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ARTIGO DE PESQUISA
Óleo de peixe www.ejlst.com

Oxidação de oleogéis de óleo de peixe formados por ceras


naturais em comparação com óleo a granel

Hong-Sik Hwang,* Matthew Fhaner, Jill K. Winkler-Moser e Sean X. Liu

margarina, pastas e gorduras. No entanto,


O objetivo deste estudo é avaliar a tecnologia do oleogel (ou organogel) como um novo método para transas gorduras que são produzidas durante
prevenir a oxidação do óleo de peixe por meio da imobilização do óleo e fornecer informações úteis o processo de hidrogenação têm efeitos
negativos em várias doenças, como doenças
sobre a oxidação de oleogels para sua aplicação em produtos alimentícios reais. Quatro ceras naturais
cardiovasculares, diabetes e alguns tipos de
diferentes, cera de farelo de arroz, cera de girassol, cera de candelila e cera de abelha são usadas para
câncer.[1–3]Por esta razão, muitos países e
preparar oleogéis de óleo de peixe. O valor do peróxido, o valor do dieno conjugado, o ácido municípios implementaram regulamentos
eicosapentaenóico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA) são medidos após o armazenamento de para reduzir ou eliminartransgorduras nos
oleogéis a 35 e 50-C, respectivamente. Todos os oleogéis de óleo de peixe com cera a 3% apresentam alimentos. Por sua vez, óleos tropicais, como
oxidação mais lenta do que o óleo de peixe a granel a 35-C. A cera de abelha não é tão eficaz quanto óleo de palma e óleo de coco, juntamente
com óleos vegetais totalmente hidrogenados
outras ceras durante o armazenamento a 50-C devido ao seu ponto de fusão mais baixo. O método de
e seus óleos transesterificados, tornaram-se
medição de penetração de cor é desenvolvido como um método conveniente para prever a taxa de
as alternativas mais populares para trans
oxidação do oleogel. Resfriar o oleogel a uma taxa mais rápida pode reduzir significativamente a taxa gorduras na indústria alimentícia. No entanto,
de oxidação do oleogel. Uma quantidade maior de cera não é recomendada para aumentar o efeito deve-se notar que esses óleos contêm altos
protetor, o que pode dar um efeito negativo devido à atividade pró-oxidante da cera. A tecnologia do teores de gorduras saturadas e também
oleogel pode ser aplicada para reduzir a oxidação de produtos alimentícios e suplementos nutricionais
podem causar alguns problemas de saúde,
como aumento do risco de doenças
contendo óleo ômega-3.
cardiovasculares (DCV) e aumento dos níveis
de colesterol LDL.[4]
Aplicação prática:Este estudo mostra claramente que a tecnologia oleogel pode ser usada para Um oleogel ou organogel é uma classe de gel
prevenir a oxidação do óleo, imobilizando o óleo em produtos alimentícios. Essa tecnologia pode ser feito de um óleo imobilizado por uma rede

usada para produtos comerciais, como suplementos de óleo de peixe, para evitar a oxidação do óleo tridimensional formada por um oleogelator. A
estruturação de óleo comestível com um oleogelator
durante a produção, transporte e armazenamento. As informações apresentadas neste estudo
tornou-se uma importante área de pesquisa para
também podem ser usadas para novos produtos alimentícios enriquecidos com óleo ômega-3, como
substituir gorduras nocivas, comotranse gorduras
margarina, pastas para barrar, gordura vegetal, biscoitos e outros produtos relacionados. A saturadas. Em um oleogel, o óleo é misturado com
tecnologia oleogel pode ser facilmente aplicada como método dropin. As ceras naturais utilizadas um oleogelator comestível, aquecido e resfriado para
como oleogelificantes são baratas e amplamente disponíveis, e a maioria delas já é utilizada em formar um gel. Embora existam muitos tipos de
oleogeladores desenvolvidos, ceras vegetais como
muitos produtos alimentícios.
cera de farelo de arroz (RBW), cera de girassol (SW),
cera de candelilla (CW) e cera de abelha (BW) têm
muitas vantagens sobre outros oleogeladores devido
à sua disponibilidade, baixo custo , e grande

1. Introdução capacidade de gelificação.[5]


Os oleogéis podem ser feitos de muitos óleos vegetais diferentes,
Os óleos vegetais hidrogenados têm sido amplamente utilizados para fornecer incluindo óleos de canola, soja, linhaça, oliva, amendoim, gergelim,
a textura desejada a um produto alimentício à base de óleo, como noz e milho.[6]Os óleos ômega-3, incluindo o óleo de peixe, têm um
uma infinidade de benefícios para a saúde, como o desenvolvimento
Dr. Hwang, Dr. JK Winkler-Moser, Dr. SX Liu do cérebro em fetos, redução da inflamação e redução da incidência
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos de ataques cardíacos.[7–9]Portanto, o consumo de suplementos de
Serviço de Pesquisa Agrícola
óleo ômega-3 e alimentos enriquecidos com óleos ômega-3, como
Centro Nacional de Pesquisa de Utilização Agrícola
Pesquisa de Alimentos Funcionais cereais, pães, iogurte, leite e café da manhã e lanchonetes
Peoria, IL, EUA aumentaram nos últimos anos.[10,11]Os oleogéis de óleo de peixe são
E-mail: hongsik.hwang@ars.usda.gov considerados excelentes alternativas às gorduras saturadas em
Prof. M. Fhaner margarinas, pastas e gorduras.[12–14]Um desafio na fabricação,
Departamento de Química e Bioquímica armazenamento e transporte de alimentos e suplementos contendo
Universidade de Michigan-Flint
óleo ômega-3 é que os ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) nos
Flint, MI, EUA
óleos ômega-3 são facilmente oxidados.[15]Como exemplo, Ogutcu et
DOI: 10.1002/ejlt.201700378 al.[12]relataram que os oleogéis de óleo de peixe mostraram

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oxidação mais rápida do que a margarina comercial. A oxidação dos solventes de grau incluindo clorofórmio, metanol e hexano
PUFAs causa impactos negativos na nutrição, sabor e odor do foram adquiridos da Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, EUA).
produto alimentício.[16,17]
Compreender a oxidação dos oleogéis é fundamental para o
desenvolvimento de uma variedade de produtos alimentícios saudáveis 2.2. Preparação de Oleogéis e Estudo de Armazenamento
usando a tecnologia de oleogel. O objetivo deste trabalho foi realizar um
estudo sistemático sobre a oxidação de oleogéis de óleo de peixe Para oleogéis de cera a 3%, pesaram-se 90-2 mg de cera num frasco de
formados por ceras naturais. Se a tecnologia do oleogel pudesse vidro (15 mm de diâmetro externo, 45 mm de altura, 12,7 mm de
efetivamente proteger o óleo de peixe da oxidação, ela poderia ser usada diâmetro interno). Enquanto soprava levemente argônio no frasco de
como um novo método para prevenir a oxidação do óleo durante a óleo de peixe, pesou-se óleo de peixe (2,91 g) no frasco. A relação
produção, transporte e armazenamento de suplementos de óleo de calculada entre área superficial e volume foi de 0,39 cm2cm3por este
peixe, o que sempre foi um desafio nesta indústria. Houve alguns método. As amostras foram colocadas em 100-C por exatamente 7min e
estudos sobre a oxidação de oleogéis. Por exemplo, o óleo de fígado de foram agitados para misturar cera derretida e óleo de peixe e depois
bacalhau gelificado com monoglicerídeo mostrou uma formação mais resfriados à temperatura ambiente. O controle, óleo de peixe a granel
lenta de produtos de oxidação secundária do que o óleo a granel, sem cera, também foi submetido a este procedimento para ter igual
embora não tenha mostrado diferença na formação de PV.[18] oxidação durante esta etapa. Usando uma amostra extra de oleogel em
Também houve alguns estudos sobre oleogéis de cera, que um frasco, a taxa de resfriamento foi medida colocando uma sonda de
forneceram informações valiosas sobre as propriedades do oleogel, arame no centro da amostra. Como a curva de resfriamento não era
incluindo a estabilidade oxidativa. No entanto, na maioria dos linear, o tempo decorrido de 70 a 40-C, em que ocorreu a cristalização da
estudos, o valor de peróxido (PV) foi o único método analítico usado cera, foi usado para determinar a taxa de resfriamento. A taxa de
para medir a estabilidade oxidativa do oleogel.[12,14,19,20]É bem resfriamento por este método foi determinada em 5,3 -0,4-Cmin1(taxa de
conhecido que qualquer método analítico único medindo apenas um resfriamento 1). Usando um cotonete, o gel extra formado acima da linha
tipo de produto de oxidação não pode fornecer uma descrição superior do oleogel foi removido. As amostras foram armazenadas em
satisfatória da oxidação lipídica ao longo de todo o curso da estufas a 35 e 50-C para simular possível calor excessivo durante o
oxidação, uma vez que existem numerosos produtos de oxidação. transporte e fabricação, respectivamente. Um conjunto de amostras foi
[21,22]Além disso, ainda não está muito claro se o óleo gelificante submetido a 90-C para investigar o efeito da cera fundida na oxidação do
pode reduzir a oxidação do óleo, pois existem algumas descobertas óleo de peixe sem o efeito gelificante. Amostras com diferentes taxas de
contraditórias em relação à taxa de oxidação do oleogel em resfriamento foram preparadas da mesma maneira, exceto pelo método
comparação com a do óleo a granel.[12,13]Portanto, estudos mais de resfriamento. Um conjunto de amostras foi resfriado em um freezer (–
sistemáticos são necessários para melhor compreensão da oxidação 20-C) colocando os frascos de amostra no freezer, cuja taxa de
do oleogel. Neste estudo, medimos o PV para avaliar a oxidação do resfriamento foi medida em 11,0 -0,1 (taxa de resfriamento 2). O outro
óleo no estágio inicial da oxidação e determinamos o valor do dieno conjunto de amostras foi resfriado por imersão do frasco de amostra em
conjugado (CDV), ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido um banho de gelo, para o qual a taxa de resfriamento foi determinada
docosahexaenóico (DHA) para um tempo de armazenamento mais em 25,3 -1,5-Cmin1(taxa de resfriamento 3). Oleogéis com diferentes
longo. Também examinamos os efeitos de diferentes ceras naturais, quantidades de cera foram preparados nas mesmas condições, exceto
a quantidade de cera e a taxa de resfriamento durante a gelificação, pelo uso do método de resfriamento para a taxa de resfriamento 1. Para
juntamente com a possível atividade pró-oxidante da cera. Para oleogéis, a maior oxidação pode ter ocorrido na superfície. Para distribuir
tanto, amostras de organogel de óleo de peixe foram preparadas uniformemente o óleo oxidado no frasco, as amostras foram aquecidas a
com quatro ceras naturais diferentes, com diferentes quantidades 100-C por 4min, agitado vigorosamente e resfriado à temperatura
de cera, e por diferentes taxas de resfriamento e suas estabilidades ambiente. Embora esse procedimento tenha oxidado ainda mais as
oxidativas foram comparadas. amostras, achamos esse método o mais eficaz para misturar a amostra.
O controle, óleo de peixe a granel sem cera, também foi submetido a
este procedimento de aquecimento e mistura para oxidar nas mesmas
condições. As amostras foram armazenadas no congelador (–20-C) até as
2. Seção Experimental
análises. Três réplicas foram usadas para cada amostra. Como o calor
2.1. Materiais estava envolvido na preparação de oleogéis para dissolver cera em óleo,
foi necessário confirmar que o calor não causou nenhuma diferença no
O óleo de peixe comercial foi adquirido da Nordic Naturals estado de oxidação das amostras iniciais de oleogéis, especialmente,
(Watsonville, CA, EUA). Cera de farelo de arroz (RBW), cera de para oleogéis com diferentes ceras devido à possível atividade pró-
girassol (SW), cera de candelila (CW) e cera de abelha (BW) oxidante de cera. Para isso, amostras de 0h foram preparadas e
foram obtidas da Glenn Corporation (Lake Elmo, MN), TKB analisadas separadamente em cada conjunto de experimentos. Foi
Trading (Oakland, CA), Sigma-Aldrich (St. Louise, MO) e Koster confirmado que não houve diferença significativa nos estados de
Keunen Inc. (Watertown, CT), respectivamente. Os padrões de oxidação de amostras de 0 h.
éster metílico de ácido graxo (FAME) foram adquiridos da Nu-
Chek Prep (Elysian, MN, EUA). Tiocianato de amônio, cloreto de
bário, sulfato de ferro (II) heptahidratado, 2,2,4-trimetilpentano 2.3. Valor de Peróxido (PV)
(isooctano) e Sudão III foram adquiridos da Sigma – Aldrich (St.
Louis, MS, EUA). Clorofórmio deuterado (CDCl3) foi adquirido de O valor de peróxido (PV) foi determinado usando um método padrão
Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA). HPLC- da International Dairy Federation (IDF) modificado.[23]Em

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este método a concentração de férrico (Fe3º) foram determinados (1,4 ml), KOH metanólico (2N, 200ml) foi adicionada e a solução foi
íons, que foram formados pela oxidação de ferrosos (Fe2º) íons via agitada em vórtex por 2 min. Após 1 minuto de repouso, a porção
peróxidos. Portanto, a curva padrão da absorbância em 510 nm hexânica foi transferida para um frasco autoamostrador. A análise
versus diferentes férricos (Fe3º) concentrações de ferro foi preparado das concentrações de FAME foi realizada com um Agilent 6890 GC
com 1 15 μg Fe3º/ml em 7:3 clorofórmio/metanol usando um (Palo Alto, CA, EUA) equipado com uma coluna capilar Supelco
espectrofotômetro UV/Vis, PerkinElmer Lambda 35 (Perkin Elmer, SP-2380 (Bellefonte, PA, EUA, 30 0,25 mm ID 0,20mm filme). As
Waltham, MA, EUA). Uma solução de cloreto ferroso foi preparada condições de GC empregadas foram as seguintes: Vazão 1ml min1
previamente pela adição lenta de solução de cloreto de bário (0,2 g (Hélio), temperatura do injetor 220-C, temperatura do forno 185-C,
em 25ml de água DI) a uma solução de sulfato ferroso (0,25 g FeSO4 proporção de divisão 50:1 e temperatura FID 220-C. Os picos foram
-7H2O em 25ml de água desionizada) e adicionando 1ml de 10NHCl identificados com padrões FAME comerciais. As proporções de área
enquanto mexe. Amostras de oleogel (aproximadamente 10 mg) relativa (%) de EPA e DHA para a soma das áreas de todos os picos
foram pesadas em tubos de ensaio (Pyrex, 16 150 mm) e diluídas de ácidos graxos são relatadas. As amostras foram analisadas em
com clorofórmio/metanol (7:3, 9,8 ml). Tiocianato de amônio (50 μl, duplicado.
0,3 gml1) foi adicionado ao tubo de ensaio e agitado por 10-15 s. A
solução de cloreto ferroso foi então adicionada ao tubo de ensaio
contendo a amostra e agitada por 10 a 15 segundos. A amostra foi 2.6. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)
deixada em repouso por 5min em luz suave, então transferida para
cubetas de quartzo, e a absorbância de cada solução foi medida a Os experimentos DSC foram realizados em um TA Instruments DSC,
510 nm no espectrofotômetro UV/Vis. As amostras foram analisadas Modelo Q2000 (New Castle, DE) com um sistema de resfriamento
em duplicado. O PV foi calculado usando a seguinte equação: refrigerado. A calibração foi feita com uma panela vazia para linha
de base e com índio para temperatura. Amostras (7–8mg) foram
pesadas em potes de alumínio Tzero e encapsuladas. A amostra foi
ðComo Abº m equilibrada a 90-C por 5min, resfriado a 60-C em 10-Cmin1, fixado em
PV¼
55:84 mo 2 60-C por 20min, e então aquecida a 120-C em 10-Cmin1sob
nitrogênio seco purgado a 50ml min1. Os dados foram analisados
As: A absorbância da amostra,Ab: A absorção do branco,m:A usando o software TA Universal Analysis. Duas réplicas analíticas
inclinação da curva padrão,mo: Massa da amostra. foram calculadas em média para cada amostra.

2.9. Análise de Oxidação por1Espectroscopia de RMN H


2.4. Valor Dieno Conjugado (CDV)
O1H NMR é conhecido por ser um método analítico confiável,
O valor do dieno conjugado (CDV) foi medido usando o método especialmente para óleo aquecido a temperaturas relativamente altas.[28]
oficial AOCS Ti 1a-64.[24]Resumidamente, oleogel (aproximadamente Para amostras de oleogel aquecidas a 90-C, o1O método H NMR foi usado
10 mg) foi pesado em um tubo de ensaio (Pyrex, 16 125 mm), para determinar o estado de oxidação dos oleogéis juntamente com a
isooctano (10 ml) foi adicionado ao tubo de ensaio, a solução foi análise FAME. Em resumo, as amostras de oleogel (cerca de 80 μl) foram
deixada em repouso por 10 a 15 minutos, 1,0 ml de solução foi dissolvidas em CDCl3(cerca de 0,6 ml) e transferido para tubos de RMN.
removido para um novo tubo de ensaio e diluído com isoctano (9ml). 1Os espectros H NMR foram adquiridos em um espectrômetro
A solução foi transferida para uma cubeta de quartzo e a Bruker (Billerica, MA) Avance 500 operando a 500 MHz. O software
absorbância foi medida com um espectrofotômetro PerkinElmer SpinWorks 3.1.7 foi usado para integrar sinais usando o sinal de
Lambda 35 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) UV/Vis a 233 nm.[25] prótons do backbone de triacilglicerol (quatro prótons, a 4,06–4,36
As amostras foram analisadas em duplicado. O CDV foi determinado ppm) como o pico padrão. Perdas de olefínico (5,29–
usando a seguinte equação: 5,45 ppm) e prótons bissílicos (2,17–2,85 ppm) são relatados.
-- Nenhuma réplica analítica foi testada porque não foram observadas
As diferenças substanciais com análises repetidas com uma amostra
CDV¼0:84 ko
bc conforme relatado anteriormente.[28]

ko: Absortividade por grupos ácidos ou ésteres,As: Absorvância


observada a 233 nm da amostra,b:Comprimento da cubeta em cm,c: 2.10. Experiência de penetração de cor
Concentração da amostra em g L1.
Na suposição de que a taxa de difusão do corante através do oleogel
reflete a taxa de difusão do oxigênio, um novo método foi desenvolvido
2.5. Análises de EPA e DHA neste estudo. Para oleogéis de cera de óleo de peixe a 3%, cera (1,08 g)
foi pesada em um balão Erlenmeyer de 100 ml e óleo de peixe (34,92 g)
Os níveis dos principais ácidos graxos no óleo de peixe, ácido foi adicionado. Enquanto o argônio era soprado sobre o óleo, a mistura
eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosahexaenóico (DHA) foram determinados era aquecida em uma placa de aquecimento com agitação de vez em
pela conversão do óleo em éster metílico de ácido graxo (FAME), seguido de quando até que a cera fosse dissolvida. Enquanto o argônio foi soprado,
análise de ácidos graxos com cromatografia gasosa (GC).[26,27]Resumidamente, a solução foi transferida para três tubos NMR (9,9 mm OD 180 mm altura,
a amostra de oleogel (cerca de 10 mg) foi dissolvida em hexano Precision NMR Sample Tubes, New Era Enterprises, Inc.,

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Vineland, NJ) até a altura de 10 cm do fundo. Os tubos de amostra foram 3 Resultados e discussão
colocados em um rack de metal para mantê-los na posição vertical,
3.1. Oxidação de Oleogéis de Cera-Óleo de Peixe a 3% a 35-C
aquecidos em 90-Forno C por 15min. As amostras foram movidas para
outro rack de metal em temperatura ambiente para resfriá-las. O mesmo
O primeiro objetivo deste estudo foi investigar a eficácia de diferentes ceras na
procedimento foi seguido para oleogéis com diferentes quantidades de
proteção do óleo de peixe contra a oxidação. Para tanto, oleogéis de cera de
cera. Sudan III (0,09 g) foi dissolvido em óleo de peixe (180 g) em um
óleo de peixe a 3% foram preparados com quatro ceras diferentes, cera de
béquer de 300 ml com agitação para preparar a solução de Sudan III a
farelo de arroz (RBW), cera de girassol (SW), cera de candelilla (CW) e cera de
0,05% em óleo de peixe. A solução de Sudan III foi adicionada
abelha (BW) e armazenados a 35 e 50-C, que eram conhecidas por terem
suavemente no topo da amostra de oleogel no tubo de NMR até a marca
habilidades de gelificação mais fortes do que outras ceras.[5]figura 1a mostra
feita 5 cm acima do nível do oleogel. As amostras foram colocadas na
valores de peróxido (PV) de amostras de oleogel de óleo de peixe SW a 3%
estante metálica para mantê-las na posição vertical e armazenadas a 35 e
armazenadas a 35-C por 0, 7 e 21 dias. É sabido que o PV atinge um valor de
50-C. Em geral, a cor desenvolveu-se de forma desigual. Portanto, foram
pico em um curto período de tempo e, portanto, apenas os valores medidos
calculadas as médias das distâncias máxima e mínima.
antes do pico são significativos para a comparação de diferentes amostras.[29]
Em nosso estudo, o PV atingiu um pico no dia 21 para todas as amostras aos
35-C e os dados mais significativos foram obtidos no dia 7. No dia 7, os PVs de
2.11. Estatisticas todas as amostras de oleogel de óleo de peixe 3% SW foram menores do que o
controle, indicando que, independentemente do tipo de cera, a oxidação do
Todos os experimentos de armazenamento a 35 e 50-Experimentos de C óleo de peixe foi reduzida pela gelificação o óleo. Na comparação entre ceras,
e penetração de cor foram realizados em triplicata e em ordem aleatória. BW e CW mostraram significativamente (P¼0,05) PVs mais baixos do que RBW.
As análises de PV, CDV, FAME e DSC foram realizadas em duplicata. Os A circulação do óleo é significativamente reduzida pela gelificação em
dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) unidirecional e comparação com o óleo a granel. Portanto, acredita-se que a circulação
todas as médias dos dados de oxidação foram comparadas pelo teste relativamente mais lenta do óleo no oleogel levou à oxidação mais lenta do
Tukey-Kramer HSD com significância estatística em um “P” valor menor óleo no oleogel. Kodali[19]também relatou aumento mais lento
ou igual a 0,05.

Figura 1.Oxidação de organogéis de cera de óleo de peixe a 3% a 35-C: a) PV até 21 dias, b) CDV até 49 dias, c) concentrações relativas de EPA (20:5) e d) DHA (22:6) até 56 dias.
As barras de erro representam desvios padrão. Meios que não compartilham a(s) mesma(s) letra(s) são significativamente diferentes pelo teste Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

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em PV com oleogel formado com cera de carnaúba e RBW. No entanto, oxidação do que o controle (o óleo de peixe a granel) indicando a
Ogutcu, et al.[12]relataram resultados contraditórios de que o oleogel CW proteção efetiva do óleo de peixe por gelificação com cera. CW e SW
mostrou um PV mais alto do que o óleo a granel e que o oleogel BW deu apresentaram a melhor proteção seguida por BW e depois RBW. No
um PV semelhante ao óleo a granel a 20-C. A razão para resultados geral, das quatro diferentes indicações de oxidação, a CW foi a cera
diferentes pode ser devido às diferentes condições experimentais, como mais eficaz na proteção do óleo de peixe contra a oxidação a 35-C.
a temperatura de armazenamento e a relação entre a área superficial e o
volume da amostra.
Embora o nível de oxidação possa aumentar além do nível aceitável
durante um longo período de armazenamento, o efeito da cera será 3.2. Oxidação de Oleogéis de Cera-Óleo de Peixe a 3% a 50-C
mostrado mais claramente após um longo período de armazenamento.
Portanto, para melhor compreensão dos efeitos de diferentes ceras na Os valores de peróxido (PV) das amostras de oleogel tornaram-se tão
oxidação do óleo de peixe, armazenamos 3% de oleogéis de cera e óleo aleatórios após o dia 7 aos 50-C e apenas os dados no Dia 3 mostraram
de peixe por 59 dias a 35-C e mediu o valor de dieno conjugado (CDV), resultados significativos (Figura 2a). O resultado mais notável foi o BW, que
que, em geral, atinge um valor de pico depois de PV (Figura 1b). apresentou o menor PV a 35-C, não apresentou efeito protetor a 50-C. Além
Conforme mostrado na Figura 1b, a análise CDV também mostrou que disso, ao contrário dos resultados em 35-C, RBW apresentou o melhor efeito. O
todas as quatro ceras protegeram efetivamente o óleo de peixe da CDV dos oleogéis armazenados a 50-Atingiu o valor máximo aos 35 dias e
oxidação. Após 56 dias, CW mostrou um efeito melhor do que RBW, SW e depois disso, os valores tornaram-se tão aleatórios que nenhuma informação
BW. A oxidação do oleogel também foi determinada pela análise FAME. significativa foi obtida. Portanto, apenas CDV até 35 dias são relatados (Figura
Entre outros ácidos graxos analisados, dois ácidos graxos, ácido 2b). No dia 35, todas as ceras, exceto BW, mostraram o óbvio efeito protetor
eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosahexaenóico (DHA) são relatados por gelificação. CW apresentou o menor CDV entre as ceras. A concentração de
neste estudo (Figura 1c,d). Esses ácidos graxos são os mais importantes EPA (Figura 2c) também mostrou que o BW não deu o efeito protetor e, ao
para os benefícios à saúde e os mais afetados pelo processo de oxidação. contrário, apresentou diminuições mais rápidas nas concentrações desses
As concentrações de EPA e DHA para todas as amostras não foram ácidos graxos. A análise de DHA mostrou resultados muito semelhantes aos de
significativamente diferentes até 35 dias. No entanto, no dia 56, todas as EPA (dados não mostrados). Oleogéis feitos com SW e RBW também
amostras de oleogel mostraram menos apresentaram menor

Figura 2.Oxidação de organogéis de cera de óleo de peixe a 3% a 50-C: a) PV no Dia 3, b) CDV até 49 dias, c) concentração de EPA (20:5), d) concentração de DHA (22:6) e e)
Curvas DSC de 3% de peixe cera oleogéis de óleo durante o aquecimento a 10-Cmin1. As barras de erro representam desvios padrão. Meios que não compartilham a(s) mesma(s)
letra(s) são significativamente diferentes pelo teste Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

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concentrações de EPA no Dia 49. Portanto, ao contrário do PV e do algumas diferenças nos mecanismos de oxidação eram esperadas em
CDV que indicam o efeito protetor da cera, os dados da EPA no Dia diferentes temperaturas, o estudo de aquecimento a 90-C foi a melhor
49 mostraram que as ceras podem ter exibido a atividade pró- forma de investigar a atividade pró-oxidante da cera. PV e CVD não foram
oxidante. Yilmaz et ai.[13]também relataram maior PV e menor tempo considerados bons indicadores de oxidação do óleo a 90-C, pois atingem
de indução oxidativa (OIT) com um oleogel de óleo de peixe BW do um valor de pico muito rapidamente. O método NMR[28]é conhecido por
que o controle (óleo de peixe a granel), indicando a atividade pró- ser um método muito confiável para avaliar a oxidação lipídica em
oxidante do BW. Diferentes indicações de oxidação lipídica muitas temperaturas relativamente altas. Portanto, o método NMR foi usado
vezes dão resultados contraditórios.[21]Portanto, os diferentes para determinar a oxidação do óleo, além da análise FAME. tabela 1
resultados entre a análise FAME e as análises PV e CDV na Figura 2a- mostra perdas de EPA, DHA, prótons olefínicos e prótons bissílicos de
c podem ser explicados pela diferença entre a formação de um certo oleogéis de óleo de peixe de cera a 3% em comparação com o controle
tipo de produto de oxidação e o desaparecimento de materiais de (óleo de peixe a granel). Os dados de EPA e DHA mostraram que, embora
partida.[29] alguns não sejam estatisticamente significativos emP¼0,05, a tendência
Compreender as diferentes tendências observadas aos 35 e geral foi que a cera acelerasse a oxidação do óleo de peixe. As perdas de
50 anos-C, experimentos de DSC foram conduzidos (Figura 2d). prótons olefínicos e bisalílicos observadas no espectro de RMN
O início da fusão e as temperaturas de pico de fusão para BW mostraram a atividade pró-oxidante mais óbvia da cera. Portanto, pode-
foram medidos em 34,2-1,7-C e 50,12-0,4-C, respectivamente, se concluir que a cera atua como pró-oxidante, o que deve ser
indicando que uma quantidade significativa de BW foi derretida considerado um fator importante na aplicação da tecnologia de oleogel
a 50-C. Acredita-se que a maioria dos cristais BW derreteu e as em alimentos. Se os principais componentes da cera, como ésteres de
redes de cristal de cera foram comprometidas em 50-C. Em cera e hidrocarbonetos, não forem considerados como pró-oxidantes de
contraste, CW tendo o pico de fusão mais baixo (45,5-0,4-C) suas estruturas moleculares, ingredientes menores na cera[31]podem ser
mostrou efeitos protetores significativos para PV e CDV aos 50- os principais pró-oxidantes na cera.
C. Isso pode ser explicado pelo pequeno segundo pico de fusão
em 67,7-0,1-C, que pode ter mantido a estrutura do gel mesmo a
50-C e retardou a oxidação do óleo. Mais de um pico DSC de CW 3.4. Estudo de Firmeza e Penetração de Cor
é atribuído a seus vários componentes, incluindo nalkane C29-
C33 (49-50%), ésteres de maior peso molecular (20-29%), ácidos Embora a capacidade de ligação do óleo e a reologia sejam amplamente
livres (7-9%) e resinas (12 –14%, principalmente éster utilizadas para examinar as propriedades físicas do oleogel, é inevitável
triterpenóide.[30]Em contraste, o oleogel 3% RBW-FO com o que a rede cristalina do oleogel seja parcialmente ou completamente
ponto de fusão mais alto mostrou o PV mais baixo e o CDV quebrada durante esses experimentos e, conseqüentemente, as
relativamente baixo a 50-C. Embora existam outros fatores que propriedades medidas com esses métodos são após a rede cristalina
afetam o efeito de proteção, como estruturas cristalinas de cera inicial ter sido quebrado. No entanto, a oxidação do óleo de peixe no
e suas redes, o ponto de fusão da cera pode ser um fator que oleogel neste estudo está mais intimamente relacionada à rede cristalina
pode afetar a oxidação do oleogel. e ao óleo imobilizado resultante do que às propriedades físicas após a
quebra da rede. Uma propriedade que pode refletir a densidade da rede
é a firmeza, a força exigida pela sonda para quebrar a rede cristalina
3.3. Oxidação de Oleogéis de Cera-Óleo de Peixe a 3% a 90-C inicial. Para entender se a firmeza se correlaciona com a taxa de oxidação
do óleo de peixe, foram medidas as firmezas dos oleogéis (Figura 3a). O
Para investigar se a cera atua como pró-oxidante, realizamos outro resultado mostra que o oleogel 3% SW apresentou maior firmeza que os
estudo de aquecimento a 90-C. Aos 90-C, todos os ingredientes da cera outros três oleogels. A tendência encontrada nos dados de firmeza não
foram dissolvidos para que o efeito gelificante fosse eliminado. Embora se correlacionou bem com

Tabela 1.Oxidação de oleogéis de cera de peixe a 3% durante aquecimento a 90-C por 5 e 10 dias.

Ao controle 3% RBW 3% SW 3% peso corporal 3% CW

5 dias

% Perda de EPA 2,18-0,13b 2,39-0,88b 3,56-0,32a 3,37-0,30a 3,41-0,24a


% Perda de DHA 12,96 -1,62c 13.26-0.72c 16,61 -0,41ab 17.37-0.68a 15,92-0,37b
% Perda de H olefínico 3,38-0,09c 5,02-0,07b 5,45-0,18b 5,01-0,26b 5,71-0,47ab
% Perda de H bisalílico 4,18-0,09b 5,79-0,11a 6,27-0,21a 5,84-0,22a 6,04-0,40a

10 dias
% Perda de EPA 6,54-0,12c 6,78-0,33bc 7,66-0,40a 7,43-0,43ab 6,92-0,26abc
% Perda de DHA 19,91 -0,82b 20.07-0.19b 22.18-0.31a 22.28-0.17a 21.15-0.43ab

% Perda de H olefínico 6,31-0,31bc 7,57-0,32a 7,95-0,16a 7,71-0,13a 6,74-0,30b


% Perda de H bisalílico 8,87-0,24b 9,92-0,40a 10.17-0.61a 10.13-0.21a 8,59-0,25b

Valores que não compartilham a mesma letra (s) dentro de cada linha são significativamente diferentes pelo teste Tukey-kramer HSD (P<0,05).

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Figura 3.a) Firmeza de oleogéis de cera de peixe a 3%, b) uma imagem representativa de amostras para experimentos de penetração de cor, c) penetração de cor a 35-C e d)
penetração da cor a 50-C. As barras de erro representam os desvios padrão. Meios que não compartilham a(s) mesma(s) letra(s) são significativamente diferentes pelo teste
Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

marcadores de oxidação do óleo. Isto indica que o SW, tendo a a atividade pró-oxidante de SW. Conforme mostrado na Tabela 1, constatou-se
maior resistência física, não possui necessariamente a rede mais que o SW tinha uma atividade pró-oxidante mais forte que o CW e o RBW,
densa que impede a difusão do oxigênio no gel a 35 e 50-C. embora alguns valores não tenham sido estatisticamente significativos em P¼
0,05.
Na tentativa de desenvolver um novo método que possa explicar e
prever a eficácia da cera na prevenção da oxidação do óleo, foi concebido
o experimento de penetração de cor. Neste método, assumiu-se que a 3.5. O efeito da taxa de resfriamento
taxa de difusão do corante através do oleogel pode refletir a taxa de
difusão do oxigênio. O estudo de penetração de cor foi realizado aos 35-C A taxa de resfriamento é um fator muito importante para determinar as
e 50-C. A Figura 3b mostra a imagem representativa das amostras propriedades do oleogel. O resfriamento mais rápido durante o processo
armazenadas por 13 dias a 35-C. A Figura 3c mostra a medição da de gelificação aumenta significativamente a firmeza do oleogel. Nosso
penetração da cor de quatro diferentes amostras de oleogel estudo anterior mostrou que a firmeza do oleogel de óleo de soja com
armazenadas a 35-C. A penetração de cor mais lenta para oleogéis CW e 3% de SW aumentou cerca de quatro vezes com o aumento da taxa de
SW a 3% no dia 6 explicou bem a oxidação mais lenta desses oleogéis resfriamento de 1 para 4-Cmin1.[5]O resfriamento mais rápido produz um
mostrada nas análises de CDV, EPA e DHA. Portanto, a taxa de número maior de cristais de cera menores e fornece uma rede cristalina
penetração da cor correlacionou-se com as taxas de oxidação dos tridimensional mais densa.[32]Blake e Marangoni[33]também relataram
oleogéis melhor do que com os valores de firmeza. A Figura 3d mostra a que o resfriamento rápido diminuiu o comprimento do cristal, diminuiu a
taxa de penetração de cor a 50-C. Aos 50-C, 3% BW oleogel mostrou uma fração da área de poros da rede e aumentou a dimensão fractal da rede
penetração de cor tão rápida que a cor penetrou até o fundo da amostra cristalina, resultando em um aumento na capacidade de ligação do óleo
em 1 dia e, portanto, a Figura 3d não tem o resultado de BW. A dos oleogéis de cera-óleo de amendoim. Para entender o efeito da taxa
penetração de cor mais rápida de 3% BW oleogel bem correlacionada de resfriamento na eficácia do oleogel em proteger o óleo de peixe da
com a pior proteção do óleo de peixe da oxidação por BW mostrado em oxidação, 3% de SWoleogels foram preparados em três taxas de
todas as análises; PV, CDV, EPA e DHA a 50-C. No entanto, a penetração resfriamento diferentes.Figura 4a mostra PV de 3% de oleogéis de óleo
de cor mais lenta observada com 3% SW oleogel não forneceu a melhor de peixe SW preparados na taxa de resfriamento de 5,3-Cmin1, 11,0-Cmin
proteção da oxidação do óleo, o que pode ser atribuído a 1, e 25,3-Cmin1e armazenado a 35-C. No dia 21, o PV de todas as três
amostras atingiu o pico e não mostrou estatisticamente

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Figura 4.Oxidação de organogéis de óleo de peixe SW a 3% preparados em diferentes taxas de resfriamento: A) PV, b) CDV e c) EPA a 35-C e d) PV, e) CDV e f) EPA a 50-C. As
barras de erro representam os desvios padrão. Meios que não compartilham a(s) mesma(s) letra(s) são significativamente diferentes pelo teste Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

diferenças significativas entre os oleogéis. No dia 7, oleogéis de 3% SW mais cera não fornecia melhor proteção ao óleo. Novamente, os valores
preparados nas taxas de resfriamento mais rápidas, 11,0 e 25,3-- Cmin1, de PV no dia 21 já atingiram o valor máximo e não deram resultados
mostrou o PV mais baixo do que o oleogel preparado na taxa de significativos. A análise CDV mostrou que a oxidação de 9% SWoleogel foi
resfriamento mais lenta, 5,3-Cmin1. A Figura 4b também mostrou que as mais rápida do que 1-7% SWoleogels como mostrado na Figura 5b. A
taxas de resfriamento mais rápidas resultaram em CDVs mais baixos. A atividade pró-oxidante do SW foi mais pronunciada nos níveis de EPA e
análise FAME também mostrou reduções mais lentas em EPA e DHA com DHA, que diminuíram mais rapidamente com oleogéis com maiores
oleogéis preparados em taxas de resfriamento de 11,0 e 25,3-Cmin1do concentrações de SW. A Figura 5c mostra a mudança de EPA. O DHA
que o preparado em 5.3-Cmin1. A Figura 4c mostra a mudança no EPA (o mostrou uma tendência muito semelhante à do EPA e os dados não são
DHA mostrou uma tendência muito semelhante ao EPA). No geral, mostrados. Esses resultados indicam que mais SW afetou adversamente
aumentando a taxa de resfriamento de 5,3-Cmin1para 11,0-Cmin1mostrou a proteção do óleo contra a oxidação devido à atividade pró-oxidante do
a melhora mais significativa do que aumentar de 11,0 para 25,3-Cmin1. SW, conforme visto na Tabela 1. Os valores de PV no dia 7 não mostraram
essa atividade de pró-oxidação, presumivelmente devido ao tempo de
Aos 50-C, os dados de PV no dia 3 mostraram que aumentar a taxa de armazenamento muito curto para mostrar este efeito.
resfriamento de 5,3-Cmin1a 11,0 e 25.-Cmin1reduziu significativamente a Aos 50-C, PVs mais baixos foram observados com concentrações mais
oxidação do oleogel (Figura 4d). Os valores de CDV também mostraram altas de SW (5–9%) do que SW mais baixo (1–3%) no Dia 3, enquanto a
que o resfriamento mais rápido proporcionou melhor proteção do óleo concentração além de 5% não melhorou ainda mais o efeito protetor
de peixe contra a oxidação (Figura 4e). A mudança nas concentrações de (Figura 5d). Não foram obtidos dados significativos no Dia 7, uma vez que
EPA (Figura 4f) confirmou que a taxa de resfriamento mais rápida poderia todos os PV ultrapassaram o valor de pico (dados não mostrados). O CDV
fornecer melhor proteção ao óleo. Da mesma forma que os resultados mostrou que 3–9% de SW protegeu melhor o óleo de peixe da oxidação
aos 35-C, a melhoria observada ao aumentar a taxa de resfriamento de do que 1% de SW (Figura 5e). CDV's de oleogéis de 3-9% de SW foram
11,0 para 25,3-Cmin1não foi tão significativo quanto o observado ao menores do que de 1% de oleogel de SW durante o período de
aumentá-lo de 5,5 para 11,0-Cmin1. armazenamento do dia 7 ao dia 21 e tornaram-se semelhantes no dia 35.
Portanto, concluiu-se que cerca de 3-5% de SW foi o mais otimizado
concentração para evitar a oxidação do óleo até 21 dias a 50-C. A
3.6. Efeito da quantidade de cera concentração de EPA até 35 dias não apresentou diferenças significativas
entre os oleogéis (Figura 5f). No entanto, 9% de SW apresentou oxidação
A maior concentração de cera proporciona um oleogel com maior mais rápida do que 1–7% de SW, indicando a atividade pró-oxidante do
firmeza, redes cristalinas mais densas e maior ponto de fusão.[5,32] SW. Portanto, quanto mais cera no oleogel não proporciona
Para entender o efeito da concentração de cera na proteção do óleo, necessariamente melhor proteção do óleo de peixe contra a oxidação.
oleogéis feitos com cinco concentrações diferentes de SW foram Para entender melhor o efeito da concentração de SW, os
examinados (Figura 5).A Figura 5a mostra que a quantidade de SW experimentos de penetração de cor foram conduzidos a 35 e 50-C
não afetou o PV inicial (4,36, 3,95, 4,31, 4,26 e 4,47meq Kg1 (Mesa 2).Em contraste com o resultado aos 35-C que não apresentou
para oleogéis de 1, 3, 5, 7 e 9% de SW, respectivamente, no Dia 0). Após 7 dias diferenças significativas, a taxa de penetração da cor a 50-C diminuiu
aos 35-C, 5% SW apresentou menor PV do que outros oleogéis, mas significativamente com uma maior concentração de SW. Esse

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Figura 5.Oxidação de organogéis de óleo de peixe contendo 1, 3, 5, 7 e 9% de SW: a) PV, b) CDV ec) EPA a 35-C e d) PV, e) CDV e f) EPA a 50-C. As barras de erro representam os
desvios padrão. Meios que não compartilham a(s) mesma(s) letra(s) são significativamente diferentes pelo teste Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

Mesa 2.Penetração de cor (cm), perda de EPA (%) e perda de prótons olefínicos (%) de 1-9% de oleogéis de óleo de peixe SW.

1% SW 3% SW 5% SW 7% SW 9% SW

Penetração de cor, 35-C, Dia 6 1,13-0,06a 1,03-0,23a 1,37-0,50a 1,17-0,15a 1,33-0,32a


Penetração de cor, 35-C, Dia 13 1,63-0,06a 1,90-0,35a 1,47-0,50a 1,43-0,06a 1,47-0,47a
Penetração de cor, 50-C, Dia 6 1,80-0,06ab 1,67-0,00abc 1,63-0,00bcd 1h30-0h10cde 0,97-0,12e

Penetração de cor, 50-C, Dia 13 2,67-0,06a 2,07-0,15b 2,07-0,25b 1,60-0,15cde 1,23-0,15ef


Perda de EPA, 90-C, Dia 5 2,23-0,74b 3,56-0,32a 3,47-0,27a 3,70-0,30a 3,48-0,21a
Perda de EPA, 90-C, dia 10 7,21-0,51a 7,66-0,40a 7,48-0,74a 7,78-0,34a 7,77-0,30a
Perda de prótons olefínicos, 90-C, Dia 5 4,71-0,40d 5,45-0,18d 6,56-0,44c 7,18-0,55bc 8,90-0,07a

Perda de prótons olefínicos, 90-C, dia 10 7,57-0,43de 7,95-0,16d 8,92-0,14c 10,51-0,16b 11,50-0,33a

Meios que não compartilham a(s) mesma(s) letra(s) em cada linha são significativamente diferentes pelo teste Tukey-Kramer HSD (P<0,05).

indica que embora 1% SW fosse bom o suficiente para uma rede A atividade pró-oxidante da cera deve ser considerada para
densa evitar a difusão de petróleo a 35-C, a maior concentração de entender a oxidação de oleogéis, além de redes cristalinas
SW forneceu as redes cristalinas mais densas para reduzir mais que diminuem a taxa de difusão de oxigênio através de
efetivamente a difusão do óleo a 50-C. oleogéis.
Para investigar se mais cera causava a atividade pró-oxidante mais séria, o
estudo de aquecimento a 90-C foi realizado (Tabela 2). Mais uma vez, o efeito
gelificante na oxidação do óleo foi eliminado, pois todos os cristais de cera
4. Conclusões
fundiram a 90-C e, portanto, apenas o efeito do SW fundido foi mostrado neste
experimento. Os oleogéis de 3-9% de SW mostraram uma perda mais rápida Conclui-se que a tecnologia do oleogel pode ser utilizada como método
de EPA do que o oleogel de 1% de SW no Dia 5, indicando a possível atividade para prevenir a oxidação do óleo por meio da imobilização do óleo. Para
pró-oxidante do SW. O sinal olefínico do próton na RMN mostrou uma maior eficácia, a quantidade e o tipo de oleogelador devem ser
atividade pró-oxidante mais clara do SW. A maior perda de prótons olefínicos escolhidos com cuidado. Neste estudo, descobriu-se que o BW não teve
foi observada com maior concentração de SW. Os dados de DHA e de prótons um desempenho tão eficaz quanto outras ceras a 50-C devido ao seu
bisalílicos eram quase idênticos aos de EPA e de prótons olefínicos, baixo ponto de fusão. A cera de Candelilla (CW) com dois picos de fusão
respectivamente, e portanto esses dados não são apresentados. Este resultado em DSC mostrou um efeito protetor melhor do que BW a 50-C, embora o
indica que o maior pico de fusão de CW tenha aparecido em um

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temperatura do que o pico de fusão de BW. Todas as ceras utilizadas [6] HS Hwang, M. Singh, JK Winkler-Moser, EL Bakota, SX Liu,J. Food
neste estudo exibiram uma certa atividade pró-oxidante. Portanto, a Sci.2014,79,C1926.
atividade pró-oxidante da cera deve ser considerada um fator [7] AM Minihane, DL Givens, RA Gibbs,Benefícios para a saúde de alimentos
importante na aplicação da tecnologia do oleogel. A medição da orgânicos: efeitos do meio ambiente,I. Givens, S. Baxter, AM Minihane, E.
Shaw (Eds.), CAB International, Oxfordshire (Inglaterra)2008, pág. 19.
penetração da cor que foi recentemente desenvolvida neste estudo
pode ser um método bom e conveniente para prever a eficácia dos
[8] KS Sidhu,Regul. Toxicol. Pharmacol.2003,38,336.
oleogéis na prevenção da oxidação do óleo, embora sozinha não
[9] JW Finley, F. Shahidi,SCA Simp. Ser.2001,788,2.
possa fornecer informações completas sobre a oxidação do oleogel. [10] B. Ganesan, C. Brothersen, DJ McMahon,Crit. Rev. Food Sci. nutr.
2014,54,98.
[11] C. Jacobsen,Ana. NY Acad. Ciência.2010,1190,141.
[12] MO€gütcü, N. Arifoglu, E. Yilmaz,Int.J. Ciência Alimentar. Tecnologia2015,50,404.
[13] E. Yeulmaz, M. O €gütcü, N. Arifoglu,J. Oleo Sci.2015,64,1049.
Reconhecimentos
[14] M. O€gütcü, R. Temizkan, N. Arifoglu, E. Yeulmaz,J. Oleo Sci.2015,
Os autores gostariam de agradecer a Lynne Copes, Julie Anderson e 64,713.
Ashley Wayman pelo excelente trabalho técnico. A menção de nomes [15] PT Frankel,Prog. Lipid Res.1980,19,1.
comerciais ou produtos comerciais neste artigo tem o único objetivo de [16] PT Frankel,Lipid Res.1983,22,1.
fornecer informações científicas e não implica recomendação ou endosso [17] PT Frankel,Chem. Física lipídios1987,44,73.
do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um [18] S. Da Pieve, S. Calligaris, A. Panozzo, G. Arrighetti, MC Nicoli,Alimentos
provedor e empregador de oportunidades iguais. Res. Int.2011,44,2978.
[19] Dr. Kodali,Lipid Technol.2009,21,254.
[20] MO €gütcü, N. Arifoglu, E. Yeulmaz,Geléia. Petróleo Chem. Sociedade2015,
92,459.
Conflito de interesses
[21] JI Gray,Geléia. Petróleo Chem. Sociedade1978,55,539.
Os autores declaram não haver conflito de interesses. [22] A. Kamal-Eldin, J. Pokorn,Análise de Oxidação Lipídica,A. Kamal-Eldin,
J. Pokorny (Eds.), AOCS Publishing, Champaign (Illinois)2005,
pág. 1.
[23] MC Shantha, EA Decker,J. AOAC Int.1994,77,421.
Palavras-chave
[24] AOCS, determinação espectrofotométrica de ácido dienoico
óleo de peixe, oleogel, óleo ômega-3, organogel, oxidação conjugado. Em: Métodos oficiais e práticas recomendadas da
American Oil Chemists' Society, American Oil Chemists' Society,
Champaign (Illinois) 1990. AOCS Official Method Ti 1a-64.
Recebido: 31 de agosto de 2017
[25] BA Brice, ML Swain,J. Op. Sociedade Sou.1945,35,532.
Revisado: 10 de janeiro de 2018
[26] KI Ichihara, A. Shibahara, K. Yamamoto, T. Nakayama,lipídios1996,
Publicado online: 30 de março de 2018
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