UM ABSTRACT

Hematologia contrai composições e sistemas usados para mea se uma pluralidade de

parâmetros em uma amostra de sangue é fornecida . Tbe bematologia composições de
contrai são particularmente úteis como contrai para multiparâmetro, instru automatizado
ment sistemas . Tbe contrai composições compreendem um reticu Componente de
jócito, um componente de célula sanguínea wbite, um vermelho componente de células
sanguíneas, um vermelho nucleado componente de células do sangue, um componente
de plaquetas e reticulado componente plaquetário. M etbods de fazer e usando tbe
Contrai composições também são fornecidas .

5 3 C eu uma Eu estou s, N o Dr uma W ings

SISTEMA E CONTROLE DE HEMATOLOGIA PARA

MEDIÇÕES DE HEMATOLOGIA DE MULTI-PARÂMETROS
Este pedido é uma continuação do pedido copendente de Ser. No. 09 / 740.509
protocolado em dez.
19, 2000, que é uma continuação do pedido Ser. No. 09 / 504.816 depositado em 16
de fevereiro de 2000, agora US Pat. No. 6.221.668 que é uma continuação em parte
do pedido de Série No. 09 / 378.608 depositado em 20 de agosto de 1999, emitido
em 13 de março de 2001 como US Pat. No. 6.200.500. Os requerentes reivindicam o
benefício da data de apresentação de tais aplicações para todos os fins e na extensão
permitida de acordo com 35 USC Seção 120.

CAMPO DE INVENÇÃO

A presente invenção se refere genericamente a composições e sistemas de controle de

hematologia e, mais particularmente, a uma composição e sistema de controle de
hematologia usado para medir uma pluralidade de parâmetros em uma amostra de
sangue com um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os controles hematológicos para vários instrumentos automatizados que medem, por

exemplo, contagens de glóbulos vermelhos e brancos e de plaquetas, são conhecidos
na técnica e são descritos nas seguintes patentes US Nos. 3.558.522; 3.873.467;
4.179, 398; 4.219.440; 4.299.726; 4.324.687; 4.358.394; e 4.436.821 (aqui
incorporado por referência). Atualmente, a análise de sangue requer o uso de um ou mais
dos vários instrumentos diferentes e, subsequentemente, diferentes amostras de sangue e
preparações de amostra de sangue para analisar os vários componentes do sangue. Vários
instrumentos de hematologia, no entanto, agora têm a capacidade de medir vários
parâmetros de sangue sem exigir a preparação de amostras separadas para cada
parâmetro sendo testado. Esses instrumentos incluem o Beckman Coulter STKS ou Gen-
S Systems, o Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology System, Bayer ADVIA 120 e o Sysmex
XE2100 System. Esses instrumentos automatizados aprimorados podem medir um ou
mais dos seguintes: 1) reticulócitos, 2) glóbulos vermelhos, 3) glóbulos vermelhos
nucleados, 4) plaquetas, 5) plaquetas reticuladas, 6) glóbulos brancos, incluindo
linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e 7) glóbulos brancos com todos
os fenótipos. Portanto, seria desejável fornecer uma composição de controle de
hematologia que pudesse ser usada como um controle em conexão com esses
instrumentos. Na modalidade preferida, uma composição de controle de hematologia
para uso com um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro inclui uma
suspensão líquida de partículas que tem características mensuráveis, como sangue
total. A composição de controle inclui uma ou mais células sanguíneas (ou seja,
células manipuladas ou tratadas para simular tal componente como encontrados no
sangue total) ou seus análogos (referidos coletivamente como componentes das células
sanguíneas), que podem ou não ser fixados, estabilizados ou preparados por outro
tratamento antes da suspensão final. Em diferentes modalidades, os componentes das
células sanguíneas podem ser derivados de uma fonte que exibirá o tamanho, a forma ou
outras características mensuráveis de sangue humano, animal ou outro sangue total. A
título de exemplo, a US Pat. 4.198.206; 4.436.821; 5.008.021; 5.262.327; 5.270, 208;
5.432.089; 5.460.797; 5.672.474; 5.677.145; 5,731, 205; 5.811.099 e 5.981.282, que
são aqui incorporados por referência, cada um contém exemplos desses tipos de
componentes de células sanguíneas. O controle tem um ou mais hemocomponentes
para se assemelhar aos componentes correspondentes no sangue total quando
medido pelo instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro. Quando
assim medida, a composição de controle ajudaria na calibração, operação e acúmulo
de dados de garantia de qualidade para o instrumento de hematologia automatizado
de multiparâmetros. Também de interesse potencial podem ser as Patentes dos EUA.
No. 5.888.790 e "Isolamento Melhorado de Reticulócitos Humanos Normais via
Exploitation of Chloride-Dependent Potassium Transport, "Sorette et al., Blood, Vol. 80,
No. 1 (Jul. 1), 1992: pp. 249-254; aqui incorporado por referência.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Um controle de hematologia e sistema para medição de hematologia multiparâmetros

são fornecidos. O controle de hematologia fornece valores para os vários constituintes
do sangue que o instrumento de hematologia multiparâmetro é capaz de medir. A
composição de controle hematológico compreende componentes para simular
reticulócitos, glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, glóbulos vermelhos nucleados,
plaquetas ou constituintes de plaquetas reticuladas de sangue total. Métodos de
preparação e uso da composição de controle de hematologia da presente invenção
também são fornecidos aqui. O sistema da presente invenção também inclui um
instrumento de hematologia, um controle e pode ainda incluir dispositivos de saída ou
leitura. Em uma modalidade, o sistema inclui outros dispositivos periféricos, como um
dispositivo para rastrear amostras e associá-las a dados específicos,

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS

FORMAS DE REALIZAÇÃO
PREFERIDAS

A composição de controle de hematologia da presente invenção compreende

componentes para simular um ou mais dos seguintes constituintes do sangue total:
reticulócitos, glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, glóbulos vermelhos nucleados,
plaquetas ou plaquetas reticuladas. Em uma modalidade, os componentes são suspensos
em um meio isotônico, de preferência incluindo lipoproteína. O campo de controle de
hematologia da presente invenção fornece valores para vários constituintes do sangue
que um instrumento de hematologia, tal como um instrumento de hematologia
multiparâmetro, é capaz de medir. Exemplos de instrumentos de hematologia
multiparâmetros incluem aqueles disponíveis comercialmente sem limitação, sob as
designações Beckman Coulter STKS ou Gen-S Systems, o Abbott Cell-Dyn 4000
Hematology System, Bayer ADVIA 120 System, o Sysmex XE2100 System, ou
semelhante. A presente discussão inclui múltiplas abordagens para fazer um controle de
acordo com a presente invenção, sendo reconhecido que uma modalidade altamente
preferida contempla um controle tendo componentes que simulam as características do
sangue total para fins de obtenção leituras em um instrumento Beckman Coulter GEN-S
para células vermelhas do sangue, as cinco populações de células brancas do sangue,
reticulócitos e plaquetas. Assim, é fornecida uma suspensão que inclui uma pluralidade de
partículas que exibem dispersão de luz semelhante, condutividade, impedância, respostas
ópticas (incluindo fiuorescência), fotométricas ou outras propriedades detectadas pelo
instrumento em operação, como o fariam os componentes correspondentes do sangue total.
Será apreciado que o termo "composição de controle", tal como aqui utilizado, significa um
ou mais componentes do sangue (ou seja, constituintes do sangue, bem como seus
análogos), que quando combinados ou usados isoladamente, simulam suficientemente as
características relevantes do sangue total para o qual o testes de instrumentos. O seguinte
aborda a preparação de vários dos componentes constituintes. O controle da presente
invenção contempla uma mistura de dois ou mais componentes do sangue e, de preferência,
um componente de reticulócito e um componente que simula pelo
menos três, e de preferência cinco subpopulações de leucócitos. As percentagens são em
volume, a menos que seja indicado o contrário

COMPONENTE DE RETICULÓCITO

O componente reticulócito da composição de controle inclui um componente que exibe

as características relevantes para a detecção de reticulócitos usando um instrumento de
hematologia de acordo com a presente invenção. Consequentemente, o controle pode
conter adequadamente reticulócitos estabilizados (isto é, glóbulos vermelhos anucleados
imaturos contendo algum ácido ribonucleico) ou um análogo dos mesmos. Por exemplo,
entre modalidades possíveis, o componente reticulócito pode compreender reticulócitos
verdadeiros de mamíferos preparados, por exemplo, por encapsulação de glóbulos
vermelhos de mamíferos (por exemplo, humanos) ou por isolamento de sangue total. O
componente reticulócito é preparado de qualquer maneira adequada. Ver, S <g., US Pat.
Não. 5.432.089, incorporado por referência. Alternativamente, é possível obter reticulócitos
adequados obtendo sangue de um animal anêmico (por exemplo, um porco, cabra, coelho ou
semelhante).

Em uma modalidade particularmente preferida, o componente reticulócito é preparado

por um método de encapsulação, usando células sanguíneas não reticulócitas, tais como
glóbulos vermelhos de um ser humano ou de outra fonte. Os glóbulos vermelhos são
encapsulados e estabilizados. A título de ilustração, em uma modalidade, são fornecidos
glóbulos vermelhos com um MCV relativamente alto (por exemplo, cerca de 85 a cerca
de 95 EL, e mais preferencialmente cerca de 88 a cerca de 92 fL). As células são
lavadas com um diluente adequado (por exemplo, NaCl cerca de 0,15 M) em uma ou
mais etapas de lavagem. As células são então concentradas até um valor de hematócrito
desejado, por exemplo, maior do que cerca de 50%, e mais preferencialmente maior do
que cerca de 70%. As células são então encapsuladas com RNA. A título de exemplo, o
RNA é encapsulado nas células vermelhas do sangue por uma etapa de lise adequada,
por exemplo, por lise hipotônica. Isso pode ser feito de várias maneiras, incluindo a
mistura de glóbulos vermelhos com uma solução de RNA com pH e osmolaridade
apropriados. Por exemplo, a solução pode conter uma quantidade mínima de RNA
(mais preferencialmente cerca de 1%) e tem um pH entre cerca de 7 e 8 (mais
preferencialmente cerca de 7,6). A solução é ajustada (por exemplo, com NaCl) para
obter uma osmolaridade de cerca de 40 mOsm.

Os glóbulos vermelhos são misturados com a solução de RNA em uma proporção adequada,
que pode variar conforme desejado. Em uma presente modalidade preferida, a proporção de
volume de glóbulos vermelhos empacotados para solução de RNA é de cerca de 0,8 a cerca
de 1,2: cerca de 1 a cerca de 2, e mais preferencialmente é de cerca de 1: 1,4. Antes da lise,
ou em um estágio inicial da lise, os glóbulos vermelhos e a solução de RNA são pré-
incubados, por exemplo, por aquecimento acima da temperatura móvel (por exemplo, cerca
de 37 graus C.). As células são lisadas na mistura e, a partir daí, os glóbulos vermelhos são
selados novamente. A título de exemplo, os glóbulos vermelhos são selados novamente,
introduzindo-os em uma solução salina e, em seguida, aquecendo acima da temperatura
ambiente (por exemplo, adicionando cerca de 0,15 volume de solução de NaCl a cerca de
12% e, em seguida, aquecendo ou recozendo as células a cerca de 37 graus C. por cerca de
uma hora).

A mistura resultante é vertida para um funil de separação e deixada a incubar durante

um tempo adequado, por exemplo, durante pelo menos cerca de 18 horas à temperatura
ambiente. Depois disso, as células da parte inferior do funil são coletadas (por exemplo,
cerca de 70% da parte inferior ou menos). As células são lavadas com um diluente
adequado, como o diluente da Tabela 1 ou 4. Opcionalmente, cerca de 0,5 a cerca de
5,0% e mais preferencialmente cerca de 0,75% do número do produto Streck
Laboratories 233301, também conhecido como STA-CELL (disponível em Streck
Laboratories (Omaha, Nebraska)) é adicionado. Na presente modalidade ilustrada, as células
são assim tratadas de uma maneira que as tornaria suscetíveis a uma mancha de detecção
(por exemplo, azul de metileno). Em outra modalidade, o componente reticulócito é fixado
(tal como com um aldeído ou outro produto fixo adequado) em uma lactose ou outro
diluente adequado. Um diluente semelhante ausente do fixador também pode ser empregado
para a lavagem.

COMPONENTE DE CÉLULAS DE SANGUE BRANCO

Na presente modalidade, o componente do controle que é para simular as características dos

glóbulos brancos no sangue total é preparado a partir de um material biológico. Mais
especificamente, o material é um material biológico celular e, de preferência, o material
inclui glóbulos brancos humanos (embora possam ser empregues células sanguíneas de
qualquer animal adequado). Em uma modalidade preferida da presente invenção, o
componente de glóbulos brancos inclui materiais para replicar as características
mensuráveis relevantes para alguns ou todos os cinco tipos de glóbulos brancos, a saber,
linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos, e eles por sua vez, são fornecidos
em seus níveis divulgados na técnica (ver,., Tabela 6). O componente de glóbulos brancos
da composição de controle hematológico compreende uma célula do sangue (por exemplo
glóbulos brancos) ou seu análogo, selecionado do grupo que consiste em glóbulos brancos
para vários tipos celulares, glóbulos brancos para todos os fenótipos e suas misturas. Nos.
5.270.208 e 5.262.327, incorporados neste documento por referência, fornecem exemplos
de um componente adequado de glóbulos brancos (ver também Patente US No. 5.529.933,
aqui incorporada por referência).
Obviamente, o perito na arte apreciará que a presente invenção não se limita a
componentes de glóbulos brancos preparados apenas a partir de glóbulos brancos.
Análogos preparados a partir de qualquer uma de uma variedade de outras fontes são
possíveis, incluindo, mas não se limitando a, glóbulos vermelhos de pássaros, répteis,
mamíferos, etc. As células são fornecidas em embalagens (por exemplo, 2 a 3
embalagens por garrafa). As células são tratadas por uma série de etapas para lisar
seletivamente quaisquer células sanguíneas indesejadas presentes no material, conforme
fornecido; para lavar as células; e para fixar ou de outra forma estabilizar as células. A
lise seletiva pode ser realizada de qualquer maneira adequada, por exemplo, por contato
das células sanguíneas indesejadas com um agente de lise. Qualquer agente de lise
adequado pode ser empregado. Halogenetos tamponados, como cloreto de amônio e
Trizma Based (por exemplo, cerca de 7. 5 g de cloreto de amônio e 2 g de Tris por litro),
ilustra uma classe adequada de agentes de lise, em que as células indesejadas incluem
glóbulos vermelhos. A lise é realizada por meio de uma série de etapas de lavagem
consecutivas com o agente de lise. Opcionalmente, antes da lise, as células são
submetidas a uma etapa de fixação preliminar, como por contato com um agente de
fixação adequado, aquecê-los ou ambos. Por exemplo, as células são colocadas em contato
com uma solução salina antimicrobiana tamponada (opcionalmente incluindo um diluente
conforme descrito na Tabela 4), incluindo uma quantidade adequada de um fixador (por
exemplo, cerca de 0,11% de formaldeído). A lise pode ser realizada em uma única etapa ou
em uma pluralidade de etapas (por exemplo, por cerca de uma hora, depois por cerca de 25
minutos), onde após cada etapa, o agente de lise é removido e o agente fresco é introduzido.
Após a lise, as células são lavadas para remover o agente de lise. Qualquer composição e
técnica de lavagem adequada pode ser empregada. Por exemplo, a solução salina
antimicrobiana tamponada acima mencionada (na ausência de um agente de fixação) pode
ser empregada. Usando esta solução, as células são lavadas em pelo menos uma etapa e, de
preferência, duas etapas, em que as células são centrifugadas a uma taxa adequada (por
exemplo cerca de 900 rpm por cerca de 10 minutos) (por exemplo, cerca de 200 xg). Antes
da fixação, pode ser preferível pré-tratar ainda as células em um diluente contendo albumina,
como cerca de 2% de BSA em um diluente como o da Tabela 1. De preferência, o diluente
tem um pH de cerca de 8 e uma osmolaridade de cerca de 175 a cerca de 300 (por exemplo,
cerca de 215). Qualquer período adequado de pré-tratamento pode ser empregado, por
exemplo, cerca de uma hora, quando mantido a cerca de 6 graus C.

As células são fixadas de qualquer maneira adequada, suficiente para desnaturar a proteína
na superfície celular. As células podem ser aquecidas, colocadas em contato com um
agente de fixação ou ambos. O especialista na técnica reconhecerá que, embora o agente de
fixação preferido seja um aldeído, qualquer agente adequado (de preferência em uma
solução hipotônica) pode ser usado, incluindo, por exemplo, aqueles contendo um aldeído,
um álcool, uma ureia heterocíclica (por exemplo, diazolidinil ureia (conhecido como DU),
imidazolidinil ureia (conhecido como IDU) ou uma mistura dos mesmos) ou uma mistura
dos mesmos. Entre os agentes de fixação adequados, um agente contendo álcool
particularmente eficaz é de 50% em volume.,

- {1-metil-2- (5-metil-3-oxazolidinil) -etoxi] metoxi] metanol (por exemplo, NUOSEPT

145, de HULS America, Inc.), ou uma mistura destes. Em uma presente modalidade
preferida, o aldeído é selecionado do grupo que consiste em formaldeído, glutaraldeído
e suas misturas. A título de ilustração, uma mistura de fixação é preparada para incluir
cerca de 10 partes de células, cerca de 20 partes de água destilada, um agente para
aumentar a osmolaridade através da membrana celular, para auxiliar na formação de
aglomerados em leituras de população de diagrama de dispersão ou ambos (por
exemplo, cerca de 5 g / 1 de um açúcar, como sorbitol), um agente para ajudar a
estabilizar a leitura de monócitos (por exemplo, cerca de 4% DU) e um agente de
fixação, como cerca de 4 partes de formaldeído e cerca de 0,1 partes de glutaraldeído .
A fixação é realizada por um período de tempo adequado e a uma temperatura
adequada. Usando este agente de fixação, por exemplo, a fixação é realizada por cerca
de 2 a cerca de 3 dias a cerca de 22 graus C (isto é, aquecido antes da fixação após
refrigeração). As células fixas são lavadas com um material de enxágue adequado (por
exemplo, um estabilizador de células em um diluente) para remover o agente de
fixação. A título de ilustração, duas lavagens são feitas durante a centrifugação a cerca
de 900 rpm por cerca de 10 minutos (por exemplo, cerca de 200 xg), em uma solução
incluindo um haleto de metal (por exemplo, cerca de 5% NaF) estabilizador de células
em um diluente (por exemplo, um diluente com a composição delineada na Tabela 2).

Em outra modalidade ilustrativa, ao preparar o componente de glóbulos brancos para a

composição de controle da presente invenção, as células são obtidas por separação padrão de
sangue total ou de porção de sangue total previamente fracionado contendo a população de
células desejada.

As células são ressuspensas, por exemplo, numa solução tamponada com fosfato contendo
polietilenoglicol 20.000 (PEG), ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) e gluconato de
magnésio com 2% de albumina de soro bovino. A osmolaridade desta solução é
preferencialmente suficiente para inchar os glóbulos brancos antes da fixação (por exemplo,
cerca de 215 mosm).
As células podem então ser armazenadas nesta solução, por exemplo, a cerca de 6 ° C
durante 1 hora. As células são fixadas em um meio adequado em arder de preferência para
desnaturar a superfície ou de outra forma realizar preservando a morfologia celular. Para
ilustrar, em uma modalidade, em uma solução de água destilada contendo 5 g / 1 de sorbitol,
7,4% de formaldeído e 0,125% de glutaraldeído. Claro, outros agentes de fixação adequados
podem ser usados em quantidades adequadas. Em uma modalidade altamente preferida, os
glóbulos brancos e a solução de fixação são mantidos a uma temperatura suficiente para
fornecer uma posição adequada dos glóbulos brancos (por exemplo, entre cerca de 4 o C e
12 ° C.). O fixador é adicionado às células em uma proporção adequada. Por exemplo, em
uma modalidade, é usada uma razão entre 10 ml de suspensão de células e 24 ml de solução
fixa. A água destilada na solução fixadora incha ainda mais as células brancas do sangue,
enquanto o fixador estabiliza a membrana celular. As células são então deixadas no fixador
por 2 dias em temperatura ambiente. Após a fixação, as células são preferencialmente
lavadas. Em um aspecto, eles são lavados em uma solução tamponada com fosfato.

Uma dessas soluções contém polietilenoglicol (PEG), ácido etilenodiaminotetráctico

(EDTA), gluconato de magnésio e albumina de soro bovino. O concentrado de
lipoproteína é adicionado a 150 mg / dl de HDL para armazenar as células antes do uso
em arder para melhorar a estabilidade da posição do diagrama de dispersão enquanto os
glóbulos brancos estão esperando para serem adicionados aos outros componentes da
composição de controle. Será apreciado que glóbulos brancos preparados conforme
descrito na Pat. No. 5.459.073 (incorporada neste documento por referência) para
citometria de fluxo pode ser empregada para fenotipagem. Ao misturar os dois tipos de
glóbulos brancos, ambos os requisitos podem ser atendidos, ou seja, glóbulos brancos
para vários tipos e fenótipos celulares,

COMPONENTE DE CÉLULA VERMELHA

Na presente modalidade, o componente do controle que é para simular as características dos

glóbulos vermelhos no sangue total é preparado a partir de um material biocompatível. Mais
especificamente, o material é um material biológico celular e, de preferência, o material
inclui glóbulos vermelhos humanos (embora possam ser empregues células sanguíneas
análogas de qualquer animal adequado). As células fornecidas são separadas do meio líquido
ou sobrenadante no qual é fornecido por meio de qualquer técnica de separação adequada,
incluindo, mas não se limitando a centrifugação, filtração ou semelhantes. As células são
lavadas em uma série de uma ou mais (por exemplo, 3) etapas de lavagem consecutivas, de
acordo com as quais o excesso de sobrenadante é removido. As células são
preferencialmente lavadas em (por exemplo tal como o diluente da Tabela 2) e,
opcionalmente, um ou mais componentes adicionais selecionados do grupo que consiste em
um estabilizador celular, uma albumina, um agente para reduzir a probabilidade de hemólise
celular na presença de oxigênio e suas misturas. Em um aspecto mais preferido, os
componentes adicionais são selecionados do grupo que consiste em um estabilizador de
células de haleto metálico, albumina de soro bovino (BSA), um antioxidante e suas misturas.
Em ainda uma modalidade mais preferida, o diluente é um tal como aquele da Tabela 4, e irá
incluir cerca de 0,003 a cerca de 0,010 (e mais preferencialmente cerca de 0,005%) NaF,
cerca de 2% BSA, cerca de 0,005 a cerca de 0,020 (e mais de preferência sobre Em um
aspecto mais preferido, os componentes adicionais são selecionados do grupo que consiste
em um estabilizador de células de haleto metálico, albumina de soro bovino (BSA), um
antioxidante e suas misturas. Em ainda uma modalidade mais preferida, o diluente é um tal
como aquele da Tabela 4, e irá incluir cerca de 0,003 a cerca de 0,010 (e mais
preferencialmente cerca de 0,005%) NaF, cerca de 2% BSA, cerca de 0,005 a cerca de 0,020
(e mais de preferência sobre Em um aspecto mais preferido, os componentes adicionais são
selecionados do grupo que consiste em um estabilizador de células de haleto metálico,
albumina de soro bovino (BSA), um antioxidante e suas misturas. Em ainda uma modal
0,010%) sulfassalizina. O diluente da Tabela 1 também pode ser usado como desejado.
Opcionalmente, dependendo do uso final e das considerações comerciais, um ou mais agentes
para reduzir a taxa de degradação são empregados em uma quantidade adequada; por
exemplo, cerca de 0,25 a cerca de 2,0%, e mais preferencialmente cerca de 0,75% de um
material disponível na Streck Laboratories (Omaha, Nebraska) sob o número de produto
233301 ou a designação STA CELL (que material também pode ser adicionado
adequadamente para um ou mais dos outros componentes). Além disso, opcionalmente,
as células são preferencialmente preparadas em um ambiente substancialmente livre de
glicose. Em ainda outra modalidade opcional, as células são fixadas (por exemplo, por
uma etapa de desnaturação de proteína adequada, tal como por fixação de glutaraldeído)
após a lavagem e depois lavadas As células podem ser lavadas por qualquer período de
tempo adequado e ressuspensas (na mesma lavagem ou em uma diferente, por exemplo,
uma com uma concentração mais alta) qualquer número adequado de vezes.

O versado na técnica apreciará que os glóbulos vermelhos podem ser removidos de

qualquer outro material celular, tal como usando um diluente de gluconato de magnésio.

A título de ilustração adicional, em outra modalidade, glóbulos vermelhos concentrados são

fornecidos, separados do sobrenadante associado, e pacotes de glóbulos vermelhos humanos
concentrados são suspensos em uma solução (por exemplo, solução tamponada com fosfato
contendo PEG (MW = 20.000)) e permitidos a resolver durante a noite. O sobrenadante é
então removido e 0,5% de NaCl com PEG é adicionado em um volume igual aos glóbulos
vermelhos empacotados e deixa-se assentar em temperatura ambiente por 45 horas. O
sobrenadante é novamente removido e as células são ressuspensas na solução de NaCl e
armazenadas a 6 ° C durante a noite. As embalagens são posteriormente verificadas quanto a
hemólise excessiva e removidas do estoque. Os pacotes restantes são agrupados em lotes
com base nos MCVs, em que doze a quatorze pacotes são combinados para formar um lote.
Os lotes são novamente suspensos na solução de NaCl por cerca de 4-5 horas em
temperatura ambiente. Claro, outros tempos e temperaturas podem ser empregados.

Cada lote é ressuspenso em uma solução tamponada com fosfato contendo PEG, EDTA e
gluconato de magnésio. As células são deixadas assentar, o sobrenadante é removido e as
células são ressuspensas na solução acima com concentrações de PEG mais baixas para
armazenamento até 90 dias a 6 ° C.

Um diluente eficiente na estabilização dos glóbulos vermelhos no Coulter STKS inclui uma
solução tamponada com fosfato contendo PEG, Na2EDTA, gluconato de magnésio e um
antioxidante (por exemplo, sulfassalazina ou
alfa-tocoferol), em que o antioxidante é adicionado para prevenir a hemólise quando a
lipoproteína é adicionado à composição de controle da presente invenção. O diluente final
também contém cerca de 2% de albumina de soro bovino para melhorar a posição das
células brancas do sangue. Após as células terem sido lavadas neste diluente, STA-CELL de
Streck Laboratories (Omaha, Nebraska) é adicionado a 0,75% ao volume total de glóbulos
vermelhos para dar estabilidade aos MCV'S. Opcionalmente, em certas aplicações, pode ser
desejável fixar os glóbulos vermelhos, após remover o excesso de glóbulos vermelhos, como
por centrifugação lenta. A título de exemplo, para tal modalidade, o diluente da Tabela 1 é
empregado. As células são lavadas e ressuspensas no diluente para uma concentração
adequada (por exemplo, cerca de 4x106 / mm3). De preferência, o pH é cerca de 7 e não há
glicose na suspensão. Aproximadamente uma para um proporções das células são misturadas
com o diluente e uma quantidade adequada de um fixador (por exemplo, cerca de 0,007% a
cerca de 0,01% de glutaraldeído (por contagem)) por um período adequado e a uma
temperatura adequada (por exemplo, 22 graus C. por cerca de um ou dois dias). As células
resultantes são então lavadas uma pluralidade de vezes (por exemplo, cerca de 3 a cerca de
8) em um diluente semelhante (de preferência a um pH entre 7 e 8). As células são
centrifugadas a cerca de 1500 durante cerca de 15 minutos. A decantação e a sonicação são
realizadas conforme necessário. Além disso, as células podem ser posteriormente tratadas
conforme desejado pela adição de uma quantidade adequada de STA-CELL (por
exemplo, cerca de 0,75%) de Streck Laboratories, Inc. (Omaha, Nebr.).

COMPONENTE DE CÉLULAS SANGUÍNEAS NUCLEADAS VERMELHAS

Quando empregado, o componente de glóbulos vermelhos nucleados da composição de

controle da presente invenção compreende glóbulos vermelhos nucleados ou um análogo
dos mesmos, tais como glóbulos vermelhos de aves, por exemplo, glóbulos vermelhos de
peru ou frango. Por exemplo, glóbulos vermelhos de peru são lavados em uma solução
tamponada com fosfato e definida para uma contagem de cerca de 1x105 / mm3. As
células são fixadas com uma solução de fosfato (volume igual ao volume da célula) +
0,4% v / v glutaraldeído, em temperatura ambiente por um dia e então lavadas em um
tampão de fosfato. Os glóbulos vermelhos de peru fixados são adicionados à composição
de controle da presente invenção para produzir uma contagem de células igual a pelo
menos 10% da contagem de glóbulos brancos em arder para produzir fiags NRBC no
Coulter STKS ou no CellDyne 4000 fabricado pela Abbott Laboratórios.

COMPONENTE DE PLACA

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a composição de controle de

hematologia fornece adicionalmente um componente de plaquetas, de preferência um
componente de plaquetas simulado. Entre outros tipos possíveis, o componente plaquetário
pode compreender plaquetas humanas estabilizadas ou plaquetas simuladas
de células sanguíneas de cabra, bovina ou suína. Em uma modalidade, eles são preparados
a partir de glóbulos vermelhos. Veja, US Pat. 4.160.644 e 4.198.206, aqui incorporados por
referência, divulgam um exemplo de um controle de referência de plaquetas adequado e
métodos de preparação. O especialista na técnica apreciará uma série de outras técnicas
para preparar plaquetas simuladas. Em geral, como as plaquetas são preparadas pode
depender sobre a origem das células (ou seja, se são células sanguíneas de animais a
serem encolhidas, inchadas ou de outro modo dimensionadas ou moldadas para se
parecer com plaquetas, ou se são plaquetas de sangue). Em geral, as células são lavadas,
opcionalmente pré-fixadas, dimensionadas e moldadas e, em seguida, fixadas ou de
outra forma estabilizadas em termos de tamanho e forma e neutralizadas. A título de
exemplo, o componente plaquetário é preparado a partir de células do sangue de
animais, como os glóbulos vermelhos de cabra. As células são lavadas uma ou mais
vezes (por exemplo, cerca de três vezes) em uma solução tamponada adequada, como
uma solução salina tamponada (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). A
solução também pode incluir uma quantidade adequada de um agente quelante (por
exemplo, cerca de 1% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). As células são
opcionalmente prefixadas em uma mutação adequada para auxiliar na etapa de
dimensionamento e modelagem. A título de ilustração, as células são postas em contato
com uma solução pré-fixada adequada (por exemplo, um para um na solução de
lavagem inicial com um fixador (por exemplo, cerca de 0,0085% de glutaraldeído)). A
quantidade de tal agente de fixação, é claro, pode ser adequadamente ajustada conforme
necessário para controlar a taxa de dimensionamento (por exemplo, a taxa de
encolhimento). De preferência, a solução pré-fixada é aquecida a uma temperatura
elevada (por exemplo, cerca de 30 graus C), e a pré-fixação é realizada por um tempo
suficiente na temperatura sue h (por exemplo, cerca de 90 minutos). Após a etapa de
prefixação, o sobrenadante é removido, por exemplo, por centrifugação, aspiração ou
ambos. Nos casos em que o dimensionamento e a modelagem são realizados para
encolher as células e formar uma estrutura de plaquetas simulada, as células são
preferencialmente lisadas de uma maneira adequada (por exemplo, usando agente
alítico, como tris de cloreto de amônio). Durante a lise, o tamanho e a forma da célula
podem ser monitorados usando um instrumento adequado, como o H3 da Bayer
Corporation (um analisador de hematologia com um sistema de detecção óptica a laser). As
células são então lavadas uma ou mais vezes com um diluente adequado (por exemplo, o
diluente da Tabela 3). Assim como com as células sanguíneas supracitadas, as plaquetas
simuladas são fixadas de qualquer maneira adequada, de preferência uma que desnature a
proteína na superfície celular . Numa forma de realização particularmente preferida, as
células são fixadas numa solução um a um com um diluente tal como o da Tabela 3 e
formaldeído a cerca de 0,1%. De preferência, a temperatura da solução de fixação é elevada
(por exemplo, cerca de 37 graus C) por um período de tempo razoável (por exemplo, cerca
de 3 dias). As células são então lavadas com uma lavagem adequada para remover o
fixador, de preferência também tomando medidas para neutralizar qualquer fixador que não
reagiu que não se ligou à superfície da célula.

Para ilustrar, preferencialmente onde o fixador é um aldeído, uma quantidade adequada

de uma solução de glicina é empregada na lavagem. Uma ou mais etapas de lavagem
adicionais podem ser realizadas, usando uma ou mais lavagens adicionais, conforme
desejado. Por exemplo, etapas de lavagem subsequentes podem ser empregadas usando a
composição de lavagem da Tabela 3, Tabela 4 ou uma mistura das mesmas. Será
apreciado que o componente de plaquetas pode ser feito de sangue humano, usando
qualquer processo adequado. A título de exemplo, sem limitação, o sangue humano é
fornecido (de preferência em um diluente com uma fixação fixa (por exemplo, um
diluente como o da Tabela 4 com cerca de 0,10% de formaldeído). Opcionalmente, os
glóbulos vermelhos são removidos e o resultado as células são misturadas com células
fixas. Por exemplo,

As células fornecidas como fornecidas são colocadas em um fixador (por exemplo, cerca de
uma para uma proporção em um diluente, como o da Tabela 3 com uma quantidade
adequada de fixador (por exemplo, cerca de 0,075% de glutaraldeído)). A fixação é feita a
cerca de 22 graus C por cerca de 2 dias. Após a fixação, a centrifugação é realizada a cerca
de 1800 rpm por cerca de 20 minutos (para um recipiente de 400 ml). As duas coleções
separadas de células são trazidas juntos e lavados (como em um diluente 1x como o da
Tabela 1) e, em seguida, centrifugados (por exemplo, a cerca de 1800 rpm por cerca de 20
minutos). Opcionalmente, as plaquetas são decantadas dos glóbulos vermelhos residuais. A
sonicação pode ser usada conforme desejado para tratar o acúmulo de plaquetas. A
decantação também pode ser usada conforme desejado para assegurar que detritos e
glóbulos vermelhos sejam removidos. Os materiais resultantes são então ressuspensos em
um diluente. Um exemplo de um diluente adequado seria o da Tabela 1 sem glicose e um pH
de cerca de 7.

COMPONENTE DE PLACA RETICULADA

Em outra modalidade da presente invenção, a composição de controle compreende um

componente de plaquetas reticuladas. Para ilustrar, sem limitação, glóbulos vermelhos de
cabra com ácidos nucleicos encapsulados constituiriam um exemplo de um componente de
plaquetas reticulado útil para a presente invenção. Outros análogos também podem ser
usados. A título de ilustração adicional, em outra modalidade, as plaquetas reticuladas para a
composição de controle da presente invenção são preparadas através da indução de uma
membrana de célula do sangue porosa para permitir a entrada de RNA em uma célula, a
saída de hemoglobina ou ambos. As células são então dimensionadas ou modeladas e
estabilizadas. Para ilustrar, glóbulos vermelhos de cabra são colocados em uma solução de
NaCl a cerca de 0,9% e concentrados para hematócrito de 70-80% (HCT). Volumes iguais de
glóbulos vermelhos concentrados e solução de RNA a 4% (20 ml de cada) ajustados para
300 mosm com um sal adequado (por exemplo, KCl) são misturados e dialisados contra
500 ml de uma solução hipotônica, como uma contendo glicerol ( osm = 90-100), por 90
minutos a 6 ° C. A diálise é necessária para alterar lentamente a osmolaridade sem danificar
as células. A mudança de osmolaridade resultante no vermelho a solução de células
sanguíneas é de cerca de 300 mosm a cerca de 150 mosm. Este processo cria orifícios na
membrana celular para permitir que o RNA na solução de glóbulos vermelhos entre nos
glóbulos vermelhos. A osmolaridade é trazida de volta à isotonicidade por meio da diálise
dos glóbulos vermelhos contendo RNA contra uma solução isotônica. Esta diálise está em
temperatura de roam por 30 minutos e a osmolaridade final das células é de cerca de 260
mosm. Esse processo fecha os buracos que foram criados pela diálise hipotônica, prendendo
o RNA dentro das células.

Oitenta mililitros do diluente de resselagem contendo 0,1% de Nuosept 101 são adicionados
aos glóbulos vermelhos encapsulados e a mistura é aquecida a 37 ° C durante 3 horas. Esta
etapa de aquecimento ajuda a lisar as células enfraquecidas do processo de encapsulamento
e recoze as membranas dos glóbulos vermelhos encapsulados.

Para ilustrar, os glóbulos vermelhos de cabra são separados de outros constituintes do sangue
total de cabra. Por exemplo, as células são lavadas em PBS três vezes para remover o plasma
e os glóbulos brancos. A concentração é ajustada para 8x106 / mm3 e fixada com um
volume de PBS igual ao das células que contém 0,2240-0,320% de glutaraldeído,
fornecendo a quantidade de proteção necessária para permitir a lise adequada durante a etapa
de encolhimento. As células são incubadas a 30 ° C por uma hora e centrifugadas a 1200
RPM por 15 minutos. O sobrenadante é removido e o volume da célula é ajustado para um
quarto do volume fixo.

Uma solução de cloreto de amônio é adicionada às células para igualar o volume

original das células fixas. Sem a intenção de se limitar à teoria, a solução de cloreto de
amônio cria orifícios na membrana para permitir que a hemoglobina saia para as
células, enquanto o glutaraldeído protege da lise total. As células são monitoradas
quanto à perda de hemoglobina com base nas diminuições (MPV) em um Bayer H-1.
Quando o MPV está a 10 pés no Bayer H-1, as células são diluídas com uma solução
tamponada com fosfato e centrifugadas a 1800 RPM por 20 minutos. O sobrenadante é
removido e as células são lavadas para remover a hemoglobina livre e encolher a
membrana ao redor da hemoglobina para produzir um VPM de aproximadamente 10
pés em instrumentos de impedância, como o S + IV, fabricado pela Beckman Coulter.
Quando o MPV está a 10 pés no H1, as células são diluídas com uma solução
tamponada com fosfato e centrifugadas a 1800 RPM por 20 minutos. O sobrenadante é
removido e as células são lavadas para remover a hemoglobina livre e encolher a
membrana ao redor da hemoglobina para produzir um VPM de aproximadamente 10
pés em instrumentos de impedância, como o S + IV, fabricado pela Beckman Coulter.
Em uma modalidade mais preferida, para evitar perda adicional de hemoglobina e
encolhimento da membrana, as células são fixadas mais de uma vez, por exemplo, com
glutaraldeído a 0,04% em um volume de solução tamponada com fosfato igual ao
volume da célula em uma contagem de 1x106 / mm3. As células são deixadas à
temperatura ambiente durante a noite e depois lavadas. Embora o presente exemplo
contemple o uso de células de cabra,

A presente invenção se refere a um método para fazer uma composição de controle de

hematologia para uso com sistemas multiparâmetros, compreendendo a etapa de
misturar um ou mais de um componente reticulócito (retico), um componente de
glóbulo branco, um componente de glóbulo vermelho, um componente de glóbulo
vermelho nucleado componente de células sanguíneas, um componente de plaquetas e
um componente de plaquetas reticulado em um meio de suspensão isotônica.

Os componentes do controle são preferencialmente suspensos em concentrações

apropriadas em um meio de suspensão adequado que permite que o controle seja
processado através do instrumento automatizado. O meio de suspensão tem, portanto, um
pH de cerca de 6,5 a cerca de 8,5 e é isotônico. A título de exemplo, entre as modalidades
possíveis da presente invenção, o meio de suspensão isotônico pode compreender um
tampão, antioxidante, proteína ou uma mistura dos mesmos, por exemplo, tampão de
gluconato de magnésio / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) / fosfato com glóbulos
vermelhos nucleados; o mesmo tampão com os aditivos HDL, sulfassalazina e alfa
tocoferol; ou o mesmo tampão com albumina a 3%.

LIPOPROTEÍNA

Embora o BSA em qualquer diluente presente melhore a posição dos leucócitos no

diagrama de dispersão, a lipoproteína também é preferencialmente usada em uma
quantidade eficaz para fornecer um diagrama de dispersão que representa o sangue total,
incluindo o posicionamento adequado das cinco subpopulações de leucócitos. Ver US
Pat. Nos. 5.270.208 e 5.262.327 incorporados por referência. Uma fonte de lipoproteína,
de preferência uma consistindo essencialmente em lipoproteína de alta densidade (isto é,
HDL) é adicionada em cerca de 0,5 a cerca de 8,0% em volume do controle, e mais
preferencialmente em cerca de 100-175 mg / dl para a composição de controle e um -O
tocoferol é adicionado à fonte de lipoproteína para reduzir os peróxidos produzidos pela
oxidação das lipoproteínas. Um exemplo de uma forma de lipoproteína comercialmente
disponível adequada é SUPERTRATE (disponível na Bayer).
COMPONENTES DE ADESÃO

Os volumes de estoque dos componentes constituintes são pareados nas seguintes

concentrações aproximadas:

RBC: 6,0xl06 / mm3

WBC: 150.000 / mm3
Plaquetas: 10x106 / mm3
Retics: 50% de 5,5x10 / mm3 contagem
de vermelho NRBC: 0,5xl06 / mm3

Para preparar a composição de controle final, por exemplo, em um volume de 5 litros, os

volumes de estoque dos componentes constituintes são combinados da seguinte forma:

Os constituintes combinados são levados a um volume final total de 5 litros por adição de um
diluente final adequado (por exemplo, preparado de acordo com a Patente US 5.262.327,
incorporada neste documento por referência (de preferência incluindo SUPERTRATE ou uma
substância semelhante)). O versado na técnica apreciará que existem outros meios e
procedimentos para preparar esta e outras modalidades da presente invenção. Além disso, as
concentrações podem ser variadas para fornecer controles com leituras anormais
predeterminadas quando testadas.

USANDO O CONTROLE

O seguinte discute exemplos de métodos de uso da composição de controle para determinar

a precisão e reprodutibilidade da operação de um instrumento de hematologia automatizado
multiparâmetro. A título de exemplo, um instrumento de hematologia automatizado de
multiparâmetros, como um Beckman Coulter STKS ou Gen-S Systems, o Abbott Cell-Dyn
4000 Hematology System, Bayer ADVIA 120 e o Sysmex XE2100 System, é fornecido,
opcionalmente com uma preparação de lâmina módulo. A composição de controle
reivindicada é obtida ou preparada que inclui, a título de exemplo, um componente de
glóbulo vermelho humano estabilizado tratado e um componente de reticulócito com
valores de controle de qualidade em uma faixa apropriada, por exemplo, 1,0%, 2,5% e
9,0%, respectivamente. É refrigerado antes do uso. No início do teste, a composição de
controle é deixada aquecer até a temperatura ambiente por cerca de quinze minutos,
misturada manualmente e verificada quanto à ressuspensão do conteúdo. A composição de
controle é preparada e analisada pelo mesmo método padrão que as amostras de teste que
podem ser testadas em quantidades de lote pelo uso de uma cassete adequada com
aberturas para receber frascos de teste. Após a preparação, a composição de controle e as
amostras de teste são analisadas pela contagem do número da população de cada tipo de
componente do sujeito com um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro,
que produzirá uma exibição visual dos dados.

Para um Sistema Coulter, o instrumento de teste automatizado pode empregar tecnologia

geralmente conhecida como Tecnologia VCS (como comercializada pela Beckman Coulter).
VCS geralmente analisa amostras de células em vista de medições simultâneas de
condutividade de volume e dispersão. Normalmente, uma amostra de partida é empregada
em combinação com reagentes adequados (que podem compreender um componente de um
kit) e agitação física para lise e medição de células por meio de citometria de fluxo.
Consequentemente, a amostra pode ser testada pelo Coulter Principie of (DC) Impedance
para medir o volume celular em uma suspensão isotônica. A condutividade pode ser
empregada, por exemplo, aplicando corrente alternada na faixa de radiofrequência. A
energia pode penetrar na célula causando um curto-circuito na camada lipídica bipolar da
membrana celular. Informações sobre as células também são possíveis com técnicas de
dispersão de luz, como as características de dispersão detectadas a partir das células em
resposta a uma fonte de luz coerente, por exemplo, um feixe de laser. Claro, de forma
alguma o modo de teste de amostra está limitado ao acima. Conforme mencionado, outros
princípios podem ser usados. As respectivas contagens de população obtidas a partir da
análise são comparadas com o valor de referência conhecido para cada tipo de componente
na composição de controle, ou por comparação das contagens de população para cada tipo
de componente na amostra de teste com os valores correspondentes de componentes no
controle composição. Os dados relativos à medição dos componentes na composição do
controle e nas amostras de teste são coletados, monitorados, armazenados, comparados e
analisados por meios eletrônicos, como um computador programado com software
apropriado e contendo estrutura de arquivo de dados apropriada.
A albumina de soro bovino concentrada é adicionada ao produto no momento da
combinação dos vários tipos de células para perfazer a concentração de proteína
de 3% da porção líquida do produto.
O versado na técnica apreciará que uma série de ingredientes foram divulgados por meio
de exemplo específico, mas que qualquer um de uma série de ingredientes alternativos na
concentração sugerida ou diferente, pode ser adequadamente substituído por tais
ingredientes. A Tabela 5 a seguir ilustra exemplos de várias alternativas e também inclui
uma breve discussão dos intervalos de concentração comumente empregados quando
empregados nos diluentes das Tabelas 1- 4. Embora os ingredientes sejam descritos por
referência a uma função particular, deve ser apreciado que tal discussão é apresentada
sem a intenção de ser limitado pela teoria. Em alguns casos, o ingrediente desempenhará
uma função diferente ou adicional. Além disso, o versado na técnica apreciará que a
referência na Tabela 5 às funções, no contexto 35 das presentes modalidades preferidas,
pode ser feita para selecionar alternativas adicionais. Assim, não há intenção de se limitar
à amplitude de qualquer ingrediente ou concentração ilustrativa específica, onde seja
aparente que outros podem ser vantajosamente empregados em adição ou como um
substituto para tal ingrediente.

Da mesma forma, conforme desejado, os ingredientes podem ser excluídos do

diluente. Assim, uma combinação de alguns dos ingredientes pode ser
adequadamente empregada para alcançar os resultados desejados. De preferência, o
diluente inclui um ou mais agentes que funcionam como um surfactante, inibidor de
hemólise, decantador de glóbulos vermelhos, estabilizador de MCV, tampão,
metabólito, ajustador de osmolaridade, antimicrobiano, antifúngico, fonte de
proteína, posicionador de subpopulação de glóbulos brancos, antioxidante , redutor
de detritos ou uma mistura dos mesmos.
. Outra Modalidade Exemplar Alternativa

Para o componente de glóbulos vermelhos, um diluente contendo Gluconato de Mg e

EDTA (por exemplo, cerca de 3,92 g / 1 Mg de gluconato; 7,04 g / 1 EDTA-
dissódico; 2,68 gl NA2HP04; glicose 6 g / 1; e antimicrobianos (pH de 7,1 e
osmolaridade usando KCl de cerca de 300)) estabilizam as hemácias de forma que os
parâmetros da hemácia sejam estáveis por 200 dias. O componente de glóbulos
brancos é preparado a partir de glóbulos brancos humanos frescos. As células são
lavadas para remover os glóbulos vermelhos e plaquetas usando o diluente acima. As
células são suspensas em solução salina tamponada com fosfato com osmolaridade
de 280 e pH de 7,2. Uma solução de 20% de Nuosept 145 (Huls America) é
misturada com os glóbulos brancos 1: 1 para dar uma concentração final de cerca de
10% (por exemplo, 9,11%). A mistura é colocada a uma temperatura de cerca de 37 °
C a cerca de 50 ° C por seis dias ou mais. Depois disso, as células são lavadas uma
ou mais vezes (por exemplo, 3 vezes) em um diluente adequado, por exemplo, um
diluente como a Tabela 1, centrifugado (por exemplo, cerca de 900 rpm por 10
minutos) e ressuspenso em um diluente, tal como na Tabela 1 (sem glicose e um pH
de cerca de 7). O componente plaquetário é preparado lavando as plaquetas humanas
livres de componentes do sangue total por centrifugação a baixa velocidade (900
RPM por 10 min.). As plaquetas são então estabilizadas pela adição de um baixo
nível de
glutaraldeído. As plaquetas são estabilizadas misturando 1: 1 com o diluente
gluconato de magnésio contendo 0,075% de glutaraldeído (concentração final de
0,037% de glutaraldeído). Após uma incubação de 22 ° C, as células são
novamente lavadas no diluente e estão prontas para uso. O mesmo procedimento
pode ser usado para bovinos ou suínos.

Os reticulócitos são preparados por encapsulação de ARN de levedura conforme descrito

na Pat. Não. 5.432.089, incorporado por referência.
O componente de glóbulos brancos pode ser configurado com glóbulos
vermelhos para alcançar estabilidade diferencial, por exemplo, mantendo-os a
cerca de 22 ° C por cerca de 20 dias. O controle final contém as seguintes
concentrações celulares (Tabela 7), exibe um perfil de histograma / diagrama de
dispersão que inclui um diferencial de cinco partes adequadamente posicionado de
leucócitos e reticulócitos, substancialmente se aproximando do sangue total e é
estável por 200 dias ou mais. Este controle fornece esses resultados para os
instrumentos da série Cell Dyn, Bayer H-3 e Sysmex SF.

Por conseguinte, a discussão anterior divulga e descreve modalidades meramente

exemplificativas da presente invenção. Um especialista na técnica reconhecerá
prontamente a partir de tal discussão e dos desenhos e reivindicações que os
acompanham, que várias alterações, modificações e variações podem ser feitas nos
mesmos, sem se afastar do espírito e escopo da invenção, conforme definido nas
reivindicações a seguir. Todas as patentes e outras publicações citadas neste
documento são expressamente incorporadas por referência.

Nós reivindicamos:

1.Método para garantir a qualidade de um instrumento de hematologia, caracterizado pelo

fato de que compreende as etapas de:

a) fornecer um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;

b) fornecer em uma quantidade de referência conhecida:

uma. um primeiro componente para simular reticulócitos humanos para detecção

pelo referido
instrumento de análise hematológica multiparâmetros;

um segundo componente para simular glóbulos vermelhos nucleados humanos

b.

para detecção pelo referido instrumento de análise hematológica

multiparâmetros;

um componente de glóbulos brancos que é preparado a partir de análogos

c.

de glóbulos brancos e é capaz de exibir um diferencial de cinco partes, após

detecção pelo referido instrumento de análise de hematologia
multiparâmetros;

c) contar o número da população por tipo de componente, de uma mistura da referida

etapa (b), com o referido instrumento de hematologia automatizado de
 multiparâmetros; e

d) comparar o número da população por tipo de componente obtido na etapa c)

acima com a referida quantidade de referência conhecida para cada tipo de
componente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos

análogos são fornecidos a partir de glóbulos brancos humanos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos

análogos são fornecidos a partir de glóbulos vermelhos.

4.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o

referido segundo componente é preparado a partir de glóbulos vermelhos aviários.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os referidos

glóbulos vermelhos aviários são glóbulos vermelhos de frango.

Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido

6.

componente de glóbulos brancos foi colocado em contato com um aldeído.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os referidos

glóbulos vermelhos aviários são glóbulos vermelhos de peru.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido

aldeído é formaldeído

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido

aldeído é glutaraldeído.

Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido

10.

componente de glóbulos brancos foi colocado em contato com uma ureia

heterocíclica.

Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido

11.

segundo componente compreende ainda um componente para simular humanos

glóbulos vermelhos para detecção pelo referido instrumento de análise hematológica
multiparâmetros.

Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido
12.

componente para simular glóbulos vermelhos compreende glóbulos vermelhos

humanos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o
referido segundo componente compreende ainda um componente para simular
humanosplaquetas para detecção pelo referido instrumento de análise de
hematologia multiparâmetros.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido
componente de plaquetas compreende plaquetas simuladas

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as
referidas plaquetas simuladas compreendem plaquetas humanas estabilizadas ou
plaquetas simulado de células de cabra, bovina ou suína.

16.Composição de controle, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo

fato de que o referido primeiro componente compreende glóbulos vermelhos de
cabra.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido
componente de glóbulos brancos foi fixado por calor.

Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido

18.

componente de glóbulos brancos foi fixado por pelo menos um agente químico.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido
agente químico é do grupo que consiste em álcool e ureia.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o

referido componente de glóbulos brancos foi fixado por uma combinação de
calor e em pelo menos um agente químico.

21.Método para garantir a qualidade de um instrumento de hematologia, caracterizado pelo

fato de que compreende as etapas de:
a) fornecer um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;

b) fornecer em uma quantidade de referência conhecida:

uma. um componente para simular reticulócitos humanos para detecção pelo

referido instrumento de análise hematológica multiparâmetros; e

b.um componente de leucócitos preparado a partir de análogos de leucócitos,

o referido componente de leucócitos sendo suspenso em uma suspensão
isotônica incluindo uma lipoproteína, e sendo capaz de exibir um diferencial
de cinco partes, mediante detecção pelo referido instrumento de análise de
hematologia multiparâmetros, dito sangue branco célula componente
incluindo ainda um componente para simular glóbulos vermelhos nucleados
humanos para detecção pelo referido instrumento de análise hematológica
multiparâmetros;
 c) contar o número da população por tipo de componente com o
referido instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro; e
d) comparar o número da população por tipo de componente obtido a partir
da etapa c) acima com a referida referência conhecida

quantidade para cada tipo de componente.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o
referido componente para simular reticulócitos humanos é preparado a partir do
sangue de um animal anêmico.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o
referido componente para simular reticulócitos humanos é preparado a partir do
sangue de um porco anêmico.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o
referido componente para simular reticulócitos humanos é preparado a partir de
sangue de na cabra anêmica

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o
referido componente para simular reticulócitos humanos é preparado a partir do
sangue de um coelho anêmico.

Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o

26.

referido componente de glóbulos brancos compreende ainda glóbulos vermelhos

estabilizados.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os
referidos glóbulos vermelhos estabilizados são preparados em uma forma
substancialmente livre de glicose Meio Ambiente

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os
referidos glóbulos vermelhos estabilizados estão contidos em um diluente incluindo
fosfato solução salina tamponada com PEG.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o referido
diluente inclui um conservante EDTA.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido
diluente inclui gluconato de nésio.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido
diluente inclui um antioxidante.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido
diluente inclui cerca de 2% de albumina de soro bovino.

Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os

33.

referidos análogos de glóbulos brancos são preparados a partir de glóbulos vermelhos.

34. Método para garantir a qualidade de um instrumento de hematologia, caracterizado pelo

fato de que compreende as etapas de:

a) fornecer um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;

b) fornecer em uma quantidade de referência conhecida:

uma. um componente para simular reticulócitos humanos para detecção pelo
referido instrumento de análise hematológica multiparâmetros;
b. um componente para simular glóbulos vermelhos nucleados humanos

para detecção pelo referido instrumento de análise hematológica

multiparâmetros;
c. um componente para simular glóbulos vermelhos humanos para
detecção pelo referido instrumento de hematologia multiparâmetros;
 d. um componente para simular a detecção humana pelo referido
multiparâmetro instrumento e plaquetas para hematologia
e. um componente de glóbulos brancos que é preparado a partir de análogos de
glóbulos brancos, estando o referido componente de glóbulos brancos suspenso
numa suspensão isotónica incluindo uma lipoproteína, e sendo capaz de exibir
um diferencial de cinco partes, após detecção pelo referido instrumento de
análise hematológica multiparâmetros;

c) contar o número da população por tipo de componente com o referido

instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro; e

e) comparar o número da população por tipo de componente obtido na

etapa c) acima com a referida quantidade de referência conhecida para cada tipo
de componente.

Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que os referidos
35.

componentes de glóbulos brancos são preparados a partir de células humanas.

Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que os referidos
36.

componentes de glóbulos brancos são preparados a partir de glóbulos vermelhos.

Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o referido
37.

componente de reticulócito é preparado por encapsulação de glóbulos vermelhos.

Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que os referidos
38.

glóbulos vermelhos são preparados em um ambiente substancialmente livre de glicose.

Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que os referidos
39.

componentes são preparados de maneira a preservar os antígenos de superfície.

40. Método para garantir a qualidade de um instrumento de hematologia, caracterizado pelo

fato de que compreende as etapas de:

a) fornecer um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;

b) fornecer em uma quantidade de referência conhecida:

uma. um componente para simular reticulócitos humanos;

b. um componente para simular glóbulos vermelhos nucleados humanos para detecção
pelo referido
instrumento de análise hematológica multiparâmetros;
c. um componente para simular glóbulos vermelhos humanos para detecção pelo
referido
instrumento de hematologia multiparâmetros;
d. um componente reticulado de plaquetas; e

e. um componente de glóbulos brancos que é preparado a partir de análogos de

glóbulos brancos que são fixados por pelo menos um produto químico, o referido
componente de glóbulos brancos sendo suspenso em uma suspensão isotônica
incluindo uma lipoproteína e sendo capaz de exibir um diferencial de cinco partes,
mediante detecção pelo referido instrumento de análise hematológica
multiparâmetros;

c) contar o número da população por tipo de componente com o referido

instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;
d) emitir os resultados da referida contagem; e
e) comparar o número da população por tipo de componente
obtido a partir da etapa c) acima com a referida quantidade de referência conhecida para cada
tipo de componente.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido
41.

componente para simular reticulócitos é preparado por encapsulação de glóbulos

vermelhos.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido
42.

componente para simular reticulócitos é preparado a partir do sangue de um animal

anêmico.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a referida
43.

quantidade de referência inclui ainda plaquetas para detecção pelo referido

instrumento de hematologia multiparâmetros.

44. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido
análogo de glóbulos brancos é ainda fixado por aquecimento.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido
45.

componente de glóbulos brancos é preparado a partir de glóbulos vermelhos.

46.Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que os referidos
glóbulos vermelhos são preparados em um ambiente substancialmente livre de glicose.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que os referidos
47.

componentes são processados de maneira a preservar os antígenos de superfície.

48. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o
 referido componente de glóbulos brancos inclui pelo menos três subcomponentes
selecionados do grupo que consiste em linfócitos, monócitos, neutrófilos, basófilos e
eosinófilos.

Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o referido
49.

componente de glóbulos brancos é preparado a partir de glóbulos brancos humanos.

50. Método para garantir a qualidade de um instrumento de hematologia, caracterizado pelo

fato de que compreende as etapas de:

a) fornecer um instrumento de hematologia automatizado multiparâmetro;

b) fornecer em uma quantidade de referência conhecida:

uma. um componente para simular reticulócitos humanos para detecção pelo
referido análise de hematologia multiparâmetros instrumento;
b. um componente para simular glóbulos vermelhos nucleados humanos

para detecção pelo referido instrumento de análise hematológica

multiparâmetros;
c. um componente para simular glóbulos vermelhos humanos para
detecção pelo referido hematologia multiparâmetros
instrumento;
d. um componente para simular plaquetas humanas para detecção pelo referido
instrumento de hematologia multiparâmetros;
um componente para simular plaquetas reticuladas humanas para
e.
detecção pelo referido hematologia multiparâmetros
instrumento; e um componente de glóbulos brancos que é preparado a partir
de análogos de glóbulos brancos
que são fixados por pelo menos um
químico, o referido componente de glóbulos brancos sendo suspenso em uma
suspensão isotônica incluindo um lipoproteína, e sendo capaz de exibir um
diferencial de cinco partes, mediante detecção pelo referido multiparâmetro
instrumento de análise hematológica;
c) contar o número da população por tipo de componente com o referido
multiparâmetro hematologia automatizada instrumento;
d) emitir os resultados da referida contagem; e
e) comparar o número da população por tipo de componente obtido a partir da etapa c) acima
com a referida referência conhecida
quantidade para cada tipo de componente.

Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que os referidos
51.

componentes são processados de maneira a preservar os antígenos de superfície.

Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o referido
52.

componente de glóbulos brancos é preparado a partir de glóbulos brancos humanos.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o referido
componente de glóbulos brancos inclui pelo menos três subcomponentes selecionados de
45 componentes que são preparados a partir de glóbulos vermelhos. do grupo que consiste
em linfócitos, monócitos, neutrófilos, basófilos e eosinófilos