Determinação de proteína bruta

em grãos
Prof. Nathan Levien Vanier
Eng. Agrônomo, Dr.

Faculdade de Agronomia
“Eliseu Maciel”
Proteínas são polímeros de aminoácidos

Grupamento carboxila
COO-

H3N+ C H
Grupamento amino
R Radical
 Grupos R apolares, alifáticos
Grupos R polares, não carregados

Grupos R Grupos R
Grupos R aromáticos
carregados
carregados
positivamente
negativamente
Estrutura de proteínas

Fonte: Delcour e Hoseney, Principles of Cereal Sci. and Tech. 3ª Ed., 2010.
Aminoácidos essenciais
➢ Histidina
➢ Isoleucina
➢ Leucina
➢ Lisina
➢ Metionina
➢ Fenilalanina
➢ Treonina
➢ Triptofano
➢ Valina

Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.

Proteínas em cereais

Espécie Teor de Principal proteína de reserva

proteína dos
grãos (% bs)
1. Trigo ~11 Prolaminas (gliadinas) e Glutelinas
(gluteninas)
2. Cevada ~11 Prolaminas (Hordeína)
3. Centeio ~9 Prolaminas (Secalina)
4. Aveia ~10 Globulinas
5. Milho ~ 10 Prolaminas (Zeína)
6. Sorgo ~8,5 Prolaminas (Kafirina)
7. Arroz ~7,5 Glutelinas (Oryzenína)

Fonte: FAO – Food and Agriculture Organization, 1991, disponível em

http://www.fao.org/docrep/x2184e/x2184e04.htm
Proteínas em trigo

Prolaminas (gliadinas)

Globulinas (triticina)
Globulinas (triticina)

Trigo 11 dias após o florescimento, apresentando inclusões de triticina (I)

em uma matriz de prolamina (M).

Fonte: Shewry e Halford, J. of Exp. Botany, v. 53, p. 947-958, 2002.

Proteínas em trigo

Trigo duro Trigo mole

Proteínas em trigo
Composição de AAs do glúten e de suas frações após hidrólise
ácida com HCl 6 M a 110°C por 24 h, seguido de evaporação,
filtração, diluição e separação por HPAEC-IPAD.

Fonte: Rombouts et al., J. of Chromat. A., v. 1216, p. 5557-5562, 2009.

Proteínas em arroz

Fonte: Paiva, F. F., Tese de Doutorado, PPGCTA-UFPEL, 2014.

Principais aminoácidos das proteínas do arroz
Perfil de aminoácidos em diferentes cultivares de arroz.

Os grupamentos amida promovem agregação de proteínas,

reduzindo sua flexibilidade e solubilidade.

Fonte: Houston et al., AACC Anual Meeting, 1968.

Isolados proteicos de soja

Isolado proteico de soja

Isolado proteico de soja Isolado proteico de soja Isolado proteico de soja

tratada a 40°C por 16 h tratada a 60°C por 16 h

Fonte: Wally-Vallim et al., J. Food Sci., v. 79, p. E1351-E1358, 2014.

Métodos de determinação do teor de
proteína bruta
1. Kjeldahl/Micro-Kjeldahl
2. Biureto
3. Ácido bicinconínico (BCA)
4. Lowry
5. Bradford
6. Ninidrina
7. Medição de turbidez
8. Dumas
9. Ultravioleta
10. Ouro coloidal (colloidal gold)
11. Infravermelho
12. Fluorescência
Método Princípio Vantagens Limitações Referências

Kjeldahl/ N é convertido em Método N não proteico AOAC

Micro- NH3, o qual é oficial que deve ser (1995)
Kjeldahl coletado em excesso determina determinado
de ácido para diretamente separadamente,
determinação de N o teor de N. caro, demorado,
por titulação. N x Universal. requer
fator = % proteína treinamento.
Biureto Íons cúpricos, sob Rápido, Interferentes: Robinson e
condições alcalinas, barato. agentes de Hodgen
interagem com ligações precipitação (1940)
peptídicas para proteica, agentes
produzir compostos redutores, fibras,
arroxeados, aditivos, pigmentos
mensurados a 540 nm. e minerais.
Ácido Redução do cobre a íons Rápido, Agentes redutores Smith et al.
bicinconínico cúpricos (Cu1+) por relativamente podem interferir na (1985)
(BCA) proteínas em condições barato, reação. Coloração
alcalinas, produzindo reagentes não formada é instável.
compostos arroxeados, interferem na
mensurados a 560 nm. quantificação
BCA age como reagente (sais,
capturador de Cu1+ em guanidina-
vez de Folin-Ciocalteau. HCl, ureia).

Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.

Método Princípio Vantagens Limitações Referências

Lowry Cobre alcalino reage Rápido, Proteína deve ser Lowry et al.
com ligações peptídicas barato, menos solúvel em pH 10. (1951)
+ redução com Folin- interferentes Agentes redutores Seevaratnam
Ciocalteau por por causa de interferem. Requer et al. (2009)
aminoácidos turbidez. mistura rápida
aromáticos (Tryp e (<10s) com Folin
Tyr). O complexo de para ser
coloração azulada é reprodutível. Cor
avaliada a 750 nm. não é proporcional
ao teor de proteína.
Bradford Para uma solução ácida Rápido, Tampões alcalinos Bradford
de Comassie Blue G- preciso, sais e fortes e SDS (1976)
250, a absorbância reagentes que (>0,1%)
áxima varia de 465 a interferem em interferem.
595 nm quando o Lowry não
corante se liga a interferem
proteína. neste método.
Ninidrina Aminoácidos, amônia e Mais simples Aminas primárias, Spackman et
grupamentos amino do que amônia, e al. (1958)
primários reagem com Kjeldahl. Pode aminoácidos livre
ninidrina em pH 5,5. ser usado para podem interferir. A
quantificar cor varia.
AA.

Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.

Método Princípio Vantagens Limitações Referências

Medição de Baixas concentrações de Simples e Ácidos nucléicos Layne

turbidez TCA, SSA e rápido. interferem. Utiliza (1957)
Ferrocianeto de reagentes corrosivos. Wieser
Potássio são utilizados (2000)
para precipitar as
proteínas, formando
uma suspensão túrbida.
A turbidez é mensurada
como redução de
absorbância a 540 nm.
Dumas Amostra é queimada Não utiliza Necessita bastante Simonne
a altas temperaturas químicos. amostra para et al.
(700-800°C) e o Método análise e (1997) e
nitrogênio liberado rápido. instrumento caro. Miller et
é quantificado Resultados Determina al. (2007)
(cromatografia comparáveis nitrogênio total
gasosa) ao Kjeldahl. (proteico e não
proteico)
Ultravioleta Alta absorção a 280 nm Rápido, Coeficiente de extinção Stoschek
(UV) de triptofano e tirosina barato, não molar a 280 nm do (1990) e
presentes nas proteínas. destrutivo, Trip. e da Tir. deveria Sanchez-
Lei de Beer é utilizada livre da ser calculado para cada Martínez et
para quantificação. interferência proteína. Interferência al. (2009)
de sais de fenóis, ácidos
nucléicos e outros.
Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.
Método Princípio Vantagens Limitações Referências

Infravermelho Absorção da energia Rápido. Alto custo do Wesley et

de radiação das equipamento. al. (2001),
proteínas nas Kim et al.
regiões próximas (2007),
(3300-3500 nm, Prieto et
2080-2220 nm, al. (2009)
1560-1670 nm) ou
pertencentes (6,47
µm) ao IV.
Fluorescência Reagentes específicos Rápido, Equipamento com Benson e
(OPA, ANS...) sensível, custo elevado. Hare (1975),
produzem derivados estável. Substâncias não Petersen
fluorescentes. Como proteicas que (1983),
exemplo, OPA reage apresentam Nielsen et al.
com NH2 terminal dos fluorescência (2001), Held
aminoácidos e grupos ε- interferem. (2006)
amino dos resíduos de Estabilidade dos
lisina. A leitura da produtos
fluorescência é fluorescentes é
geralmente feita a 450 maior nos
nm. hidrolisados do que
nas proteínas
nativas.

Fonte: Hetyarachchy, Food Proteins and Peptides, 2012.

Métodos de determinação do
Método de Kjeldahl
teor de proteína bruta

Etapas do método:

1. Preparo e pesagem de amostra

2. Adição de reagentes
3. Digestão
4. Destilação da amônia
5. Titulação

Fonte: Ötleş, Methods of Analysis of Food Comp. And Additives, 2012.

Métodos de determinação do
Método de Kjeldahl
teor de proteína bruta
~0,2 g de amostra
5 mL H2SO4
2 g de mistura catalítica

- Digestão por 4 h a 350ºC

- Repouso 1 h
Métodos de determinação do
Método de Kjeldahl
teor de proteína bruta

Função dos reagentes na etapa de digestão:

H2SO4 → promove a oxidação de compostos orgânicos à CO2 e água, e

induz a quebra e transformação de compostos nitrogenados em amônia
livre, a qual é complexada na forma de sulfeto de amônio.

Sais (K2SO4, Na2SO4) → necessário para elevar a temperatura de digestão.

Catalisadores → aceleram a oxidação. Incluem: metais (Hg, Cu, Se);

óxidos (CuO, HgO, P2O5, TiO2); peróxidos (H2O2); sais (CuSO4, Hg2SO4).

Fonte: Ötleş, Methods of Analysis of Food Comp. And Additives, 2012.

Métodos de determinação do
Método de Kjeldahl
teor de proteína bruta
Reações:
25 mL NaOH
(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO4

NH3+H3BO3→NH4H2BO3

10 mL H3BO3
Indicador misto
Métodos de determinação do
Método de Kjeldahl
teor de proteína bruta

Titulação com HCl 0,1 N

(verde → rosa)

NH4H2BO3+HCl→H3BO3+NH4Cl