Projeto CEUA Queimadura 3grau Pós AP Corrigido Ana Paula

TÍTULO DO PROJETO Avaliação da matriz dérmica derivada da
pele da tilápia descelularizada no tratamento de

lesões cutâneas causadas por queimaduras de
terceiro grau experimentais.
AUTORA DA PROPOSTA Profa. Dra. Marisa Jadna Silva Frederico
Universidade Federal do Ceará – Núcleo de

INSTITUIÇÃO EXECUTORA/UF
Pesquisa e Desenvolvimento de
Medicamentos
PERÍODO DE VIGÊNCIA
EQUIPE
Marisa Jadna Silva Frederico
Edmar Maciel Lima Júnior
Manoel Odorico de Moraes Filho
Nylane Maria Nunes de Alencar
Carlos Roberto Koscky Paier
Felipe Augusto Rocha Rodrigues
Ana Paula Negreiros Nunes Alves
Rebeca Silva Duarte (Aluna de Iniciação
Científica)
Evanir Lima Teixeira (apoio técnico)
Junior e Alex (apoio técnico)
RESUMO
As queimaduras são um problema de saúde pública global, responsável por cerca de
180.000 mortes anuais e danos de ordem psicológica e social. O tratamento de feridas
causadas por queimaduras de terceiro grau resulta em custos elevados e riscos de
complicações que podem prejudicar a resolução do processo de cicatricial. Estudos
recentes e publicados demonstraram que o curativo oclusivo da pele da tilápia apresentou
boa aderência no leito das feridas causadas por queimaduras de segundo grau superficiais,
em animais, minimizou o exsudato e a formação de crosta interferindo positivamente no
processo cicatricial. Posteriormente, em estudo clínico conduzido em queimaduras
superficiais de segundo grau, o curativo oclusivo da pele de tilápia aumentou a velocidade
de reepitelização e diminuiu o número de troca de curativos, a dor e o desconforto do
tratamento em comparação ao tratamento padrão o que representou uma significativa
redução dos custos. A pele de tilápia possui características microscópicas semelhantes à
estrutura morfológica da pele humana e elevada resistência à tração, o que suporta sua
possível aplicação como biomaterial. Portanto, o objetivo do estudo é avaliar a matriz
dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada no tratamento de lesões cutâneas
causadas por queimaduras de 3° grau experimentais. No modelo pré-clínico as feridas
que mimetizam a queimadura serão produzidas com auxílio de um chapa de alumínio
cirúrgico a uma temperatura de 100°C. Posteriormente será realizada uma excisão no
local da queimadura e as lesões serão tratadas com a matriz dérmica derivada da pele da
tilápia comparada a matrizes dérmicas Integra® e Pelnac® acompanhadas ao longo de 28
dias. O processo cicatricial será avaliado de acordo com os seguintes parâmetros: análise
macroscópica (redução da área lesada) e microscópica através da histologia (presença de
úlcera, infiltrado inflamatório, vascularização e colagênese). Serão realisadas análises

bioquímicas de mediadores inflamatórios (Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL-4),
Interleucina-6 (IL-6), Interferon-γ (IFN- γ), níveis de proteína do fator de necrose tumoral
(TNF-α), interleucina-17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10) e expressão por
imunohistoquímica de TNF-α, IL-1β, TGF-β e α-SMA. Além disso, serão avaliados o
perfil hematológico, a expressão proteica diferencial e alterações epigenéticas nas lesões
tratadas com a matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada. Espera-se que
os resultados obtidos possam agregar informações consistentes e valiosas e que sirvam
de amparo para o uso da Pele de Tilápia como biomaterial, podendo vir a ser utilizado na
cicatrização de feridas, acrescentando soluções que podem ter grande impacto social.
Palavras-chave: matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada. Queimadura
de terceiro grau. Regeneração dérmica.

1. Introdução
As queimaduras são um problema de saúde pública global, responsável por cerca
de 180.000 mortes anuais. A maioria destes ocorre em países de baixa e média renda e
quase dois terços ocorrem nas regiões da África e Sudeste Asiático (Latifi et al., 2017).
A incidência anual de queimaduras nos Estados Unidos é de aproximadamente 486.000,
de acordo com o Repositório Nacional de Queimados da Associação Americana de
Queimados. Aproximadamente 3.275 pessoas perdem suas vidas e 40.000 necessitam de
hospitalização devido a lesões relacionadas à queimadura (American Burn Association,
2016). De forma alarmante, no Brasil acontecem em torno de 1.000.000 de incidentes
por queimaduras ao ano, sendo que 100.000 pacientes buscaram atendimento hospitalar
e, destes, cerca de 2.500 pacientes irão a óbito direta ou indiretamente em função de
suas lesões (Ministério da Saúde, 2017).
As queimaduras afetam diretamente a pele, o maior órgão do corpo humano,
abrangendo aproximadamente 1,5-2,0 m2 para um adulto. A pele funciona como uma
barreira defensiva contra materiais estranhos auxiliando na termorregulação, previnindo
a perda por evaporação de fluidos, atua como órgão sensorial e desempenha um papel na
produção de vitamina D. É composta de três camadas: a epiderme, a derme e a
hipoderme. A epiderme é a camada mais externa, enquanto a derme está entre a epiderme
e a hipoderme. A derme papilar, isto é, a camada dérmica superior; consiste em redes
capilares e fibras de colágeno dispostas de maneira frouxa. A derme reticular, ou seja,
camada dérmica inferior; contêm vasos sanguíneos, nervos, raízes dos folículos pilosos,
glândulas sebáceas e sudoríparas e fibras de colágeno que se encontram densamente
compactadas e fornecem suporte nutricional e estrutural à epiderme. A camada mais
interna é a hipoderme, que consiste em tecido adiposo subcutâneo e vasos sanguíneos e
linfáticos associados. Esta camada fornece isolamento, amortecimento de insultos

traumáticos, flutuabilidade no corpo e possui algumas funções endócrinas (Serrano et al.,
2015)
As queimaduras podem ser causadas por diversos mecanismos, incluindo chama,
escaldadura, química, elétrica e radiação. As feridas causadas por queimaduras são
classificadas com base na profundidade como superficial (primeiro grau), de espessura
parcial (segundo grau) e de espessura total ou profundas (terceiro grau). Um exemplo de
queimadura de primeiro grau comum é a queimadura solar, que dentro de 7 dias, apresenta
auto resolução através da proliferação de queratinócitos e da diferenciação das células
epiteliais basais. As queimaduras superficiais de espessura parcial envolvem a epiderme
e a derme papilar e são dolorosas ao toque. As queimaduras de espessura parcial profunda
envolvem a derme reticular, incluindo as estruturas anexiais, enquanto que as
queimaduras de espessura total envolvem toda a epiderme e a derme e também podem
afetar o tecido adiposo subcutâneo, músculo ou até estruturas ósseas (Serrano et al.,
2015).
Indivíduos acometidos por queimaduras de terceiro grau profundas e extensas
apresentam perda significativa de tecido epitelial. A falta total da pele resulta em perdas
hídricas e deixa o organismo mais susceptível a infecções. A ferida pode se tornar
rapidamente colonizada por um grande número de patógenos, imediatamente após a
lesão, devido ao comprometimento da função de barreira da pele. Além disso, a resposta
imune bifásica, hiperinflamação aguda seguida de imunossupressão, observada em
queimaduras, deixa o paciente incapaz de combater a infecção. Deste modo, após a lesão
inicial da queimadura, a infecção é a principal causa de morte e morbidade, com 51% das
mortes atribuídas à sepse subjacente (Greenhalgh et al., 2007; Krishnan et al., 2013).
Quando estes pacientes sobrevivem, após tratamento intensivo e prolongado, se deparam
com cicatrizes desfigurantes, não funcionais e contraturas graves da pele. O manejo das
feridas nas lesões por queimaduras muitas vezes requer múltiplas cirurgias e enxertos,
que podem resultar em longas internações hospitalares e tratamentos nas unidades de
terapia intensiva (Sanchez et al., 2014).
Quando a pele é lesionada como resultado de trauma, cirurgia ou queimadura, a
ferida é considerada aguda. A cicatrização de feridas é uma sequência orquestrada de
eventos envolvendo sinais químicos, moléculas da matriz extracelular (MME) e uma
ampla gama de tipos de células. A cicatrização aguda da ferida segue uma cascata de
eventos complexos e sobrepostos, que consiste em hemostasia, inflamação, proliferação
celular e remodelação da matriz do local da ferida (Lazarus et al., 1994). O fechamento
de feridas, geralmente aceito como reepitelização completa, é o objetivo da fase de
proliferação celular. O restabelecimento da camada epidérmica é fundamental na
regeneração da barreira protetora da pele, prevenindo a infecção e limitando a perda de
fluidos. Em poucos dias após a lesão, os fibroblastos migram para a ferida e depositam
grandes quantidades de MME consistindo primeiro em colágeno tipo III relativamente
desorganizado, com o conteúdo de colágeno da ferida atingindo seu pico 2 a 3 semanas
após a lesão. Esses fibroblastos muitas vezes se diferenciam em miofibroblastos, que
possuem um fenótipo contrátil e são fáceis de identificar devido à sua expressão de α-
SMA (alfa actina do músculo liso). Novos vasos sanguíneos são formados por células
endoteliais invasoras em toda a MME para fornecer nutrientes ao recém-formado tecido
de granulação. À medida que o tecido de granulação preenche a ferida, os queratinócitos
nas bordas da ferida migram e proliferam sobre a parte superior da ferida até que ocorra
o fechamento da ferida (Werner e Grose, 2003).
Clinicamente, o manuseio de queimaduras ocorre durante a fase aguda (em poucos
dias) da queimadura e envolve a excisão tangencial do tecido necrótico até a hemorragia
punctiforme no leito da ferida ser visível, seguida pela aplicação imediata de enxerto de
pele autólogo permanente ou substituto temporário da pele. É bem aceito que a excisão
precoce e a cobertura imediata da ferida atenuam a resposta inflamatória da queimadura,
diminuem o risco de infecção e levam a melhores resultados de cicatrização. Infelizmente,
a excisão da queimadura é frequentemente acompanhada por grandes quantidades de
perda de sangue e hipotermia, que limitam a quantidade de tecido que pode ser extraído
por operação (Zuo et al., 2017).
Na década de 1980, surgiram as primeiras coberturas definitivas para feridas com
áreas extensas em pacientes queimados, as matrizes dérmicas. Exemplos destas matrizes
são o Integra®, a Matriderm® e o Pelnac®. Estes materiais devem permanecer estáveis
no leito da ferida até o processo de formação da neoderme (Burke et al., 1981).
A matriz de regeneração conhecida como Integra® (Life Science Corp.,
Plainsboro, New Jersey, USA.) é composta de colágeno tipo I de tendão bovino,
glicosaminoglicanos e condroitina-6-sulfato proveniente da cartilagem de tubarão. Possui
película externa de silicone para proteção quanto à perda de água e invasão por bactérias.
O tamanho poro do Integra® é de 70 a 200 µm (Auxenfans et al., 2009) importante para
uma adequada arquitetura da neoderme (Burke et al., 1981), pois permite o influxo de
fibroblastos (Nuutila et al., 2018). Após aproximadamente três semanas, a matriz torna-
se vascularizada pela migração de brotos capilares do leito da ferida e está pronta pra
receber o enxerto de pele, no caso das matrizes em dois tempos (Bloemen et al., 2010).
Mais recentemente, foi desenvolvido o Integra® Single Layer para ser utilizado em um
único tempo, e o Integra® Flowable para ser aplicado em feridas com formações de
crateras, ou seja, tunelizadas, pois trata-se de uma matriz pastosa dispersível. Como a
matriz simula uma derme humana, é possível a colocação de enxertos de pele mais finos,
o que reduz o dano da área doadora. Alguns estudos relatam que o uso de matriz dérmica
reduziu a formação de cicatriz e aumentou a remodelação da matriz extracelular e a

regeneração da elastina (Dantzer et al., 2003). Desta forma estudos demostram que o uso
de Integra® em sequelas de queimaduras, apresentam menor contração do enxerto e deste
modo uma qualidade da pele satisfatória (Dantzer e Braye, 2001).
Matriderm® (Dr. Suwelack Skin and Health Care AG, Billerbeck, Germany):
composta por fibra de colágeno tipo I (não reticulada) revestida com α-elastina
hidrolisada, extraída do ligamento nucal de bovinos. Está disponível para uso o
Matriderm® de 1 mm e 2 mm. Com o Matriderm® de 2 mm, o fabricante recomenda o
uso de terapia por pressão negativa associada. O procedimento cirúrgico é realizado em
tempo único com a aposição do enxerto de pele parcial sobre a matriz dérmica
(Kolokythas et al., 2008).
O Pelnac® (Gunze Medical Materials Center, Kyoto, Japan) é uma matriz de
colágeno liofilizado com 2 mm de espessura, derivado do atelocolágeno do tendão de
suínos e possui ligações cruzadas do colágeno para prevenir contração por meio da
inibição da sua degradação (Kolokythas et al., 2008). Também possui estrutura bilaminar,
com lâmina externa de silicone, sendo uma matriz de dois tempos. Alguns trabalhos
descreveram o uso de Pelnac® na reconstrução de defeitos de espessura total da pele
(Soejima et al., 2006). Estudos demostram que a associação da matriz Pelnac® com o
VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) promove vascularização, aumento do
tecido de granulação e da epitelização em suínos diabéticos (Suzuki et al., 2000).
Ainda não existe no mercado um substituto dérmico ideal. Quanto ao manuseio,
podemos dizer que o mais satisfatório está relacionado com a matriz Integra®. Sua
adaptabilidade ao leito das feridas e sua maleabilidade (evitando a formação de tendas
em defeitos com superfície irregular) conferem importantes vantagens a essa matriz. A
lâmina de silicone do Integra®, quando comparada com a do Pelnac®, permanece por
mais tempo aderida ao colágeno da matriz. Em alguns casos, existem relatos de que a
lâmina de silicone do Pelnac® soltou-se ou rasgou parcialmente antes do segundo tempo
da cirurgia, o que pode comprometer a função de barreira da lâmina. Além disso, foi
relatado que o manuseio do Pelnac® e do Matriderm® deve ser muito cuidadoso, uma
vez que qualquer mínima fricção (inclusive quando já aplicado no leito da ferida) pode
causar dano à integridade da matriz. Na grande maioria dos casos, mesmo quando a
contração do enxerto de pele foi considerada intensa, os pacientes relataram melhora
funcional. Alguns pacientes também referiram importante melhora da dor e do prurido
após a cirurgia. Ainda, uso das matrizes dérmicas não mostraram melhores resultados em
relação ao grupo do enxerto de pele sem matriz (grupo Controle) no quesito contração do
enxerto de pele (Corrêa, 2018).
As características para uma cobertura dérmica ideal é ter baixo custo, longa vida
útil, durável, flexível, capacidade de prevenção de perda de água, barreira contra
microrganismos, adaptação a superfícies irregulares, fácil manuseio, seguro, crescimento
com a criança, aplicação em uma única operação, possibilidade de evitar surgimento de
cicatriz hipertrófica ou contraturas (Dagalakis et al., 1980). Com o objetivo de encontrar
uma cobertura dérmica ideal, a pele de peixe tilápia-do-Nilo (Oreochromis niloticus)
considerada apenas um rejeito dos frigoríficos vem ganhando cada vez mais finalidades
nobres na medicina.
Estudos foram conduzidos para converter a pele da Tilápia-do-Nilo em um
curativo biológico para feridas causadas por queimaduras. Com este intuito, a pele da
tilápia foi conservada em glicerol de acordo com método de preservação de pele humana
empregado em Bancos de Pele da Europa (De Backere, 1994). O curativo foi produzido
pelo do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Medicamentos (NPDM) e está de
acordo com os critérios de segurança da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) quanto aos parâmetros de resistência e extensão à tração em quebra nos

ensaios tensiométricos, manutenção das propriedades após esterilização por irradiação e
ausência de sinais infecciosos (Alves et al., 2018). Além disso, a pele de tilápia possui
alta quantidade de colágeno tipo I e estrutura morfológica semelhante à pele humana, por
isso tem sido sugerida como um potencial xenoenxerto para o manejo de queimaduras. A
partir destes dados, o curativo biológico oclusivo da pele da tilapia foi avaliado para o
tratamento de queimaduras de segundo grau superficiais em ratos Wistar. O curativo
biológico mostrou boa aderência ao leito da ferida e não provocou alterações nas funções
hepática, renal e no hemograma dos animais (Lima Júnior et al., 2017). Além disso, sua
eficácia foi superior ao tratamento convencional com o antimicrobiano sulfadiazina de
prata. Tais resultados encorajaram a realização dos estudos clínicos de Fase I em 2016,
para avaliar a segurança e o potencial de irritabilidade e sensibilização cutânea da pele de
Tilápia em humanos. O estudo, foi executado pela empresa Allergisa (Campinas - SP), e
os resultados demonstraram a segurança da pele de Tilápia para aplicação em seres
humanos, em razão da ausência de irritação e sensibilização significativa dos sujeitos
saudáveis da pesquisa (dados não publicados).
A Fase Clínica II foi iniciada em julho de 2016, no Instituto Dr. José Frota,
hospital público de Fortaleza, um dos maiores serviços de queimados da região Nordeste
e do Brasil. Nesta etapa, foram incluídos 60 pacientes com queimaduras de segundo grau
superficial e profundo, com tratamento ambulatorial e internado. Os resultados foram
animadores: a pele da tilápia teve ótima aderência ao leito da ferida, evitando a
contaminação externa, a perda de líquidos e não demandou remoção (troca de curativos),
permanecendo no leito da ferida até a completa cicatrização das queimaduras de segundo
grau superficial (Figura 1). Ainda, foi relatado que nas queimaduras de segundo grau
profundo foi necessário realizar uma ou duas trocas simples de curativo, visto que a pele
xenográfica inicial se desprendia espontaneamente da ferida antes da troca. O estudo

demonstrou diminuição da dor e do desconforto no tratamento com a pele da tilápia,
menor trabalho da equipe e redução dos custos em 57,38% no ambulatório (dados
submetidos a publicação). Apesar do estudo fase II com adultos ainda estar em processo
de revisão em um periódico internacional, parte dos achados aqui descritos estão
presentes em um relato de caso publicado recentemente (Lima Júnior et al., 2019). Em
outro relato de caso já aceito, contribuiu para reduzir as limitações em relação às áreas
anatômicas apropriadas para a aplicação da pele de tilápia, uma vez que, mesmo com a
necessidade de reposição de pele, foram obtidos bons resultados com aplicação na
genitália e região inguinal (Lima Júnior et al., 2019).
Figura 1. Queimadura de 2º grau superficial ambulatorial tratada com curativo biológico

oclusivo de pele de tilápia antes, durante e após o tratamento.
O ensaio clínico de Fase III foi iniciado em abril de 2017 e concluído em 2018
no Instituto José Frota, com 120 pacientes adultos vítimas de queimaduras de segundo
grau superficial, em tratamento ambulatorial. Neste grupo foi realizado um estudo de
custos comparativo com o tratamento convencional, sulfadiazina de prata, que revelou
uma redução de custos de 50,42%. Outro estudo quantitativo e comparativo da dor
mostrou uma redução acentuada em relação ao tratamento convencional, devido a não
necessidade de trocas de curativos. Seguindo, o uso da pele de tilápia como curativo
oclusivo em queimaduras pediátricas foi concluído com êxito em 30 crianças internadas
com queimaduras de segundo grau superficial, confirmando os resultados anteriores e o
grande benefício do uso do curativo oclusivo da pele da tilápia nestas lesões (Costa et al.,
2019). A conclusão desses estudos permitiu a aprovação e registro do curativo biológico
de pele de Tilápia pela ANVISA.
Durante a condução dos estudos, melhoramentos quanto à conservação do
curativo foram realizados, o que permitiu sua armazenagem e a estabilidade deste por um
período de até dois anos sem a perda das suas propriedades terapêuticas (Alves et al.,
2018). O novo formato do curativo corresponde a pele da tilápia liofilizada, na qual esta
se encontra esterilizada quimicamente com digluconato de clorexidina e fisicamente por
irradiação gama, associada aos antibióticos penicilina e estreptomicina e embalada a
vácuo. No processo de liofilização a pele da tilápia é desitratada, e perde cerca de 85 a
90% do conteúdo de água total do tecido da pele. A pele liofilizada possui atividade de
água de 0,5 em média, o que garante a sua estabilidade microbiológica e aumenta a sua
vida útil. Além disso, o baixo conteúdo de água do tecido evita a ocorrência da reação de
hidrólise e a embalagem a vácuo diminui o contato com o oxigênio atmosférico, evitando
a oxidação do produto.
O sucesso do uso da pele da tilápia em queimaduras levou os pesquisadores da
ginecologia a testar ambos os curativos de pele da tilápia (conservada em glicerol e o
liofilizado) na rara Síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster Hauser, um raro distúrbio
congênito, que faz nascer sem o canal vaginal ou com ele pouco desenvolvido. Além
disso, o curativo oclusivo da pele da tilápia liofilizado foi utilizado em casos de
reconstrução da vagina por causa de sequelas de um câncer ginecológico e em cirurgia de
redesignação sexual. Foi relatado que, o colágeno, material abundante na pele da tilápia
é absorvido e esta pele torna-se aderida a mucosa vaginal. Deste modo, o epitélio da pele
de tilápia funciona como arcabouço e suporte para o desenvolvimento do epitélio vaginal,
com elasticidade, dimensão e funcionalidade adequadas. Nestes estudos foi constatado
que o curativo biológico da pele de tilápia permite uma operação mais simples, rápida e
menos invasiva (Pinto Medeiros Dias et al., 2019). Tal fato motivou nosso grupo de
pesquisa a desenvolver uma matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada.
A partir disso, um método foi executado para padronização desta matriz dérmica
(Scaffold), que podem ser utilizadas mundialmente como biomateriais de suporte em
diversas especialidades cirúrgicas e em queimaduras de terceiro e sequelas de
queimaduras. Visto que as matrizes dérmicas comerciais atualmente disponíveis
apresentam uma serie de efeitos indesejáveis e alto custo (Corrêa, 2018), o presente
projeto pretende testar a pele da tilápia descelularizada como matriz dérmica no
tratamento de queimaduras de terceiro grau.

Objetivo Geral
✓ Avaliar a eficácia da matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada
comparada a matriz dérmica comercial (Integra®) e Pelnac®, em modelo
experimental de queimadura de 3°grau;
Objetivos específicos
✓ Avaliar a contração de lesões tratadas com a matriz dérmica derivada da pele da
tilápia descelularizada em modelo de cicatrização in vivo;
✓ Avaliar a aderência ou rejeição da matriz ao leito da ferida, bem como a presença
de secreção ou infecção;
✓ Investigar os parâmetros histológicos e imunohistoquímicos (fibroplasia,
colagênese, reepitelização, edema) de lesões tratadas com a matriz dérmica
derivada da pele da tilápia descelularizada;
✓ Investigar o perfil de citocinas Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL-4),
Interleucina-6 (IL-6), Interferon-γ (IFN- γ), níveis de proteína do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10) das lesões
tratadas com a matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada;
✓ Avaliar o perfil hematológico completo dos animais submetidos ao tratamento
lesões tratadas com a matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada;
✓ Avaliar a expressão proteica diferencial nas lesões tratadas com a matriz dérmica
derivada da pele da tilápia descelularizada, para verificar via molecular o padrão
de regeneração das queimaduras.

✓ Avaliar o perfil molecular do padrão de metilação do DNA nas lesões tratadas
com matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada para identificar
mudanças epigenéticas no funcionamento de um gene.

2. Materiais e Métodos
Resumo esquemático do delineamento experimental
Figura 2. Etapas propostas e critérios para avaliação da eficácia e mecanismo de ação

da matriz dérmica derivada da pele da tilápia.
Preparo da matriz dérmica derivada da pele da tilápia
As peles de tilápia serão retiradas mecanicamente dos peixes na piscicultura,
lavadas em água corrente e armazenadas em recipientes plásticos estéreis refrigeração a
no gelo (-2°C). Este material será transportado ao laboratório de Cicatrização localizado
no NPDM, local onde ocorre o processamento das peles de tilápia. As peles serão
raspadas para retirada de fragmentos de tecidos, lavadas em soro fisiológico estéril e
congeladas para armazenamento. Posteriormente, serão descongeladas e incubadas em
solução de detergente não iônico 0,1 - 5% (v/v) sob agitação vigorosa a 37°C, por 2 a 16
h. Após, lavagens em água estéril para retirada do detergente, as peles serão incubadas
em tampão fisiológico sob agitação vigorosa por 30 - 60 min, por duas vezes. Em seguida
as peles serão incubadas em tampão fosfato com protease a 0,05% (m/v) por 1 a 5 h a
37°C, sob agitação suave. As peles serão lavadas novamente em soro fisiológico estéril e
branqueadas em solução diluída de peróxido de hidrogênio, sob agitação. O excesso de
solução branqueadora será retirado e as peles serão novamente lavadas em soro
fisiológico, e incubadas com digluconato de clorexidina 5 - 15% (m/v) por 30 - 60 min a
25°C, sob agitação vigorosa. As peles serão novamente lavadas em solução fisiológica e
posteriormente incubadas com tampão de pH levemente ácido a 37°C, sob agitação
vigorosa, por 30 - 60 min. Este processo será repetido 3 a 5 vezes. Finalmente, a pele
descelularizada será submetida a lavagens extensivas (5 - 10 lavagens por 1 h) com
tampão fisiológico a 37°C, sob agitação vigorosa. As peles descelularizadas serão
congeladas a -80°C por pelo menos 16h, liofilizadas até atingirem umidade satisfatória,
embaladas a vácuo e irradiadas para esterilização completa (Keane et al., 2015).
Animais
Serão utilizados 75 ratos Wistar machos (48-50 dias) de elevado padrão sanitário
(SPF, Specific Pathogen Free), machos, pesando entre 180 – 200 g, de procedência da
Charles River. Os animais serão mantidos no biotério do Núcleo de Pesquisa e
Desenvolvimento de Medicamentos (NPDM), sob temperatura controlada de 21°C,
umidade de 60-65% e ciclo claro escuro de 12 horas acordo com a Lei Arouca n.º
11.794/08. O delineamento do estudo será realizado seguindo as recomendações da
“Animal Research: Reporting In Vivo Experiments”(ARRIVE), com relação aos
cuidados necessários descritos no plano de estudo (cálculo do tamanho da amostra,
experimento realizado de maneira cega, tratamento estatístico correto) de forma a reduzir
resultados falsos positivos e/ou negativos, procurando reduzir o máximo possível as
variáveis experimentais, permitindo a reprodutibilidade e a rastreabilidade dos resultados
obtidos nos estudos in vivo (Kilkenny et al., 2011).

Protocolo de indução da ferida de terceiro grau e delineamento experimental
A queimadura de terceiro grau é confirmada pela destruição total da epiderme e
da derme em cortes de tecido corados com hematoxilina e eosina. Neste sentido, para
padronizar a técnica em nosso laboratório, apenas 3 ratos serão pesados e em seguida será
administrada cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ambos por via i.p. Um
analgésico opióide, a buprenorfina, 1,5 mg/kg será administrada por via subcutanea para
completa analgesia e recuperação do procedimento cirúrgico (Instrução Normativa
CONCEA 33/2016), de 12 em 12 h por 1 dia. Os animais serão imobilizados em decúbito
ventral, realizando-se a tricotomia digital dos pelos do dorso, em uma área de
aproximadamente 16,0 cm2 (4,0 cm x 4,0 cm). Em seguida, será utilizado um gabarito de
acetato de celulose, para demarcar na região dorsal (com caneta permanente) um
quadrado de 3,0 x 3,0 cm. Posteriormente, proceder-se-á queimadura de 3º grau, com
chapa de alumínio de 9,0 cm2 (3,0 cm2 x 3 cm2), aquecida a 100°C, pressionada na pele
do dorso por 30 segundos (Pezeshki-Modaress et al., 2014; Oryan et al., 2018;
Haghshenas et al., 2019). Após 48 horas deste procedimento três animais serão
eutanasiados e as feridas serão examinadas pela coloração com hematoxilina e eosina
(H&E) para avaliar a profundidade do dano na pele e seus anexos.
Realizado este passo, inicia-se o experimento com 40 animais. Nestes, a
queimadura de terceiro grau preceder-se-á conforme descrito acima. Quatro dias após a
queimadura, os animais serão anestesiados (cetamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg i.p.)
e será realizada uma excisão cirúrgica de espessura total (9 cm2 de área) do tecido
necrótico até a hemorragia punctiforme no leito da ferida ser visível. Buprenorfina, 1,5
mg/kg via s.c. será administrada antes do desbridamento das feridas queimadas por um
dia. No mesmo dia os animais serão divididos em grupos de 10 de acordo com os
tratamentos:
Grupo C1: Após a excisão, as feridas serão limpas diariamente com solução salina
isotônica de NaCl.
Grupo C2: Após a excisão, as feridas serão limpas com solução salina isotônica de
NaCl e em seguida, será aplicado uma camada do scaffold comercial (Integra®),
suficiente para cobrir as feridas por completo.
Grupo C3: Após a excisão, as feridas serão limpas com solução salina isotônica de
NaCl e em seguida, será aplicado uma camada do scaffold comercial (Pelnac®),
suficiente para cobrir as feridas por completo.
Grupo T1: Após a excisão, as feridas serão limpas com solução salina isotônica de
NaCl e em seguida, será aplicado a matriz dérmica derivada da pele da tilápia
descelularizada, suficiente para cobrir as feridas por completo.
Análise macroscópica das feridas excisionais
A área das feridas excisionais será estimada nos dias 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 e 28
(Lima-Junior et al., 2017) após a cirugia, através da mensuração dos diâmetros horizontal
e vertical, com o auxílio de um paquímetro e, do cálculo da área pela equação: A = π.R.r
onde “A” representa a área, “R” o raio maior e “r” o raio menor da ferida. A evolução do
ferimento para a cicatrização também será acompanhada pelo surgimento do tecido
cicatricial em substituição à área lesionada a partir da abertura do curativo, que será
renovado quando necessário (Romana-Souza et al., 2010).
Análise histológica das feridas excisionais
As análises microscópicas de feridas excisionais serão realizadas no intuito de
verificar o efeito do tratamento com a matriz dérmica derivada da pele da tilápia
descelularizada nas diferentes etapas do processo cicatricial. Nos dias 0, 14 e 28 (Fatemi

et al., 2018) serão retirados aproximadamente 2 fragmentos cilíndricos do tecido
neoformado sobre a região da cirurgia (n=6/grupo/dia). Este procedimento será realizado
com a utilização de “punch” de 8 mm de diâmetro. Após a coleta dos tecidos os animais
serão submetidos à eutanásia por superdosagem de anestésico (xilazina+cetamina).
Confecção das Lâminas Histológicas
Os fragmentos do tecido serão imersos em formol neutro a 10% por 48 horas.
Quarenta e oito horas depois, os mesmos serão lavados em água corrente e analisados
macroscopicamente, sendo examinadas alterações na forma, coloração e consistência.
Posteriormente, as peças serão seccionadas, colocadas em cassetes e seguidas para
processamento histotécnico automatizado PT05 LupTec® passando por desidratação em
série alcoólica crescente, diafanização em xilol, impregnação em parafina, fundição a
60ºC e inclusão dos espécimes formando blocos parafinados à temperatura ambiente.
Os fragmentos serão seccionados com 5 µm de espessura e corados utilizando a
coloração de rotina para histologia hematoxilina-eosina (H&E) e montadas em bálsamo
de Canadá (Junqueira, Junqueira, 1983) para análise em microscópio de luz convencional
para avaliar os escores de cicatrização e PicroSirius para avaliar quantidade de colágeno
e a fibroplasia. A partir das lâminas histológicas, fotomicrografias serão obtidas por um
microscópio óptico, acoplado a uma câmera digital de alta resolução (Leica, 2000). As
imagens capturadas serão salvas em formato JPEG e analisadas pelo software ImageJ
1.43 (U.S. National Institutes of Health, USA).
Avaliação por hematoxilina-eosina
Escores de análise de cicatrização serão avaliados de acordo com Cavalcante et al
2011.
0: Sem úlcera + epitélio normal + hiperceratose / conjuntivo remodelado
1: Sem úlcera + epitélio atrófico + hiperceratose / fibrose + discreto a moderado
infiltrado inflamatório crônico
2: Superfície desnuda de epitélio / fibrose + discreto a moderado infiltrado
inflamatório crônico
3: Com úlcera / tecido de granulação (fibroblasto, neoformação vascular, linfócito,
plasmócto e macrófago)
4: Com úlcera / infiltrado inflamatório agudo (ectasia, vasos dilatados, infiltrado
leucocitário misto)
Coloração de Picrocírius Red
A fibroplasia traduz-se pela proliferação de fibroblastos e sua migração para o
interior da ferida. Por sua vez a deposição de colágeno no leito de uma lesão ocorre como
consequência da proliferação e migração de fibroblastos, fenômeno este conhecido como
colagênese. Deste modo, essa coloração contribui para a melhor compreensão da
participação dos fibroblastos e a deposição de colágeno na biologia dos tecidos e na
patologia.
As lâminas serão confeccionadas através de cortes de 3 μm dos blocos parafinados
selecionados. Será realizada a desparafinização em estufa a 60ºC por 3h, seguida de 3
(três) banhos de 5 minutos em xilol, reidratação em solução de etanol decrescente (90%,
85% e 70%), com posterior lavagem com água, incubação em solução de picrosirius
(ScyTek®) por 30 minutos e realização de dois banhos de ácido clorídrico 5%. A contra-
coloração dos espécimes será feita com hematoxilina de Harris por 45 segundos e, em
seguida, realizar-se-á montagem com Enthellan®.

A avaliação dos resultados será realizada primeiramente pela seleção de cinco
campos das lâminas em um aumento de 400x, os quais serão fotografados com uso de
câmera DFC 295, acoplada ao Microscópio Leica® DM 2000, seguida pelas análises das
fotomicrografias pelo software Image J® (RSB). As fotomicrografias serão tomadas em
luz convencional e em luz polarizada em cada campo no maior aumento (400x).
Após a tomada da fotomicrografia em luz convencional, deve-se realizar a
calibração das imagens pelo comando Color Thershold (Image>Adjust> Color Thersold)
na função RGB, para as cores Vermelho (Mínimo de 71 e Máximo de 255), Verde
(Mínimo de 0 e Máximo de 69) e Azul (Mínimo de 0 e Máximo de 92).
Após a calibração, as imagens serão convertidas para a escala de cor de 8-bits
(Image>Type> 8-bit), binarizadas (Process>Binary>MakeBinary) e mensuradas através
da porcentagem de área de colágeno marcada em vermelho (Analyse>AnalyseParticles).
As imagens em luz polarizada seguirão o mesmo protocolo na função RGB para
Vermelho (Mínimo de 0 e Máximo de 255), Verde (Mínimo de 0 e Máximo de 255) e
Azul (Mínimo de 0 e Máximo de 32). Após ajuste, as imagens serão convertidas para a
escala de cor de 8-bits (Image>Type> 8-bit), binarizadas (Process>Binary>MakeBinary),
e mensuradas através da porcentagem de área de colágeno com birrefringência amarelo-
avermelhado (compatível com colágeno tipo I). Em seguida, do total da área marcada em
vermelho, será separado um percentual da região ocupada somente pela birrefringência
amarelo-avermelhada. A área verde-esbranquiçada, relativa ao colágeno tipo III, será
obtida pela subtração da região total marcada em vermelho e o percentual marcado
unicamente pela cor amarela-avermelhada.
Coloração de Tricrômico de Masson
Essa coloração contribui para a melhor diferenciação da formação e deposição de
colágeno. As lâminas serão confeccionadas através de cortes de 3 μm dos blocos seguida

de desparafinização em estufa a 60ºC por 3h, três banhos de 5 minutos em xilol,
reidratação em solução de etanol decrescente (90%, 85% e 70%), com posterior lavagem
com água, incubação em solução de Bouin (Ácido Pícrico 75mL, Formaldeído PA 25
mL, Ácido acético glacial 5mL) por 60 minutos.
Após lavagem em água corrente para retirar o excesso dos corantes, as lâminas
serão incubadas por 10 minutos na Hematoxilina Férrica de Weigert (Hematoxilna 1g,
Álcool 95% 100mL, Solução aquosa de Cloreto Férrico a 29% 4mL, Água destilada
95mL, Ácido Clorídrico Concentrado 1mL) e novamente lavadas por 10 minutos e
incubação em Escarlate de Biebrich (Solução aquosa de Escarlate de Biebrich 1% 90mL,
Solução aquosa de Fucsina Ácida 1% 10mL, Ácido Acético Glacial 1mL). Após
diferenciação em Fosfotúngstico-Fosfomolíbdico (Ácido Fosfotúngstico 2,5g, Ácido
Fosfomolíbdico 2,5g, água destilada 100mL) durante 10 a 15 minutos, as lâminas serão
coradas com Azul de Anilina (Azul de Anilina 2,5g, Ácido Acético Glacial 2mL, Água
destilada 100mL) durante 5 a 10 minutos. Em seguida, as lâminas serão passadas em
solução de Ácido Acético Glacial 1% por 3 a 5 minutos, desidratadas, diafanizadas e
montadas com Enthelam®.
campos das lâminas em um aumento de 400x, os quais serão fotografados com uso de
câmera DFC 295, acoplada ao Microscópio Leica® DM 2000, seguida pelas análises das
fotomicrografias pelo software Image J® (RSB). As fotomicrografias serão tomadas em
luz convencional e após a tomada da fotomicrografia em luz convencional, deve-se
realizar a calibração das imagens pelo comando Color Thershold (Image>Adjust> Color
Thersold) na função RGB, para segregação das cores azul e vermelho e avaliação do
percentual de cada uma das cores.
Imunohistoquímica
Os blocos parafinados selecionados serão submetidos a cortes de 3µm dispostos
sobre lâminas silanizadas. A reação de imunohistoquímica será realizada através da
técnica da estreptavidina-biotinilada e os seguintes anticorpos primários serão avaliados:
TNF-α, IL-1β, α-SMA, TGF-β1. O protocolo da reação de imunhistoquímica adotado
seguirá os passos abaixo:
1. Desparafinização e reidratação, como anteriormente descrito;
2. Recuperação antigênica, através de imersão em solução tampão de citrato 10
mM (ph = 6,0) em aquecimento por 20 minutos;
3. Bloqueio da peroxidase com peróxido de hidrogênio a 3% diluído em solução
tampão de fosfato (PBS) por 30 minutos;
4. Duas lavagens de 5 minutos com PBS ;
5. Incubação com anticorpo primário nas diluições propostas pelo facricante,
overnight em geladeira;
6. Duas lavagens de 5 minutos com PBS;
7. Incubação com anticorpo secundário biotinilado (Histofine® ou HRP-Dako®);
8. Duas lavagens de 5 minutos com PBS;
9. Revelação com 3,3-diamino-benzidina (DAB) por 5 minutos (Dako®) em
ambiente escuro;
10. Contra-coloração com Hematoxilina de Harris por 10 segundos
11. Desidratação em série crescente de álcool, diafanização em xilol e montagem
com Enthellan®.
✓ Como controle positivo será utilizado _____________, e, controle negativo será
feito através da supressão do anticorpo primário da reação em um dos cortes.

campos das lâminas utilizadas em um aumento de 400x, os quais serão fotografados com
uso de câmera DFC 295, acoplada ao Microscópio Leica® DM 2000, seguida pelas
análises das fotomicrografias pelo software Image J® (RSB). As fotomicrografias serão
tomadas em luz convencional e células com marcação citoplasmática, membranar,
nuclear e sem marcação serão contadas através da ferramenta “Cell Counter” do software
ImageJ®, para cálculo do percentual médio de células imuno-positivas para cada
marcador.
Avaliação de edema
Apenas no dia 2 do tratatamento a permeabilidade vascular será avaliada
indiretamente pela quantificação do extravasamento de proteínas plasmáticas das úlceras
dos animais. Para tanto, uma hora antes da eutanásia todos os animais receberão azul de
Evans (25 mg/kg), e.v., via veia dorsal peniana. Posteriormente as úlceras serão
removidas em anéis, medindo 8 mm de diamentro utilizando um punch dermatológico
igual diçamento e 3 mm em sua profundidade utilizando um paquímetro digital.
Em seguida os tecidos serão pesados (Média ± E.P.M.) e incubados em 1,5 mL de
formamida concentrada a 37 °C por 72h. A quantificação do azul de Evans extraído dos
tecidos será realizada por espectofotometria (A600nm) e os dados foram expressos como
µg de azul de Evans/g tecido, através de regressão linear baseado em uma curva padrão
de azul de Evans.
Coleta de Sangue e Avaliação de Parâmetros Hematológicos e Bioquímicos
Após o tratamento, os animais serão anestesiados com uma associação de
cloridrato de xilasina (10 mg/kg) e cloridrato de cetamina (90 mg/kg) por via
intraperitoneal, para coleta de sangue via punção da veia cava abdominal para avaliação
dos parâmetros hematológicos (Leucócitos, Linfócitos, Monócitos, Granulócitos,
Reticulócitos, Hemoglobina (HGB), Hematócrito (HCT), Plaquetas), e bioquímicos
(bilirrubina total, bilirrubina direta, Alanino aminotransferase (ALT), Aspartato
aminotransferase (AST), Creatinina, Ureia e Glicose) dos grupos nos dias 0, 2, 14 e 28
de tratamento.
Análise do Perfil de Citocinas
O kit de citocina Th1 / Th2 / Th17 de camundongo CBA BD ™ será usado para
medir citocinas Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-6 (IL-6),
Interferon-γ (IFN- γ), níveis de proteína do fator de necrose tumoral (TNF), interleucina-
17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10) por citometria de fluxo, conforme as instruções
do fabricante nos dias 2, 14 e 28 de tratamento.
Análise Proteômica
Os biomateriais serão analisados em abordagem proteômica shotgun ao longo do
tratamento (2, 14 e 28 dias). O tecido fibrótico que eventualmente crescer em torno dos
biomateriais inseridos também será analisado, ou o tecido normal adjacente.
Suscintamente, as biópsias deverão ser lavadas com PBS gelado e ressuspendidas em
tampão de lise gelado (Tris-HCl 50 mM pH 8,2; NaCl 75,0 mM; uréia 8,0 M; NaF 1,0
mM; β-glicerofosfato 1,0 mM; Na3VO4 1,0 mM; Na4P2O7 10,0 mM; PMSF 1,0 mM e
coquetel de inibidores de protease obtido da Sigma-Aldrich – St. Louis, Estados Unidos),
em proporção de 1mL / 2 cm2 de tecido. As células ressupendidas deverão ser sonicadas
em banho de gelo por 3×60s (15% de potência), com intervalo de 2 min entre as
sonicações. A suspensão resultante deve ser centrifugada a 2500g por 10 min a 4˚C, o
precipitado deve ser descartado (Villén e Gygi, 2008) e o sobrenadante (extrato proteico
solúvel, ES) submetido à quantificação de proteínas solúveis totais com o DC Protein
Assay, obtido da Bio-Rad (Hercules, Estados Unidos), de acordo com instruções do
fabricante. Posteriormente, o ES será submetido diretamente à redução, alquilação,
digestão em solução e dessalinização para posterior fracionamento, identificação e
quantificação em cromatógrafo capilar acoplado a espectrômetro de massas (proteômica
shotgun). As análises de proteômica shotgun serão realizadas em instrumento Q Exactive
Plus (obtido da Thermo Fisher Scientific – Waltham, Massachusetts, Estados Unidos), de
acordo com instruções do fabricante. Os espectros de íons coletados serão processados
no programa Proteome Discoverer da Thermo Fisher Scientific e transformados em uma
lista de picos em arquivos de texto, para busca em bancos de dados do National Center
for Biotechnology Information (NCBI), utilizando-se a ferramenta PatternLab 4.0
(Carvalho et al., 2016). Os parâmetros de busca ajustados nesse programa serão:
tolerância de 1 clivagem perdida pela tripsina, peptídeos monoisotópicos, oxidação em
resíduos de metionina e carbamidometilação em resíduos de cisteína.
Analise epigenética
Para a análise molecular do padrão de metilação será utilizada a metodologia de
Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real (qAMP)
descrita previamente (Gomes et al., 2007) nos dias 2, 14 e 28 de tratamento. O método
consiste de uma digestão do DNA, previamente à PCR, por meio da enzima de restrição
sensível à metilação HpaII, a qual reconhece e cliva o sítio polimórfico CCGG, mas não
atua quando a citosina interna se encontra metilada (Cm5CGG). Dessa forma, a clivagem
ocorre somente no alelo não-metilado, impedindo sua amplificação por PCR. A digestão
com a enzima HpaII será realizada utilizando-se 0,2 μg de DNA em condição e
concentração de tampão segundo recomendação do fabricante (Invitrogen). A

quantificação do DNA metilado será obtida pelo sistema de detecção de sequência
LightCycler Real-Time PCR (Roche), em um volume total de reação de 10μL contendo
SYBR Green PCR Master Mix (Roche) e ajustada para a quantidade ideal de cada primer.
Para o desenho dos primers será utilizado o programa Primer3 de acordo com sequências
depositadas no GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
A análise quantitativa da metilação será obtida pela comparação da quantidade
amplificada do DNA não digerido com HpaII e do DNA digerido com HpaII. Ambas as
amostras foram amplificadas por PCR em Tempo Real e o ciclo no qual o nível de
fluorescência emitido pelas amostras amplificadas atingiu o nível de fluorescência
arbitrário Ct (cycle threshold) será obtido para cada amostra pelo software StepOne™
Real-Time PCR (Applied Biosystems). Cada amostra será analisada em triplicata,
estipulando-se o desvio padrão máximo de 0,3, e o valor médio do Ct será obtido para
comparação entre a amostra metilada e a não metilada (Gomes et al., 2007).
Para obter os valores percentuais de metilação de DNA nestas regiões será
realizada a comparação entre o DNA não digerido com o DNA digerido com a enzima
HpaII. Para esse cálculo, será utilizado o valor de Ct de cada amostra amplificada. Assim,
a porcentagem de DNA metilado será obtida pela fórmula (1/2)d-nd, sendo ― d
corresponde à média do Ct do DNA digerido e ― nd à média do DNA não digerido.
3. Cronograma de execução:
Etapa / 2019 2020

Atividade
Set-out Nov-dez Jan-fev Mar-abr Mai-jun Jul-ago
Submissão e X
Aprovação do
Comitê de Ética
em Pesquisa da
UFC
Aquisição e X
síntese da matriz
dérmica derivada
da pele da tilápia
Modelo X
experimental
Queimadura de
terceiro grau
Aspectos X
macroscópicos
Aspectos X X
microscópicos
(Histologia)
Perfil X
hematológico e
bioquímico
Edema e citocinas X
Proteomica X
Epigenética X
Redação de X X
publicações e
relatório
científico
4.
4. Disponibilidade efetiva de infraestrutura e apoio técnico disponível
Todo o desenvolvimento do projeto será realizado no Núcleo de Pesquisa e
Desenvolvimento de Medicamentos (NPDM) da Universidade Federal do Ceará, a síntese
da matriz dérmica derivada da pele da tilápia será realizada no laboratório de Cicatrização
do Dr. Edmar Maciel; as análises bioquímicas no Laboratório de Farmacologia e
Bioquímica, em parceria com a profa. Dra Nylane Nunes de Alencar e o laboratório da
profa Ana Paula Negreiros que dará todo o suporte para processamento histológico. O
protocolo experimental com animais será realizado no Biotério do NPDM.

5. Resultados esperados
A partir dos dados obtidos neste estudo pretende-se obter um relatório sobre a eficácia
pré-clínica da matriz dérmica derivada da pele da tilápia para o seguimento dos estudos
clínicos em pacientes com queimadura de terceiro grau. Novas propostas da adoção do
da matriz dérmica derivada da pele da tilápia como tratamento de queimaduras de terceiro
grau no Sistema Público de Saúde podem garantir estratégias mais efetivas e de baixo
custo e deste modo melhorar qualidade de vida dos pacientes.
6. Orçamento
Valor total
Item
(R$)
Produção da a matriz dérmica derivada da pele da tilápia

500,00
descelularizada
Kit de citocina Th1 / Th2 / Th17 de camundongo CBA BD ™ e

5.000,00
testes bioquímicos
Material consumo proteômica e epigenética 20.000,00
Material de consumo histologia e imunohistoquímica (fibroplasia,

20.000,00
colagênese, reepitelização e edema)
Total 45.500,00
7.
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Projeto CEUA Queimadura 3grau Pós AP Corrigido Ana Paula

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TÍTULO DO PROJETO Avaliação da matriz dérmica derivada da

pele da tilápia descelularizada no tratamento de

AUTORA DA PROPOSTA Profa. Dra. Marisa Jadna Silva Frederico

Universidade Federal do Ceará – Núcleo de

As queimaduras são um problema de saúde pública global, responsável por cerca de

180.000 mortes anuais e danos de ordem psicológica e social. O tratamento de feridas

causadas por queimaduras de terceiro grau resulta em custos elevados e riscos de

complicações que podem prejudicar a resolução do processo de cicatricial. Estudos

recentes e publicados demonstraram que o curativo oclusivo da pele da tilápia apresentou

em animais, minimizou o exsudato e a formação de crosta interferindo positivamente no

processo cicatricial. Posteriormente, em estudo clínico conduzido em queimaduras

superficiais de segundo grau, o curativo oclusivo da pele de tilápia aumentou a velocidade

de reepitelização e diminuiu o número de troca de curativos, a dor e o desconforto do

tratamento em comparação ao tratamento padrão o que representou uma significativa

redução dos custos. A pele de tilápia possui características microscópicas semelhantes à

possível aplicação como biomaterial. Portanto, o objetivo do estudo é avaliar a matriz

dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada no tratamento de lesões cutâneas

causadas por queimaduras de 3° grau experimentais. No modelo pré-clínico as feridas

que mimetizam a queimadura serão produzidas com auxílio de um chapa de alumínio

cirúrgico a uma temperatura de 100°C. Posteriormente será realizada uma excisão no

tilápia comparada a matrizes dérmicas Integra® e Pelnac® acompanhadas ao longo de 28

macroscópica (redução da área lesada) e microscópica através da histologia (presença de

úlcera, infiltrado inflamatório, vascularização e colagênese). Serão realisadas análises

(TNF-α), interleucina-17A (IL-17A) e interleucina-10 (IL-10) e expressão por

imunohistoquímica de TNF-α, IL-1β, TGF-β e α-SMA. Além disso, serão avaliados o

perfil hematológico, a expressão proteica diferencial e alterações epigenéticas nas lesões

os resultados obtidos possam agregar informações consistentes e valiosas e que sirvam

Palavras-chave: matriz dérmica derivada da pele da tilápia descelularizada. Queimadura

de terceiro grau. Regeneração dérmica.

As queimaduras são um problema de saúde pública global, responsável por cerca

A incidência anual de queimaduras nos Estados Unidos é de aproximadamente 486.000,

de acordo com o Repositório Nacional de Queimados da Associação Americana de

Queimados. Aproximadamente 3.275 pessoas perdem suas vidas e 40.000 necessitam de

hospitalização devido a lesões relacionadas à queimadura (American Burn Association,

2016). De forma alarmante, no Brasil acontecem em torno de 1.000.000 de incidentes

e, destes, cerca de 2.500 pacientes irão a óbito direta ou indiretamente em função de

suas lesões (Ministério da Saúde, 2017).

As queimaduras afetam diretamente a pele, o maior órgão do corpo humano,

abrangendo aproximadamente 1,5-2,0 m2 para um adulto. A pele funciona como uma

barreira defensiva contra materiais estranhos auxiliando na termorregulação, previnindo

produção de vitamina D. É composta de três camadas: a epiderme, a derme e a

e a hipoderme. A derme papilar, isto é, a camada dérmica superior; consiste em redes

capilares e fibras de colágeno dispostas de maneira frouxa. A derme reticular, ou seja,

glândulas sebáceas e sudoríparas e fibras de colágeno que se encontram densamente

compactadas e fornecem suporte nutricional e estrutural à epiderme. A camada mais

interna é a hipoderme, que consiste em tecido adiposo subcutâneo e vasos sanguíneos e

linfáticos associados. Esta camada fornece isolamento, amortecimento de insultos

As queimaduras podem ser causadas por diversos mecanismos, incluindo chama,

escaldadura, química, elétrica e radiação. As feridas causadas por queimaduras são

classificadas com base na profundidade como superficial (primeiro grau), de espessura

parcial (segundo grau) e de espessura total ou profundas (terceiro grau). Um exemplo de

auto resolução através da proliferação de queratinócitos e da diferenciação das células

epiteliais basais. As queimaduras superficiais de espessura parcial envolvem a epiderme

e a derme papilar e são dolorosas ao toque. As queimaduras de espessura parcial profunda

envolvem a derme reticular, incluindo as estruturas anexiais, enquanto que as

queimaduras de espessura total envolvem toda a epiderme e a derme e também podem

Indivíduos acometidos por queimaduras de terceiro grau profundas e extensas

hídricas e deixa o organismo mais susceptível a infecções. A ferida pode se tornar

rapidamente colonizada por um grande número de patógenos, imediatamente após a

lesão, devido ao comprometimento da função de barreira da pele. Além disso, a resposta

imune bifásica, hiperinflamação aguda seguida de imunossupressão, observada em

Quando estes pacientes sobrevivem, após tratamento intensivo e prolongado, se deparam

que podem resultar em longas internações hospitalares e tratamentos nas unidades de