VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

ANALÍTICOS
CQ
2019

Fonte:
Gil, ES “Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos, 3ª ed. Pharmabooks, 2010.
Apostila: Lopes, N.T. “Validação”, 2008.
Brasil, ANVISA: RDC 210/2003.
 VALIDAÇÃO
• BPF – BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO
(inglês – GMP – Good Manufacturing Practices) RDC 210 – 2003

- Todos os processos de fabricação devem ser definidos,

sistematicamente revisados, mostrando-se adequados para a
fabricação, garantindo a qualidade do produto;
- Etapas críticas dos processos de fabricação devem ser validadas;
- Áreas de produção devem ter infra-estrutura adequada (pessoal,
instalação, material, equipamentos, armazenagem, etc);
- Registros de todas as etapas de produção para facilitar
rastreabilidade;
- Sistema de atendimento ao consumidor (SAC) – pós-venda;
 VALIDAÇÃO

Validação significa provar e documentar resultados que

indiquem que o método, processo, equipamento, operação
material, procedimento ou sistema é seguro dentro dos
respectivos limites estabelecidos e que com sua aplicação
se conseguem os resultados desejados, atingindo a
excelência da qualidade.
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

• todos os métodos analíticos devem ser previamente validados

• a validação exigida pela legislação à para comprovar que o
método é realmente adequado.
• estudos estatísticos são utilizados para garantir que o método
atenda as exigências
• instrumentos devem estar previamente calibrados, incluindo
vidrarias, balanças e outros equipamentos.
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
PLANO MESTRE DE VALIDAÇÃO

• escrever a política de qualidade e validação da empresa;

• determinar e justificar a extensão dos testes e definir os
procedimentos de sua realização
• definir as atividades de monitoramento, requalificação e revalidação.
• identificar as normas e procedimentos operaicionais padronizados a
aplicar
• elaborar pops
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:

Deve-se também definir parâmetros para a validação do ensaio

analítico (performance analítica):
- exatidão
- precisão
- especificidade
- linearidade
- sensibilidade
- robustez
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
IDENTIFICAÇÃO:

• comprovar qualitativamente a identidade de uma

substância

• especificidade – caracteristica principal deste método

 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
EXATIDÃO:

- concordância entre os resultados encontrados pelo método e um valor

aceito como referência.
- usa-se oncentrações conhecidas de um padrão de referência primário.

a exatidão é expressão pela equação:

EX = CME x 100, ONDE:

CT
CME = Conc. Média Experimental CT = Conc. Teórica
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
PRECISÃO:
grau de repetibilidade entre valores obtidos em análises
individuais ou número de dados significativos obtidos em uma
análise que podem ser utilizados na emissão de um resultado.

relaciona-se a repetibilidade dos resultados obtidos em uma mesma

análise

CV % = Desvio padrão x 100

Média

CV: Coeficiente de Variação

 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:Precisão
Fortificação 50 µg/kg Analista 1

Conc Calc Rec

Amostra Rep (µg/kg) Media (%) DPR(%)
100,0
1 50,00 0
1 50,50 1,40
102,0
2 51,00 0
1 49,00 98,00
2 49,50 100,0 1,43
2 50,00 0
Paramelli e col. Validação da 102,0
metodologia de 3 1 51,00 49,50 0 4,29
determinação de 2 48,00 96,00
ditiocarbamatos em matriz 1 49,00 98,00
de maçã 4 49,00 0,00
2 49,00 98,00
por Cromatografia Gasosa 100,0
acoplada à Espectrometria
1 50,00 0
de Massas (CG/EM) 5 50,00 0,00
Workshop FACCAMP, 2013. 100,0
2 50,00 0
CV 1,15
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS:
ESPECIFICIDADE/Seletividade

Capacidade que um método tem de avaliar de forma

inequívoca uma determinada substância em uma mistura
complexa. é feito exame de soluções-padrão e amostra,
padráo de referência na presença de componentes que
poderiam interferir com a sua determinação.
 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:
A especificidade de um método é expressa pela
concordância entre resultados obtidos para a solução-
padrão e amostra ou ente solução-padrão com e sem
ESPECIFICIDADE/Seletividade
interferentes.
Aplicar placebo
Abs

1,300

Concordância % = Teor da solução-padrão x 100

Teor da solução amostra
0,800

Atenolol Padrao
Placebo

0,300

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Comprimento de Onda (nm)
-0,200
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

LINEARIDADE:

- é a extensão na curva de calibração de um determinado

método analítico que responde de forma diretamente
proporcional.
- diz respeito na capacidade em que o método tem de fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da substância
em exame dentro dos limites de variação.
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:
PARA SE DETERMINAR NA LINEARIDADE:

é necessário que se obtenha a reta de calibração

com, no mínimo, cinco pontos. a partir desta, obtém-
se a equação da reta (y= bx + a)

ponto de intersecção em y (a)

inclinação (b)
coeficiente de correlação (r).
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:
Construção da Curva de Calibração -
Linearidade
- Linearidade:
Diz respeito na capacidade em que o método tem de fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância em exame dentro
dos limites de variação.

Fonte:
HOLLER, F. James.; SKOOG, Douglas. A.; CROUCH, Stanley. R. Princípios de Análise Instrumental. 6º Ed. Editora Bookman, 2009.
Análise Instrumental – apostila de espectrofotometria molecular. CEFET QUÌMICA-RJ.
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- Usada nas dosagens de amostras conhecidas;
- É necessário que se obtenha a reta de calibração com, no mínimo, cinco pontos,
ou seja 5 concentrações diferentes (soluções padrões).
Preparo das soluções padrões:
Preparar as soluções: pesar massa do analito padrão e diluir em balões
volumétricos.
Pelo menos 5 concentrações
Soluções padrões: Apresenta concentração exata de uma substância que servirá
como referência na determinação
Fonte:
HOLLER, F. James.; SKOOG, Douglas. A.; CROUCH, Stanley. R. Princípios de Análise Instrumental. 6º Ed. Editora Bookman, 2009.
Análise Instrumental – apostila de espectrofotometria molecular. CEFET QUÌMICA-RJ.
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- Antes de iniciar fazer o Branco:
Utilizado na espectrofotometria para estabelecer o Zero de absorbância ou
100% Transmitância.
A curva deve cobrir a faixa de trabalho;
- Para cada concentração da solução padrão obter o valor da absorbância
Ex: Concentração (mg/mL) Absorbância
0,0020 0,145
0,0040 0,245
0,0060 0,344
0,0080 0,481
0,0104 0,585

Fonte:
ZAM, L.F., BRAMBILLA, O.H., FISCHER, L.M.L., MARCHESINI, S.A., MARQUES, S.A. Análise do teor de furosemida em comprimidos de diferentes laboratórios.
IX Workshop Multidisciplinar sobre Ensino e Aprendizagem. FACCAMP, Campo Limpo Paulista-SP. P. 48-51, 2012/2013.
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- Plotar os dados obtidos em programas como Excel ou Origin e
adicionar linha de tendência ou fazer a regressão linear dos dados;
- Adicionar a equação da reta;

- A equação da reta de calibração y = bx + a, e o coeficiente de

correlação (R) podem ser obtidos pelo método dos mínimos
quadrados. R aceito para indústria: 0,99

- Existe uma relação entre a curva de calibração e a lei de Lambert-Beer;

e através dessa equação (relação) verifica-se que a absorbância (A) é
diretamente proporcional a concentração (C).
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
É necessário que se obtenha a reta de calibração com, no
mínimo, cinco pontos. a partir desta, obtém-se a equação
da reta (y= bx + a) pelo método dos mínimos quadrados

- ponto de intersecção em y (a)

- inclinação (b)
- coeficiente de correlação (R).

Quem é x? x é concentração

Quem é y? y é absorbância

Para que serve R?

Construção da Curva de Calibração

A
A – Curva muito sensível
B – Curva Ideal 45º
B C – Curva pouco sensível

C A curva de calibração deve ter ângulo de 45° em relação ao

ponto de origem. Curvas de ângulos muito agudos ou obtusos
não devem ser utilizadas porque não têm sensibilidade ideal.

Fonte:
Gil, ES “Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos, 3ª ed. Pharmabooks, 2010.
Apostila: Validação: Lopes, N.T., 2008.
 Curva de Calibração
0,7

0,6
y = 54,439x + 0,0272
R² = 0,9961
0,5
Absorbância

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012

Concentração (mg/ml)

Fonte:
ZAM, L.F., BRAMBILLA, O.H., FISCHER, L.M.L., MARCHESINI, S.A., MARQUES, S.A. Análise do teor de furosemida em comprimidos de diferentes laboratórios.
IX Workshop Multidisciplinar sobre Ensino e Aprendizagem. FACCAMP, Campo Limpo Paulista-SP. P. 48-51, 2012/2013.
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
Curva de Calibração
- Plotar os dados obtidos em programas como Excel ou Origin e adicionar linha
0,7

de tendência ou fazer a regressão linear dos dados;

- Adicionar a equação da reta;
0,6
y = 54,439x + 0,0272
R² = 0,9961
0,5
Absorbância

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012

Concentração (mg/ml)

Fonte:
ZAM, L.F., BRAMBILLA, O.H., FISCHER, L.M.L., MARCHESINI, S.A., MARQUES, S.A. Análise do teor de furosemida em comprimidos de diferentes laboratórios.
IX Workshop Multidisciplinar sobre Ensino e Aprendizagem. FACCAMP, Campo Limpo Paulista-SP. P. 48-51, 2012/2013.
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- Como calcular a amostra desconhecida??
- Preparar a amostra nas mesmas condições de diluição do padrão
incluindo o mesmo solvente
- Medir a absorbância da amostra
- Ex: Abs da amostra: 0,378
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- Usando a curva de calibração
- Y = 54,439x + 0,0272 o que equivale a Abs = 54,439.Conc + 0,0272
- Substituir o valor de Abs da amostra: 0,378
0,378 = 54,439.Conc + 0,0272

0,378 – 0,0272 = 54,439.Conc

0,3518 =54,439.Conc
0,3518/54,439 = Conc
Conc = 0,00646 mg/mL
Construção da Curva de Calibração –
Exemplo para Espectrofotometria
- O valor obtido está de acordo com a Curva?
Curva de Calibração
0,7

0,6
y = 54,439x + 0,0272
R² = 0,9961
0,5

Absorbância 0,4

0,3

0,2

0,1

0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012

Concentração (mg/ml)

Exercícios
1- Obter o valor de concentração para Abs de 0,511
2- Qual o provável valor de absorbância para 0,003 mg/mL?
3- Esta curva é adequada para amostras de concentração 0,015 mg/mL?
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

ROBUSTEZ/ Resistência

- relacionada à precisão e vulnerabilidade que o método tem

de ser afetado por pequenas variações das condições de
ensaio.
- capacidade que o método tem de reproduzir resultados sob
uma variedade de condições ambientais ou operacionais.
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

ØMÉTODO NÃO AFETADO POR

IRREGULARIDADES
ØDIFÍCIL CONTROLE
Øtemperatura, pH, grau de pureza de reagentes,
composição de fase móvel, velocidade de fluxo, são
fatores que se destacam na avaliação da robustez
de um método
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

SENSIBILIDADE:
capacidade que se tem de avaliar para avaliar baixas concentrações de
um determinado analíto.

existem dois parâmetros usados para avaliar a sensibilidade de um método:

Ø limite de detecção
Ø limite de quantificação
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:
LIMITE DE DETECÇÃO: (LD)

Ø concentração mais baixa detectável pelo método

Ø caráter semiquantitativo
Ø aplicável a ensaios limites

ØRelação Sinal / Ruído = maior que 3

LD= DESVIO-MÉDIO x 3
INCLINAÇÃO DA RETA
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO: (LQ)
• aplicados a ensaios de doseamento
• menor concentração que pode ser determinada
quantitativamente
• o que difere do anterior é o peso dado a cada
parâmetro.
ØRelação Sinal / Ruído = maior que 10

LQ = DESVIO-PADRÃO MÉDIO x 10
INCLINAÇÃO DA RETA
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS:

- os valores de LQ, são maiores que os valores de LD:

as concentrações mínimas para uma detecção segura são
obviamente menores que as concentrações mínimas necessárias a
sua quantificação precisa e exata.
 42.77 TIC = 377
100
m/z 292 ® 176

Relative Intensity (%)

0
42.75
100

TIC = 6.47 x 103

m/z 297 ® 181

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)

Relative ratio (ion 292/ ion 297)

10
2
R = 0.9994
8

20 fmol 6

0
LOUREIRO, A.P.M., MARQUES, S.A., GARCIA, C.C.M.,
DI MASCIO, P.,MEDEIROS, M.H.G. (2002) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Chem. Res. Toxicol., 15, 1302-1308. 2
1,N -e dGuo (fmol)
Exemplo: Curva de Calibração – Medicamento
Dosagens: 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/cpdo
Diluição da Amostra:
0,7
1 cpdo/bv 100 mL
y = 22,484x - 0,0052
0,6 R² = 0,9913

0,5

0,4

Pergunta-se:
0,3 Esta curva é válida para todas as dosagens?

0,2

0,1

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

Exercícios
•Dada a curva de calibração realizada para a análise de uma substância desconhecida ,
responda o que se segue:
Análise da Substância Desconhecida
1
y = 1,0475x + 0,0473
0,8 R² = 0,9842
Absorbância R = 0,9920
0,6

0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentração mg/mL

•O que se entende por linearidade e qual o motivo da realização de uma curva de calibração em controle de qualidade?
•A curva está adequada? Justifique.
•Calcule a concentração para a absorbância 0,400.
•Calcule a possível absorbância para a concentração de 0,12 mg/mL.
•Você utilizaria esta curva para análise de uma substância cuja concentração teórica é de 0,05 mg/ml? Explique.
Exercícios
- O valor obtido está de acordo com a Curva?

Curva de Calibração
0,7
0,6 y = 54,439x + 0,0272
R² = 0,9961
0,5
Absorbância 0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012
Concentração (mg/ml)

Exercícios
1- Obter o valor de concentração para Abs de 0,511
2- Qual o provável valor de absorbância para 0,003 mg/mL?
3- Esta curva é adequada para amostras de concentração 0,015 mg/mL?
Exercícios
•Dada a curva de calibração realizada para a análise de uma substância desconhecida , responda o que se segue:
Análise da Substância Desconhecida
1
y = 1,0475x + 0,0473
0,8 R² = 0,9842
R = 0,9920

Absorbância
0,6
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentração mg/mL

•RESPONDA
•A curva está adequada? Justifique.
•Calcule a concentração para a absorbância 0,400.
•Calcule a possível absorbância para a concentração de 0,12 mg/mL.
•Você utilizaria esta curva para análise de uma substância cuja concentração teórica é de 0,05 mg/ml? Explique.
Uma amostras da substância
Exercícios
•Uma amostras da substância X foi analisada por espectrofotometria.
• Inicialmente realizou-se uma curva de calibração para esta substância.
•Os dados estão mostrados na tabela a seguir:
•Construa a curva de calibração.
•A curva está adequada? Justifique.
•Calcule a concentração da substância X sabendo que sua absorbância foi 0,458.

Concentração (mg/L) Absorbância

0,1 0,378
0,2 0,523
0,4 0,674
0,6 0,809
0,8 0,987
Exercícios
•Uma amostra foi analisada por Cromatografia e no cromatografia o pico do analito
mostrou uma relação sinal ruído de 4 (S/R=4). Explique se esta amostra pode ser
identificada e quantificada corretamente.

•Explique o que se entende por Seletividade/ Especificidade e qual a importância

numa análise de controle de qualidade em indústria farmacêutica.

•Faça um resumo dos principais parâmetros da validação de metodologia analítica.

•Quais os testes que devem ser realizados para o controle de qualidade de formas
farmacêuticas, sólidas, líquidas e semi-sólidas?

•O que se entende por desintegração e dissolução? Como são realizados estes

testes e qual sua importância em relação a absorção do fármaco?