Universidade Estadual de Feira de Santana

Departamento de ciências biológicas

Disciplina – Bio 465 Bioquímica B (Prática2)
Professor – Luiz Carlos Alcântara
Aluno – Raimundo Mário Silva Rodrigues dos Santos

Relatório sobrecaracterização de enzimas

Racional teórico

Enzimas em sua maioria são proteínas especializadas que tem a capacidade de acelerar
reações químicas essenciais à vida no interior das células. A sua atividade catalítica depende de
sua estrutura proteica. Uma enzima só é funcional se for uma molécula tridimensional. Se ela
for desnaturada ou dissociada em peptídeos ela perderá sua capacidade de catálise. As
enzimas são fundamentais paraas funções biológicas catalisando centenas de reações químicas
que muitas vezes ocorrem em sequencias onde moléculas mais simples são transformadas em
moléculas mais complexas e vice-versa sendo fundamentais para o metabolismo dos
organismos. Algumas enzimas são moléculas de RNA com funções catalíticas (ribozimas). As
enzimas se tornaram importantes ferramentas práticas para várias áreas do conhecimento,
como a medicina, a biotecnologia, indústria química, farmacêutica e de processamento de
alimentos. O estudo das enzimas se confunde com a própria historia da bioquímica. A catálise
biológica foi reconhecida em 1700 em estudos sobre a digestão biológica. Em 1800 as
pesquisas continuaram através de estudos buscando entender por que o amido é convertido
em açúcar simples pela saliva e vários extratos vegetais. Em 1850 Louis Pasteur concluiu que a
fermentação do açúcar em álcool era catalisada por leveduras. Para eles o princípio dessa
transformação que ele batizou “fermentos” era inseparável das células de levedura dando
início a uma teoria chamada vitalismo que perdurou durante muitos anos. Em 1897 Eduard
Buchner através de experimentos com extratos de leveduras concluiu queo açúcar poderia ser
fermentado em álcool demonstrando que as moléculas que fermentavam o açúcar poderiam
ser separadas das células de leveduras e ainda assim continuar operando derrubando dessa
maneira a teoria do vitalismo. Frederich W. Kuhner denominou essas moléculas de enzimas.
Com o passar do tempo cientistas refutaram a ideia do vitalismo e passaram a isolar e estudar
as propriedades das enzimas. Em 1926 James Summer isolou cristais de Urease e descobriu
pela sua estrutura que ela se tratava de uma proteína, assim como a grande maioria das outras
enzimas proporcionando um grande avanço ao início dos estudos das enzimas. Porém essa
ideia ainda causava bastante controvérsia nos meios científicos. Em 1930, John Northrop e
Moises Kunitz isolaram e cristalizaram a tripsina, pepsina e outras enzimas digestivas
concluindo assim que essas enzimas também são proteínas. Dessa forma os trabalhos de
James Summer passaram a ser completamente aceitos. No final do século XX J. B.S.Haldane
escreveu o tratado “Enzimas” que mesmo sem a estrutura molecular das enzimas estarem
completamente elucidada, nele o autor sugeria que as interações fracas entre as enzimas e o
substrato faziam com que aquela se ligasse neste distorcendo sua estrutura e iniciando assim a
reação de catálise. Isso representou o primeiro passo para a moderna compreensão da
atividade enzimática. No final do século XX milhares de enzimas do metabolismo celular foram
purificadas e isoladas de forma que sua estrutura, propriedades e papel nas reações
metabólicas dos organismos passaram a ser desvendadas cada vez mais ampliando assim a
compreensão do papel delas no metabolismo celular.

Para a maior parte das enzimas basta seus resíduos de aminoácido para realizarem
suas funções. Outras necessitam de um cofator que é um íon tal como Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,
uma molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica chamada coenzima.
Algumas enzimas requerem ambas, a coenzima e um ou mais íons metálicos inorgânicos para
suas atividades. A coenzima, ou íon metálico inorgânico que está ligado à parte proteica
chama-se grupo prostético. A enzima completa, cataliticamente ativa ligada à coenzima/ou íon
metálico chama-se holoenzima. A parte protéica dessa enzima chama-se apoenzima ou
apoproteína. As coenzimas funcionam como moléculas transportadoras transitórias de grupos
funcionais específicos. Geralmente elas são derivadas de vitaminas. Algumas enzimas são
modificadas por fosforilação, glicolisação e outros processos que funcionam como reguladores
da atividade enzimática.

Objetivos gerais

Entender a cinética enzimática, como as enzimas realizam sua atividade catalítica,

quais fatores físicos e químicos podem interferir nessas atividades, bem como o pH ótimo que
favorece a atuação de cada enzima e como elas interagem com o substrato para que as
reações químicas aconteçam. Quais os fatores físicos e químicos que interferem na atividade
enzimática.

Objetivos específicos

Utilizar a enzima catalase como modelo para entender as reações enzimáticas em

diferentes circunstancias como variação de temperatura, pH e concentração de substrato.
Entender como esses fatores influenciam na atividade enzimática acelerando ou diminuindo
reações químicas catalisadas por elas ou ativando e desativando a capacidade catalítica das
enzimas.

Metodologia

A turma foi dividida em três grupos e um ficou encarregado de verificar o efeito da

temperatura sobre a atividade enzimática, outro grupo o efeito do pH e o terceiro a
concentração de substrato. A equipe encarregada de avaliar o efeito da temperatura preparou
uma bateria com três tubos de ensaios. No primeiro adicionou 1,0 mL de água oxigenada; 2 mL
de água destilada e 6 gotas de albumina. A mistura foi homogeneizada e incubada a 0o C por
10min. Em seguida foi adicionado, cuidadosamente, 3,0 mL de água sanguínea. A mistura foi
homogeneizada por uma única inversão e o tubo foi tampado com parafilme por 10 minutos.
No tubo nº 2 foi adicionado 1.0 mL de água oxigenada; 2,0 mL de água destilada; 6 gotas de
solução de albumina e em seguida a mistura foi homogeneizada e incubada a 30° C em
temperatura ambiente por 10 minutos em um recipiente metálico contendo água. Em seguida
foi adicionado cuidadosamente à mistura 3,0 mL de água sanguínea na mesma temperatura
que o restante da mistura que foi homogeneizada por uma única inversão e o tubo tampado
com parafilme por 10 minutos. No tubo nº 3 foi adicionado 1,0 mL de água oxigenada; 2,0 mL
de água destilada; 6 gotas de solução de albumina e em seguida a mistura foi homogeneizada
e incubada a 100° C em um béquer sobre uma chapa metálica aquecida por um bico de Bunsen
por 19 minutos. Foi adicionado, cuidadosamente, 3,0 mL de água sanguínea na mesma
temperatura. Em seguida a mistura foi homogeneizada por uma única inversão e o tubo
tampado com parafilme. Esperou-se 10 minutos para observar os resultados.

A segunda equipe, ao qual eu fiz parte realizou o experimento do efeito do pH na

atividade enzimática. Para esse experimento foram reunidos 5 tubos de ensaios e rotulados.
No tubo 1 foi adicionado 2,0 mL de água destilada; 2 gotas de ácido sulfúrico; 3,0 mL de água
sanguínea e 6 gotas de solução de albumina. A mistura foi homogeneizada e em seguida foi
adicionado cuidadosamente 1,0 mL de água oxigenada. Novamente foi homogeneizado com
uma única inversão e o tubo tampado com parafilme. Aguardou-se 10 minutos. No tubo nº 2
foi adicionado 2,0 mL da solução tampão pH 4,5; 3,0 mL de água sanguínea e 6 gotas de
albumina. A mistura foi homogeneizada e em seguida adicionado cuidadosamente 1,0 mL de
água oxigenada. A mistura foi homogeneizada por uma única inversão e o tubo tampado com
parafilme e aguardou-se 10 minutos para ver o resultado. No tubo nº 3 foi adicionado 2,0 mL
da solução tampão pH 7,0; 3,0 mL de água sanguínea e 6 gotas de albumina. Em seguida a
mistura foi homogeneizada e adicionou-se cuidadosamente 1,0 mL de água oxigenada. A
mistura foi homogeneizada por uma única inversão e o tubo tampado com parafilme.
Aguardou-se 10 minutos para observar a reação. No tubo nº 4 foi adicionado 2,0 mL da
solução tampão pH 10,0; 3,0 mL de água oxigenada e 6 gotas de solução de albumina e em
seguida homogeneizado a mistura. Adicionou-se cuidadosamente 1,0 mL de água oxigenada e
a mistura novamente homogeneizada por uma única inversão e o tubo tampado com
parafilme. Aguardou-se 10 minutos para se observar a reação. No tubo nº 5 foi adicionado 2,0
mL de água destilada mais 2 gotas de hidróxido de sódio, 3,0 mL de água sanguínea e 6 gotas
de solução de albumina. Em seguida a mistura foi homogeneizada e adicionou-se
cuidadosamente 1,0 mL de água oxigenada. Novamente a mistura foi homogeneizada por uma
única inversão e o tubo tampado com parafilme. Também se aguardou 10 minutos para
observar a reação.

O terceiro grupo encarregado de observar o efeito da concentração do substrato na

reação enzimática separou seis tubos sendo que em todos eles foram acrescentados 6 gotas e
albumina e 5,0 mL de água sanguínea. Porém no tubo 1 foi acrescentado a essa mistura 2,0 mL
de água destilada. No tubo 2 foi acrescentado 0,4 mL de água oxigenada e 1,6 mL de água. No
tubo 3 foi misturado 0,8 mL de água oxigenada e 1,2 mL de água destilada. No tubo 4 foi
misturado 1,2 mL de água oxigenada e 0,8 mL de água destilada. No tubo 5 foi misturado 1,6
mL de água oxigenada mais 0,4 mL de água destilada e no tubo 6 foi acrescentado apenas 2,0
mL de água oxigenada. Em seguida os tubos foram tampados e aguardou-se 10 minutos para
observar a reação de todos os tubos.

Resultados

Decorrido 10 minutos após os tubos serem vedados com parafilme partiu-se para a
observação das reações representadas em mm de bolhas formado a partir da superfície do
líquido devido à reação da enzima atuando junto com a água oxigenada que apresentaram os
seguintes resultados:

Na reação enzimática que envolveu o efeito da temperatura, o tubo que foi incubado a
30° C foi o que alcançou maior milímetro de bolhas em detrimento dos outros tubos que
pouca ou nenhuma reação envolvendo bolhas aconteceu.

No experimento envolvendo o efeito do pH na atividade enzimática, o tubo que

alcançou o maior mm de bolhas indicando que houve uma maior reação foi o tubo 4 (96mm)
seguido dos tubos 3 (57mm) e 2 (52mm). Os tubos que apresentaram a menor atividade de
reação representada em mm de bolhas foram os tubos 5 (8mm) e 1(4mm) respectivamente.

Já o experimento envolvendo o efeito da concentração do substrato, nos tubos 1 e 6

não ocorreram reação visível ao passo que nos tubos 2 a 5 ocorreram reações em ordem
crescente de mm de bolhas.

Discussão

No experimento da temperatura demonstrou-se que a ação das enzimas aumenta à

medida que a temperatura aumenta evidenciado pela reação que ocorreu no tubo quando
submetido a uma temperatura de 30° C em detrimento do tubo incubado a 0° C. Porém
também demonstrou-se que as enzimas possuem uma faixa de temperatura ótima inativando-
se á medida que a temperatura se torna excessivamente elevada desnaturando-se. Isso foi
evidenciado pelo tubo incubado a 100°C ao qual não houve reação.

Na reação envolvendo o pH das enzimas, constatou-se que cada enzima possui um pH

ótimo na qual a sua atividade é máxima devido ao fato de que alguns tubos com solução
tampão apresentarem uma reação mais intensa do que outros, nesse caso, o tubo 4
evidenciando que o pH ótimo da enzima utilizada no experimento é 10 devido ao fato de ter
sido esse o tubo que alcançou maior reação visível. Já os dois tubos aos quais não foram
acrescentado solução tampão (1 e 5) tiveram pouca ou nenhuma reação. Nesses foram
acrescentados 2 gotas de Ácido Sulfúrico e NaOH (hidróxido de sódio) respectivamente,
levando a conclusão de que em meio muito ácido ou muito básico a enzima sofre
desnaturação tornando-a inativa.

O experimento envolvendo a concentração de substrato demonstrou que a velocidade

de reação das enzimas aumenta e diminui conforme e a concentração do substrato além de
ocorrer sua inativação quando a concentração de substrato atinge um determinado ponto de
saturação. A evidencia disso é o fato de que não houve reação no tubo 1 onde o substrato
estava mais diluído. Porém á medida que se ia diminuindo a quantidade de água e
consequentemente aumentando a concentração de substrato, a enzima passou a aumentar
sua velocidade de reação diminuindo a velocidade de reação no tubo 5 a sua inativação total
quando se atingiu o seu ponto de saturação no tubo mais concentrado (o 6 que não foi diluído
em água).

Referências

LEHNINGER, Albert L., NELSON, David L. e COX, Michael M. Princípios de

bioquímica. Traduzido por Arnaldo Antônio Simões e Wilson Roberto Navega Lodi. 2ª
ed. São Paulo: SARVIER, 1995.
SCHÖFFER, Jéssie da Natividade. Imobilização de ciclodextrinas glicosiltransferase
para produção de Ciclodextrinas: catálise em batelada e catálise contínua em reator de leito
fixo. 2013. 82 fls. Dissertação (mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) –
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, 2013.
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/enzimas.htm <acesso em 18/12/16

https://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica <acesso em 28/12/16