Machine Translated by Google

Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335 DOI

10.1007/s00210-009-0434-8

ARTIGO ORIGINAL

O íleo do porquinho-da-índia não tem o poder direto, de alta potência,

M2-muscarínico, mecanismo contrátil característico do íleo do
camundongo

Michael T. Griffin & Minoru Matsui &

Rennolds S. Ostrom & Frederick J. Ehlert

Recebido: 5 de maio de 2009 /Aceito: 16 de junho de 2009 / Publicado online: 7 de julho

de 2009 # O(s) autor(es) 2009. Este artigo é publicado com acesso aberto em Springerlink.com

Resumo Nós exploramos se o receptor muscarínico M2 no íleo A curva da oxotremorina-M no íleo de tipo selvagem
da cobaia provoca uma resposta contrátil direta altamente assemelhava-se à do camundongo knockout M3 em termos de
potente, como a do camundongo knockout do receptor seu pEC50, Emax e inibição por antagonistas muscarínicos
muscarínico M3 . Primeiro, caracterizamos a atividade de seletivos. Assim, o tratamento com mostarda 4-DAMP parece
bloqueio irreversível do receptor da mostarda 4-DAMP no íleo inativar as respostas M3 seletivamente e torna o comportamento
de camundongos knockout para receptores muscarínicos para contrátil muscarínico do íleo de tipo selvagem semelhante ao
verificar sua seletividade M3 . Em seguida, usamos mostarda 4- do camundongo knockout M3 . Após o tratamento com mostarda
DAMP para inativar as respostas M3 no íleo da cobaia para 4-DAMP, a resposta contrátil do íleo da cobaia à oxotremorina-
tentar revelar contrações diretas mediadas pelo receptor M2 . M exibiu baixa potência e um perfil de antagonismo competitivo
O agonista muscarínico, oxotremorina-M, provocou contrações consistente com uma resposta M3 . O íleo da cobaia, portanto,
potentes no íleo de camundongos de tipo selvagem, nocaute não possui um componente contrátil M2 direto e altamente
do receptor M2 e nocaute do receptor M3 , caracterizados por potente, mas pode ter um componente M2 direto e de menor
valores negativos de log EC50 (pEC50) ± SEM de 6,75 ± 0,03, potência .
6,26 ± 0,05 e 6,99 ± 0,08, respectivamente. Os valores de Emax
correspondentes em camundongos de nocaute de receptor de Palavras-chave Íleo. Porquinho da índia . Camundongos knockout
tipo selvagem e M2 foram aproximadamente os mesmos, mas para receptores muscarínicos. 4-DAMPmostarda . Receptor muscarínico M2 .
no camundongo de nocaute de receptor M3 foi apenas 36% do Receptor muscarínico M3
tipo selvagem. Após o tratamento com mostarda 4-DAMP, a concentração-resposta

Introdução
MT Griffin
Departamento de Química, Chapman University,
Orange, CA, EUA Os antagonistas seletivos de subtipo inibem as contrações
muscarínicas do músculo liso gastrointestinal e da bexiga
M. Matsui
urinária de uma maneira que concorda com o mecanismo do
Departamento de Farmácia, Instituto de Ciências de Chiba,
receptor M3 (Eglen et al. 1996). Este comportamento é
15-8 Shiomi-cho, Choshi, Chiba 288-0025, Japão
consistente com o conhecido acoplamento do receptor M3 ao
Gq/11 (Noronha-Blob et al. 1989; Candell et al. 1990; Roffel et
Departamento
al. 1990), que está frequentemente envolvido na mobilização de Ca2+ .
de Farmacologia RS Ostrom,
Centro de Ciências da Saúde da Universidade do
Os detalhes de como a sinalização M3-Gq/11 leva à contração
Tennessee, Memphis, TN 38163, EUA não são claros, no entanto, porque a contração do íleo da
cobaia depende principalmente de uma fonte extracelular de
FJ Ehlert (*) Ca2+ (Bolger et al. 1983).
Departamento de Farmacologia, Escola de Medicina,
O receptor muscarínico M2 também é expresso no músculo
Universidade da Califórnia, Irvine, Irvine, CA 92697-4625,
EUA e-mail: fjehlert@uci.edu liso e supera o M3 por um fator de pelo menos quatro (Eglen et
al. 1996). A aparente falta de um papel do
Machine Translated by Google
328
O receptor M2 em contração pode ser explicado pela natureza
de seus mecanismos de sinalização conhecidos no músculo
liso (ver Tabela 1). A estimulação do receptor M2 ativa uma
condutância catiônica não seletiva; no entanto, a condutância
depende do Ca2+ (Bolton 1979; Inoue 1991; Sakamoto et al.
2007). Isso explica por que há pouco aumento na condutância,
a menos que tanto o receptor M2 quanto o receptor M3
mobilizador de Ca2+ sejam ativados simultaneamente. O
receptor M2 também é conhecido por inibir os canais de K +
ativados por Ca2+ , que liberam o músculo liso das correntes
inibitórias de K+ e aumentam a contração (Kotlikoff et al. 1992).
Assim como a condutância catiônica, no entanto, esse
mecanismo também requer a mobilização de Ca2+ por outro
receptor para ativar a corrente de K+ antes que o receptor M2
possa inibi-la. Finalmente, o receptor M2 inibe a adenilato
ciclase no músculo liso. Essa inibição se opõe ao efeito relaxante
dos receptores que aumentam o monofosfato de adenosina
cíclico (cAMP; por exemplo, ÿ-adrenoceptor; Thomas et al.
1993; Thomas e Ehlert 1996; Sawyer e Ehlert 1998; Ehlert et
al. 2005), e esse efeito requer Ca2+ mobilização em primeiro
lugar; caso contrário, não há contração a ser relaxada pelo ÿ-
adrenoceptor e nenhuma resposta do ÿ-adrenoceptor para o
receptor M2 inibir. Na traqueia, a ativação do receptor M2 se
opõe ao relaxamento induzido por forscolina, mas não por
isoproterenol, o que é consistente com o postulado de que o
receptor ÿ2-adrenérgico medeia o relaxamento através de um
mecanismo não-AMPc na traqueia (Ostrom e Ehlert 1998; 1999).
Pode parecer que esses efeitos M2 se manifestariam em
estudos padrão de antagonismo farmacológico. No entanto,
mostramos que o antagonismo competitivo de uma resposta
mediada pelas interações do receptor M2-M3 se assemelha ao
perfil do receptor de ação direta (ou seja, o M3) e não ao do
receptor de ação condicional (ou seja, o M2;
Tabela 1 Resumo dos tipos de contrações induzidas pelos receptores muscarínicos M2 e M3 no músculo liso e seus mecanismos putativos
Tipo de Receptor de contração
M2 Contração direta
Inibição condicional de AMPc
relaxamento mediado
Aprimoramento condicional da
contração mediada pelo receptor M3
M3 Contração direta
A contração é definida como direta se a ativação do receptor indicado por si só for suficiente para causar contração. Se a ativação do subtipo de receptor por si só não tem
efeito sobre a contração, mas provoca ou aumenta a contração quando outros receptores são ativados, então a contração muscarínica é definida como condicional. Maiores
detalhes estão descritos no texto.
Condutância catiônica não seletiva Icat , canal de potássio ativado por BKCa Ca2+
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
Ehlert 2003). Assim, o perfil de antagonismo M3 das contrações
muscarínicas padrão do íleo e da bexiga não é
inconsistente com o postulado de que ambos os receptores M2
e M3 interagem para induzir a contração.
Estudos sobre o útero de camundongos são consistentes
com um papel condicional do receptor M2 na contração
(Kitazawa et al. 2008). O antagonismo competitivo da resposta
contrátil muscarínica do útero do tipo selvagem se assemelha a
um perfil M3 , mas o Emax para contração é inibido em cerca
de 50% no útero do camundongo knockout M2 (KO). No
camundongo M3 KO, as contrações muscarínicas estão
ausentes. Assim, o receptor M2 é incapaz de induzir a contração
direta do útero do camundongo, mas é capaz de aumentar as
contrações mediadas pelo receptor M3 .
Após a inativação dos receptores M3 no íleo e cólon de
cobaias, identificamos dois tipos de respostas contráteis
muscarínicas para o receptor M2 . Um é uma inibição mediada
pelo receptor M2 altamente potente do relaxamento mediado
por forscolina e ÿ-adrenoceptor, e o outro é um aprimoramento
mediado pelo receptor M2 menos potente da sinalização contrátil
do receptor M3 (Ehlert 2003).
Evidências circunstanciais sugerem que este último está
envolvido na dessensibilização heteróloga, que requer ativação
de ambos os receptores M2 e M3 e é potencialmente
antagonizada por antagonistas seletivos M2 (Griffin et al. 2004).
Estudos em camundongos knockout para receptores
muscarínicos são consistentes com essas observações, mas
revelaram um mecanismo contrátil direto adicional altamente
potente para o receptor M2 . Em camundongos M3 KO, o
receptor M2 desencadeia uma resposta contrátil altamente
potente no íleo e na traqueia, embora o máximo dessa resposta
seja apenas cerca de 40% da contração muscarínica no tecido
tipo selvagem e M2 KO (Matsui et al. 2000; Matsui et al. 2002).
Tecido e espécies Mecanismo putativo
Rato: íleo, traqueia e bexiga Desconhecido, mobilização Gi de Ca2+ extracelular
urinária
Rato: íleo, traqueia e bexiga Inibição da adenilato ciclase mediada por Gi
urinária
Cobaia: íleo, traqueia, cólon e esôfago
Rato: íleo, bexiga urinária e útero estimulação Gi de Icat; Inibição Gi de BKCa
Cobaia: cólon e íleo
Difundido no músculo liso de Maior: influxo mediado por Gq desconhecido
cobaias e camundongos de Ca2+ extracelular
Menor: hidrólise de fosfoinositida mediada por Gq e
liberação de Ca2+ intracelular
Machine Translated by Google
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
No presente estudo, investigamos se uma contração mediada
pelo receptor M2 direto semelhante, altamente potente, ocorre no
íleo da cobaia. Mostramos que o tratamento do íleo de camundongo
do tipo selvagem com mostarda 4-DAMP (difenilacetato de N-2-
cloroetil-4-piperidinil) revela um mecanismo contrátil direto de M2
altamente potente e converte seu comportamento farmacológico no
do M3 KO rato. Em contraste, o tratamento do íleo da cobaia com
mostarda 4-DAMP causou uma grande redução de 56 vezes na
potência do agonista, e a resposta muscarínica residual exibiu um
perfil farmacológico M3 . Assim, o íleo da cobaia parece não ter o
mecanismo M2 de contrátil direto altamente potente observado no
camundongo. Nossos dados também ilustram que o músculo liso
ileal de camundongos M3 KO de corpo inteiro exibe com precisão a
atividade contrátil do receptor M2 em camundongos do tipo selvagem
e que a mostarda 4-DAMP é uma ferramenta útil para inativar as
respostas M3 seletivamente.
Métodos
Animais Camundongos knockout para receptor muscarínico M2
(M2ÿ/ÿ; M2 KO) e knockout para receptor muscarínico M3 (M3ÿ/ÿ;
M3 KO) foram gerados conforme descrito por Matsui et al. (2002).
Ensaios contráteis em tecido ileal isolado As medições contráteis
foram feitas no íleo de cobaias Hartley machos (300–400 g) e
camundongos C57Bl-6 (25–30 g) conforme descrito anteriormente
(Griffin et al. 2004). O meio foi tampão de bicarbonato de Krebs-
Ringer (KRB) (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1,3 mM, NaHCO3
26 mM, KH2PO4 1,2 mM , CaCl2 1,8 mM, glicose 10 mM) contendo
indometacina (1 ÿM) e mantido a 37 °C e gaseificada com O2/CO2
(19:1). Os tecidos foram deixados a incubar por pelo menos uma
hora e foram subsequentemente desafiados com KCl (50 mM) três
vezes, seguido pela medição de uma curva de concentração-
resposta cumulativa para oxotremorina M. Isso foi feito para acelerar
o equilíbrio do íleo, que sofre um aumento dependente do tempo na
atividade contrátil. Após lavagem adequada, o íleo foi incubado por
mais 30 minutos antes da coleta dos dados apresentados em
“Resultados”. As respostas contráteis à oxotremorina-M foram
medidas usando uma técnica cumulativa. O valor Emax da
oxotremorina-M aumentou com o aumento da idade ou do peso
corporal de cada linhagem de camundongo. Além disso, a contração
ileal ao KCl (50 mM) aumentou com o aumento do peso corporal,
mas foi semelhante em camundongos de peso corporal equivalente
nas diferentes cepas. Todas as contrações de oxotremorina-M,
portanto, foram normalizadas em relação àquela induzida por KCl
(50 mM).
Tratamento de mostarda 4-DAMP Uma solução de 4-DAMP mus
tard foi primeiro ciclizado em tampão fosfato 10 mM, pH 7,4,
329
por 30 min a 37°C para permitir a formação do íon aziridínio (Thomas
et al. 1992). A solução foi colocada no gelo e utilizada assim que
possível. Ilea foram incubadas com mostarda 4-DAMP (40 nM) em
combinação com o antagonista seletivo M2 AF-DX 116 (4 ÿM;
[[2-2(dietilamino)metil]-1-piperidinil]-acetil]-5,11 -dihidro-6H pirido[2,3b]
[1,4]benzodiazepina-6-ona) por um ou dois períodos de 1 h, em um
volume final de 50 ml de tampão KRB.
Este volume mínimo de meio é essencial porque a mostarda 4-
DAMP é inativada por nucleófilos teciduais, particularmente em
tecidos substanciais como o íleo da cobaia.
Após essas incubações, o tecido foi lavado três vezes e incubado
por 30 min antes das medidas contráteis.
Análise das curvas de concentração-resposta As curvas de
concentração-resposta foram analisadas usando o software
GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA)
usando a função de curva de concentração-resposta de inclinação
variável. As constantes de dissociação logarítmica negativa dos
antagonistas (pKB) foram estimadas a partir de experimentos em
que sua capacidade de deslocar a curva de concentração-resposta
do agonista para a direita foi medida (Arunlakshana e Schild 1959):
pKB ¼ Log
½ troco 1
Nesta equação, [I] denota a concentração molar do antagonista, e
desvio denota o valor EC50 do agonista medido na presença do
antagonista dividido pelo medido na sua ausência. Os valores de
Log shift e pKB foram determinados para experimentos individuais e
calculados em média. A significância das diferenças foi avaliada
usando o teste t de Student não pareado com o ajuste de Bonferroni
excessivamente conservador do valor crítico de P, quando apropriado.
Medicamentos e produtos químicos Os reagentes utilizados neste
estudo foram obtidos das seguintes fontes: AF-DX 116, Boehringer
Ingelheim Pharmaceutical, Ridgefield, CT, EUA; oxotremorina-M e
indometacina, Sigma RBI, Natick, MA, EUA; O 4-DAMP foi sintetizado
usando um método semelhante ao descrito por Barlow et al. (1976),
e a mostarda 4-DAMP foi sintetizada como descrito anteriormente
(Thomas et al. 1992).
Resultados
Atividade contrátil da oxotremorina-M no íleo de cobaia e
camundongo A oxotremorina-M induziu potentemente contrações no
íleo tanto de camundongo quanto de cobaia. O log negativo médio
EC50 (pEC50) ± SEM e Emax ±
Machine Translated by Google
330
Os valores SEM de oxotremorina-M foram maiores em cobaias
(7,48±0,05 e 58,2±4,5 mN) do que em camundongos de tipo
selvagem (6,75±0,03 e 12,2±0,5 mN). As respostas médias e
seus valores SEM associados em cobaia e camundongo de tipo
selvagem foram normalizados em relação ao valor médio de
Emax de seu respectivo grupo (ou seja, cobaia ou camundongo
de tipo selvagem), e os dados normalizados são representados
na Fig. 1 A maior potência de oxotremorina-M na cobaia é
facilmente aparente na figura. A atividade contrátil da oxotremorina-
M também foi investigada em íleo de camundongos M2 e M3
KO. As respostas em cada íleo de camundongo foram primeiro
normalizadas em relação à contração provocada por KCl (50
mM) conforme descrito em "Métodos". As respostas contráteis
médias e seus respectivos valores SEM foram então normalizados
em relação ao valor Emax do camundongo de tipo selvagem. O
valor médio de Emax ± SEM de oxotremorina-M no íleo de
camundongo M2 KO (101,2 ± 7,5%) foi semelhante ao do tipo
selvagem, enquanto o medido no camundongo M3 KO foi
substancialmente menor (35,7 ± 3,5%). A normalização das
respostas muscarínicas no camundongo para o KCl não alterou
significativamente a relação entre os valores de Emax nas cepas
M2 KO e M3 KO em relação ao tipo selvagem, mas causou uma
redução modesta na variância das estimativas médias em
selvagem -tipo e camundongos M2 KO. A potência da
oxotremorina-M no camundongo M2 KO (pEC50 = 6,26 ± 0,05)
foi cerca de um terço da do camundongo de tipo selvagem,
enquanto que no camundongo M3 KO (pEC50, 6,99 ± 0,08) foi
1,7 vezes maior do que tipo selvagem.
Essas diferenças no pEC50 foram significativas, conforme
indicado no resumo desses dados na legenda da Tabela 2.
Como relatórios anteriores mostraram que o íleo do camundongo
M2/M3 duplo KO não possui uma resposta contrátil muscarínica,
os dados na Fig. 1 são consistente com o postulado de que a
resposta contrátil muscarínica no íleo de camundongo de tipo
selvagem inclui um componente principal do receptor M3, bem como 116 para os subtipos de receptores M2 e M3 humanos são
7,27±0,05 e 6,10±0,06, e as de 4-DAMP são 7,87±0,03 e
Fig. 1 Atividade contrátil da oxotremorina-M em íleo da cobaia e de camundongos
de tipo selvagem, M2 KO e M3 KO. Os dados representam os valores médios ±
SEM de experimentos em 13 cobaias, 39 camundongos do tipo selvagem, 25
camundongos M2 KO e 25 camundongos M3 KO. As respostas no íleo da
cobaia foram normalizadas em relação ao Emax e aquelas em camundongos
ao Emax no tipo selvagem
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
Tabela 2 Atividade contrátil da oxotremorina-M no íleo de cobaia e no íleo de
camundongo de tipo selvagem, M2 KO e M3 KO
pEC50 Emaxa (% tipo selvagem) Encosta da colina
Cobaia (13) 7,48±0,05b 100±7,7 1,38±0,20
Rato
Tipo selvagem (39) 6,75±0,03 100±4,1 1,14±0,06
M2 KO (25) 6,26±0,05c 101±7,5 1,18±0,06
d
M3 KO (25) 6,99±0,08c 35,7±3,5 1,18±0,18
Os dados são da Tabela 1 e representam os valores médios ± SEM. O número
de experimentos é indicado entre parênteses
uma
Os valores de Emax e SEM foram normalizados em relação ao valor médio de
Emax de tipo selvagem para cada espécie.
b
Significativamente diferente do valor pEC50 do íleo de camundongo de tipo
selvagem (P = 4,3 × 10-16 )
c
A análise de variância unidirecional mostrou diferenças altamente significativas
entre os valores de pEC50 medidos no tipo selvagem, M2 KO e M3 KO ilea de
camundongo (F2,86=44,14; P=6,4×10ÿ14 ). Usando o teste t de Student não
pareado, os valores de P para diferenças entre os valores médios de pEC50 de
tipo selvagem e M2 KO (P=3,3×10ÿ11 ), tipo selvagem e M3 KO (P= 0,0054), e
M2 KO e M3 KO (P=2,1×10ÿ10 ) foram todos menores que o valor ajustado de
0,05 de Bonferroni para três comparações (0,0167).
d
Significativamente diferente do Emax do íleo do tipo selvagem (P=6,1×10ÿ19 )
um componente receptor M2 menor, mas mais potente . Matsui
et ai. (2000; 2002) chegaram a uma conclusão semelhante.
Antagonismo da resposta muscarínica no íleo de camundongo
Investigamos dois antagonistas muscarínicos (AF-DX 116 e 4-
DAMP (N,N-dimetil-4-piperidinil difenilacetato)) com seletividade
conhecida para subtipos de receptores para determinar se sua
ação inibitória no camundongo íleo é consistente com o quadro
da função do receptor M2 e M3 descrito acima em conexão com
nossos estudos em camundongos KO. As afinidades de ligação
(pKD, constante de dissociação logarítmica negativa) de AF-DX
8,81±0,05, respectivamente ( Esqueda et ai.
1996; Griffin et ai. 2004). Assim, AF-DX 116 exibe uma afinidade
cerca de 15 vezes maior para o receptor M2 em relação a M3,
enquanto que 4-DAMP exibe uma seletividade dez vezes oposta.
O 4-DAMP na verdade exibe alta afinidade para todos os subtipos
do receptor muscarínico, exceto o M2. Testamos cada antagonista
em uma concentração aproximadamente igual ao maior de seus
dois valores de KD para os receptores M2 e M3 . Com essa
estratégia, o AF-DX 116 seletivo para M2 e o 4-DAMP seletivo
para M3 devem causar apenas cerca de duas vezes
deslocamentos na curva concentração-resposta de um agonista
para induzir respostas M3 e M2 , respectivamente, mas muito
maiores de dez a 15 -fold shifts nas respostas mediadas pelos
receptores para os quais eles exibem seletividade (ou seja, M2
e M3, respectivamente).
Os resultados dos estudos de antagonismo usando AF-DX
116 (1 ÿM) no íleo de camundongo do tipo selvagem, M2 KO e M3
Machine Translated by Google
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
Camundongos KO são mostrados na Fig. 2a–c. No íleo do
camundongo M3 KO (Fig. 2c), AF-DX 116 causou um deslocamento
de 10,5 vezes na curva de resposta de concentração de
oxotremorina-M, que rendeu um valor de pKB estimado de
(6,97±0,03) semelhante à sua afinidade de ligação para o receptor
M2 (pKD=7,27±0,05). Em contraste, AF-DX 116 apenas causou
desvios de 2,6 e 2,7 vezes nas curvas de resposta de concentração
de oxotremorina-M em camundongos de tipo selvagem e M2 KO,
respectivamente. 4-DAMP exibiu a seletividade oposta (Fig. 2a-c).
Isso causou um deslocamento de 6,8 vezes na curva de
concentração-resposta de oxotremorina-M no camundongo M2 KO
(Fig. 2b), que produz um valor de pKB estimado (8,74±0,19)
semelhante à sua afinidade de ligação para o receptor M3 (8,81
±0,05, Griffin et al. 2004). Um deslocamento semelhante de 14
vezes foi observado no camundongo de tipo selvagem (Fig. 2a),
enquanto um deslocamento muito menor (1,5 vezes) foi medido
em ilea do camundongo M3 KO (Fig. 2c). Esses resultados estão resumidos de Tabela
Fig. 2 Antagonismo competitivo da resposta à oxotremorina-M por AF-
DX 116 (1 ÿM) e 4-DAMP (10 nM) em íleo do tipo selvagem (a), M2
KO (b) e M3 KO (c) ratos. Os dados são normalizados em relação ao
Emax de controle e representam os valores médios ± SEM de quatro
a sete experimentos
331
consistente com o postulado mencionado acima de que a resposta
contrátil muscarínica no íleo do camundongo inclui componentes
M3 e M2 principais e menores, atuando diretamente ,
respectivamente.
Também investigamos os efeitos da mostarda 4-DAMP na
resposta contrátil muscarínica do íleo do camundongo (Fig. 3). Em
pH neutro, a mostarda 4-DAMP forma um íon aziridínio que se
liga covalentemente aos receptores muscarínicos. Quando usado
em uma concentração de 40 nM na presença de AF-DX 116 (4
ÿM) por 1 h a 37°C, a mostarda 4-DAMP inativa 96% dos
receptores M3 humanos expressos em células CHO, mas apenas
22% do M2 humano receptores (Griffin et al. 2003). Ilea isolado
de camundongos de tipo selvagem, M2 KO e M3 KO foram
incubados, com mostarda 4-DAMP (40 nM) em combinação com
AF-DX 116 (4 ÿM) por um tempo total de 2 h, e lavados
extensivamente (ver "Métodos"). Este tratamento reduziu o valor
Emax na
oxotremorina-M
3 e são no íleo de camundongo de tipo selvagem
para apenas 43% do controle, tendo pouco efeito sobre EC50.
Conforme mostrado na Fig. 3a, a resposta residual no íleo de tipo
selvagem após o tratamento com mostarda 4-DAMP foi quase
idêntica à medida no íleo não tratado do camundongo M3 KO.
Resultados semelhantes foram obtidos quando a incubação com
mostarda 4-DAMP durou apenas 1 h (Tabela 4). O tratamento com
mostarda 4-DAMP (2 h) causou uma grande inibição na resposta
à oxotremorina-M no íleo de camundongo M2 KO (Fig. 3b), mas
teve pouco efeito na resposta no íleo M3 KO (Fig. 3c) . Os
resultados são consistentes com o postulado de que o tratamento
com mostarda 4-DAMP inativa seletivamente as respostas M3
sobre M2, convertendo assim o comportamento muscarínico do
íleo do tipo selvagem no íleo M3 KO. Esses resultados estão
resumidos na Tabela 4.
Para obter mais suporte para esta hipótese, caracterizamos o
perfil farmacológico da resposta muscarínica no íleo de tipo
selvagem tratado com mostarda 4-DAMP usando os antagonistas
competitivos, 4-DAMP e AF-DX 116.
Após o tratamento de mostarda com 4-DAMP, AF-DX 116 (1 ÿM)
e 4-DAMP (10 nM) causaram deslocamentos de 9,8 e 3,0 vezes
na curva de resposta de concentração para oxotremorina-M no
íleo de camundongo tipo selvagem, produzindo estimativas de
pKB de 6,90±0,13 e 8,30±0,28, respectivamente (Fig. 3d). Este
perfil de antagonismo é semelhante ao descrito acima para o íleo
de camundongos M3 KO (Fig. 2c).
Caracterização da resposta contrátil muscarínica no íleo da cobaia
Os efeitos de AF-DX 116 (1 ÿM) e 4-DAMP (10 nM) na resposta
contrátil à oxotremorina-M no íleo da cobaia são mostrados na
Fig. 4a. Esses dois antagonistas causaram desvios de 3,1 e dez
vezes, respectivamente, na curva concentração-resposta.
Este comportamento é consistente com o conhecido perfil M3
deste tecido, produzindo valores de pKB±SEM de 6,28±0,10 e
9,00±0,06 para AF-DX 116 e 4-DAMP, respectivamente, em
Machine Translated by Google
332
Tabela 3 Efeitos de AF-DX 116 e 4-DAMP na resposta contrátil à oxotremorina-M no íleo de camundongo
AF-DX 116 (1ÿM)
mudança de log
Tipo selvagem (7, 7) 0,42±0,06
M2 KO (4, 6) 0,43±0,18
M3 KO (7, 4) 1,02±0,02
Os dados são da Fig. 1 e representam os valores médios ± SEM. Os dois números entre parênteses ao lado de cada linhagem de camundongo denotam o número de
experimentos feitos com AF-DX 116 e 4-DAMP, respectivamente
uma
O deslocamento Log denota o logaritmo da razão do valor EC50 medido na presença do antagonista dividido pelo medido em seu
ausência
b
O pKB não foi determinado devido ao baixo valor de deslocamento logarítmico
excelente acordo com a afinidade de ligação para o ser humano
receptor M3 . Tratamento do íleo da cobaia com
Mostarda 4-DAMP (40 nM) em combinação com AF-DX
116 (4 ÿM) por 2 h seguido de lavagem causou um aumento de 56 vezes
deslocamento dextral na curva concentração-resposta para
oxotremorina-M, com um pequeno aumento em seu valor Emax
(Fig. 4b). Este pequeno efeito pode ser atribuído ao tempo, uma vez que
observamos aumentos dependentes do tempo em Emax com medição
repetitiva de curvas de concentração-resposta para
oxotremorina-M. Ao contrário do comportamento observado no tipo selvagem
íleo de camundongo, tratamento do íleo de cobaia com
Fig. 3 Efeitos do tratamento com mostarda 4-DAMP nas contrações induzidas
à oxotremorina-M no íleo de camundongo. a As respostas foram medidas em
ilea do camundongo M3 KO (triângulos abertos) e do íleo do tipo selvagem
antes (círculos abertos) e após (triângulos fechados) tratamento com
Mostarda 4-DAMP (40 nM) em combinação com AF-DX 116 (4 ÿM)
por 2 h seguido de lavagem conforme descrito em "Métodos". b
As respostas foram medidas em ilea do camundongo M2 KO antes (aberto
círculos) e após (triângulos fechados) tratamento com mostarda 4-DAMP
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
4-DAMP (10 nM)
pKB mudança de log pKB
6,17±0,14 1,16±0,13 9,12±,14
5,93±0,42 0,83±0,19 8,74±,19
6,97±0,03 0,18±0,17 ndb
A mostarda 4-DAMP não descobriu um efeito direto e altamente potente
contração com um valor Emax baixo . Seguindo 4-DAMP
tratamento com mostarda, os efeitos de AF-DX 116 (1,3 vezes
deslocamento dextral) e 4-DAMP (deslocamento dextral de 4,3 vezes) no
Valor EC50 de oxotremorina-M no íleo de cobaia
onde qualitativamente semelhantes aos medidos antes
tratamento de mostarda 4-DAMP e, portanto, sugestivo de uma
mecanismo M3 direto . Experimentos de controle mostraram que o
potência da oxotremorina-M aumentou 1,45 vezes 1 h após
tratamento de mostarda 4-DAMP, sugerindo que a medida
mudanças induzidas por antagonistas foram subestimadas. Corrigindo
conforme descrito em a. c Igual a b, exceto que as respostas foram medidas em
ilea do mouse M3 KO. d Todas as respostas foram medidas em ilea
de camundongos do tipo selvagem que foram tratados com mostarda 4-DAMP como
descrito em um. Após este tratamento, as respostas foram medidas no
ausência (círculos abertos) e presença de AF-DX 116 (1 ÿM; fechado
triângulos) ou 4-DAMP (10 nM; triângulos abertos). Valores médios ± SEM
de cinco a sete experimentos são plotados em a-d
Machine Translated by Google

Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335 333

Tabela 4 Efeito do tratamento de mostarda 4-DAMP (40 nM) em combinação com esses deslocamentos medidos por um fator de 1,45 rendem valores teóricos
AF-DX 116 (4 ÿM) na atividade contrátil de
deslocamentos de 1,89 e 6,21 para AF-DX 116 (1 ÿM) e 4-DAMP
oxotremorina-M no íleo de camundongo
(10 nM), respectivamente, que produzem valores de pKB de 5,94 e
Ao controle 4-Mostarda DAMP 8,72 para esses antagonistas.

pEC50 pEC50 Emax (%)a

Tipo selvagem
Discussão
1 h de tratamento (9) 6,59±0,08 6,62±0,17 34±8

2 h de tratamento (7) 6,96±0,06 6,89±0,14 43±9

M2 KO
6,39±0,09 5,80±0,16
2 h de tratamento (6)
M3 KO
2 h de tratamento (5) 7,15±0,08 7,36±0,09
Os dados são da Fig. 2 e representam os valores médios ± SEM. o
números entre parênteses ao lado de cada linhagem de camundongo denotam o número
de experimentos. Os valores Emax no íleo tratado com mostarda 4-DAMP
são normalizados em relação ao medido sob condições de controle
uma
Os valores Emax e seu SEM foram normalizados em relação ao
valor Emax médio de controle
Fig. 4 Efeitos de AF-DX 116 (1 ÿM) e 4-DAMP (10 nM) antes
(a) e após (b) tratamento com mostarda 4-DAMP nas respostas contráteis
à oxotremorina-M no íleo da cobaia. a As respostas foram
medido na ausência (símbolos abertos) e presença de AF-DX
116 (triângulos fechados) ou 4-DAMP (triângulos abertos). b As respostas foram
medido pela primeira vez em condições de controle (círculos abertos). Após 4-DAMP
tratamento de mostarda e lavagem, as respostas foram medidas no
ausência (triângulos fechados) e presença de AF-DX 116 (triângulos fechados
diamantes) ou 4-DAMP (triângulos abertos). Ilea foram tratados com
Mostarda 4-DAMP (40 nM) por 1 h na presença de AF-DX 116
(4 ÿM) e foram então lavados três vezes conforme descrito em
"Métodos." Os dados em aeb representam os valores médios de resposta ±
SEM de dez a 13 experimentos
Agonistas muscarínicos provocam contração no íleo isolado,
33±9
traqueia e bexiga urinária de muitos mamíferos, incluindo o
camundongo. Esta função sofre pequenas, grandes e
perdas completas no M2 KO, M3 KO e M2/M3 duplo
74±3
camundongos KO, respectivamente (Matsui et al. 2000; Matsui et al.
2002), mostrando que os receptores M2 e M3 respondem por
contração e que, na ausência de outros agentes, a
a última contribui mais para a resposta do que a primeira.
As contrações de agonistas muscarínicos eficazes são insensíveis à
tetrodotoxina, indicando que o M2 e
Os receptores M3 estão localizados pós-junção (Unno et al.
2005). Agonistas muscarínicos apresentam alta potência para
induzindo a contração através do receptor M2 em
músculo do rato M3 KO, mas comparado com aquele
medidos em tecido de tipo selvagem, seus valores Emax são apenas
10% na bexiga urinária e 30-40% no íleo e traqueia
(Matsui et al. 2000). As contrações mediadas pelo receptor M2 direto
no íleo do camundongo M3 KO foram
relatados como evanescentes (Unno et al. 2005), embora
descobriram que eles são razoavelmente estáveis ao longo do tempo
necessários para medir os dados para uma concentração cumulativa-
curva de resposta. Essas contrações são sensíveis à toxina pertussis
e inibidas completamente pela tensão dependente da voltagem.
Antagonista de Ca2+ , nicardipina (Unno et al. 2005). Em contraste,
As contrações mediadas pelo receptor M3 são insensíveis à toxina
pertussis e são parcialmente inibidas pela nicardipina em
camundongo (Unno et al. 2005), mas quase completamente inibido
por bloqueadores de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem em cobaias
(Bolger et ai. 1983).
O primeiro relatório (Matsui et al. 2000) de um
contração M2 mediada no camundongo M3 KO foi
surpreendente porque estudos anteriores sobre a cobaia não tinham
descobriu tal papel, embora evidências claras para
respostas condicionais M2 - isto é, aquelas dependentes de
outros receptores - haviam sido observados. Pode-se argumentar que
o efeito direto M2 passou despercebido em cobaias
porque os antagonistas usados para caracterizar a contração
faltou a seletividade necessária para o receptor muscarínico
subtipos para detectar um pequeno efeito M2 . Isso levanta a
questão de saber se o papel contrátil direto do M2
receptor foi perdido na cobaia ou se a cobaia
porcos simplesmente diferem de camundongos na falta deste potente M2
função. Por essas razões, investigamos se é
possível converter a resposta muscarínica do íleo
Machine Translated by Google
334
do camundongo do tipo selvagem para o do M3 KO usando mostarda 4-
DAMP e, em caso afirmativo, se este tratamento revela uma contração
direta mediada pelo receptor M2 na cobaia.
O composto, mostarda 4-DAMP, é um derivado da mostarda nitrogenada
que cicliza espontaneamente em um íon aziridínio reativo quase idêntico
ao antagonista muscarínico competitivo 4-DAMP, exceto pela falta de dois
átomos de hidrogênio (Barlow et al. 1990). O último composto exibe apenas
uma afinidade cerca de dez vezes maior para o receptor M3 em relação ao
M2. Com 100% de ocupação do receptor, a mostarda 4-DAMP alquila os
receptores M2 e M3 a uma taxa semelhante (velocidade constante, 0,1
min-1 ; metade do tempo, 7 min), mas a seletividade para o receptor M3
pode ser alcançada ao custo de uma taxa mais lenta. taxa de alquilação
usando uma concentração mais baixa do íon aziridínio ou adicionando um
antagonista seletivo M2 competitivo (por exemplo, AF-DX 116) à incubação
(Thomas et al. 1992). Usando mostarda 4-DAMP (40 nM) em combinação
com AF-DX 116 (4 ÿM) por 1 h, mostramos que é possível alquilar 96% de
uma população do receptor M3 humano expresso em células CHO,
enquanto apenas inativa 22% dos receptores M2 humanos (Griffin et al.
2003).
O tratamento do íleo de camundongo de tipo selvagem com mostarda
4-DAMP reduziu o Emax da resposta contrátil à oxotremorina-M em cerca
de 60%, tendo pouco efeito sobre EC50. A curva de concentração-resposta
residual se assemelhava àquela medida no camundongo M3 KO, em
termos de EC50, Emax e antagonismo por AF-DX 116 e 4-DAMP. Esses
compostos tinham valores de pKB de 6,90 e 8,30, respectivamente, que
diferiam em apenas cerca de 0,4 unidades log de suas afinidades de
ligação (pKD) para receptores M2 humanos (7,27 e 7,87 (Esqueda et al.
1996; Griffin et al. 2004)). A diferença pode ser atribuída à reciclagem de
receptores muscarínicos após o tratamento com mostarda 4-DAMP,
conforme discutido abaixo. Em contraste, os valores de pKB dos mesmos
compostos no íleo de camundongo de tipo selvagem (6,17 e 9,12) são
semelhantes às suas respectivas afinidades de ligação (pKD) para o
receptor M3 (6,10 e 8,81 (Esqueda et al. 1996; Griffin et al. 2004)). O
componente M2 direto da contração no camundongo do tipo selvagem não
perturba significativamente o perfil de antagonismo da resposta do tipo
selvagem daquele esperado para uma resposta M3 pura , ilustrando a
incapacidade desses antagonistas de resolver um componente receptor
menor da resposta . O tratamento com mostarda 4-DAMP teve pouco efeito
nas contrações muscarínicas no camundongo M3 KO.
Nossos dados sugerem que o tratamento com 4-DAMP mostarda inativou
seletivamente os receptores M3 no íleo do tipo selvagem para desmascarar
as contrações mediadas pelo receptor M2 direto que se comportaram de
forma semelhante às do camundongo M3 KO.
Em contraste, o tratamento com mostarda com 4-DAMP eliminou
completamente a resposta de alta potência do íleo da cobaia à oxotremorina-
M. Apenas contrações de baixa potência para oxotremorina-M
permaneceram após o tratamento com 4-DAMP mostarda, pois a curva
concentração-resposta se deslocou para a direita cerca de 56 vezes sem
declínio no Emax. Essas contrações de baixa potência
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
foram antagonizadas por AF-DX 116 e 4-DAMP de uma maneira
qualitativamente semelhante à esperada para uma resposta M3 . A
mudança na curva concentração-resposta causada pelo AF-DX 116 seletivo
para M2 foi apenas um quadragésimo do esperado para uma resposta M2 ,
e a causada pelo 4-DAMP seletivo para M3 foi três vezes maior do que o
esperado para uma resposta M2 . Ambos os deslocamentos, no entanto,
foram cerca de três vezes menores do que o esperado para uma resposta
M3 . Este decréscimo no antagonismo pode ser explicado, em parte, pelo
tráfico de novos receptores muscarínicos para a membrana plasmática
após o tratamento com mostarda 4-DAMP porque experimentos de controle
mostraram um aumento de cerca de 1,5 vezes na potência de oxotremorina-
M durante o mesmo período de tempo. .
O íleo da cobaia é extremamente sensível aos agonistas muscarínicos,
e apenas uma fração de 1% da população de receptores muscarínicos é
necessária para a resposta em EC50 (Ringdahl 1984). A recuperação de
uma quantidade tão pequena de receptores parece plausível após o
tratamento com mostarda 4-DAMP e antes da resposta à oxotremorina-M
ser medida na presença do antagonista (45-60 min). Este tempo foi usado
para lavar o agonista residual do tecido e incubar com o antagonista. Em
homogeneizados de tecido, não há recuperação da ligação do receptor
muscarínico após algumas horas após o tratamento com mostarda 4-DAMP
(Thomas et al. 1992), embora o erro nesta medida esteja no mesmo nível
daquele capaz de causar um pequeno desvio para a esquerda na curva
concentração-resposta (ou seja, cerca de 2% da população de receptores).
Em contraste com a da cobaia, a resposta M3 do íleo do camundongo
é muito menos sensível à oxotremorina-M.
Com base em nosso trabalho anterior, requer aproximadamente 30% de
ocupação do receptor por oxotremorina-M para provocar uma resposta
contrátil de 50% (Tran et al. 2009). Essa diferença nas sensibilidades do
íleo do camundongo e da cobaia pode explicar por que foi possível reduzir
o valor Emax da oxotremorina-M tanto no íleo selvagem quanto no íleo M2
KO, enquanto o mesmo tratamento não afetou o Emax na guiné íleo de
porco.
Nossa incapacidade de detectar contrações diretas mediadas pelo
receptor M2 no íleo da cobaia não as exclui; nosso ponto é que se eles
existem, eles devem ser mediados pela oxotremorina-M com muito menos
potência do que no camundongo ou que requer um agonista com eficácia
muito maior do que a oxotremorina-M para detectá-los. Uma vez que a
eficácia relativa da oxotremorina-M é semelhante ou superior à da
acetilcolina no receptor M2 (Ehlert 1985; Tran et al. 2009), nossos dados
mostram que as contrações mediadas pelo receptor M2 altamente potentes
e diretas não são mediadas pela acetilcolina fisiologicamente . Assim,
embora o receptor M2 do íleo da cobaia media uma inibição de alta potência
do relaxamento e um aumento de baixa potência das contrações mediadas
pelo receptor M3 (Ehlert 2003), ele não medeia uma contração direta de
alta potência como a do íleo do camundongo.
Machine Translated by Google
Naunyn-Schmied Arch Pharmacol (2009) 380:327-335
Agradecimentos Este trabalho foi apoiado pela concessão número HL079166
do National Institutes of Health (RSO).
Acesso Aberto Este artigo é distribuído sob os termos da Creative Commons
Attribution Noncommercial License que permite qualquer uso não comercial,
distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o(s) autor(es)
original(is) e a fonte sejam creditados.
Referências
Arunlakshana O, Schild HO (1959) Alguns usos quantitativos de antagonistas
de uma preparação. Brit J Pharmacol 14:48–58 Barlow RB, Berry KJ,
Glenton PA, Nilolaou NM, Soh KS (1976) Uma comparação de constantes
de afinidade para receptores de acetilcolina sensíveis a muscarina em
células marcapasso atrial de cobaia a 29°C e em íleo a 29°C e 37°C.
Brit J Pharmacol 58:613–620 Barlow RB, Shepherd MK, Veale MA
(1990) Alguns efeitos diferenciais de cloridrato de 4-difenilacetoxi-N-(2-
cloroetil)-piperidina em átrios e íleo de cobaias. J Pharm Pharmacol
42:412-418 Bolger GT, Gengo P, Klockowski R, Luchowski E, Siegel
H, Janis RA, Triggle AM, Triggle DJ (1983) Caracterização da ligação do
antagonista do canal Ca++, [3H]nitrendipina, à Guiné -músculo liso
ileal de porco. J Pharmacol Exp Ther 225:291–309 Bolton TB (1979)
Mecanismos de ação de transmissores e outras substâncias no
músculo liso. Physiol Rev 59:606–718 Candell LM, Yun SH, Tran LL, Ehlert
FJ (1990) Acoplamento diferencial de subtipos do receptor muscarínico
para a adenilato ciclase e hidrólise de fosfoinositide no músculo longitudinal
do íleo de rato. Mol Pharmacol 38:689-697
Eglen RM, Hegde SS, Watson N (1996) Subtipos de receptores muscarínicos
e função do músculo liso. Pharmacol Rev 48:531–565
Ehlert FJ (1985) A relação entre a ocupação do receptor muscarínico e a
inibição da adenilato ciclase no miocárdio de coelho. Mol Pharmacol
28:410–421 Ehlert FJ (2003) Análise farmacológica do papel contrátil
do receptor muscarínico M2 e M3 no músculo liso. Canais de Receptores
9:261–277
Ehlert FJ, Griffin MT, Abe DM, Vo TH, Taketo MM, Manabe T, Matsui M
(2005) O receptor muscarínico M2 medeia a contração através de
mecanismos indiretos na bexiga urinária de camundongos. J Pharmacol
Exp Ther 313:368-378
Esqueda EE, Gerstin EH Jr, Griffin MT, Ehlert FJ (1996) Estimulação do
acúmulo de AMP cíclico e hidrólise de fosfoinositide por receptores
muscarínicos M3 no pulmão periférico de rato. Biochem Pharmacol
52:643-658
Griffin MT, Hsu JC-H, Shehnaz D, Ehlert FJ (2003) Comparação do
antagonismo farmacológico dos receptores muscarínicos M2 e M3
expressos isoladamente e em combinação. Biochem Pharmacol
65:1227-1241
Griffin MT, Matsui M, Shehnaz D, Ansari KZ, Taketo MM, Manabe T, Ehlert
FJ (2004) A dessitização heteróloga mediada por agonistas
muscarínicos em íleo isolado requer a ativação de ambos os receptores
muscarínicos M2 e M3 . J Pharmacol Exp Ther 308:339–349 Inoue R
(1991) Canais iônicos envolvidos em respostas à ativação do receptor
muscarínico no músculo liso. In: Sperelakis NKuriyama H (ed) Canais
iônicos de células musculares lisas vasculares e células endoteliais.
Elsevier, Nova York, pp 81–91 Kitazawa T, Hirama R, Masunaga K,
Nakamura T, Asakawa K, Cao J, Teraoka H, Unno T, Komori S, Yamada M,
Wess J, Taneike T (2008) Muscarínico subtipos de receptores
envolvidos no carbacol
335
contração induzida do músculo liso uterino de camundongo. Naunyn
Schmiedebergs Arch Pharmacol 377:503–513 Kotlikoff MI, Kume H,
Tomasic M (1992) Regulação muscarínica de canais iônicos de membrana
nas células musculares lisas das vias aéreas. Biochem Pharmacol
43:5-10
Matsui M, Motomura D, Karasawa H, Fujikawa T, Jiang J, Komiya Y,
Takahashi S, Taketo MM (2000) Múltiplos defeitos funcionais em
órgãos autônomos periféricos em camundongos sem gene receptor
muscarínico de acetil colina para o subtipo M3 . Proc Natl Acad Sci
USA 97:9579–9584 Matsui M, Motomura D, Fujikawa T, Jiang J,
Takahashi S, Manabe T, Taketo MM (2002) Ratos sem receptores
muscarínicos de acetilcolina M2 e M3 são desprovidos de contrações
colinérgicas do músculo liso, mas ainda assim viável. J Neurosci
22:10627–
10632
Noronha-Blob L, Lowe V, Patton A, Canning B, Costello D, Kinnier WJ
(1989) Receptores muscarínicos: relações entre degradação de
fosfoinositide, inibição da adenilato ciclase, contrações do músculo
detrusor in vitro e estudos de cistometrograma in vivo na bexiga de
cobaias. J Pharmacol Exp Ther 249:843-851
Ostrom RS, Ehlert FJ (1998) Os receptores muscarínicos M2 inibem o
relaxamento mediado por forscolina, mas não por isoproterenol, no
músculo liso traqueal bovino. J Pharmacol Exp Ther 286:234–242
Ostrom RS, Ehlert FJ (1999) Comparação de antagonismo funcional entre
isoproterenol e receptores muscarínicos M2 em íleo e traqueia de
cobaias. J Pharmacol Exp Ther 288:969-976 Ringdahl B (1984)
Determinação de constantes de dissociação e eficácias relativas de
análogos de oxotremorina em receptores muscarínicos no íleo de
cobaia por procedimentos farmacológicos. J Pharmacol Exp Ther
229:199-206
Roffel AF, Meurs H, Elzinga CR, Zaagsma J (1990) Caracterização do
subtipo de receptor muscarínico envolvido no metabolismo de
fosfoinositide no músculo liso traqueal bovino. Brit J Pharmacol 99:293–
296 Sakamoto T, Unno T, Kitazawa T, Taneike T, Yamada M, Wess
J, Nishimura M, Komori S (2007) Três vias de sinalização muscarínica
distintas para ativação de canais catiônicos em células musculares
lisas do intestino de camundongos. J Physiol 582:41–61 Sawyer GW,
Ehlert FJ (1998) Papel contrátil dos receptores muscarínicos M2 e M3
no cólon de cobaias. J Pharmacol Exp Ther 284:269-277
Thomas EA, Ehlert FJ (1996) Envolvimento do receptor muscarínico M2
nas contrações da traqueia de cobaia, esôfago de cobaia e fundo de
rato. Biochem Pharmacol 51:779–788 Thomas EA, Hsu HH, Griffin
MT, Hunter AL, Luong T, Ehlert FJ (1992) Conversão de N-(2-cloroetil)-4-
piperidinil difenilacetato (mostarda 4-DAMP) em um íon aziridínio e
sua interação com receptores muscarínicos em vários tecidos. Mol
Pharmacol 41:718-726
Thomas EA, Baker SA, Ehlert FJ (1993) Papel funcional para o receptor
muscarínico M2 no músculo liso do íleo da cobaia. Mol Pharmacol
44:102-110
Tran JA, Chang A, Matsui M, Ehlert FJ (2009) Estimativa de constantes de
afinidade microscópica relativa de agonistas para o estado ativo do
receptor em estudos funcionais em receptores muscarínicos M2 e M3 .
Mol Pharmacol 75:381–396 Unno T, Matsuyama H, Sakamoto T,
Uchiyama M, Izumi Y, Okamoto H, Yamada M, Wess J, Komori S (2005)
M(2) e M(3) contrações mediadas por receptores muscarínicos no
músculo liso longitudinal do íleo estudado com camundongos knockout
para receptores. Br J Pharmacol 146:98-108