Laboratórios de Bioquímica III

(os resultados utilizados foram retirados de diferentes relatórios, pelo que os

valores podem não estar de acordo com os teóricos, mas sim de acordo com as
práticas laboratoriais)

1.Compostos de Cobre

Objectivo:

Síntese de um pigmento de cobre – malaquite – e preparação de uma tinta

com base neste pigmento [1.2]. Preparação de nanopartículas de cobre em
suspensão aquosa (colóide de cobre) [1.3].

1.2. Pigmentos de cobre

O cobre, de símbolo químico Cu é um metal de transição de cor

castanho-avermelhado. Este é maleável, dúctil e bom condutor.

Cu: [Ar] 3d10 4s1 ; Cu+: [Ar] 3d10 ; Cu2+: [Ar] 3d9

A malaquite é um mineral dos grupos carbonados (carbonato de

cobre II), com fórmula química CuCO3(HO)2 que, para além da cor, não
apresenta qualquer semelhança com o pigmento industrial. Resulta da
interacção de minerais de cobre e rochas de carbonato, podendo ser obtido
em laboratório por reacção entre sulfato de cobre penta-hidratado e
carbonato de sódio.

2CuSO4-5H2O + Na2CO3 --- CuCO3Cu(HO)2 + 2Na2SO4 + CO2 + 4H20

(excesso)

Apresenta uma cor verde-azulada e pode ser usado como pigmento

na preparação de tintas, de diferenciam-se de acordo com o meio (agente
aglutinante) utilizado.

Síntese de Malaquite

A solução de sulfato de cobre com carbonato de sódio é colocada em

banho de gelo para que a malaquite precipite mais rápido (é insolúvel em
água). Isto porque o processo de precipitação é mais rápido a baixas
temperaturas, por ser mais fácil formar-se a estrutura cristalina. Outra
razão é que a reacção é exotérmica (ΔH<0), logo ao baixar a temperatura,
favorecemos a reacção no sentido directo.

O pigmento obtido tem uma cor azul-esverdeada pois o ião cobre

tem estado de oxidação +2, fazendo dele um d9. Assim, sabe-se que tem

1
electrões desemparelhados e orbitais d semipreenchidas, permitindo
transições d-d na zona do visível. Todos os pigmentos metálicos têm a cor
característica dos metais que os constituem. O pigmento pode ser mais azul
do que seria de esperar, caso haja excesso de cobre.

A reacção que ocorre é substituição ácido-base e não de redox

visto que o estado de oxidação do ião cobre é sempre +2 e ocorre a troca
dos ião SO42- pelos CO32-.

O CO2 libertado, representado pela presença de bolhas na solução

contida no copo, é devido à formação de ácido carbónico (H 2CO3 muito
instável) que se decompõe em CO2 e H2O. Isto acontece porque há um
excesso de CO3 que não é incorporado na malaquite.

Alguns resultados e Análise destes

 Malaquite com cor azul em vez de verde-azulado

Uma explicação possível é o facto de Cu2+ não ter reagido todo

 Água como agente aglutinante/Ovo como agente aglutinante

Quando adicionamos água à malaquite não há formação de tinta, ficando

com um aspecto de aguarela isto porque a malaquite é insolúvel em água
pelo que não se vai dissolver. No entanto quando usamos ovo como agente
aglutinante, já há formação de tinta isto porque a gema é lipossolúvel

2
(contém lípidos) e solubiliza o sal de malaquite, permitindo formar uma
tinta de óleo.

1.2. Nanopartículas de cobre

As nanopartículas são estruturas da ordem dos nanómetros muito

utilizadas, visto que podem ser preparadas a partir de praticamente
qualquer substância, conferindo-lhes bastante versatilidade. Apresentam
características distintas dos metais que lhes dão origem, dependo do
tamanho e morfologia das partículas. Uma das maiores diferenças
observadas entre o metal e a nanopartícula é a cor. Neste caso, as
nanopartículas têm cor amarela, muito diferente da cor vermelho-
acastanhada de metal ou azul do Cu(II).

As nanopartículas podem ser preparadas a partir da redução de um

sal de metal na presença de um agente redutor em excesso. O Cu2+ é
reduzido a Cu0 e origina-se ácido glucónico que em meio básico dá
gluconato.

C6H12O6 + Cu2+  C6H12O7- + Cu0(s) (meio básico, OH-)

(excesso)

O agente redutor é a glucose que reage com o sulfato de cobre. A

glucose tem capacidade de reduzir devido ao grupo aldeído. A existência de
glucose em excesso permite garantir que todo o Cu 2+ passa a Cu0 o que é
industrialmente vantajoso, pois permite que o equilíbrio se desloque para a
direita.

O Cu0 é incolor, porque é um d10, logo as orbitais d estão todas

preenchidas, não havendo assim, transições d-d.

A glucose transforma-se em ácido glucónico e

este, em meio básico – adição de NaOH -
transforma-se em gluconato. O gluconato
adsorve à superfície das nanopartículas,
conferindo-lhes carga negativa (aniões
gluconato), o que permite que elas se
mantenham em suspensão na solução aquosa
por forças electrostáticas repulsivas. A cor amarela é devida à dispersão
da luz branca quando passa pelas nanopartículas.

3
 Com o passar do tempo a cor amarela vai desaparecendo, ficando a
solução incolor, isto porque o Cu0 oxida-se (contacto com o oxigénio do ar)
e passa a Cu+, que é um d10 não há transições d-d e também já não
permite que as partículas fiquem em suspensão, não havendo diferenciação
da luz. Passado mais algum tempo a solução fica azul porque há uma nova
oxidação (complexação com a água) e o Cu+passa a Cu2+, a solução fica
azul, pois o Cu2+ é um d9.

As nanopartículas metálicas têm diversas aplicações:

 Medicina: agentes quimioterapéuticos no tratamento do cancro;

 Biotecnologia: marcação de nanopartículas e introdução nas células
para análise por Raio-x ou RMN;
 Farmacologia: transporte de fármacos (no interior da partícula ou à
superfície) para locais específicos no organismo.

4
2.Pigmentos Fotossíntéticos

Objectivo:

Extração, separação e identificação de pigmentos, clorofilas e caratenóides,

de folhas verdes. Observação dos espectros de absorção de cada pigmento.

Os pigmentos são substâncias que absorvem luz na zona do visível,

sendo capaz de converter energia luminosa em química, sob condições
apropriadas. Este processo de conversão é designado fotossíntese. A
libertação de energia química dá-se quando os electrões retornam do
estado excitável (causado pela absorção de luz), para o estado base.

Diferentes pigmentos absorvem radiação a diferentes ʎ, o que lhes

confere uma cor e espectro de absorção característicos. A existência de
diversos tipos de pigmentos está na complementaridade de absorção, isto
é, havendo diferentes tipos de pigmentos que absorvem a comprimentos de
onda diferentes no espectro, derivado das diferenças de estrutura e
polaridade, há uma ampliação do espectro de absorção da planta,
aumentando assim a sua taxa de fotossíntese.

A capacidade dos pigmentos absorverem luz está relacionada com o

facto de terem um extenso sistema de ligações duplas, ricas em electrões
facilmente excitáveis por radiação, ocorrendo transições entre as orbitais π
 π*.

Polaridade: (+) xantofilas > clorofila b > clorofila a > carotenos (-)

5
Clorofilas

Existem em todos os eucariontes fotossintéticos e nas cianobactérias.

São responsáveis pela cor verde das plantas e estão localizados nos
cloroplastos, ligados a lipoproteínas que formam lamelas cloroplasmáticas.
Absorvem a maior parte dos comprimentos de onda do visível.

A estrutura básica das clorofilas é constituída por quatro anéis pirrol

ligados por pontes de meteno (=CH) tendo como átomo central o ião
magnésio (Mg2+) coordenado por quatro átomos de azoto e caracteriza-se
por um sistema de ligações duplas, podendo possuir vários grupos
substituintes (R). Esta estrutura contém ainda uma longa cadeia
hidrocarbonada designada de fitol.

Existem dois principais tipos de clorofila, a a e a b que diferem

apenas no grupo R (grupo substituinte do carbono 3), que corresponde ao
grupo metilo (-CH3) e ao grupo aldeído (-CHO) respectivamente. É graças a
esta diferença que estas biomoléculas apresentam diferentes polaridades e
diferentes espectros de absorção.

Caratenóides

São pigmentos amarelos que são mais notórios nas folhas quando a
clorofila é degradada. A maior vantagem é ampliarem o espectro de
absorção da planta.

Carotenos

Apresentam uma longa cadeia hidrocarbonada que nas pontas têm ciclos,
como por exemplo benzeno, logo são muito apolares. Estes reflectem a cor
laranja.

Xantófilas

Apesar de terem uma estrutura semelhante aos carotenos, têm grupos

hidroxilos o que os torna polares. Estes reflectem a cor amarela.

Metologia

 Adicionou-se sulfato de sódio anidro para secar o material biológico.

 Extração contínua e a quente dos pigmentos usando como solvente
orgânico o éter etílico (muito volátil).

6
Para proceder à separação dos pigmentos fotossintéticos é realizada uma
cromatografia em camada fina. Este usa as diferenças de polaridade dos
diversos pigmentos para conseguir separá-los.

A placa de sílica (camada fina de adsorvente espalhado numa placa

de vidro, polar), onde se coloca o concentrado das folhas verdes, é a fase
estacionária. O eluente (mistura de solventes, que tem propriedades
apolares – mistura de éter de petróleo, acetona e n-propanol) constitui a
fase móvel.

A separação, que ocorre à medida que o eluente sobre pela placa,

resulta do facto dos diversos componentes da mistura serem arrastados
com diferentes velocidades, pela fase móvel que sobre por capilaridade ao
longo do material poroso da placa. A placa é mantida numa tina tapada com
folha de alumínio de forma a não haver degradação dos pigmentos por
acção da luz.

Os pigmentos são separados conforme a sua polaridade. As

substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as mais polares,
uma vez que estas sofrem um retardamento na migração, que é devido ao
facto destes componentes moleculares possuírem uma maior afinidade pela
fase estacionária (polar). Como o eluente é apolar espera-se que os
pigmentos apolares se desloquem mais na placa.

Após a realização da cromatografia e após a amostra secar, é

possível observar diversas manchas correspondentes a cada componente da
amostra.

O grau de separação é dado pelo facto de retardação (Rf). Este depende da

solubilidade e da adsorção dos componentes da mistura. Quanto maior o Rf,
mais apolares será o pigmento.

7
 Rf =

Alguns resultados e Análise destes

 Banda cinzenta

A camada cinzenta correspondente aos resíduos de degradação da clorofila,

apareceu devido à instabilidade das clorofilas, principalmente a pH ácido.

Tiram-se, posteriormente à remoção dos pigmentos da placa de sílica

e dissolução em éter etílico (é o branco), os espectros de absorção no
visível (350-700nm). Usaram-se cuvettes de vidro por causa do solvente e
das possíveis interacções com o plástico (contaminação da amostra).

As clorofilas absorvem na zona do azul e do vermelho, adquirindo portanto

a cor verde.

 Clorofila a – tem duas bandas nos 410 e 670 nm (aproximadamente).

 Clorofila b – tem duas bandas nos 450 e 640 nm. (aproximadamente)

Uma vez que os picos de ambas as clorofilas não se encontram

sobrepostos, vamos obter colorações ligeiramente diferentes: clorofila a -
verde escura; clorofila b - verde clara. Seria de esperar que tanto a clorofila
a como a clorofila b tivessem um espectro muito semelhantes, mas tal não
acontece isto deve-se ao papel desempenhado pelo Mg2+, isto é, a transição
π  π* do electrão ocorre com menor energia (ʎ maior, para a clorofila a).

No caso dos carotenóides podemos ver que eles absorvem na zona do

azul/verde, assim, a cor que vemos é a cor complementar a
amarelo/laranja.

8
  Xantófilas – uma banda aos 440 nm.
 Carotenos – uma banda aos 450 nm.

Os picos de absorção estão inteiramente relacionados com o papel de

cada pigmento no processo fotossintético.

Alguns resultados e análise destes

 Não se verifica o máximo de absorção da porfirina nos espectros

registados

A cadeia fitol não tem interferência significativa na determinação do

espectro da clorofila, pelo que se espera ver os valores de absorção da
porfirina. O máximo de absorção da porfirina situa-se na zona dos 390nm,
no entanto este não se verifica devido à ligação ao ião Mg 2+. Esta ligação
permite que a transição ππ* requeira baixos níveis de energia, ou seja
comprimentos de onda maior, na zona do vísivel. Caso contrário esta
transição, quando a porfirina não se encontra ligado ao magnésio, requer
grandes níveis de energia e por isso menores comprimentos de onda, o que
se encontraria já na zona do UV.

Esta foi um das técnicas de adptação utilizadas pelos organismos

fotoautotróficos, uma vez que a abundância da energia solar é superior à da
energia UV.

 Quando as bandas de absorção não começam no zero (valor)

Estas oscilações devem-se principalmente à turbidez da solução, causada

por resíduos de sílica, provenientes da placa de cromatografia, que podem
não ter precipitado.

9
3.Compostos de Coordenação

Objectivo:

Determinação da estequiometria e do coeficiente de extinção molar do

complexo [Ni(EDTA)]2- [3.1]. Determinação da constante de estabilidade
termodinâmica do complexo [Fe(SCN)]2+ [3.2]. Determinação da ordem de
estabilidades para uma séries de complexos de Cu(II).

Um ião complexo é uma espécie química constituída pelo ião

metálico central (ácido de Lewis – aceitador de electrões), representado por
Mn+, que se vai encontrar ligado a um certo nº de moléculas ou iões
designados por ligandos (bases de Lewis – dadoras de electrões),
representados por L, formando uma ligação ião metálico-ligando.

Muitos dos complexos apresentam cor, isto ocorre porque existem

transições eletrónicas entre as orbitais d do ião central, que após a
formação do complexo adquirem energias diferentes. Sucedendo a
passagem de e- em orbitais d de menor energia para orbitais de energia
superior, esta energia adquirida pelos electrões é posteriormente emitida na
forma de radiação visível aquando da desexcitação dos electrões para o seu
nível inicial, conferindo-lhe cor.

Através desta característica é possível determinar propriedades como

a estequiometria e o coeficiente de extinção molar recorrendo a técnicas de
espectroscopia e à Lei de Beer-Lambert.

3.1. Determinar a estequiometria e ɛ de [Ni(EDTA)]2-

Determinação do ʎmáx

4 tubos:

A – contém excesso de EDTA

B – contém excesso de Níquel

C – contém apenas Níquel (II)

D – contém apenas EDTA

10
 A solução D não tem qualquer banda de absorção, o que era de
esperar porque o EDTA não tem cor, logo não absorvem nem emite no
visível. O EDTA é um ligando hexadentado.

A solução C apresenta duas bandas (2 máx. de absorção)

aproximadamente nos 650nm e nos 720nm, isto porque o níquel assume
uma geometria planar quadrada quando o ligando é a água, forma-se
[Ni(H2O)4]2+. Como o níquel(II) é um d8 existem duas transições possíveis
dxy e dx2-y2 (banda dos 720nm) e dz2 e dx2-y2 (banda dos 650nm). Se o
complexo apresentasse geometria octaédrica apenas existiria uma
possibilidade de transição entre as orbitais d, no entanto isto entra em
contradição com os dados experimentais, pelo que podemos concluir que a
geometria octaédrica não se observa neste complexo.

Os espectros A e B têm os dois um máximo de absorvância por

volta dos 590nm, isto foi possível aferir pelo facto de as duas soluções
apresentarem []’s de Ni(II) e EDTA diferentes. Assim, conclui-se que este é
o valor de absorvância máxima do complexo. Em A a absorvância é maior,
nos 590nm, isto acontece porque a concentração do complexo é maior. O
espectro B tem outra banda, pois o níquel em excesso vai formar o aquaião
[Ni(H2O)4]2+.

Determinação da estequiometria do complexo formado

Métodos de Jobs (método de variações contínuas) – prepara-se

uma série de soluções em que se faz variar a concentração do ião metálico
central e do ligando, fazendo alterar a razão metal:ligando, mas mantendo
constante a soma total das concentrações dos mesmo. Mede-se a
absorvância das soluções que tiverem cor, na zona do visível. A absorção
máxima corresponde ao ponto em que [M]:[L] é a estequiometria do
complexo.

11
Neste caso, a medição deve ser feita a ʎ=590nm, pois este corresponde ao
comprimento de onda para o qual o complexo tem o máximo de
absorvância )(excluem-se os comprimentos de onda aos quais o
aquaião ou ligando absorvem).

1. Escolhe-se um tubo para calcular a [ ] total

Tubo 5: 5 ml de solução de Ni(II) a 0,05M

5ml de solução de EDTA a 0,05M

Volume final: 10ml

[Ni2+]= [EDTA]=

[total] =

2. Medem-se as abs para os tubos e obtém-se o gráfico da Abs590 função

de

Verifica-se que há um máximo de absorvância quando a fracção molar é 0,5

e verificando a estequiometria.

,a
estequiometria é de 1:1 que era
de esperar porque o EDTA é um
ligando hexadentado e a
geometria do complexo é
octaédrica.

Determinação do ɛ à absorvância de 590nm

Para determinar o ɛ do complexo [Ni(EDTA)]2+, prepara-se uma solução com
10ml de Níquel (0,05M) e 10ml de EDTA (0,05M). A partir desta prepara-se
5 soluções com diferentes concentrações de água e solução, mantendo
constante o volume final. Mede-se a absorvância das soluções a 590nm.

12
[Ni2+]=[EDTA]=  n= 0,05Mx0,01dm3  n= 0,0005mol

Assume-se que há conversão total, visto que a formação do complexo

é favorável e a estequiometria é de 1:1

[Ni(EDTA)]2+=

A adição de água não causa alterações no nº de moles de EDTA,

apenas na sua concentração do complexo, visto que se trata de uma
diluição, por isso, temos de calcular a concentração de cada tubo com a
fórmula ci x Vi = cf x vf, em que ci
corresponde a concentração
anteriormente calculada 0,025M;Vi
corresponde ao volume [Ni(EDTA)]2-
y=mx+b usado e vf corresponde ao volume final
de cada tubo.

Do gráfico das Abs em função da

[[Ni(EDTA)]2-], podemos retirar o valor de
ɛ que corresponde ao declive da recta.

3.2. Determinação da constante de estabilidade

termodinâmica (Kf)

A estabilidade de um composto de coordenação depende do carácter

mole ou duro do ligando e do ião metálico, e também do efeito quelato.
Sabemos pelo Príncipio de Pearson que os iões metálicos duros
(>densidade de carga) formam complexos mais estáveis com ligandos
duros e de forma equivalente, os iões metálicos macios (<densidade de
carga) formam complexos mais estáveis com ligandos macios. Esta
estabilidade reflecte-se termodinamicamente.

Quanto ao efeito quelato, este verifica-se quando há a formação de

complexos com ligandos polidentados (dois ou mais grupos dadores de
electrões), sendo estes complexos termodinamicamente mais estáveis. Ao
composto de coordenação chama-se quelato e ao ligando chama-se agente
quelante. Em solução, a formação de quelatos faz com que aumente o nº de
partículas livres, isto é, aumento da entropia (ΔS 0).

A constante de formação (Kf) aumenta à medida que a ΔG0 (=ΔH0-

TΔS0) é mais negativa, o que permite concluir que um complexo quelato é

13
mais estável do que um complexo que coordena somente ligandos
monodentados.

Kf (Mlm)= [MLm]/[M][L]m ou βMLm =MLm[ ]/M[ ]x L[ ]m

O complexo [Fe(SCN)(H2O)5]2+ forma-se de acordo com a seguinte equação

[Fe(H20)6]3+ (aq) + [SCN-](aq) [Fe(SCN)(H2O)5]2+(aq) + H2O(l)

Cálculo da concentração do complexo [Fe(SCN)(H 2O)5]2+

 [FeCl3] = 20mM =0,02M= [Fe3+]

Vi (Fe3+)= V (FeCl3)= 0,001L

Vf (Fe3+)= 0,01L

Cf=

 [KSCN]= 15mM=0,015M=[SCN-]

Vi (SCN-)= V (KSCN)= 0,001L

Vf (SCN-)= 0,01L

Cf=

[Fe(H20)6]3+ (aq) + [SCN-](aq) [Fe(SCN)(H2O)5]2+(aq) + H2O(l)

Inicio 2mM 1,5mM 0

Equilíbrio 2mM-x 1,5mM-x x

Sabendo que c equivale ao x, que corresponde à concentração do

complexo [Fe(SCN)(H2O)5]2+, podemos calcular através da Lei de Beer
Lambert, do valor de ɛ=4800 l-1M-1 e das absorvâncias que determinámos.

A1 corresponde à abs450 da solução de tiocianto de potássio + nitrato de

potássio + cloreto de ferro e A2 corresponde à abs450 da solução nitrato de
potássio + cloreto de ferro, cujo os valor são respectivamente 0,482 e
0.031.

14
Pela Lei de Beer Lambert

 0,482-0,031=4800 x c  0,451=4800 x c  c=9,39x10-5M

Kf [Fe(SCN)(H2O)5]2+= Kf= 35,2M-1

Alguns resultados e análises destes

 Valor da constante baixo

Erros na medição dos volumes adicionados às duas soluções, o que leva a

alterações das concentrações e consequentemente a um registo de uma
absorvância mais baixa à que seria de esperar, desencadeando assim um
erro que se prolongou até ao resultado final.

3.3. Determinação da ordem de estabilidade de complexos

Cu(II)

Complexos:

 [Cu(H2O)4]2+ - Sulfato de cobre

A cor azul turquesa, devido à existência de aquaiões de cobre (II) em

solução, isto porque o Cu(II) é um d9. A cor não se deve apenas a um
complexo, mas sim a dois.

Cu2+ (aq) +4H2O (l) [Cu(H2O)4]2+ (aq)

Complexo: Tetraaquoião de cobre Geometria: Tetraédrica

Cu2+ (aq) + 6H2O (l) [Cu(H2O)6]2+ (aq)

Complexo: Hexaaquoião de cobre Geometria: Octaédrica

 [Cu(Cl)4]2+

Este complexo apresenta uma cor verde, isto porque as moléculas de H 2O

foram substituídas por iões de cloreto (Cl-).

[Cu(H2O)4]2+ (aq) + 4Cl- [Cu(Cl)4]2+ (aq) + 4H20(l)

O complexo tem mais afinidade pelo ligando Cl- do que pela H2O, pois a
reacção de substituição representada efectivamente ocorre. Se

15
adicionarmos mais água, a solução irá voltar à cor original, uma vez que se
dá a reação inversa devido ao excesso de produto.

 [Cu(NH3)4]2+ depois de HCl

Adicionando uma solução de amoníaco à solução anterior, o complexo passa

a ter uma cor azul escura, isto porque as moléculas de Cl - foram
substituídas por as de NH3.

[Cu(Cl)4]2+ (aq) + 4NH3 (aq) [Cu(NH3)4]2+ (aq) + 4Cl-

O NH3 forma complexos mais estáveis com o Cu(II) do que o Cl -. De

tivéssemos adicionado mais HCl concentrado a solução adquiria novamente
a cor verde, o que nos permitiria deduzir que a reacção é reversível.

 [Cu(NH3)4]2+ depois de H2O

O amoníaco actua inicialmente como base, formando um precipitado, e só

depois como ligando.

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 2NH3 (aq) ↔ [Cu(H2O)4(OH)2] (s) + 2NH4+ (aq)

Quando adicionamos mais NH3, a reacção ocorre maioritariamente no

sentido direto (até ao equilíbrio). Isto leva a diminuição dos reagentes
(aquaião). Quando os reagentes começam a diminuir a reacção compensa
ocorrendo maioritariamente no sentido inverso (até ao equilíbrio) o que leva
à diminuição dos produtos, ou seja, o precipitado dissolve-se.

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) ↔ [Cu(NH3)4(H2O)2] (aq) + 4 H2O (l)

 [Cu(EDTA)]2+ depois de NH3

Adicionando EDTA, passamos a ter um complexo com cor azul clara (turvo),
pois os ligandos NH3 são substituídos por EDTA, um ligando hexadentado.

[Cu(NH3)4]2+ (aq) + EDTA4- (aq) [Cu(EDTA)]2- (aq) + 6NH3(aq)

O composto [Cu(EDTA)]2- é um quelato, a sua ligação com o Cu(II) é mais

estável, até porque a estequiometria é de 1:1. Esta substituição de ligandos
verificou-se também ao se adicionar EDTA a um tubo já com HCl ou com
água, o que permite concluir que o EDTA forma complexos mais estáveis
com o Cu(II) do que qualquer um dos ligandos monodentados NH3, Cl- ou
H2O.

Os compostos têm cores diferentes devido às transições d-d. Cada

ligando cria um campo diferente logo provocam um desdobramento
diferente das orbitais d do Cu(II), e assim as transições são distintas, tal

16
como as cores dos compostos. O complexo [Cu(EDTA)] 2- tem geometria
octaédrica. Os complexos formados pelo Cu2+ e pelos ligandos H2O, Cl- e
NH3 podem ter geometria tetragonal Z + ou planar quadrada.

Ordem de estabilidade

[Cu(EDTA)]2+ >> [Cu(NH3)4]2+>> [Cu(Cl)4]2+>> [Cu(H2O)4]2+

A estabilidade pode ser explicada pelo principio de Pearson, já

referido anteriormente e sabendo que o Cu(II) é tem carácter intermédio. A
dureza dos iões metálicos e dos ligandos, aumenta com a carga e diminui
com a polarizibilidade. O amoníaco aproxima-se mais do carácter
intermédio, enquanto que o cloreto e a água apresentam carácter mais
duro.

Podemos também organizar os ligandos por grandeza de campo, isto

verifica-se na séries espetroquímica, que nos diz que à medida que
avançamos na série, o campo que as substâncias criam é cada vez mais
forte (diferença energética maior), e daqui resulta um spin cada vez mais
baixo. Para os ligandos em questão a ordem na série é a apresentada:

Cl- < H2O < EDTA < NH3

O Cl- é o que cria o campo mais fraco e o NH3 o mais forte. Daí os
complexos com NH3 serem azuis escuros, ao ter um campo forte a radiação
emitida é mais energética (são absorvidos ʎ mais pequenos/curtos). Neste
caso a diferença entre as orbitais d é mais acentuada, a isto corresponde
uma energia emitida superior, aquando da desexcitação dos electrões.

A banda de comprimentos de onda absorvidos quando se faz incidir

luz visível nos complexos, é correspondente à cor complementar que o
complexo apresenta macroscopicamente.

17
4.Interacção de iões metálicos com proteína

Objectivo:

Estudo da interacção da albumina do soro bovino (BSA) com vários iões

metálicos (Cu2+, Hg2+, Zn2+ e Pb2+) [4.1]. Estabilidade de complexos de ião
Cu2+ com diferentes ligandos BSA e EDTA [4.2].

As metaloproteínas são proteínas que contêm iões metálicos na sua

constituição que vão determinar, atendendo à estrutura e geometria de
coordenação que podem assumir como proteína, a sua função biológica e
ma grande diversidade de metaloproteínas e, em particular, de
metaloenzimas.

Estas apresentam vários possíveis locais de coordenação de iões

metálicos, como os grupos carboxilo (-COOH), amina (-NH2), hidroxilo (-
OH), sulfídrico (-SH) e imidazol, presentes nos resíduos de aminoácidos da
proteína mas, também é possível a existência de coordenação nas ligações
peptídicas (ligação amida).

A coordenação de proteínas a iões metálicos é portanto devida à

existência de bons grupos ligantes nos resíduos da proteína, no caso da
BSA, cisteínas.

Para que ocorra a formação do complexo metaloproteíco, o ião

metálico e a proteína devem obedecer ao Principio de Pearson. Tanto o
ião metálico – átomo central do complexo - como a proteína – ligando –
podem ser classificados como macios ou duros. Os ácidos de Lewis macios
vão interagir muito facilmente com bases de Lewis macias e os ácidos de
Lewis duros com bases de Lewis duras (por exemplo N, O ou F). Os iões
metálicos actuam como ácidos e as proteínas como bases. Existem ainda
iões metálicos de carácter intermédio, que podem coordenar com ligandos
macios e intermédios.

A albumina do soro bovino, BSA, é uma metaloproteína plasmática

que consegue transportar catiões metálicos ao permitir a solubilidade
destes. No centro activo da proteína os resíduos de cisteína desempenham
um papel crucial na interacção com o ião metálico, pois são os únicos
resíduos de cisteína disponíveis para coordenar com iões plasmáticos, uma
vez que não participam em ligações dissulfídicas, intramoleculares. Devido
ao carácter macio do grupo sulfídrico, o grupo –SH da cisteína vai
interagir essencialmente com iões macios como Pb2+ e Hg2+, formando
complexos mais estáveis. No entanto pode também coordenar com iões de
carácter intermédio, como Cu2+ e Zn2+, embora com menor afinidade.

18
 Através da espectroscopia visível/UB é possível detectar ligações
metal-ligando estabilizadas pelas:

 Bandas d-d: visível, menor energia, logo maior ʎ, orbitais d.

 Bandas de transferência de carga: maior energia, menor ʎ,
electrões entre o ligando e o ião metálico.

Pretende-se comparar a estabilidade dos compostos resultantes da

coordenação com diferentes iões, por competição. Para isso vão ser
adicionados diferentes iões na solução de Cu-BSA e posteriormente vão ser
medidos os espectros electrónicos de cada solução com os iões a competir.

Todos os iões metálicos pertencem aos blocos de metais de transição,

mas apenas o ião Cu2+ é um ião d9, com electrões desemparelhados nas
orbitais d e, por isso, considerado paramagnético. Esta propriedade vai
conferir ao complexo metaloproteíco uma determinada cor, que no caso do
cobre (II)-BSA (Cu-BSA), é azul. No caso dos restantes iões não se espera
observar qualquer tonalidade devido ao total preenchimento das suas
orbitais d de valência, uma vez que são d10, diamagnéticos.

4.1. Interacção da BSA com vários iões metálicos

Ligação do Cu2+ com a BSA e a água

O ião cobre vai coordenar preferencialmente com o átomo de azoto

das ligações amida da BSA e com o grupo –SH dos resíduos de cis-34 da
proteína. Este ião, de acordo com a classificação de Lewis, tem carácter
intermédio e pode, também, estabelecer ligações com o grupo sulfidrilo dos
resíduos de cisteína (ligação responsável pelo transporte deste ião no
sangue por parte da BSA).

O complexo octaédrico que se forma, tem o átomo de metal rodeado

por seis pares de electrões não compartilhados, no entanto o ião Cu2+ tem
nove electrões nas orbitais d de valência d9, sendo que um deles está
desemparelhado, o que significa que há a possibilidade de ocorrerem
tranferências electrónicas entre o ião e o ligando.

Assim, quando complexa com a BSA, o grupo sulfifrilo do resíduo de

cisteína transfere um electrão para uma das orbitais d do ião Cu 2+.

Existem duas bandas na ligação Cu2+-BSA uma a 378nm e outra a

680nm. A primeira deve-se à transferência de carga do grupo –SH para
uma orbital eg (dx2-y2) do ião Cu2+ (d9). A segunda banda de absorção é o
resultado da ligação entre o ião Cu2+ e os azotos de ligações peptídicas

19
(ligação amida), formando um complexo corado, semelhante ao reagente
do biureto. Todas as bandas do visível derivam desta ligação.

Na ligação Cu2+-H2O existe apenas uma banda nos 680nm, por causa
das transições d-d, devido ao desdobramento das orbitais causo pelo
2+
ligando H2O. Esta banda resulta da ligação do aos azotos das ligações
peptídicas e à formação do complexo [ ( ₂ )₆]2+, que também é
acompanhada de uma transferência eletrónica que confere coloração à
solução.

Interação da BSA com os iões Cu2+, Zn2+, Hg2+ e Pb2+

Diferentes ligandos criam complexos de diferentes estabilidades com

o mesmo ião metálico, uma vez que influenciam de modo desigual o grau
de desdobramento das orbitais d desse ião.

A BSA-Cu2+ tem duas bandas como já foi visto. Os outros iões são
todos d10, logo não há possibilidade de haver transições d-d nem de
transferência de carga. Por não se observarem essas ligações dizem-se
soluções silenciosas no visível, explicando a ausência de cor das soluções.

Alguns resultados e Análise destes

 Quando o espectro de Zn-BSA apresenta absorvância no visível

Isto verifica-se, a valores muito baixos, quando existe a possibilidade de

forma aquaiões.

Competição entre os iões em estudo

É necessário adicionar primeiro Cu2+ porque os outros são inactivos

espectroscopicamente, isso podia levar ao erro de pensar que eles não se
ligam à BSA. Como o grupo –SH é um grupo macio vai ter maior afinidade
pelos iões metálicos de carácter macio e Zn2+, Pb2+ e Hg2+ são
considerados mais macios que o ião Cu2+. Apesar de não se verificarem
bandas das transições d-d, podem-se observar bandas de transferência de
carga devido à existência ligação Cu-BSA.

Cu2+-BSA-Zn2+: verifica-se uma diminuição da banda de

transferência de carga, porque o Zn2+ tem um carácter mais macio do que o
Cu2+, permitindo ligações mais estáveis com o grupo –SH das cisteínas.
Ocorre uma substituição parcial e gradual dos iões centrais do complexo.

De notar que o facto de a banda diminuir ou desaparecer é consequência

da diminuição ou desaparecimento de Cu-BSA. Portanto, a banda
continuará a ser detectável apenas enquanto ainda existir Cu 2+ e BSA

20
complexados e será tanto maior quanto maior for a intensidade do
complexo em solução. Verifica-se uma diminuição da intesidade do
complexo BSA devido à competição iónica.

Como o Pb2+ e o Hg2+, respectivamente, são mais macios (>raio

iónico, <densidade de carga) que o Zn2+ verifica-se um efeito semelhante
mas mais acentuado. No caso do Hg2+ a banda desaparece totalmente o
que indica que o Hg2+ “retirou” todo o Cu2+ dos grupos –SH.

Metodologia

 Na análise de todas as amostras que continham BSA ao

espetrofotómetro foi utilizado como referência a solução de
BSA. Devido à presença de resíduos aromáticos na sua constituição,
a proteína em solução absorve na gama do UV, devido à existência
de transições electrónicas muito energéticas, a cerca de 280nm,
entre orbitais ligantes e antiligantes da molécula π  π*. Deste modo,
a absorção pela BSA em solução poderia encobrir a banda dos 370nm
do complexo Cu-BSA. Ao se retirar a influência da BSA ao espectro
do complexo em questão diminuímos a interferência causada pela
BSA na análise do espectro do complexo. Para as amostras que não
continham BSA, utilizou-se como referência a água miliQ,
solvente das mesmas.
 A solução de acetato de sódio serviu como solução tampão, útil para
manter um pH relativamente constante.
 A adição das gotas lentamente serve para evitar o aumento repentino
da força iónica em solução, para evitar elevadas [ ]’s locais e a
formação de precipitados (consequências da desnaturação proteica).

4.2. Interacção do ião Cu2+ com BSA ou EDTA (competição

entre ligandos)

Num complexo formado por um ião metálico de transição com vários

ligandos, os níveis das orbitais d não se encontram todas com a mesma
energia, devido ao efeito que exercem esses ligandos.

Ao adicionar Na2EDTA, à solução de CuBSA, o ião EDTA vai complexar

com o ião Cu2+ (pela equação Cu2+ + BSA + EDTA4-  [Cu(EDTA)]2+)
por reações de substituição de ligandos. Isto acontece porque, como o EDTA
é um ligando hexadentado, pode coordenar com o ião metálico por 6 locais
diferentes, formando um composto extremamente estável designado por
quelato. Também se verifica uma substituição do EDTA no complexo quando
este é adicionado a uma solução de BSA-H2O, isto porque a substituição dos

21
ligandos por EDTA dá-se, nos dois casos, porque há um fator entrópico
favorável quando se substitui um ligando monodentado por um polidentado.

Pela teoria do campo cristalino, pode explicar-se que o aumento da

intensidade da cor das soluções, quando há substituição da proteína BSA
pelo ião EDTA, traduz-se no aumento das bandas de absorção na zona do
visível. O EDTA cria uma maior distorção na geometria octaédrica e um
aumento da energia entre as orbitais t2g e eg (maior diferença energética).
Há sobreposição das orbitais, havendo mais possibilidade de ocorrer
transições d-d (coloração mais intensa).

22
5.Interacção de iões metálicos com o DNA

Objectivo:

Verificar a influência de vários iões metálicos (Mg 2+, Cu2+, Hg2+) na

estabilidade da dupla hélice do DNA através da análise do espectro de
absorvância das amostras de 240 a 340 nm, bem como o efeito de
temperaturas altas e níveis de pH muito elevados ou reduzidos.

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é a molécula transportadora da

informação genética que se organiza numa estrutura de dupla hélice. É
constituída por uma cadeia de nucleótido, cada um contendo uma pentose
(açúcar), um grupo fosfato e um das 4 bases azotadas.

As duas principais forças que estabilizam a estrutura do DNA

são:

 Forças de emparelhamento - ligações de hidrogénio entre as bases

complementares: Adenina (A) e timina (T) (duas ligações de
hidrogénio); guanina (G) e citosina (C) (três ligações de hidrogénio.
 Forças de empacotamento – interacções hidrofóbicas entre os anéis
das bases sobrepostas.

Se quisermos desnaturar uma molécula de DNA é necessário fornecer

energia que chegue para quebrar estas ligações de hidrogénio. Quando
ocorre desnaturação a molécula de DNA de dupla hélice passa a cadeias
simples. Quando o calor é a razão da desnaturação, esta estará associada à
Melting Temperature (Tm) do DNA, esta corresponde à temperatura à
qual metade das moléculas de DNA em solução se dissociaram em cadeia
simples.

As interacções dipolo-diplo têm um efeito hipocrómico na molécula do

DNA que faz com as transições que ocorrem sejam de energia mais baixa
(menor valor de absorvância). No entanto quando ocorre a desnaturação
estas ligações são quebradas e dá-se o efeito hipercrómico que leva a
que a absorção seja maior e melhor observada.

Os ácidos nucleícos da molécula de DNA possuem máximos de

absorção entre os 240-275nm, devido às transições π  π* das ligações dos
anéis das bases azotadas. É possível por isso medir, através da
espectroscopia de ultravioleta (UV com cuvettes de quartzo), a absorção
de radiação do DNA observando o efeito dos vários factores que afectam a
estabilidade: as forças estabilizadoras, o comprimento das cadeias, a
temperatura, pH e a presença de iões.

23
Amostra de DNA-Água

Preparada variando as quantidades de água ultrapura adicionadas a

0,5ml de DNA de timo de vitela, de modo a saber qual a diluição adequada
da amostra (verificou-se 1:11, vai ser utilizada como controlo). A partir da
leitura da absorvância verificam-se que os valores de comprimentos de
onda onde se observa melhor a presença do DNA são entre 240 e 340nm,
sendo dentro destes que se vai daqui em diante ver a influencia da variação
dos vários factores, visto que se estamos a ver por comparação.

A partir de uma solução de 20ml de DNA 1:11 foram preparadas

diferentes soluções:

1. 2ml DNA + 0,2ml Cu2+  (DNA-Cu)

2. 2ml DNA + 0,2ml Mg2+ (DNA-Mg)
3. 2ml DNA + 0,4ml Hg2+  (DNA-Hg)
4. 2ml DNA + HCL  pH 1.07 (ácido)
5. 2ml DNA + NaOH  ph 12.94 (básico)
6. 2ml DNA + aquecimento a 85ºC/1hora

3 A absorvância inicial na
solução DNA 1:11 era de
1.406, a 260nm, fazemos
1 por isso a comparação dos
resultados com este valor.
240 260 280 300 320 340
-1

DNA na presença de Mg2+

O ião Mg2+ é um factor estabilizador da estrutura do DNA uma vez

que sendo um ião duro, os grupos fosfatos existentes ao longo das cadeias
do DNA têm afinidade para este ião metálico, uma vez que tem uma grande
densidade de carga e segundo o Príncipio de Pearson, são classificados
como um grupo duro. Este ião metálico vai por isso coordená-los
diminuindo as repulsões entre eles, estabilizando as moléculas de DNA, o
que por sua vez leva a uma redução da absorvância (1.183 - efeito
hipocrómico).

A Tm para este composto terá de ser superior, uma vez que é

necessário fornecer mais energia para desnaturar o DNA.

DNA na presença de Cu2+

O ião Cu2+ (ião intermédio), por ser um d9 é capaz de aceitar

electrões para preencher as suas orbitais vazias e por isso quando próximo
do DNA, forma complexos com as bases azotadas, bloqueando assim os

24
locais onde se formam ligações de hidrogénio. Este impedimento das
ligações provoca uma diminuição drástica da estabilidade da cadeia,
levando à sua desnaturação e consequente aumento de absorvância (1.537
- efeito hipercrómico). Este ião é por isso um factor destabilizante.

O efeito do ião cobre varia consoante a sua concentração, pelo que

quando as concentrações são suficientemente baixas o cobre podia até
estabilizar a cadeia, exercendo um efeito semelhante ao magnésio.

DNA na presença de Hg2+

O ião Hg2+ (ião macio) é um factor estabilizador uma vez que tem
a capacidade de criar emparelhamentos timina-Hg-timina (T-Hg-T) com
muita faciliadade, criando uma estrutura molecular ainda mais estável, o
que provoca uma redução da absorvância (1.214) e até uma red-shift que
corresponde a um aumento do comprimento de onda onde se verifica a
absorção máxima.

Estes novos pares chegam a ser ainda mais estáveis que os pares
regulares T-A e G-C. O mercúrio também emparelha com as outras bases
azotadas mas de modo menos estável.

DNA numa solução de pH baixo (meio ácido)

Em meio ácido, em que o pH tem valores baixos, ocorre a protonação

dos azotos de uma grande parte das timinas e adeninas, fazendo com que
sejam destruídas a maior parte das ligações de hidrogénio, o que leva à
desnaturação do DNA. A desnaturação, como já vimos, leva a um aumento
da absorvância (1.640  efeito hipercrómico). Ocorre também um red-shift.

Pode também ter ocorrido hidrólise das ligações entre algumas bases
azotadas e a desoxirribose, bem como haver repulsões entre as bases
azotadas devido às cargas positivas derivadas da protonação dos azotos.
Estas ocorrências podem também ter ajudado à destabilização do DNA.

O pH baixo é portanto um factor destabilizador.

DNA numa solução de pH alto (meio básico)

Em meio básico ocorre o oposto ao meio ácido, isto é, ocorre a

desprotonação das guaninas e timinas, o que irá também levar a uma
redução da quantidade de ligações de hidrogénio, destabilizando a estrutura
do DNA ao ponto da desnaturação. A desnaturação, novamente, leva ao
aumento da absorvância (1.507 efeito hipercrómico).

25
 O ganho de carga negativa devido à desprotonação leva também a
uma repulsão entre as bases azotadas, o que poderá ter influenciado a
destabilização do DNA.

O pH alto é portanto um factor destabilizador.

DNA submetido a aquecimento a 85°C/1hora

Um dos factores que mais influencia a destabilização da molécula de

DNA é a temperatura, estando muitas vezes associada à T m. É por isso de
esperar que após este tipo de aquecimento, quase todo o DNA esteja
desnaturado o que maximiza o efeito hipercrómico (1.823) de se apresentar
em cadeia simples.

A temperatura é um factor de destabilização.

Como já sabemos a Tm corresponde à melting temperature que pode

ser definida como a temperatura à qual metade das moléculas de DNA em
solução se dissociaram em cadeia simples. Na presença de iões
estabilizadores, como o Mg2+ e Hg2+, esta irá aumentar visto que quando
mais estabilizada a estrutura em dupla hélice estiver, mais temperatura
(energia) é necessária para quebrar as ligações e tornar as cadeias simples.
No caso referido, a subida da Tm seria maior no caso do mercúrio, sendo
este o ião com o maior efeito estabilizador.

De forma semelhante podemos concluir que na presença de iões

destabilizadores a Tm verifica uma diminuição, visto que a energia
necessária para destabilizar a dupla cadeia já vai menor. Isto verifica-se,
por exemplo, na presença de Cu2+.

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