Metabolismo

Bioquímica e Metabolismo

1 TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

INTRODUÇÃO

Alguns compostos bioquímicos podem comportar-se como ácidos ou como bases,

no sentido de Bronsted (i.e dador ou aceitador de H+), dependendo do meio ou da
reacção em que participam. Os aminoácidos polares sem carga (ex. glicina, alanina,
treonina) comportam-se como ácidos fracos dipróticos. Os aminoácidos acídicos (ácido
aspártico, ácido glutâmico) comportam-se como ácidos fracos tripróticos enquanto que
os aminoácidos básicos (lisina, arginina) se comportam como bases fracas. Vejamos,
como exemplo, o comportamento ácido-base da glicina.
A glicina, ácido α-aminoacético ou, mais correctamente, ácido α-aminoetanóico,
é o mais simples dos aminoácidos encontrados nas proteínas. O seu átomo de carbono
α apresenta as quatro ligações de valência saturadas da seguinte maneira:
! uma por um grupo funcional amina (-NH2) NH2
! uma por um grupo funcional carboxilo (-COOH)
H Cα COOH
! duas por átomos de hidrogénio
H

Na realidade a glicina, em solução aquosa, pode apresentar qualquer uma das

três formas iónicas seguintes , dependendo do pH do meio:
+ +
NH3 NH3 NH2

H C COOH H C COO- H C COO-

H H H

a b c

A forma a (catiónica), apresenta o grupo amina carregado electricamente, a

forma b (ião dipolar) apresenta além do grupo amina também o grupo carboxilo
carregado, enquanto que a forma c (aniónica) apresenta unicamente o grupo carboxilo
com carga.
Ao dissolver a glicina, composto branco sólido cristalino, em água destilada, as
suas moléculas encontram-se com os grupos carboxilo e amina simultaneamente
ionizados:

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+
NH3 Esta forma denominada ião dipolar ou zwiterião
zwiterião,
iterião não
migra quando submetido a um campo eléctrico, pois a
H C COO-
sua carga eléctrica líquida é nula.
H

O valor de pH no qual se encontra predominantemente a forma zwitteriónica em

solução é designado pH isoeléctrico (pHi) ou, simplesmente, ponto isoeléctrico
isoeléctrico (pI
pI),
pI que
no caso da glicina é igual a 5,97 (≈ 6,00).
A acidificação, gradual, de uma solução de glicina em água destilada (em que há
predomínio de moléculas na forma de ião dipolar), é acompanhada de um progressivo
enriquecimento em H+, proveniente da dissociação do ácido. O grupo -COO- irá captar
esses protões, comportando-se este grupo funcional como uma base (no sentido de
Bronsted):

À medida que a acidez aumenta (diminuição do pH), verifica-se, portanto, uma

redução no número de moléculas na forma de ião dipolar enquanto que vai
aumentando o número de moléculas com o grupo carboxilo não dissociado (forma a,
catiónica), até atingir um valor de pH no qual o número de moléculas sob a forma
catiónica é igual ao número de moléculas na forma zwitteriónica. Este valor de pH é o
denominado pK1∗ (= 2,34, para a glicina) e corresponde, matematicamente, ao
logaritmo do inverso da constante de dissociação do grupo carboxilo, apresentando a
solução a este pH uma carga global de + 1/2. A continuação da acidificação do meio
para valores inferiores ao pK1 permite atingir um valor de pH (pH=1,2, para a glicina)
em que apenas subsistem em solução moléculas na forma catiónica, apresentando a
solução neste ponto uma carga eléctrica líquida de + 1.
Por outro lado, adicionando hidróxido de sódio (ou de potássio) ou qualquer
outra base forte à solução de glicina em água destilada, o meio será progressivamente
enriquecido em iões OH-, tornando-se cada vez mais alcalino. Os grupos -NH3+ dos
iões dipolares irão cedendo protões (que se combinarão com os iões OH-, formando-se
água) comportando-se este grupo funcional como um ácido (no sentido de Bronsted):

∗
pK1 = - logKd

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À medida que a alcalinidade aumenta (aumento do pH), verifica-se, portanto,

uma redução no número de moléculas na forma de ião dipolar enquanto que vai
aumentando o número de moléculas com o grupo amina não protonado (forma c,
aniónica), até atingir um valor de pH no qual o número de moléculas sob a forma
aniónica é igual ao número de moléculas na forma zwitteriónica. Este valor de pH é o
denominado pK2 (pH=9,60 para a glicina) e corresponde, matematicamente, ao
logaritmo do inverso da constante de dissociação do grupo amina, apresentando a
solução a este pH uma carga global de - 1/2. A continuação da alcalinização do meio
para valores superiores ao pK2 permite atingir um valor de pH (pH=12,5, para a
glicina) em que apenas subsistem em solução moléculas na forma aniónica,
apresentando a solução neste ponto uma carga eléctrica líquida de - 1.
Os valores de pK são os pontos médios de uma região na escala de pH, na qual
ocorrem pequenas variações de pH, mesmo quando são adicionadas grandes
quantidades de ácido ou base. Essa região é denominada zona tampão,
tampão e é localizada
no intervalo de pHs de pK±1.
Neste protocolo prático, estudamos o comportamento ácido-base de um
aminoácido (especificamente a glicina). A curva de titulação é construída num gráfico
de coordenadas xy, em que se relacionam os valores de miliequivalentes adicionados de
cada titulante (eixo dos xx’ - abcissas) com os valores de pH obtidos na titulação (eixo
dos yy’ - ordenadas). Nesta curva de titulação, os valores de pK são pontos de inflexão
da curva. O ponto isoeléctrico (pH isoeléctrico; pI) é o pH ao qual o aminoácido tem
uma carga líquida igual a zero. Para um aminoácido com dois grupos funcionais
tituláveis (por exemplo, glicina, alanina), esse ponto corresponde à semi-soma dos dois
valores de pK:

pK1 + pK 2
pI =
2
Os chamados pontos de equivalência da curva de titulação são os pontos em que
um equivalente de ácido ou base é adicionado na titulação de cada grupo funcional,
carboxilo ou amina, do aminoácido, quimicamente nestes pontos são encontrados, em
solução unicamente a glicina na forma catiónica (pH= 1,2) ou na forma aniónica (pH=
12,5).

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O pH pode ser calculado, teoricamente, para qualquer ponto da curva de

titulação, a partir de quantidades conhecidas de aminoácido no início e a quantidade
de titulante (ácido ou base) adicionada, por meio da equação de Henderson-
Hasselbalch. Para mais pormenores, consultar a "Bibliografia" abaixo indicada .

MATERIAL E REAGENTES:

! HCl 0,1 M ! potenciómetro (+ tampões de calibração)

! NaOH 0,1 M (ou KOH 0,1 M) ! placa de agitação (+ barra magnética)
! solução de aminoácido (glicina) 0,1 M ! pipetas de 20 ou 50 mL
! buretas de 25 mL ! copos de vidro de 100 mL (estreitos)
! funil

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A – Procedimento experimental a realizar

1 - Calibre o potenciómetro segundo as indicações do professor.

2 - Encha uma bureta com KOH 0,1 M (verifique, previamente, se a torneira da bureta
se encontra fechada).

3 - Pipete 30 ml de solução de aminoácido (glicina) para um copo de 100 ml e coloque

dentro do copo uma barra magnética.

4 - Mergulhe o eléctrodo combinado na solução de aminoácido e registe o seu pH.

Tenha cuidado para não danificar o eléctrodo com a barra magnética em agitação.

5 - Titulação da solução de aminoácido com KOH (ver "Advertência"): a) adicione um

pequeno volume (0,05 a 0,1 ml) de KOH 0,1 M; b) após estabilização do valor de
pH, registe no quadro I (páginas 7-8) o volume de titulante adicionado e o valor de
pH obtido; c) continue a adição de titulante, registando após cada adição o volume
total de titulante consumido e o correspondente valor de pH, até atingir pH=10,5.

6 - Lave o eléctrodo combinado com água destilada e mergulhe-o em água destilada.

7 - Titulação da solução de aminoácido com HCl (ver "Advertência"): repita a sequência

anterior (1 - 6), efectuando a titulação da solução de glicina com HCl 0,1 M até
atingir pH=1,5.

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8 - Para a realização de uma titulação precisa, deve-se fazer uma correção referente à
quantidade de titulante requerido para modificar o pH do solvente (neste trabalho
prático é a água). Para isso, quantidades variáveis de titulante (HCl e KOH,
separadamente) são adicionadas a 30 ml de água, de forma a que se obtenham
valores de pH semelhantes aos obtidos durante a titulação do aminoácido. Registe,
no quadro I (páginas 8-9) o pH e o volume gasto após a adição de titulante.

9 - No fim, lave bem o eléctrodo e deixe-o megulhado em água destilada.

Advertência:
A solução de titulante deve ser adicionada inicialmente em muito pequenas
quantidades (uma gota de cada vez e lentamente), enquanto se verificam grandes
variações de pH. Quando as variações de pH forem pequenas, podemos utilizar
maiores quantidades de titulante.

BIBLIOGRAFIA

a) – Nelson, D.L. e Cox, M.M. (2000) Lehninger’s Principles of Biochemistry, third

edition, Worth Publihers, New York.
b) - Weil, J.H. (1983), Bioquímica Geral, pp.17-79, Fundação Calouste Gulbenkian,
Lisboa.
c) - Morris, J. G. (1968), A Biologist's Physical Chemistry, pp.128-164, Edward Arnold
Ltd, London.
d) - Segel, I. H. (1976), Biochemical Calculations, 2nd Edition, pp.69-83, John Wiley and
Sons, New York
e) - Plummer, D. T. (1978) Practical Biochemistry, 2nd Edition pp.119-159, McGraw Hill
Book Company.
f) - Alexander, R.R., Griffiths, J.M. and Wilkinson, M.L. (1985), Basic Biochemical
Methods, pp.19-24, John Wiley & Sons In., New York.
g) - Wharton, D.C. and McCarty, R.E. (1972), Experiments and Methods in
Biochemistry, pp.40-46, 167-191, The Macmillan Company, New York.

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RESULTADOS:

1 - Registe os valores relativos às titulações de solução de aminoácido e de água com

HCl 0,1N (e KOH 0,1 N), no quadro 1.

2 - Preencha os quadros onde figuram as diferenças de volumes gastos na titulação da

aminoácido e da água, correspondentes ao mesmo valor de pH, e calcule, em
seguida, os miliequivalentes gastos na titulação do aminoácido (quadro 2).

3 - A partir dos valores obtidos (indicados no quadro 2), represente na folha de papel
milimétrico os valores de pH alcançados em função do número de miliequivalentes
de ácido ou base adicionados e trace a curva de titulação.

4 - Assinale na curva as zonas tampão e indique os valores de pK1, pK2 e pI.

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Quadro 1

Glicina Água
HCl pH KOH pH HCl pH KOH pH
(mL) (mL) (mL) (mL)

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Quadro 1 (continuação)

Glicina Água
HCl pH KOH pH HCl pH KOH pH
(mL) (mL) (mL) (mL)

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Quadro 2

pH ml de ácido para ml de ácido para n.º de

(V1 - V2)
titular a solução de titular a água miliequivalentes
aminoácido (V1) (V2) (V1 – V2) x 0,1

pH ml de base para ml de base para n.º de

(V1 - V2)
titular a solução de titular a água miliequivalentes
aminoácido (V1) (V2) (V1 – V2) x 0,1

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