FMU – BIOMEDICINA – 2011

Profª Anna Carolina R Duarte

A ciência que estuda as células esfoliadas, natural ou artificialmente é denominada Citologia. Este
estudo pode ser utilizado como método para avaliarmos a normalidade ou o estado patológico de um órgão ou
tecido (Citopatologia). A citopatologia abrange os exames de citologia oncologica (oncotica ou papanicolaou)
e citologia hormonal (endócrina ou funcional)
Em 1943, Dr. George Nicholas Papanicolaou e outros colaboradores publicaram nos Estados Unidos,
um trabalho científico, onde observaram a presença de células cancerosas ou malignas em esfregaços obtidos
de amostras do colo uterino com tumores malignos, sendo que algumas destas pacientes não apresentavam
qualquer suspeita clínica. Desta forma o exame ou teste foi consagrado com um instrumento adequado na
detecção e prevenção do câncer.
Objetivos da citologia oncologica: Triagem (screening) populacional (negativo, suspeito, positivo para
células neoplasicas malignas), Objetivos de diagnostico, Objetivos de monitoramento terapeuticos (radio e
quimioterapia, cauterização)
Objetivos da citologia hormonal: Avaliação indireta qualitativa e semi-quantitativa da função ovariana
e/ou dos hormônios esteróides através de índices citológicos que são obtidos de um estudo citomorfológico de
células epiteliais descamadas de epitélios hormonio-dependentes.
A citologia oncologica ou exame de prevenção ou papanicolaou ou exame citológico ou colpocitologico
pode ser realizada em qualquer tipo de material biológico que contenha células epiteliais descamadas de forma
natural (derrames) ou artificial (esfoliação, lavado, escovado e punção) de um tecido e com a sua morfologia
conservada (fixada).

I - TIPOS DE AMOSTRA OU DE MATERIAIS BIOLÓGICOS PARA O EXAME DE

CITOLOGIA ONCOLÓGICA
1) Esfoliação de tecidos cervico-vaginais - Material da Vagina e/ou Colo uterino (ectocervix e endocervix)
2) Esfoliação de tecido das mamas (Secreção Mamária ou Punção de Nódulos)
3) Esfoliação de tecidos do trato urinário (Urina ou Lavado Vesical)
4) Derrames cavitários (Liquido Pleural, Ascítico e Sinovial).
5) Esfoliação, Lavado e Escovado de tecidos do trato respiratório (Escarro, Lavado e/ou Escovado Brônquico).
6) Lavado e escovado de tecidos do trato digestivo (Suco gástrico, Lavado ou escovado gástrico, esofágico e
colonico).
7) Liquor
8)Punção de Tireóide
9) Punção de Cistos

II - IMPORTÂNCIA DOS DADOS CLÍNICOS

DADO CLINICO IMPORTÂNCIA PARA O EXAME DE CITOLOGIA ONCOLOGICA
IDADE Demonstra os graus de risco de uma paciente com relação a infecções e câncer e o
possível perfil hormonal (reprodutivo ou menopausa)
D.U.M. /MENOPAUSA/ Demonstra o perfil hormonal da paciente e sua relação com os tipos celulares a
GESTAÇÃO/LACTAÇÃO serem visualizados no exame
(MARCAR O PERÍODO)
CIRURGIAS Demonstra possíveis cirurgias pôr tumores malignos ou benignos e controle de
GINECOLÓGICAS tratamento, tipos celulares que poderão estar ausentes e ajuda muito durante a coleta
(HISTERECTOMIA TOTAL do material.
OU PARCIAL)
USO DE MEDICAÇÃO Demonstra possíveis alterações nos tipos celulares com relação à condição clinica da
HORMONAL E/OU paciente e o uso destas medicações
TERAPIA DE REPOSIÇÃO
HORMONAL (TRH)
DATA DO ULTIMO EXAME Demonstra possíveis exames para controle terapêutico de infecções, lesões suspeitas
DE C.O. ou câncer.

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III - PREPARO PRÉVIO DA PACIENTE PARA AS COLETAS DE CITOLOGIA
ONCOLÓGICA CERVICO-VAGINAL
Este preparo é necessário para que a colheita não sofra interferências na sua qualidade e quantidade
do material colhido, refletindo diretamente na qualidade do diagnostico citomorfológico.
1)PACIENTE NÃO DEVE COLHER O EXAME DURANTE O SEU PERIODO MENSTRUAL
Um material excessivamente hemorrágico dificulta uma boa visualização do quadro citomorfológico.
Deve-se tomar o cuidado para não confundir com quadros de metrorragias, onde neste caso a colheita deve ser
realizada.
2) NO DIA ANTERIOR AO EXAME À PACIENTE NÃO PODE FAZER USO DE DUCHAS
VAGINAIS OU QUALQUER TIPO DE HIGIENE INTÍMA.
Estes procedimentos dificulta o diagnóstico de possíveis agentes infecciosos, devido a sua retirada
temporária.
3) NÃO USAR MEDICAMENTOS VAGINAIS (ÓVULOS, CREMES OU SUPOSITÓRIOS)
DURANTE NO MINIMO 48 HORAS ANTES DO EXAME.
Estas medicações interferem na coloração dos esfregaços, criando artefatos técnicos e diminuem a flora
vaginal, principalmente os agentes infecciosos.
4) ABSTINÊNCIA SEXUAL (COITO VAGINAL) NO MINÍMO 24 HORAS ANTES DO EXAME.
Interferência do sêmen (liquido seminal + espermatozóides) na coloração e no conteúdo esfregaço, e a
paciente geralmente após um ato sexual irá realizar uma higiene intima.

IV - COLHEITA DO MATERIAL CÉRVICO-VAGINAL

Na sala de colheita devemos ter os seguintes materiais: espéculos de tamanhos variados e esterilizados
(metal), espátula de ayre, escova endobrush, lâminas, fixador (liquido ou spray), gazes, recipientes para o
transporte das lâminas, luvas (látex ou plástico), mesa ginecológica, foco e papel lençol.
Deve-se conseguir um relaxamento da paciente com bons diálogos e ser o mais delicado possível com a
mesma, principalmente durante a colocação do especulo e coleta.
Explicar a paciente cada etapa do exame e comunicar o que ela poderá vir a sentir (desconforto, dor,
vergonha).
Confirmar dados clínicos mínimos para um bom exame citológico: idade e data da última menstruação
(d.u.m.).
Questionar a paciente se possuem atividade sexual, ou se já realizou algum tipo de cirurgia ginecológica
(histerectomia ou períneo), dados importantes antes da colocação do especulo.

A)POSICIONAMENTO DA PACIENTE NA MESA GINECOLOGICA:

Paciente deve ser colocada na posição ginecológica ( posição litotomica): coxas acentuadamente
fletidas sobre a bacia, os joelhos afastados, enquanto os pés ou as dobras dos joelhos apóiam-se em suportes
especiais existentes na mesa.
Tomar o cuidado de deitar a paciente de forma que a borda das nádegas se situe ligeiramente para fora
da mesa; para facilitar o acesso ao canal vaginal.Cobrir com lençol as coxas e joelhos da paciente. Os braços
devem ficar estendidos do lado de fora ou cruzados sobre o tórax, nunca sobre a cabeça (contração de músculos
abdominais).
Focalizar a iluminação do foco para a púbis da paciente
B) COLOCAÇÃO DO ESPÉCULO
Vestir as luvas antes de iniciar este procedimento
Utiliza-se geralmente o especulo de duas valvas ou lâminas (especulo de collin), os quais podem ser de
metal ou plástico (descartáveis).Convém sempre se familiarizar com a maneira de abrir e fechar as lâminas do
especulo. Escolha um especulo de tamanho apropriado, geralmente podemos utilizar especulo de tamanho

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pequeno para as pacientes nulíparas ou que não tiveram parto vaginal (normal), ou em mulheres muito magras
ou em menopausadas, e especulo grande para as pacientes multíparas ou obesas.
A colocação de um especulo no máximo pode ser desconfortável para a paciente, no caso de sensação
de dor ou de muito ardor pode significar um processo inflamatório nas paredes vaginais.
Os grandes e pequenos lábios, juntamente com os pêlos pubianos devem ser afastados com a mão
esquerda, expondo a abertura vaginal. Evitando-se que o especulo puxe os pêlos pubianos ou belisque os lábios
O especulo com as laminas fechadas e com a borboleta ou parafuso voltado para a direita e
lateralmente (posição vertical) deve ser introduzido em um ângulo de 45 graus para baixo, com uma pressão
exercida em direção a parede vaginal posterior.
Após o especulo ter penetrado no canal vaginal, rodar as laminas para uma posição horizontal,
borboletas voltadas para a esquerda e para baixo e começar abri-lo de forma lenta, separando as paredes
vaginais, expondo o colo uterino (cervix uterina).
Caso haja dificuldade em visualizar o colo, retirar o especulo ligeiramente e posicioná-lo de modo
mais anterior.

C) COLHEITA DO MATERIAL
Caso no colo uterino haja uma grande quantidade de secreção, tirar o excesso com o auxilio de gazes,
evitando-se um esfregaço muito espesso e com grande quantidade de exsudato inflamatório (leucócitos).

- COLETA ECTOCERVICAL ----> a extremidade chanfrada da espátula de ayre deve ser encaixada
no orifício do colo e fazer um giro completo de 360 graus, raspando toda região da junção escamocolunar
(j.e.c.).A presença de “feridas” (ectropico ou zona de transformação) pode originar pequenos sangramentos
durante a coleta
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- COLETA VAGINAL -----> com a extremidade arredondada da espátula de ayre raspar as paredes
vaginais ou coletar do fundo de saco vaginal posterior
A coleta ectocervical e vaginal em casos muito excepcional pode ser realizada com auxilio de um
abaixador de língua, mas não e o indicado.
- COLETA ENDOCERVICAL -----> a escova endobrush de ser introduzida no orifício do colo
uterino, atingindo desta forma o canal endocervical, através de movimentos rotatórios obter o material. Pode
haver um pequeno sangramento (epitélio colunar simples).
O uso de swab com extremidades de algodão, não e aconselhado por dois motivos: escassez na
celularidade e contaminação do esfregaço com fibras de algodão.

RETIRADA DO ESPÉCULO VAGINAL

Fecha-se as laminas do especulo e faz-se a sua retirada do canal vaginal, ESTE PROCESSO
SOMENTE DEVERA SER REALIZADO AO FINAL DA FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS

V - CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO
O material colhido destas regiões (ecto, endocervix e vagina) devem ser delicada e de forma
homogeneamente espalhados sobre a superfície de uma lâmina em áreas diferentes, em sentido longitudinal.
Evitando-se os movimentos de vai e vem ou rotatórios.
Deve também ser evitado material em grande quantidade espalhado em pequenas áreas (esfregaços
espessos), e material escasso, difusamente espalhado pela lamina (esfregaços ralos).
O esfregaço ideal apresenta uma camada de material algo transparente, homogeneamente distribuído,
evitando conglomerado de células em áreas diferentes.
Em pacientes menopausadas (epitélio atrofico), podemos utilizar uma espátula umedecida com solução
fisiológica que facilita e aumenta a esfoliação das células.

VI - FIXAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL

Os bons fixadores são aqueles que preservam fielmente os componentes celulares, penetrando no
interior das células aumentando a sua corabilidade (desidratação e desnaturação do protoplasma). Os fixadores
utilizados nos esfregaços cervico-vaginais são: álcool 95% , fixadores de camada (polietileno glicol + álcool
etílico------> spray).
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A fixação deve ser imediata, após no mínimo 15 minutos o material já esta pronto para ser corado. Os
materiais que são fixados no ar irão prejudicar em muito a análise citomorfologica, devido à degeneração
nuclear e citoplasmática, com perda da diferenciação nuclear e citoplasmática.
O material apos a sua fixação deve ser identificado com o nome da paciente, número de registro, idade
e d.u.m.

Falhas mais freqüentes de coleta cervico-vaginal

•Colo uterino não visualizado durante a coleta
•Raspagem cervical insuficiente
•Zona Transformação ou Junção escamo colunar não raspada
•Espalhamento muito espesso ou pobre em celulas
•Esfregaço hemorragico
•Esfregaço purulento
•Esfregaço ressecado antes da fixação
•Má fixação
•Esfregaços contaminados por um lubrificante ou creme vaginal

VII - COLHEITA DO MATERIAL PARA O EXAME DE CITOLOGIA HORMONAL,

CITOLOGIA ENDÓCRINA, INDICE DE MATURAÇÃO OU DE FROST,
CITOLOGIA HORMONAL SERIADA (C.H.S.)
A avaliação citohormonal pode ser realizada através de uma amostra isolada (citologia hormonal
isolada ou índice de maturação) ou através de amostras seriadas no ciclo menstrual da paciente.No caso da
amostra isolada verificar a data da coleta solicitada pelo médico, dentro do ciclo menstrual da paciente, nas
amostras seriadas deve ser realizado as coletas nos seguintes períodos:
7 dia do ciclo menstrual, mesmo a paciente estando menstruada.
14 dia do ciclo menstrual
21 dia do ciclo menstrual
28 dia do ciclo menstrual
As datas determinadas para estas coletas podem variar no máximo 2 dias para menos ou para mais,
devendo sempre o citologista ser informado sobre tais mudanças.
As pacientes que tiverem menstruação a partir da segunda coleta deve ser cancelado as demais coletas,
e informar o citologista sobre o término das coletas devido ao inicio de um novo ciclo menstrual ou
cancelamento das coletas pela paciente.
As avaliações citohormonais devem conter os seguintes dados clínicos: idade, d.u.m. e uso de
medicação hormonal.
As coletas devem ser sempre realizadas nas paredes vaginais.Sugere-se que as pacientes antes da coleta
tenha as mesmas precauções que são solicitadas na citologia oncologica.

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VIII - COLETA DE SECREÇÕES MAMÁRIAS
Aplicação da superfície de uma lamina diretamente sobre a gota de secreções no mamilo obtida por
expressão manual das mamas
A lamina deve ser movida sempre no sentido lateral, da direita para a esquerda ou vice-versa,
espalhando-se a secreção sobre a lamina.
Verificar quando a solicitação for bilateral, coletar amostras em laminas diferentes e identificar como
mama direita e mama esquerda respectivamente.
As pacientes que apresentarem grandes quantidades de secreção, pode ser colhido duas amostras.
Fixar imediatamente em álcool ou fixadores de camada e identificar a paciente

IX – LABORATORIO DE CITOPATOLOGIA
Area para um laboratorio que processa 50.000 exames/ano: aproximadamente 100m2
Recepção – 6 m2, Processamento tecnico – 24 m2, Diagnostico – 16 m2 ou 9 m2 (bem iluminada, ventilada e
evitando-se o barulho de equipamentos e restringindo o fluxo de pessoas), Administração – 9 , Secretaria – m2,
Arquivo de laminas – 9 m2 , Sanitarios – 9 m2
Bancadas, pisos e paredes de revestimentos impermeaveis, laváveis, de cores claras e neutras.
Material permanente: Microscopio biocular, Centrifuga convencional e/ou citocentrifuga, Capela de
exaustão (NR-32)

RECEPÇÃO DAS AMOSTRAS: atendimento do paciente, quando da realização da colheita no proprio

laboratorio, Esfregaços preparados pelo clinico, Material liquido (liquidos cavitarios, lavados, urina) e pastoso
(escarro e secreções de fistula ou abscessos)

REGISTRO DO EXAME NO LABORATORIO

Amostras citologicas e requisição medica
Cadastro em sistemas eletronicos ou manuais
SISCOLO (Datasus) ou Sistemas de informatica particulares (Ex: Worklab)

PROCESSAMENTO TECNICO
Centrifugação – Especimes liquidas ou secreções)
Confecção de Esfregaços:
Método do Deslizamento (T. Lowhagen) – Qualquer tipo de material
Método do Esmagamento – Especimes mucoides

FIXAÇÃO DOS ESFREGAÇOS

Preservar as caracteristicas citomorfologicas e reter certos elementos citoquimicos, essenciais na etapa de
coloração
Os fixadores citologicos devem apresentar as seguintes caracteristicas: Penetrar rapidamente nas células,
Minimizar a retração e a distorção da celula, substituindo a agua celular; Preservar a morfologia celular,
Inativar enzimas autoliticas, Tornar a membrana celulares permeaveis aos corantes, Facilitar a adesão celular a
lamina
TIPOS DE FIXAÇÃO
Úmida – Imersão imediata do esfregaço ainda úmido na solução fixadora, as celulas não são expostas a fixação
pelo ar
Fixadores utilizado: Alcool 95%
Desnatura as proteinas e os acidos nucleicos, tornado-os insoluveis e estaveis
Agente desidratante – Retração celular
2) Fixadores de Cobertura – Fixam as celulas e quando secam promovem a formação de uma pelicula protetora
sobre o esfregaço
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Fixadores utilizados: Carbowax 4000 (polietileno glicol)
3)Fixadores a seco - Deixar secar a temperatura ambiente
Recomendado para colorações que utilizam corantes derivados de Romanoviski

IX - CONCEITOS GERAIS DE COLORAÇÃO

A coloração torna possível o estudo e a visualização das características físicas e das reações dos tecidos
e outros constituintes celulares, porque os tecidos diferentes e também os componentes celulares, exibem
afinidades diferentes para a maioria dos corantes ou tintas, devido as variações da estrutura físico-química e na
composição das células e tecidos.
As colorações podem ser especificas (histoquímica), diretas(ação de soluções simples de corantes) e
indiretas (ação do corante intensificada pôr um outro agente – mordente). O mordente pode ser incorporado na
solução corante ou pode ser usado separadamente e, geralmente, tem o efeito de formar uma ligação entre a
molécula do corante e o elemento tecidual.
. As reações químicas podem ser relativamente não especificas, pôr exemplo coloração de
nucleoproteínas acidas pôr corantes básicos, ou pôr grupos específicos (Ex. PAS) ou altamente especificas (Ex.
Azul da Prússia para íon ferro).
A adsorção envolve a atração e a fixação na superfície, de pequenas moléculas pôr grandes moléculas.
Sabe-se que a grande maioria dos corantes tem cor, porque a sua configuração molecular apresenta
geralmente ou um anel paraquinonoide ou então um ou mais grupamentos azo. Estas estruturas apresentam
uma configuração eletrônica que leva a uma absorção de certos comprimentos de onda de luz. Estes
grupamentos responsáveis pela cor na maioria dos corantes receberam o nome genérico de cromóforos
(cromo=cor e foros=transportador) e, de regra, quanto maior o número de grupamentos cromóforos em um
corante mais intensa é a sua cor. A introdução de um grupo cromóforo numa molécula não corada transforma-
la-á em corada, passando a ser chamada de cromógeno, a qual é corada, mas não é um corante.
O processo das reações químicas dos corantes para se ligarem aos tecidos ou células ocorre devido á
presença de radicais ionizáveis na molécula dos corantes, o quais podem ser catiônicos ou aniônicos, sendo
também chamados de auxocromos (auxo=auxiliar e cromo = cor). Os radicais aniônicos são geralmente o
cloreto, sulfato, o sulfônico e carboxila. O principal grupo catiônico é o aminico = NH2+, estes corantes são
chamados de corantes básicos, quando é formado pôr grupos auxocromos aniônicos são chamados de corantes
ácidos. Existe também o corante neutro que consiste na mistura de corantes ácidos e básicos (Ex. Corantes de
Romanowski).
Os corantes ácidos ou básicos se prendem pôr interação eletrostática aos radicais de sinal oposto
presentes nos componentes tissulares.
Os principais componentes ácidos das células e tecidos (substancias basofilas, devido à afinidade paro
os corantes básicos) são os ácidos nucléicos (DNA-devido aos radicais fosfato), os polissacarídeos ácidos e as
proteínas acidas. As proteínas podem ser acidas ou básicas, de acordo como a predominância de aminoácidos
ácidos ou básicos.
Os principais componentes básicos dos tecidos (substancias acidófilas, devido à afinidade para os
corantes ácidos) são as proteínas ricas em aminoácidos básicos, as proteínas dos grânulos eosinofilos dos
leucócitos e as proteínas mitocôndrias.
As colorações podem ser progressivas, onde o processo deve ser mantido ate que a intensidade de
coloração desejada nos diferentes elementos teciduais ou celulares sejam obtidos.
As colorações podem ser regressivas, os tecidos ou células são supercorados e o excesso de corante é
depois removido seletivamente até que seja obtida a intensidade desejada, ou seja, o excesso de corante é
removido, ele é clareado ou retirado de certos constituintes celulares antes dos outros, ou enquanto outras
estruturas celulares permanecem ainda fortemente coradas. Este processo de remoção seletiva do excesso de
corante é denominado diferenciação.

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A) BATERIA DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU (1954).

Esta coloração idealizada pôr George Nicholas Papanicolaou e Stockard em 1942 é universalmente
utilizada em citopatologia. O método de Papanicolaou consiste na coloração citoplasmática e nuclear com
corantes específicos, e segundo o autor, visa três objetivos:
a) definição dos detalhes nucleares, proporcionando perfeita analise das alterações inflamatórias e
neoplasicas.
b) transparência citoplasmática, de particular importância devida às espessuras celulares diferentes e freqüente
superposição celular na amostra.
c) diferenciação das células, ou seja, utilização da capacidade das células de fixar corantes ácidos ou alcalinos
permitindo tonalidades diferentes de cores, que facilitam o diagnostico citológico.
A qualidade da coloração depende da qualidade da preservação celular e fixação do espécime, dos
reagentes/soluções usadas, protocolo de coloração e da montagem e também da eficácia da iluminação
microscópica. Deve ser chamado a atenção para as reações de cor que não são estáveis e são afetadas pôr
alterações no ph, alterações inflamatórias e mesmo pela espessura dos agrupamentos celulares.
Além da coloração de Papanicolaou, podem-se empregar nos esfregaços colorações especiais ou
impregnações metálicas para melhor esclarecimento diagnostico. Dentre a mais usadas, destacam-se as de May
Gruenwald-Giemsa, Ziehl Neelsen, Acido Periódico de Schiff (PAS), Prata Metenamina de Grocott,
Mucicarmim de Best e Gram.
Desde a sua introdução, o método sofreu varias modificações através de diversos autores, o próprio
Papanicolaou publicou duas delas em 1954 ( Técnica regressiva de coloração) e 1960(Técnica progressiva de
coloração).
São usados três corantes no método: Hematoxilina, Eosina-Alcool (EA) e Orange G, no geral a
hematoxilina tem a função de corar os núcleos e os outros os citoplasma das células.
Os banhos que se seguem antes dos corantes são realizados no solvente do corante, ou seja, a hematoxilina
aquosa, as laminas são lavadas em água, seguindo o Orange e o EA, as laminas são lavadas em álcool. A água
utilizada depois da hematoxilina tem a função de remover a hematoxilina não ligada. A água que vem depois
do diferenciador tem a finalidade de interromper a ação do acido clorídrico.
Os banhos de álcool 95% apos a coloração pelo Orange e EA-36 tem a finalidade de remover a solução de
Orange que não esta ligado ao citoplasma.
Os últimos banhos com álcool absoluto tem a função de remover totalmente a água dos esfregaços
(desidratação). Esta etapa prepara o esfregaço para a imersão posterior em xilol, o passo final da coloração que
é o clareamento ou diafinização do esfregaço, que determina a transparência celular. O xilol é usado como
solução de clareamento porque não é corado, é quimicamente não reativo, além de ter um índice de refração de

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1,494 (aproximadamente o do vidro em torno de 1,515). Desta forma o índice de refração do esfregaço
aumenta, tornando-o transparente.
O primeiro banho com xilol tem a função de remover o álcool e o segundo banho com xilol possibilita o
aumento da transparência da preparação citológica, preparando-a para a fase final que a montagem.
Fatores que influenciam na coloração de Papanicolaou: Tipo de Fixador utilizado, Tipo da Formula da
hematoxilina e dos corantes Citoplasmaticos, Duração do tempo nos corantes, Numero de esfregaços em cada
corante, ph e conteudo quimico da agua corrente usada, ph das soluções e corantes, idade dos corantes usados,
presença de particulas de corantes em soluções não filtradas, tecnica de coloração inconsistente e possivel
contaminação de soluções desidratantes
Os corantes utilizados na bateria de coloração podem ser comprados comercialmente prontos ou preparados
no laboratório a partir de sais primários (abaixo segue instruções). O alcool etílico absoluto P.A., pode ser
substituído pelo álcool etílico absoluto comercial.

1) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELA HEMATOXILINA

A hematoxilina é um corante natural extraído do cerne da arvore chamada Haematoxylon

campechianum, nativa do México, mas atualmente é produzida comercialmente na Jamaica. O extrato natural
obtido dos pedaços de toras cortados desta arvore é o hematoxilo, o qual não é um corante ativo, é necessário
ser inicialmente oxidado ao principio ativo a Hemateina.
A oxidação espontânea ocorre muito lentamente em solução aquosa ou alcoólica, levando três a quatro
meses. O processo de oxidação é conhecido como amadurecimento e pode ser efetuado quase que
instantaneamente pôr oxidantes químicos, tais como óxido de mercúrio, iodato de sódio, permanganato de
potássio, peróxido de hidrogênio e hipoclorito de cálcio. A coloração pôr uma pela hematoxilina madura é
uma mistura de hematoxilina, hemateina, produtos de oxidação ativa da hemateina e do hematoxilo.
Sem um mordente, a hemateina é um corante âmbar fraco, os mordentes são essenciais para a coloração
de hematoxilina, pois são responsáveis pela indução da cor do corante. O mordente forma uma ligação da
hemateina com os ácidos nucléicos e proteínas nucleares, revelando a cromatina nuclear. Os mordentes são
geralmente representados pôr íons metálicos geralmente sulfato de alumínio e potássio ou simplesmente
alúmen, sulfato de amônio férrico e sulfato de amônia e alumínio. Estes sais se combinam como hidróxidos ao
corante, deslocando um átomo de hidrogênio do mesmo e suas valências remanescentes servem para ligar o
complexo mordente-corante aos componentes da célula ou tecido, principalmente aos grupos fosfato dos ácidos
nucléicos.
A coloração pela hematoxilina é do tipo regressivo, a remoção da hematoxilina do citoplasma é feita
pela aplicação de acido clorídrico (HCl), cujas concentrações recomendadas variam (0,2%, 1%, 0,25% e 0,5%).
A aplicação do HCl retém o corante apenas no núcleo, depois desta fase o citoplasma das células ficam
totalmente descorados. A água destilada que vem a seguir tem a finalidade de interromper a ação do acido
clorídrico.
Existem varias preparações possíveis e aceitáveis para a hematoxilina, cujas diversas variações
acabaram recebendo o nome de seus autores. A mais difundida no método de Papanicolaou é a de Harris, cujo
preparação segue logo abaixo, mas existem outras bastante utilizadas, como a de Carazzi (não é usado à etapa
da diferenciação), Mayer, Lillie-Mayer e Gill.

PREPARO DA HEMATOXILINA DE HARRIS

Dissolver em balão volumétrico, 100 g de Alúmen de Potássio em 1.000 ml de água destilada sobre Bico de
Bunsen.
Dissolver 5 g de hematoxilina em 50 ml de álcool etílico absoluto.
Juntar as duas misturas.
Levar à chama até ferver.
Juntar 2,5 g de óxido de mercúrio(oxidação artificial) lentamente, fora da chama.
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Levar a chama ate que a solução assuma uma cor púrpura escuro.
Resfriar rapidamente.
Filtrar logo em seguida, impedindo que o oxido de mercúrio continue oxidando, ou toda vez que usar.
Alguns autores orientam a colocar 20 a 40 ml de acido acético glacial para garantir a seletividade do material
nuclear e ajuda a prevenir a oxidação do corante, também é sugerido acrescentar de 50 ml de álcool etílico á
solução final, pois ajuda a impedir a formação de grumos.

Possiveis Problemas com a Coloração Hematoxilina:

• Nucleo Cora fracamente (pálido)
• Nucleo Cora Fortemente
• Depositos de Hematoxilina no esfregaço

PREPARO DO DIFERENCIADOR
Diluir em proveta, 10 mL de ácido clorídrico em 990 mL de álcool 70 %.

2) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELO ORANGE G OU ALARANJADO G

Consiste de uma solução alcoólica do corante aniônico Orange G e acido fosfotungstico, este atuando
como mordente. O Orange G apresenta-se sob a forma de uma pequena molécula que é capaz de penetrar nas
hemácias e nas células com queratina ou precursores de queratina, dando uma coloração laranja intenso e
brilhante. Evidencia também os grânulos de querato-hialina das células superficiais.

PREPARO DO CORANTE ORANGE G (ALARANJADO G)

1)Solução Estoque
10 g de Orange G
100 mL de água destilada
Agitar e usar depois de uma semana.

2) Solução do Corante Orange G para uso

Medir na proveta, 50 mL da solução estoque, e diluir em balão volumétrico ou Becker com 900mL de álcool
etílico a 95 %.
Pesar 1,5 g de ácido fosfotungstico, diluir em balão volumétrico ou Becker em 50 mL de álcool etílico a 95 % e
juntar as duas soluções.
Pronto para uso depois de filtrado.
3) PRINCIPIOS DA COLORAÇÃO PELO E.A. (EOSINA ALCOOL).

É um corante policromico composto pela eosina, lighe green (verde luz) e pardo de Bismarck,
associados ao acido fosfotungstico. A formula original do corante desenvolvido por Papanicolaou, é conhecido
por um código numérico, o EA-36. Existem duas formulas de EA, 50 e 65. Estas modificações interferem na
intensidade da cor verde da coloração. O EA-65 tem metade do light green do EA-36, enquanto o quantidade
de eosina e pardo permanecem idênticas. Qualquer formula pode ser usada para os diferentes espécimes
citológicos, dependendo da preferência pessoal.
O EA é capaz de corar as estruturas da maioria das células metabolicamente ativas, em rosa pela ação
da Eosina coram células superficiais, nucléolos, eritrócitos e cílios, ou em verde (cianofilia) ou azul pela ação
do light green as células parabasais, intermediarias, colunares, e trichomonas.
Inicialmente acreditava-se que o ácido fosfotungstico atuasse como mordente na reação de coloração,
mas esta visão foi modificada e hoje o pensamento é que atue como um corante de competição que ajuda na
coloração pelo light green.

Este material pode ser reproduzido, deste que citado a sua fonte.
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Hoje alguns autores discutem a ação do pardo de Bismarck, alguns acham que este corante não adiciona
nenhuma cor característica ao citoplasma, desta forma tem sido eliminado na elaboração de algumas formulas.
Outros autores acham que este corante deve ser incluído como um corante de fundo.
Outra duvida é em relação ao uso de uma solução saturada de carbonato de lítio que adicionada à
solução de uso do EA.
Vários fatores, entretanto, tais como a secagem ao ar, o pH da secreção e a espessura do esfregaço
poderão alterar as reações da coloração do citoplasma.

Possiveis Problemas com a Coloração Citoplasmatica

• Citoplasma muito pálido
• Não há coloração diferencial do Citoplasma

PREPARO DO CORANTE E.A. -36 (CLASSICO).

1)Soluções Estoque do EA -36
Estoque A - verde luz 10 g
água destilada 100 mL
Estoque B - pardo Bismarck 10 g
água destilada 100 mL
Estoque C - eosina amarelada 10 g
água destilada 100 mL

Preparo do Corante EA-36 para uso

Pipetar 4,5 mL de Solução Estoque A = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico
95 %
Pipetar 5,0 mL de solução Estoque B = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico
95 %
Pipetar 22,5 mL de Solução Estoque C = Diluir em balão volumétrico ou Becker com 250 mL de álcool etílico
95 %

Pesar 2 g de ácido fosfotungstico, diluir em balão volumétrico ou Becker em 250 mL de álcool etílico a 95 %.
Juntar todas as soluções em um só frasco
Pronto para uso depois de filtrado

4) CLAREAMENTO OU DIAFINIZAÇÃO DOS ESFREGAÇOS

E a fase final da coloração que determina a transparência celular, e a etapa entre a desidratação e a
montagem. A solução usada deve ser compatível tanto com o álcool como com o meio de montagem, tornando
as células transparentes. O xilol, solvente orgânico, é usado com freqüência. Não é corado e é quimicamente
não reativo, além de ter um índice de refração aproximado do vidro, aumentando o índice de refração do
esfregaço, tornando-o transparente. O primeiro banho com xilol tem a função de remover o álcool e o segundo
banho com xilol possibilita o aumento da transparência da preparação citológica, preparando-a para a fase
final que a montagem.
O xilol quando contaminado com água, desenvolve uma reação química que lhe dá uma aparência
leitosa, as laminas que estiverem em contato com este xilol hidratado ficaram opacas, para evitar esta perda de
qualidade dos esfregaços, estes laminas devem voltar para as cubas de álcool absoluto.
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O xilol hidratado deve ser trocado assim como a cuba de álcool absoluto anterior a deste xilol, as
laminas devem passar novamente pelo processo de desidratação e clareamento.

5) MONTAGEM DA LAMINA CORADA

Quando um esfregaço corado, não é montado e for examinado ao microscópio, muito poucos detalhes
podem ser observados devido a grande diferença entre o índice de refração da lamina de vidro e os
componentes das células e o ar, para uma melhor visualização das estruturas celulares, estas devem estar
impregnadas por um meio transparente que tenha o índice de refração próximo ao do vidro. O meio de
montagem é necessário também para proteger os esfregaços corados de danos físicos e do descoramento ou
deterioração da coloração como resultado da oxidação e também da dessecação do material.
O meio de montagem ideal deve Ter um índice de refração próximo ao do vidro, deve ser miscível com
o xilol, não será reativo e não mudara sua cor em ph, tornar-se-á duro sem formar grânulos ou rachaduras.
Os meios de montagem representados por uma resina sintética geralmente usadas, são o Balsamo do
Canadá e o Entellan. Alguns utilizam verniz como meio de montagem.
Durante a montagem deve ser evitar a formação de bolhas, aparecimento de pigmentos marrons
(cornflakes) sobre a superfície celular (evaporação do xilol e aprisionamento de ar entre a lamina e lamínula) e
de áreas turvas (excesso de umidade – desidratação não foi adequada).
Possiveis Problemas na montagem:
• Excesso de Resina
• Montagem muito Lenta - Cornflakes (pigmentos marrons)

B)COLORAÇÃO DE SHORR

O corante nuclear desta coloração é o Biebrich Escarlate, tendo uma afinidade por proteínas
desnaturadas, por isto o núcleos picnóticos tem uma afinidade forte corando-se de vermelho e os vesiculosos de
pardo. Este corante não é indicado para a coloração de núcleos neoplásicos.
Os citoplasmas das células coram-se de verde, e as superficiais eosinófilas de alaranjado,
igualmente na técnica de PAPANICOLAOU .
PREPARAÇÃO DO CORANTE DE SHORR
Etanol 50% -100 ml
Biebrich escarlate -50 mg
Fast Green -75 mg
Orange G -250 mg
Ácido Fosfotungstico -500 mg
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Ácido Fosfomolibdico -500 mg
Ácido Acético Glacial -1 ml

X- MANUTENÇÃO DA BATERIA DE COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU

Troca dos corantes após a coloração de 2000 laminas ou depois de um período de tempo de
6 a 8 semanas (corantes preparados no laboratório) ou quando durante a microscopia for
observado falhas na coloração citoplasmática e nuclear
Manter os corantes em recepientes e cubas escuras
Manter vedadas as cubas da bateria de coloração
Filtração regular dos corantes e soluções
Trocar periodicamente a solução diferenciadora
Trocar diariamente os álcoois usados para limpeza após os corantes
Observar diariamente a precipitação que pode ocorrer na hematolixina e retirar com auxilio
de um papel filtro este material

PROFISSIONAIS QUE ATUAM NA CITOPATOLOGIA

Profissional Formação básica Habilitação Especialização Responsabilidade
Medico Terceiro grau Residência medica em -SBP 1) Leitura e assinatura dos
anatomia patológica -SBCP exames anatomopatológicos
(histopatologia\necropsia\ - IAC 2) Leitura dos casos suspeitos
citopatologia) – e/ou positivos e assinatura
conselho federal ou dos exames citopatologicos
regional de medicina negativo, suspeito e positivo
Farmacêutico Terceiro grau Conselho federal ou - Sbac/Sbcc Leitura e assinatura dos
regional de farmácia - Iac exames citopatologicos
(citotecninologista) negativos, suspeitos e
- Sbcp(citotècnico) positivos
Biomèdico Terceiro grau - Aperfeiçoamento de no - Sbac/ Sbcc Leitura e assinatura dos
minino 500 hrs em - Abbm exames citopatologicos
entidade educacional: - Iac (citotecnologista) negativos, suspeitos e
- Habilitação pelo conselho - Sbcp (citotecnico) positivos
federal ou regional
Citotècnico Segundo grau ou Formação teórica e pratica - Sbpc Leitura e seleção para o
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terceiro grau de no mínimo 1 ano : - Iac patologista dos casos
- Adolfo lutz suspeitos e positivos, não
- Servidor publico estadual pode assinar laudos
- Fund. Onconcentro

OBSERVAÇÃO:
S.B.P – Sociedade Brasileira de Patologia
S.B.C.P. – Sociedade Brasileira de Citopatologia
S.B.A.C. – Sociedade Brasileira de Analises Clinicas
S.B.C.C. – Sociedade Brasileira de Citologia Clinica
I.A.C. – Academia Internacional de Citologia
A.B.B.M – Associação Brasileira de Biomedicina

REFERENCIAS BIBIOGRAFICAS
1.Lima, Conceição Queiroz , O laboratório de Citopatologia – Aspectos Técnicos e Operacionais –
EDUFA – 2000
2. KOSS, Leopold G., Diagnostic Cytology and its Histopathologic Base, Philadelphia, J.B. Lippincott
Company, 1990
3.TAKAHASHI, Masayoshi, Atlas Colorido de Citologia do Câncer, São Paulo, Ed. Manole, 1982
4.KOSS, Leopold G., Citologia Ginecológica e suas bases Anatomoclínicas, São Paulo, Ed. Manole, 1997
5.CARVALHO, Grimaldo, Citologia Oncológica, São Paulo, Livraria Atheneu, 1993
6.MCKEE, Grace T.; Citopatologia, Rio de Janeiro, Ed. Artes Médicas, 1997

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