Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ

Centro de Educação Superior à Distância do Estado do Rio de Janeiro – CEDERJ

Curso: Licenciatura em Ciências Biológicas

Pólo: Nova Iguaçu
Matrícula: 18114020418

Beatriz Silva Lima

Relatório da Aula Prática 2 de Bioquímica I

Rio de janeiro, 2019.

Introdução

As enzimas são moléculas orgânicas, em geral são proteínas que apresentam função de
catalisação, isto é, realizam a função de acelerar a velocidade da reação. Fazem isso ao se ligar ao
reagente da reação, o qual recebe o nome de substrato. E assim elas são essenciais para diversas
reações, principalmente as que ocorrem dentro dos organismos, pois as enzimas fazem essas reações
durarem um menor tempo do que teria se não houvesse as enzimas. Caso as enzimas, sozinhas, não
consigam se ligar ao substrato, as coenzimas entram em ação, as quais também são moléculas
orgânicas. Dentre diversos tipos de coenzimas pode-se ser citado as vitaminas.
A velocidade da reação nem sempre aumenta na presença de enzimas. Isso pode ocorrer
devido à baixa quantidade de enzimas no ambiente ou por fatores que influenciam a atividade da
enzima, diminuindo a sua velocidade ou anulando totalmente sua atividade, devido à danos em sua
estrutura. Esses fatores podem ser a concentração de substrato, o pH, a temperatura, inibidores
enzimáticos, as moléculas como uréia e guanidina, os detergentes ou os solventes orgânicos. Se em
uma reação, houver poucas enzimas, a velocidade dessa reação não será muito alta em comparação
a uma reação com mesma quantidade de substrato, mas que possui uma quantidade maior de
enzimas. Agora, a concentração de substrato também afeta na velocidade da reação visto que,
quanto mais substrato mais as enzimas estão desempenhando seu papel com rapidez para dar conta
de toda a quantidade de substrato. Como também, se houver pouco substrato mais devagar a reação
termina. A temperatura também modifica esse processo visto que, quanto maior a temperatura, mais
rápido as enzimas trabalham, pois a energia térmica acaba sendo convertida em energia cinética,
fazendo as enzimas se movimentarem mais rápido. Porém conforme a temperatura vai aumentando,
a enzima começa a entrar no processo de desnaturação, onde sua estrutura inteira é abalada e perde
a possibilidade de se ligar a um substrato, pois principalmente a região do sítio ativo – região a qual
o substrato se encaixa na enzima – também foi alterada. Além de que, temperaturas abaixo do nível
ótimo fazem com que as enzimas exerçam seu papel mais lentamente. O pH também afeta a
atividade enzimática, pois as enzimas apresentam, em seu sítio ativo, grupos funcionais protonáveis
ou desprotonáveis, e essas mudanças de protonação fazem com que a região do sítio ativo da
enzima não consiga mais reconhecer e/ou se conectar ao seu substrato. Como também em valores
de pH distantes do pH ótimo as enzimas catalisam com menos afinidade ao substrato, e tendem a ter
sua velocidade catalítica reduzida, assim como em pH ótimos fazem elas apresentarem atividade
máxima. As moléculas como guanidina e uréia também influenciam na atividade enzimática, se
estiverem presentes na reação, pois fazem ligações de hidrogênio mais facilmente, o que acaba
desestruturando as proteínas. Outros fatores que alteram a velocidade da reação enzimática são
solventes orgânicos e os detergentes que agem desnaturando as enzimas, pois ambos expõem ao
meio externo as regiões apolares que ficam escondidas no interior da proteína. E por último temos
os inibidores, os quais podem ser irreversíveis, que alteram a estrutura da enzima de forma
permanente, ou reversíveis, sendo divididos em competitivos, quando competem com o substrato
para se ligar com a enzima ou não competitivos, quando se ligam à enzima em outras regiões.
Objetivos

Observar o efeito do pH na atividade da amilase salivar.

Observar o efeito da concentração do substrato e de enzima na reação da bromelina.
Observar o que ocorre na desnaturação térmica da bromelina.

Material e Métodos

Efeito do pH na atividade da amilase salivar:

Material:
• 4 biscoitos cream-cracker;
• Saliva;
• Solução de iodo;
• Água;
• Vinagre;
• Bicarbonato de sódio;
• 4 placas de Petri;
• 4 pipetas Pasteur
• Almofariz;
• 4 Mexedores palheta de café;
• 1 cronômetro.

Métodos:
Foram identificadas as placas de Petri de acordo com a condição em que estavam, então ficaram
como “controle”, “água”, “vinagre” e “bicarbonato”. Posteriormente, foi triturado um biscoito com
o almofariz e depositado na placa identificada como “controle”. O segundo biscoito foi mastigado
por um aluno e foi posto, em uma das placas, a massa produzida pela mastigação. Esse mesmo
procedimento ocorreu com os outros dois biscoitos. Em seguida, adicionou-se água na amostra de
biscoito triturado (denominado controle), aos poucos, até obter uma pasta de consistência similar à
dos biscoitos que foram mastigados. Marcou-se e depois foi anotado o tempo do cronômetro. Após
isso, adicionou-se 1 mL de água na placa A, 1 mL de vinagre na placa B, e 1 mL de solução de
bicarbonato de sódio, que foi preparada antes da seguinte forma: adicionar 1 colher de café de
NaHCO3 em 10 mL de água, misturar, e deixar decantar. Após 30 min, pingaram-se de 3 a 5 gotas
de solução de iodo em cada placa e anotou-se a cor.

Efeito da concentração do substrato na reação da bromelina:

Material:
• Leite em pó;
• 100 mL de água destilada;
• 10 mL de suco natural de abacaxi;
• Béquer;
• 1 espátula para pesagem;
• 6 placas de petri
• Caneta de retroprojetor;
• 6 Pazinhas de plástico pequenas;
• 1 (ou 2) espátula(s) de plástico;
• Estante para tubos;
• 1 proveta de 10 mL;
• 1 pipeta de 1 mL;
• 1 Cronômetro ou relógio;
• Balança.

Métodos:
Foi anotado nas tampas das placas de petri as condições experimentais de forma que os números
identificam a quantidade, em gramas, de leite utilizada. A letra C anotada significa quais são as
amostras Controle (onde será adicionado apenas água) e E é designado para as amostras que terão
Enzimas (onde será adicionado o suco de abacaxi): então, ficam anotados os códigos 6C, 6E, 8C,
8E, 10C e 10E. Utilizando as placas de petri, pesou-se o leite em pó: 6; 8 e 10 gramas, nas
respectivas placas. Onde as placas 6C e 6E conterão 6 gramas de leite cada; 8C e 8E, terão 8
gramas, e as placas 10C e 10E com 10 gramas de leite, que é o substrato da reação. Com uma
proveta, foi depositado 9 mL de água em cada placa. Misturando bastante, e evitando não derramar
o leite ou a água, até que se forme uma massa homogênea. Após isso, é necessário tampar as placas
e deixar elas tampadas durante todas as etapas do experimento para evitar evaporação de água,
principalmente num ambiente com ar-condicionado. Adicionados 1 mL de água nas placas
identificadas como controle (C), e então mistura-se tudo. Foi ligado o cronômetro na primeira
adição de água e depois anotou-se o tempo no qual foi feita cada adição. Nas placas identificadas
como enzimas (E) foi acrescentado 1 mL de suco de abacaxi, e então misturou-se bem, anotando o
tempo inicial de cada adição. A cada 5 minutos, a tutora foi traçando uma ‘linha’, com a pá de
plástico pequena, no fundo de cada uma das placas para verificar a consistência do leite. Quando a
linha de separação feita no meio da placa demora a voltar a fechar, passou-se a medir o tempo a
cada 1 minuto, e depois vai para 30 segundos. E foi feito isso até a linha de separação na massa de
leite não retornar à sua posição inicial e então é considerado como o fim da reação. E esse tempo
todo é cronometrado para cada uma das placas.

Desnaturação térmica da bromelina:

Material:
• 5 mL de Suco de abacaxi;
• Béquer;
• 10 tubos de ensaio;
• Caneta de retroprojetor;
• Estante para tubos;
• Proveta de 10 mL;
• Pipeta de 2 mL;
• 1 pregador para tubos;
• 1 cronômetro ou relógio;
• Bico de Bunsen ou placa de aquecimento;
• Banho-maria;
• Gelatina;
Métodos:
Foram fervidos 100 mL de água em um béquer de 250 mL e nele ficou depositado, por 5
minutos, um tubo contendo 5 mL de suco de abacaxi, com o auxílio de um pregador para tubo.
Depois foi retirado o tubo e colocado em uma estante sobre a bancada, onde espera-se esse tubo
atingir a temperatura ambiente. Então, os tubos recebem identificações, onde a letra C é colocada
nos tubos de controle e a letra E para os que terão enzima, e assim os códigos de cada tubo ficam
nomeados: C, 1E e 2E. Após isso foi adicionado 2 mL de água no tubo de controle C, e colocou-se 2
mL de suco de abacaxi não fervido no tubo 1E, e 2 mL de suco de abacaxi fervido no tubo 2E.
Então, com a proveta, foi colocado 10 mL de gelatina em cada tubo. Agitou-se os tubos levemente
de forma que a gelatina e a solução se uma só mistura homogênea. Assim, após esse procedimento,
os tubos foram levados para a geladeira por ao menos 30 minutos. E enfim, após esse tempo, ou
melhor, após o tubo 1 C se solidificar, pode-se retirar todos os tubos da geladeira e observar os
aspectos dos conteúdos dos tubos.

Efeito da concentração de enzima na reação da bromelina:

Material:
• Leite em pó;
• Caneta de retroprojetor;
• Estante para tubos;
• Proveta de 10 mL;
• 1 espátula;
• 1 pipeta automática de 1 mL;
• 10 mL de suco natural abacaxi;
• 100 mL de água;
• 3 placas de petri;
• 3 tubos de ensaio;
• 3 pazinhas de plástico pequenas;
• 1 pá de plástico grande;
• 1 cronômetro ou relógio;
• Balança;

Métodos:
Foram numerados os tubos de ensaios e placas de petri de 1 a 3, e nessas últimas foram
dispostas e pesadas 10 gramas de leite em pó. Preparou-se as concentrações da enzima bromelina de
forma que no tubo 1 de controle teve 10 mL de água e 0 mL de suco de abacaxi; já no tubo 2 tinha 5
mL de água e 5 mL de suco de abacaxi e o tubo 3 conteve 0 mL de água e 10 mL de suco de
abacaxi. Adicionando o conteúdo de cada tubo (10 mL) nas placas com numeração correspondente.
Foi utilizado a espátula de plástico grande para misturar bem, e então foi acionado o cronômetro. O
tempo foi marcado logo após a adição da solução de bromelina ou de água. A pá de plástico
pequena foi sendo passada no fundo de cada uma das placas de cinco em cinco minutos, de forma a
observar a consistência da massa. Então, ao observar que a linha de separação feita no meio da
placa demora a fechar, foi diminuindo o tempo de medição para 1 minuto e para menos. Quando
formar uma canaleta na massa de leite, que não retorna à sua posição inicial seria dito como o fim
da reação e então anota-se o tempo necessário para chegar a esse ponto.
Resultados

Efeito do pH na atividade da amilase salivar:

1- Compare a cor obtida nas amostras, no início e no final do experimento. Verifique se houve ou
não mudança de cor e responda a seguinte pergunta: A solução de iodo mudou de cor em todas as
amostras? Por que?

Sim. A placa de petri controle não tinha nenhuma enzima, portanto a solução de iodo ficou
muito escura, indicando que havia muito amido, e isto significa que a atividade enzimática era baixa
ou nula. Nesse caso não havia atividade, pois era a placa de controle, com apenas água sem a
amilase salivar. Na placa A contendo a água, a cor provocada pelo iodo foi escura também. Nesse
caso houve presença de amido porque a enzima agiu, mas não em sua atividade máxima. Na placa
B a cor indicada pelo iodo foi mais escura também porque nela havia o vinagre, que é bastante
ácido e altera a atividade enzimática, fazendo as enzimas quebrarem menos amidos e por isso a cor
foi escura. Já na placa C, com o bicarbonato de sódio, a cor ficou mais fraca, pois o pH dessa
solução não influenciou na atividade enzimática, mesmo ele apresentando um pH mais alcalino.

Figura 1: Placas de petri com os biscoitos mastigados e outra com biscoito triturado após receberem a solução de iodo.

Efeito da concentração do substrato na reação da bromelina:

1- Anote o tempo de reação para cada amostra em uma tabela.

Concentração de substrato Tempo de reação (min) Velocidade da reação

(g/mL) (1/min)
6 25 0,04
8 16 0,06
10 12 0,08

2- Calcule a velocidade de reação como sendo o inverso do tempo (1/tempo).

Ao inverter o tempo obtemos as velocidades, como: 1/25= 0,04 /min, 1/16= 0,06 /min,
1/12= 0,08 /min.
3- Faça um gráfico da velocidade de reação em função da concentração de substrato.

Gráfico 1: Velocidade da reação em função da concentração do substrato.

Nesse experimento foram mantidas as mesmas condições como pH e temperatura a fim de que não
influenciasse o comportamento da enzima, de forma a poder observar se as diferentes quantidades
de substrato alteram a velocidade da reação enzimática, como o previsto: quanto mais substrato,
mais rápida a reação ocorre. Os resultados que obtivemos foi de que na placa 10E, placa com mais
substrato (10 gramas), a reação foi concluída em 12 minutos, a 8E, com 8 gramas, foi com 16
minutos e a 6E, com 6 gramas, por 25 minutos. Dessa forma foi visto que realmente a quantidade de
substrato influencia a reação enzimática, onde a reação mais rápida ocorreu justamente na placa
com mais substrato e a com menos substrato foi a que mais demorou. Os resultados foram os
esperados.

Figura 2: Placas de Petri com leite em pó (substrato) e suco de abacaxi, onde está a enzima bromelina.

Desnaturação térmica da bromelina:

1-O que aconteceu com a gelatina nos tubos com água? E com os tubos com suco de
abacaxi? Por que a consistência da gelatina mudou em alguns tubos e em outros, não?
 No tubo com água a gelatina ficou solidificada pois é esse o processo normal de acontecer.
O tubo 1E continha o suco de abacaxi não fervido, então a bromelina estava ativa, pois não passou
por altas temperaturas, e então ela atuou quebrando as ligações químicas da gelatina e isso fez com
que ela ficasse no estado líquido, mesmo estando na geladeira. E por último, o tubo 2E, que
continha o suco de abacaxi fervido, congelou, pois a bromelina presente no suco de abacaxi foi
desnaturada quando ele passou pelo processo de fervê-lo. A mudança na consistência da gelatina
ocorreu nos tubos que apresentavam a enzima, pois ela alterou a estrutura da mesma, tornando-a
líquida quando esta deveria estar em estado de gel, ou mais solidificada. Já a consistência da
gelatina ficou mais gelificada nos tubos onde não havia enzima bromelina ou nos tubos em que a
enzima estava desnaturada, não podendo clivar as ligações da estrutura da gelatina.

Figura 3: Tubos de ensaios depois de serem retirados da geladeira.

Efeito da concentração de enzima na reação da bromelina:

1- Anote o tempo de reação para cada amostra em uma tabela.

Concentração da enzima Tempo de reação (min) Velocidade da reação

(1/min)
0% - -
50% 3 0,3
100% 1 0,6

2- Calcule a velocidade de reação como sendo o inverso do tempo (1/tempo).

Como a concentração da enzima era 0% não houve reação, portanto não existiu “tempo de
reação” e “velocidade de reação”. Já na placa com 50% de enzima a velocidade foi de 1/3 = 0,3/min
e na amostra com 100% de enzima a velocidade foi de 1/130= 0,6/min.

3 - Faça um gráfico da velocidade de reação em função da concentração de enzima.

Gráfico 2: Velocidade da reação em função da concentração da enzima.

Figura 4: Placas de Petri com diferentes quantidades de substrato após o fim da reação enzimática.

Conclusões

Os objetivos previstos para essa aula foram alcançados. Os experimentos demonstraram que o pH, a
temperatura e a concentração do substrato são fatores que alteram as enzimas, influenciando na
velocidade de reação delas. De forma que o vinagre e o bicarbonato de sódio possuem pH que
alteram a atividade enzimática da amilase salivar, a temperatura alta (processo de ferver) desnatura
a enzima bromelina, e que diferentes quantidades de substrato alteram a velocidade da reação da
enzima bromelina, como também diferentes concentrações de enzima alteram a velocidade
enzimática da reação, mesmo em quantidades semelhantes de substrato.
Referências

POIAN, Andrea da. Bioquímica I. v.1 .5.ed. Rio de Janeiro: Fundação CECIERJ, 2008.