5% de pro-
ticos de vitamina C e E encontram-se reduzidos babilidade. Tais resultados referem-se aos maiores
em indivíduos fumantes. níveis dos marcadores em questão, no grupo de
A fumaça do cigarro contém mais de 4 indivíduos fumantes quando comparado aos
mil compostos, incluindo espécies reativas de oxi- não-fumantes. Os referidos estudos foram todos
gênio e nitrogênio, com ação potencialmente de- realizados em humanos. No entanto, variaram
letéria sobre as macromoléculas, especialmente quanto ao número de indivíduos participantes,
sobre os lipídeos41. Hu et al.42, por meio de método tempo de acompanhamento, número de cigarros,
ultra-sensível de quimiluminescência seletiva, métodos de aferição dos marcadores e fluido

biológico no qual estes foram medidos (plasma, nina dinucleotídeo, age como aceptor de elétrons
soro, saliva ou urina). do xenobiótico em questão e sequencialmente,
Os efeitos do álcool sobre o estresse oxida- transfere este elétron a outro aceptor, desta vez
tivo podem ser diretos ou ainda mediados por o oxigênio, gerando assim radicais superóxido. Na
seus metabólitos secundários, sendo marcante sua presença de antimicina A (antibiótico produzido
atuação sobre a redução dos níveis plasmáticos por bactérias do gênero Streptomyces), alguns
ou séricos dos antioxidantes dietéticos, entre eles: intermediários da cadeia transportadora de
α-tocoferol, ácido ascórbico e selênio45. Das & elétrons, como a ubiquinona, se auto-oxidam
Vasudevan46, sugeriram que o metabolismo do dando lugar à perda de elétrons e consequente
etanol está diretamente envolvido na geração de formação de radicais superóxido49. Os anti-infla-
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, bem matórios não-esteróides (AINEs) induzem a gera-
como na depleção dos componentes do sistema ção de radicais superóxido, via ativação da NADPH
antioxidante e aumento nos níveis de marcadores oxidase, complexo enzimático transmembrana ge-
específicos, sobretudo malondialdeído. rador do radical superóxido. Li et al.50, demons-
traram que mediante a administração AINE houve
Lecomte et al.47, demonstraram que, inde-
aumento na expressão de NADPH oxidase e
pendente do estado nutricional, o álcool exerce
P22phox (subunidade necessária a ativação enzi-
efeito sobre os níveis plasmáticos de vitaminas e
mática) em tecido cardíaco e aorta de ratos hiper-
minerais antioxidantes, bem como sobre marca-
tensivos. Os autores ainda evidenciaram tais resul-
dores específicos. Foram estudados 417 homens,
tados em células endoteliais humanas.
entre 29 e 49 anos de idade, consumidores leves
As radiações ionizantes promovem a ins-
(<33g/dia; M=1, DP=10,6 - 9,2g/dia) e moderados
tauração do estresse oxidativo, entre os meca-
(>33g/dia; M=1, DP=59,0 - 25,7g/dia) de álcool.
nismos propostos destacam-se: a ativação das
Comparados a 102 pacientes alcoólatras sem
NADPH oxidases, a disfunção da cadeia transpor-
complicações hepáticas, as concentrações plas-
tadora de elétrons mitocondrial e a redução da
máticas de α-tocoferol, ácido ascórbico e selênio
atividade das enzimas antioxidantes, sobretudo
foram maiores (p≤0,001) nos bebedores leves, ao
da SOD-Mn. Lemon et al. 51 demonstraram
passo que as de malondialdeído foram menores
maiores níveis de 8-Hidroxyl-2’-Deoxyguanosine
(p≤0,001).
(8-OHdG), marcador de dano oxidativo ao DNA
Huang et al.48 ratificaram o efeito do álcool (ácido nucléico guanina), em ratos submetidos à
sobre o estresse oxidativo, analisando em 76 indi- radiação gama (yH2AX) proveniente de uma fonte
víduos alcoólatras, marcadores específicos. Tal radiotiva de césio (137Cs). Outros estudos ratificam
análise, quando comparada a do grupo controle o efeito das radiações ionizantes sobre marca-
(19 indivíduos saudáveis, não bebedores), mostrou dores do estresse oxidativo, sobretudo os refe-
níveis séricos significativamente maiores de ma- rentes ao dano oxidativo ao DNA52-54, decorrentes
londialdeído, enquanto que menor atividade da dos processos mutagênicos, aberrações cromossô-
SOD. micas, instabilidade genômica e alterações telo-
Entre os fatores exógenos, potencialmente méricas51.
geradores de radicais livres, destacam-se ainda O acúmulo de metais pesados em um siste-
os xenobióticos, radiações ionizantes, metais pesa- ma biológico propicia a catálise de reações que
dos, entre outros41. culminam na geração de espécies reativas de
Os xenobióticos promovem, via citocromo oxigênio, e ainda pode exercer influência sobre
P-450 ou ciclo redox, a produção de espécies os mecanismos de defesa antioxidante, sobretudo
reativas de oxigênio. Um mediador de baixo peso o enzimático43,55. Farombi et al.55, por meio de
molecular do ciclo redox, usualmente flavina ade- espectrofotometria de absorção atômica, eviden-

ciaram a presença de altos níveis de metais pesa- O efeito da dieta hiperenergética sobre a
dos (arsênio, chumbo, cádmio, cobre e zinco) nas instauração do estresse oxidativo, possivelmente,
águas do rio Ogun (Nigéria, África). Posterior- é mediado pela redução do peso corporal. Existem
mente, demonstraram que nos peixes nativos des- evidências de que os fatores exógenos tais como:
te rio houve diminuição da atividade das enzi- xenobióticos, radiações ionizantes, metais pesa-
mas superóxido dismutase e catalase, alterações dos, tabagismo e ingestão de álcool agem sobre
no ciclo redox da glutationa e, ainda, indução da a geração de radicais livres, bem como sobre a
peroxidação lipídica. atuação dos sistemas de defesa antioxidante, no
entanto, ainda não é possível determinar com se-
gurança, sobretudo em humanos, os níveis de
CONSIDERAÇÕES FINAIS exposição que seriam potencialmente nocivos.
A instalação do estresse oxidativo se dá

por meio de um desequilíbrio entre os fatores COLABORADORES
pró-oxidantes e antioxidantes, em favor dos pri-

K.B.F. BARBOSA, J. BRESSAN, N.M.B. COSTA,
meiros. O sistema de defesa antioxidante tem o R.C.G. ALFENAS, S.O. PAULA e V.P.R MINIM parti-
objetivo primordial de manter o processo oxidativo ciparam da concepção, do desenho do estudo, da aná-
dentro dos limites fisiológicos e passíveis de regu- lise, da interpretação dos dados e da redação final do
lação, impedindo que os danos oxidativos se am- artigo.
plifiquem, culminados em danos sistêmicos irrepa-
ráveis. Os mecanismos de geração de radicais li-
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10.1590/S1415-52732004000200009.
importância na modulação do estresse oxidativo.
2. Ferreira ALA, Matsubara LS. Radicais livres: con-
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são ainda conclusivos, sobretudo em relação à 3. Bianchi MLP, Antunes LMG. Radicais livres e os
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os estudos de suplementação têm conseguido 200001.
demonstrar efeitos positivos sobre biomarcadores 4. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive
específicos, sendo os relacionados à oxidação de species and oxidative damage in vivo and in cell
culture: how should you do it and what do the
lipídeos (malondialdeído e isoprostanos) os de results mean? Br J Pharmacol. 2004; 142(2):
maior relevância. Tais divergem em relação às con- 231-55.
dições dos indivíduos (sexo, idade, índice de massa 5. Green K, Brand MD, Murphy MP. Prevention of
corporal, estado de saúde, uso de fármacos, mitochondrial oxidative damage as a therapeutic
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hábitos de vida, entre outros) e também existe a 110-8.
variabilidade relacionada à intervenção (dose e 6. Ferrari CKB. Functional foods, herbs and
tempo de suplementação, conteúdo dos com- nutraceuticals: towards biochemical mechanisms
ponentes antioxidantes e administração de um of healthy aging. Biogerontology. 2004; 5(5):
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componente isolado ou em combinação com
7. Koury JC, Donangelo CM. Zinco, estresse oxidativo
outros). Tais fatores dificultam a interpretação dos e atividade física. Rev Nutr. 2003; 16(4):433-41.
resultados destes estudos, bem como podem ser doi: 10.1590/S1415-52732003000400007.
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208 Rev Bras Med Esporte _ Vol. 6, Nº 5 – Set/Out, 2000

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Agradeço também a todos que contribuíram directa ou indirectamente para que

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Figura 2: Fórmula estrutural de GSH e GSSG respectivamente. 6

Figura 3: Representação esquemática das reacções intervenientes da biossíntese da

Figura 4: Reacções de biossíntese de GSH: a) γ-glutamilcisteína sintetase; b) glutationa

Figura 5: Esquematização do ciclo do γ-glutamilo 14

Figura 6: Esquematização do processo de compartimentação e exportação 15

Figura 7: Esquematização metabólica do processo de catabolismo 17

Figura 8: GSH na destoxificação de xenobióticos: via ácidos mercaptúricos 22

Figura 9: GSH na destoxificação de xenobióticos: Exemplos da actuação da glutationa

Figura 10: Activação/desactivação metabólica do acetoaminofeno 24

Figura 11: Bioactivação do diclorometano através da GSH 25

Figura 12: 4 mecanismos possíveis de transporte de GSH 27

Figura 14: Sequência de eventos apoptóticos 47

ABCC – Família de proteínas transportadoras de glutationa; em inglês, ATP- binding

ADP – Adenosina difosfato

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico

Apaf-1 – Em inglês, apoptosis protease activating-factor 1

ARE – Em inglês, antioxidant responsive element

ATP – Adenosina trifosfato

BSO – Butionina sulfoximina

Ca2+ – Ião cálcio

CFTR – Proteína reguladora de condutância de fibrose cística

Cys-SR – conjugado com a cisteína

Cu+ – Ião cobre

DMI – Degeneração macular relaciona com a idade

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DPOC – Doença pulmonar obstrutiva crónica

Epre – Elemento de resposta antioxidante; em inglês, Electrophile response element

GCS – γ-Glutamilcisteína sintetase

GGT – γ-Glutamiltransferase ou γ-Glutamiltranspeptidase

GPx – Glutationa peroxidase

GS- – Anião tiolato

GSH – Glutationa reduzida

GSSG – Glutationa oxidada

HIV – Em inglês, Human immunodeficiency virus

IAP – Proteínas inibidoras da apoptose