03 DE MAIO DE 2021 4:18 PDT

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Retrons são o próximo

CRISPR?
ESCRITO POR: Carmen Leitch
Depois de ser identificado na década de 1980, pensava-se que os retrons eram apenas uma
característica estranha de algumas células bacterianas. Mas, eventualmente, os cientistas
mostraram que os retrons são um complexo de uma enzima, DNA e RNA, e permite que
uma célula bacteriana gere moléculas de DNA de fita simples (ssDNA). Demorou décadas,
mas os cientistas mostraram que o ssDNA produzido por retrons pode ajudar as bactérias a
se defenderem de vírus invasores . Os pesquisadores sabiam que tinham potencial como
editores de genes, assim como o CRISPR.
Crédito da imagem: Pixabay

"Por muito tempo, o CRISPR foi considerado uma coisa estranha que as bactérias faziam, e
descobrir como aproveitá-lo para a engenharia do genoma mudou o mundo. Retrons são
outra inovação bacteriana que também pode fornecer alguns avanços importantes", disse o
co-primeiro estudo autor Max Schubert, Ph.D., pós-doutorado no laboratório do membro do
corpo docente Wyss Core, George Church, Ph.D.

Os cientistas agora podem usar retrons para criar um novo sistema de edição de genes. A
ferramenta é chamada de Retron Library Recombineering (RLR). Milhões de mutações
genéticas podem ser feitas ao mesmo tempo, e as células mutantes são marcadas com um
código de barras que permite que um pool de células seja rastreado ao mesmo tempo. Com
ferramentas computacionais, toneladas de dados podem ser facilmente criados e
analisados. O trabalho foi relatado nos Proceedings of the National Academy of
Sciences (PNAS).

O mecanismo de edição de genes que utiliza retrons é chamado de recombinação de

oligonucleotídeos. Em vez de cortar o DNA com uma enzima e iniciar um processo de
reparo natural que integra novo DNA, como algumas técnicas CRISPR, essa ferramenta
incorpora novo DNA nos genomas das células com uma proteína chamada proteína de
anelamento de fita única (SSAP). O SSAP adiciona o novo DNA mutante ao genoma
conforme a célula se divide, e as células filhas carregam a nova sequência.

"O RLR nos permitiu fazer algo impossível de fazer com o CRISPR: cortamos
aleatoriamente um genoma bacteriano, transformamos esses fragmentos genéticos em DNA
de fita simples in situ e os usamos para rastrear milhões de sequências simultaneamente",
disse Max Schubert. "RLR é uma ferramenta de edição de genes mais simples e flexível que
pode ser usada para experimentos altamente multiplexados, o que elimina a toxicidade
frequentemente observada com CRISPR e melhora a capacidade dos pesquisadores de
explorar mutações no nível do genoma."

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As sequências dos retrons que se integram aos genomas das células-filhas servem como
identificadores, ou códigos de barras, para que as células possam ser agrupadas e analisadas
juntas. O sequenciamento de dados classifica as células individuais posteriormente.

"Descobrimos que os retrons deveriam nos dar a capacidade de produzir ssDNA dentro das
células que queremos editar, em vez de tentar forçá-los a entrar na célula de fora, e sem
danificar o DNA nativo, que são qualidades muito atraentes", disse co -primeiro autor
Daniel Goodman, Ph.D., um ex-Graduate Research Fellow no Wyss Institute que agora está
na UCSF.

Primeiro, os pesquisadores usaram plasmídeos, pedaços circulares de DNA, que continham

genes de resistência a antibióticos dentro de sequências de retrons junto com um gene
SSAP, e tentaram integrá-lo às células bacterianas. O processo funcionou, mas foi
incrivelmente ineficiente. Em seguida, eles desativaram genes que destruiriam o ssDNA e
impediriam os mecanismos de reparo do DNA nas bactérias, e essas mudanças melhoraram
dramaticamente o processo. A equipe descobriu que 90 por cento da população bacteriana
integrou a sequência retron em seu genoma. Os pesquisadores também garantiram que
diferenças de sequência muito pequenas pudessem ser detectadas pelo RLR.

"Ser capaz de analisar bibliotecas mutantes com código de barras agrupadas com RLR
permite que milhões de experimentos sejam realizados simultaneamente, permitindo-nos
observar os efeitos das mutações no genoma, bem como como essas mutações podem
interagir umas com as outras", disse o autor sênior do estudo George Church. "Este trabalho
ajuda a estabelecer um roteiro para o uso de RLR em outros sistemas genéticos, o que abre
muitas possibilidades interessantes para pesquisas genéticas futuras."

Esse processo também é diferente do CRISPR porque a bactéria pode continuar a incorporar
uma mutação desejada em seu genoma ao longo do tempo à medida que se replica. Também
pode ser possível combinar os dois métodos.

Fontes: AAAS / Eurekalert! via Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering em

Harvard , PNAS