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PESQUISA ORIGINAL
publicada: 19 de março de 2021
doi: 10.3389/fcimb.2021.646348

Disbiose e implicações do intestino

Microbiota na Retinopatia Diabética

2 2
Yinhua Huang1,2, Zhijie Wang1,2, Hongjie Ma2, Shangli Ji , Zhongping Chen3, Zekai Cui ,
Jiansu Chen1,2,4,5* e Shibo Tang1,2,6*
1 Aier School of Ophthalmology, Central South University, Changsha, China, 2 Aier Eye Institute, Changsha, China,
3 Hospital oftalmológico Changsha Aier, Changsha, China, 4 Laboratório Principal de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Jinan
Universidade, Guangzhou, China, 5 Instituto de Oftalmologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Jinan, Guangzhou, China,
6 Centro CAS de Excelência em Ciência do Cérebro e Tecnologia de Inteligência, Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China

A patogênese do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é comumente associada a bactérias intestinais

Editado por:
Ram Prasad,
alteradas. No entanto, permanece em grande parte desconhecido se a disbiose microbiana que
Universidade do Alabama em Birmingham, existe em pacientes diabéticos humanos com ou sem retinopatia é diferente. Aqui, coletamos
Estados Unidos
informações clínicas e amostras fecais de 75 participantes, incluindo 25 pacientes diabéticos sem
Revisados pela:
retinopatia (DM), 25 pacientes diabéticos com retinopatia (DR) e 25 controles saudáveis (HC). A
Irina Vladimirovna Saltykova,
Universidade Médica do Estado da Sibéria, composição microbiana intestinal nos três grupos foi analisada usando sequenciamento do gene
Rússia
16S RNA ribossômico (rRNA). A estrutura e composição microbiana diferiram nos três grupos. As
Vikash Kansal,
diversidades aeb nos grupos DM e DR foram reduzidas em comparação com as do grupo HC.
Universidade do Alabama em Birmingham,
Estados Unidos Blautia foi o gênero mais abundante, principalmente no grupo DM. Além disso, foram observados
Carolina Francelin,
níveis aumentados de Bifidobacterium e Lactobacillus e níveis reduzidos de Escherichia-Shigella,
Universidade do Alabama em Birmingham,
Estados Unidos Faecalibacterium, Eubacterium_hallii_group e gêneros Clostridium nos grupos DM e DR em
Porto Ângela, comparação com o grupo HC. Além disso, foi identificado um conjunto de biomarcadores de 25
Universidade do Alabama em Birmingham,
Estados Unidos
famílias bacterianas, que poderiam distinguir os pacientes do grupo DR daqueles dos grupos DM e
HC, com valores de área sob a curva variando de 0,69 a 0,85. É digno de nota que Pasteurellaceae,
*Correspondência: Shibo
Tang que aumentou no DM e diminuiu no DR em comparação com o HC, gerou uma AUC elevada (0,74)
tangshibo@vip.163.com Jiansu
como biomarcador preditivo individual.
Chen

chenjiansu2000@163.com
Além disso, 14 biomarcadores familiares foram associados aos níveis de glicemia em jejum ou
Seção especializada:
diabetes, sendo a maioria deles negativamente correlacionados. Em resumo, nosso estudo
Este artigo foi submetido para

Microbiome in Health and Disease, uma

seção da revista
Fronteiras em celular e
Microbiologia de Infecção
estabelece alterações na composição da microbiota intestinal em DM e RD, sugerindo o uso
potencial da microbiota intestinal como biomarcador não invasivo para diagnóstico clínico e
diferencial, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos da retinopatia diabética.

Recebido: 07 de janeiro de 2021 Palavras-chave: microbiota intestinal, humano, diabetes mellitus, retinopatia diabética, sequência do gene 16S rRNA

Aceito: 02 de março de 2021

Publicado: 19 de março de 2021

Citação:
INTRODUÇÃO
Huang Y, Wang Z, Ma H, Ji S, Chen Z, Cui Z,
Chen J e Tang S (2021)
Inúmeras microbiotas intestinais colonizam o intestino humano. O número de bactérias no intestino adulto aumenta
Disbiose e Implicação da Microbiota Intestinal
na Retinopatia Diabética.
para 1.014, pesando aproximadamente 1,13 kg, o que é 10 vezes mais que o número total de células humanas
Frente. Célula. Infectar. Microbiol. 11:646348. (1.013) (Shivaji, 2017). Esses microrganismos constituem um ecossistema simbiótico complexo e acredita-se que
dois: 10.3389/fcimb.2021.646348 interajam com o ambiente hospedeiro, influenciando assim importantes aspectos fisiológicos.

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Huang et al.
processos como produção de nutrientes, modulação de vias de
sinalização, homeostase energética e respostas antiinflamatórias
(Pflughoeft e Versalovic, 2012). Nos últimos anos, distúrbios na
composição e função bacteriana intestinal têm sido associados a muitas
doenças sistêmicas humanas, incluindo diabetes mellitus (Qin et al.,
2012), obesidade (Haro et al., 2016), depressão (Zheng et al., 2020). ),
doença de Alzheimer (Wang et al., 2019) e doenças cardiovasculares
(Battson et al., 2018). No entanto, a disbiose do microbioma intestinal
varia de pessoa para pessoa, apresentando uma ampla gama de
variações genômicas que precisam ser elucidadas.
A diabetes é um dos desafios de saúde que mais cresce no século
XXI , tendo o número de adultos que vivem com a doença mais do que
triplicado nas últimas duas décadas. De acordo com a última edição da
Federação Internacional de Diabetes (IDF)
No Atlas da Diabetes, existem 463 milhões de adultos que vivem
atualmente com diabetes, e estima-se que este número atinja 578
milhões até 2030 e 700 milhões até 2045 (IDF, 2019). O diabetes
mellitus tipo 2 (DM2) é o tipo mais comum de diabetes e é caracterizado
por níveis elevados de glicose no sangue causados pela incapacidade
das células do corpo de responder totalmente à insulina (IDF, 2019) .
O DM2 é uma doença multifatorial influenciada por fatores ambientais
e genéticos e é a principal causa de insuficiência renal, doença
cardiovascular e retinopatia (IDF, 2019). Um estudo de 2010, que
inicialmente demonstrou a influência da microbiota intestinal no
diabetes, relatou que a associação entre Firmucutes e Bacteroidetes
estava alterada em pacientes diabéticos na Dinamarca em comparação
com indivíduos não diabéticos (Larsen et al., 2010). Estudos
subsequentes confirmaram a função da microbiota no metabolismo
sistêmico e no DM2.
Especificamente, Qin et al. (2012) e Karlsson et al. (2013) realizaram
sequenciamento metagenômico em indivíduos diabéticos chineses e
suecos, respectivamente, e estabeleceram que o DM2 era caracterizado
por uma microbiota intestinal disbiótica. Outros estudos indicaram que
a disbiose microbiana está associada à resistência à insulina,
metabolismo lipídico anormal e DM2 (Aron Wisnewsky et al., 2021).
Vários mecanismos subjacentes foram demonstrados em estudos com
ratos, incluindo sinalização do hospedeiro através de lipopolissacarídeos
(LPS) derivados de paredes celulares de bactérias gram-negativas,
ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) produzidos pela fermentação
bacteriana de fibra alimentar e regulação bacteriana de ácidos biliares.
(Allin et al., 2015).
A retinopatia diabética é uma das principais complicações do
diabetes e uma das principais causas de cegueira e deficiência visual.
Pode levar à perda de visão devido a edema macular e isquemia, bem
como à neovascularização da retina e da íris, como hemorragia vítrea,
descolamento de retina e glaucoma neovascular (Cheung et al., 2010).
Nos EUA, aproximadamente 50% dos indivíduos com DM2 podem
desenvolver retinopatia ou retinopatia que ameaça a visão (Kempen
et al., 2004). As complicações e o aumento da prevalência do DM2
exigem uma nova compreensão da sua biologia e o desenvolvimento
de abordagens eficazes para a sua prevenção e tratamento. O aumento
da compreensão da ligação da microbiota intestinal com o DM2
fornecerá novas estratégias clínicas contra o diabetes. Por exemplo,
vários ensaios clínicos randomizados indicaram que o transplante
bacteriano fecal padronizado pode reduzir a resistência à insulina e
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Microbiota intestinal na retinopatia diabética
melhorar a sensibilidade à insulina, interrompendo a progressão do
diabetes (Udayappan et al., 2014; de Groot et al., 2021).
Desde que foi proposta a ideia do “eixo intestino-retina”, no qual o
microbioma intestinal modulado pela dieta, probióticos ou antibióticos,
influencia o desenvolvimento de doenças da retina, a importância do
microbioma intestinal como um importante modulador de doenças
oculares tem sido cada vez mais reconhecido (Rowan et al., 2017;
Rowan e Taylor, 2018). A disbiose do microbioma intestinal está
associada a muitas doenças oculares, como uveíte (Janowitz et al.,
2019), glaucoma (Gong et al., 2020) e degeneração macular relacionada
à idade (Zinkernagel et al., 2017). Além disso, Beli et al. (Beli et al.,
2018) relataram que alterações no microbioma intestinal através do
jejum intermitente poderiam prevenir a retinopatia e prolongar a
sobrevivência em camundongos, indicando que a flora intestinal pode
participar no processo patológico da retinopatia diabética.
No entanto, ainda não está claro se existem diferenças na microbiota
intestinal humana entre pacientes diabéticos com e sem retinopatia.
Estudos sobre disbiose microbiana intestinal identificaram o filo
Bacteroidetes usando métodos de cultura ou concentraram-se na
disbiose de micobioma através do sequenciamento Illumina da região
ITS2 (Moubayed et al., 2019; Jayasudha et al., 2020).
Portanto, este estudo teve como objetivo detectar e identificar
sistematicamente diferenças nas composições microbianas intestinais
de indivíduos diabéticos com (DR) ou sem (DM) retinopatia e comparar
cada grupo com indivíduos saudáveis (HC) com base no sequenciamento
do gene 16S do RNA ribossômico (rRNA). . O estudo teve como
objetivo fornecer um método não invasivo para diagnóstico e
identificação de potenciais alvos microbianos que possibilitasse estudos
adicionais sobre a patogênese e estratégias terapêuticas para a retinopatia diabética.
MATERIAIS E MÉTODOS
Recrutamento de sujeitos do estudo e coleta de amostras
fecais Um total de 50 pacientes
diabéticos e 25 indivíduos saudáveis foram incluídos neste estudo;
todos eles eram residentes locais (província de Hunan na China). A
retinopatia diabética foi diagnosticada com base na Escala Internacional
de Gravidade da Doença da Retinopatia Diabética Clínica (2002)
(Wilkinson et al., 2003). O grau de retinopatia foi determinado por meio
de oftalmoscópio, oftalmoscopia de varredura a laser de campo
ultralargo (UWF-SLO) e tomografia de coerência óptica (OCT). Os
pacientes diabéticos sem retinopatia aparente foram classificados no
grupo diabético mellitus (DM), enquanto aqueles com retinopatia foram
classificados no grupo retinopatia diabética (RD), independentemente
do nível de gravidade. Indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo
também foram recrutados como grupo controle (HC), excluindo aqueles
que faziam uso prolongado de antibióticos, histórico de cirurgias
abdominais e imunocomprometidos. Nenhum dos participantes tomou
antibióticos, probióticos ou prebióticos no mês anterior à amostragem
fecal. As amostras fecais foram coletadas em recipientes de fezes
estéreis e mantidas frias e transferidas para o laboratório dentro de 2
horas após a coleta. Depois de subembaladas, as amostras fecais
congeladas foram colocadas em nitrogênio líquido e imediatamente
armazenadas a -80°C até a análise.
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Huang et al.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Grupo AIER Eye
Hospital (Ética nº AIER2018IRB21). O protocolo deste estudo estava
em conformidade com a Declaração de Helsinque e todos os
participantes forneceram consentimento informado.
Extração de DNA e amplificação da reação em cadeia da
polimerase O DNA microbiano foi
extraído de amostras fecais congeladas usando o kit EZNA® Soil DNA
(Omega Bio-tek, Inc., EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A
pureza e concentração do DNA foram determinadas usando um
espectrofotômetro NanoDrop 2000 UV-vis, e a integridade do DNA foi
verificada através de eletroforese em gel de agarose a 1%. As regiões
hipervariáveis V3 e V4 do gene bacteriano 16S rRNA foram escolhidas
como alvos para amplificação por PCR com códigos de barras
indexados. As sequências iniciadoras utilizadas foram: 338F (5'-
ACTCCTACGGGGAGGCA GCAG-3') e 806R (5'-
GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3').
As reações de PCR foram realizadas utilizando TransStart Fastpfu DNA
Polymerase (TransGen, Pequim, China) em misturas de reação de 20
ml. Os produtos amplificados foram purificados usando um kit de
extração de gel de DNA AxyPrep (AXYGEN Biosciences, Union City,
CA, EUA) e separados em géis de agarose a 2%.
Os produtos amplificados purificados foram quantificados e
homogeneizados usando um fluorômetro de corante Picogreen e
sequenciados em pares em uma plataforma Illumina MiSeq (Illumina,
San Diego, EUA) de acordo com os protocolos padrão da Majorbio Bio-
pharm Technology Co., Ltd (Xangai, China) .
Sequência do gene 16S rRNA e análise da microbiota Para obter
dados limpos,
os dados da sequência bruta foram mesclados e o controle de qualidade
foi realizado usando Trimmomatic e depois mesclados ajustando leituras
curtas em várias etapas. Primeiro, as leituras com índices de qualidade
inferiores a 20 foram truncadas, com um comprimento mínimo de leitura
definido como 50 pb. Em segundo lugar, as sobreposições superiores
a 10 pb foram fundidas com base na correlação entre leituras de PE e
sobreposição, com uma taxa de incompatibilidade não superior a 0,2.
Terceiro, as amostras foram separadas de acordo com o código de
barras/primer em ambas as extremidades da sequência. As sequências
de alta qualidade foram agrupadas em unidades taxonômicas
operacionais (OTUs) com pontos de corte de similaridade de 97%
usando Uparse v7.1 (//drive5.com/uparse/). A taxonomia de cada
sequência do gene 16S rRNA foi analisada usando o classificador
Ribosomal Database Project (RDP) v2.11 (//sourceforge.net/projects/
rdp-classifier/) baseado no banco de dados Silva v132 (//www .arb-
silva.de/). As informações de agrupamento das amostras fecais não
foram divulgadas durante as fases de processamento e sequenciamento
até que os dados da sequência fossem analisados.
Análise Estatística As análises
estatísticas foram realizadas no SPSS v25 (IBM, EUA) e os gráficos
foram gerados no GraphPad Prism v8.0. O teste qui-quadrado foi
utilizado para comparar variáveis categóricas, incluindo sexo, história
familiar de diabetes e assim por diante. ANOVA unidirecional foi usada
para comparar variáveis contínuas, incluindo idade, índice de massa
corporal (IMC), glicemia de jejum (GJ) e duração do tipo 2
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Microbiota intestinal na retinopatia diabética
diabetes (abreviado como ano T2D). a-diversidade foi avaliada pelos
índices de espécies (Ace, Chao, Shannon, Invsimpson, Shannoneven
e Heip), que foram calculados usando a mãe v1.30.1. A b-diversidade
foi usada para explorar a diversidade na estrutura microbiana. A Análise
de Variância Multivariada Permutacional foi utilizada para testar
diferenças nos três grupos e foi realizada no R studio v3.7.1 usando o
pacote “vegan”, com permutações de argumentos = 999 e distância =
“Bray – Curtis”. A análise discriminante linear Effect Size (LEfSe) foi
realizada para identificar os diferentes táxons bacterianos nos três
grupos [análise discriminante linear (LDA) > 2,5]. O classificador florestal
aleatório (R, pacote randomForest) foi utilizado para prever a
discriminação em DM vs. HC, DR vs. HC e DM vs. DR. Foram
consideradas quinhentas árvores em cada combinação. Os
biomarcadores para avaliação do modelo florestal aleatório foram
selecionados com base no valor da área sob a curva (AUC), e o efeito
foi verificado através da análise da curva receiver Operating
Characteristic (ROC) (R, pacote plotROC). A rede bidirecional foi
deduzida da abundância de famílias relacionadas ao DM, DR e HC
usando o software NetworkX v1.11, e analisada usando a análise de
correlação de postos de Spearman (r ÿ 0,1, p < 0,05). A rede bidirecional
foi deduzida a partir de biomarcadores selecionados em nível familiar e
dois parâmetros clínicos, usando o software NetworkX, e analisada
usando a análise de correlação de postos de Spearman (r ÿ 0,1, p <
0,05). O teste fatorial não paramétrico de soma de Kruskal-Wallis foi
usado para comparar as abundâncias relativas de micróbios obtidas a
partir de dados de sequência de 16S rRNA usando SPSS v25.0. Os
resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A
significância estatística das comparações múltiplas foi corrigida pela
correção de Bonferroni, e uma correlação significativa foi estabelecida
em p<0,05.
RESULTADOS
Características clínicas dos indivíduos recrutados Um total
de 75
participantes, incluindo 50 diabéticos e 25 indivíduos saudáveis, foram
recrutados para o estudo. Dependendo da ausência ou presença de
retinopatia diabética, os pacientes diabéticos foram divididos em grupo
diabetes mellitus sem retinopatia (DM, n = 25) ou grupo diabetes mellitus
com retinopatia (DR, n = 25). Outros 25 indivíduos saudáveis pareados
por idade, sexo e IMC foram recrutados para um grupo controle (HC).
As comparações de idade e IMC nos três grupos não mostraram
diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05), enquanto a GJ e a
duração mostraram diferenças significativas (p < 0,001); características
detalhadas adicionais (histórico familiar de diabetes, escala de gravidade
da retinopatia diabética, uso de medicamentos e assim por diante) dos
sujeitos do estudo estão incluídas nas Informações de Apoio (Tabela
Suplementar S1). Imagens de fundo e OCT de indivíduos com DM e
HC mostraram estrutura de fundo normal. Em contraste, as imagens de
fundo de campo ultralargo de pacientes com RD mostraram várias
lesões vasculares retinianas visíveis, incluindo microaneurismas,
hemorragias, manchas algodonosas e exsudatos lipídicos (Figura 1A).
Imagens de OCT no DR
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grupo apresentou edema macular significativo, espessamento retiniano
e descolamento de retina (Figura 1B).
Comparação de a-Diversidade e b-
Diversidade nos grupos DM, DR e HC
Obtivemos 4.468.745 sequências de alta qualidade em todas as
amostras, com comprimento médio de 410,45. Com base no número
mínimo de sequências por amostra, essas sequências foram filtradas e
agrupadas em 919 OTUs com 97% de similaridade de sequência. Neste
estudo, DM e RD foram fortemente associados a uma diminuição na
diversidade intra-individual, medida usando índices de diversidade,
incluindo índices de riqueza de espécies (Ace e Chao), índices de
diversidade de espécies (Shannon e Invsimpson) e índices de
equivalência de espécies (Shannoneven e Heip). Descobrimos que os
índices Ace, Chao e Shannon foram significativamente mais baixos
em pacientes com DM em relação ao HC (p = 0,0026, p = 0,0030 e p =
0,0005, respectivamente, teste de Wilcoxon). No entanto, esses três
índices não foram estatisticamente diferentes entre os grupos DM e RD,
ou entre os grupos RD e HC, embora tenha sido observada uma
tendência decrescente no grupo RD (Figura 2A). Ao mesmo tempo,
descobrimos que os índices de Invsimpson, Shannoneven e Heip foram
significativamente mais baixos nos grupos DM e DR em relação ao grupo
HC (p < 0,05); entretanto, esses índices não alcançaram significância
estatística entre os grupos DM e RD (Figura 2B).
Realizamos análise de diversidade b para avaliar as diferenças gerais
e semelhanças na estrutura da população microbiana entre os grupos. A
análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) distinguiu
os grupos no nível OTU, e a análise de variância multivariada
permutacional (PERMANOVA) demonstrou diferenças significativas entre
eles (p = 0,011, Figura 2C ) . O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado

FIGURA 1 | Características clínicas de pacientes diabéticos sem retinopatia (DM), pacientes diabéticos com retinopatia (RD) e controles saudáveis (HC). (A) Imagens de fundo de olho
da oftalmoscopia de fundo de campo ultralargo mostraram estrutura de fundo normal nos grupos DM e HC, mas mostraram lesões vasculares retinianas, incluindo microaneurismas,
hemorragias, manchas algodonosas e exsudatos lipídicos no grupo DR. (B) As imagens de OCT mostraram forma histológica normal nos grupos DM e HC, mas mostraram edema
macular, espessamento retiniano e descolamento de retina no grupo DR. OCT, tomografia de coerência óptica.

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A C

FIGURA 2 | Comparação da diversidade a e diversidade b em pacientes diabéticos sem retinopatia (DM), pacientes diabéticos com retinopatia (DR) e controles saudáveis (HC). (A)
Os índices de diversidade a de Ace, Chao e Shannon foram significativamente diminuídos no DM em comparação com o HC (p = 0,0026, p = 0,0030 e p = 0,0005, respectivamente,
teste de soma de postos de Wilcoxon). No entanto, esses três índices não foram estatisticamente diferentes entre os grupos DM e RD, ou entre os grupos RD e HC. (B) Os índices de
diversidade de Invsimpson, Shannoneven e Heip foram significativamente diminuídos nos grupos DM e DR em relação ao grupo HC (p <0,05). Entretanto, esses índices não
alcançaram significância estatística entre os grupos DM e DR. (C) A análise PLS-DA mostrou uma separação distinta nos três grupos no nível OTU (PERMANOVA, p =
0,011). (D) Na análise PLS-DA do componente 1 (COMP1), tanto o DM quanto o DR foram significativamente diferentes do HC. Na análise COMP2 PLS-DA, tanto o HC quanto o
DM foram significativamente diferentes do DR (todos p < 0,001; teste de Kruskal-Wallis). PLS-DA, Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais. OUT, unidades
taxonômicas operacionais. *p < 0,05, **p < 0,01,***p < 0,001; ns, sem significado.

testar a significância estatística para os dois componentes obtidos diferenças estatísticas em Actinobacteriota, Proteobacteria e
do modelo PLS-DA. No componente 1 (COMP1)
Na análise PLS-DA, tanto o DM quanto o DR foram
significativamente diferentes do HC. Na análise COMP2 PLS-DA,
tanto HC quanto DM foram significativamente diferentes do grupo
DR (todos p < 0,001, Figura 2D). Além disso, a análise de
coordenadas principais (PCoA) mostrou que a composição
microbiana nos três grupos foi significativamente diferente com
base nas distâncias de Bray-Curtis (R² = 0,048, p = 0,007, Figura
Suplementar S1A), distâncias UniFrac ponderadas (R² = 0,045 ,
p = 0,029, Figura Suplementar S1B) e distâncias UniFrac não
ponderadas (R² = 0,051, p = 0,004, Figura Suplementar S1C). Em
resumo, as análises acima mostraram que a composição
microbiana dos grupos DM e DR foi alterada em relação à do
grupo HC, indicando que os pacientes diabéticos apresentam disbiose sensu_stricto_1
Diferentes composições e abundâncias bacterianas
nos grupos DM, DR e HC A abundância relativa da
composição microbiana nos três grupos foi comparada nos níveis
de filo e gênero. Identificamos 16 filos em todas as amostras.
Firmutes, Actinobacteriota, Proteobacteria e Bacteroidota foram
os filos mais dominantes em cada grupo, respondendo por mais
de 99% da abundância da comunidade. No geral, comparando a
abundância relativa de cada filo nos três grupos, apenas os filos
Firmicutes e Desulfobacterota apresentaram diferenças
significativas (ambos p <0,05; teste de Kruskal-Wallis; Figura 3B). apenas no grupo DR, sendo 88,62% deles pertencentes às
Firmutes foi menos abundante no grupo DR do que nos grupos
DM e HC. Não havia
Bacteroidota nos três grupos, embora tenham sido observadas
as tendências de que Bacteroidota era mais abundante no grupo
DR, enquanto Actinobacteriota e Proteobacteria eram maiores no
grupo DM (Figura 3A ) . Além disso, também foram encontrados
filos menos abundantes que variaram em diferentes graus (Tabela
Suplementar S2).
Um total de 307 gêneros foram identificados. Utilizando análise
de circos, 30 gêneros principais foram distribuídos com diferentes
abundâncias relativas nos três grupos. Dentre estes, Blautia foi o
gênero mais abundante, principalmente no grupo DM. Maior
abundância dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus e menor
abundância dos gêneros Escherichia-Shigella, Faecalibacterium,
Eubacterium_hallii_group e Clostridium (incluindo Clostridium
na microecologiae intestinal.
norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014) foram
observadas nos grupos DM e DR do que no grupo HC. Além
disso, alguns gêneros, cuja abundância relativa foi inferior a 0,01,
foram agrupados em um grupo separado (denominados outros)
(Figuras Suplementares S2A, B). A maioria dos gêneros (211) se
sobrepôs e foi observada em todos os grupos. Dos 13 gêneros
detectados apenas no grupo HC, 91,14% pertenciam às famílias
norank_o_Gastranaerophilales e Morganellaceae. Foram
detectados oito gêneros apenas no grupo DM, sendo 89,7%
pertencentes às famílias Erysipelotrichaceae, unclassified_c_Bacilli
e Ruminococcaceae. Vinte e dois gêneros foram detectados
famílias Acidaminococcaceae, Muribaculacea, Atopobiaceae e
norank_o_Coriobacteriales (Figura 3C e Tabela Suplementar S3).

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A C

FIGURA 3 | Variações na composição da microbiota fecal em nível de gênero em pacientes diabéticos sem retinopatia (DM), pacientes diabéticos com retinopatia (RD) e controles
saudáveis. (A) A torta mostra as proporções relativas de filos bacterianos no DM, DR e controles, respectivamente. Os Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria e
Bacteroidota foram os filos mais dominantes em cada grupo. Os níveis de Firmicutes foram menores no grupo DR em comparação com os grupos DM e HC. Não houve diferenças
estatísticas em Actinobacteriota, Proteobacteria e Bacteroidota nos três grupos. (B) A abundância relativa de Firmicutes e Desulfobacterota mostrou diferenças significativas nos três
grupos (ambos p < 0,05; teste de Kruskal-Wallis). (C) A torta mostra os gêneros sobrepostos e únicos nos três grupos. A maioria dos gêneros (211) se sobrepôs e foi observada em todos
os grupos. No total, 13, 8 e 22 gêneros foram detectados apenas nos grupos HC, DM e DR, respectivamente.

Microbiota intestinal distinta nos grupos DM, DR e HC Para
caracterizar a microbiota
distinta nos grupos DM, DR e controle, realizamos análise LFfSe na
composição da microbiota fecal desde o nível do filo até o gênero. Houve
63 táxons bacterianos que apresentaram diferenças significativas nas
abundâncias relativas nos três grupos, com 11 e 18 táxons microbianos
distintos nos grupos DM e DR, respectivamente. Esses táxons pertenciam
a 25 famílias principais (pontuação LDA> 2,5, p <0,05, teste de Kruskal-
Wallis; Figura 4A). Analisamos ainda diferenças significativas em nível
familiar usando o teste de Kruskal-Wallis para identificar a família
bacteriana que poderia discriminar os grupos DM, DR e HC. As
abundâncias relativas de 26 famílias foram significativamente diferentes.
Este resultado foi semelhante ao das famílias distintas identificadas pela
análise LFfSe (Tabela Suplementar S4). Entre as 15 famílias
significativamente diferentes e de alta abundância, três famílias
(Streptococcaceae, Tannerellaceae e Pasteurellaceae) foram
significativamente enriquecidas no grupo DM, enquanto quatro famílias
(Oscillospiraceae, Christensenellaceae, Acidaminococcaceae e
Anaerovoracaceae) foram significativamente enriquecidas no grupo DR .
Em contraste, oito famílias (Peptostreptococcaceae, Clostridiaceae,
Eggerthellaceae, norank_o_Clostridia_UCG-014, Butyricicoccaceae,
Erysipelotrichaceae, Eubacterium_coprostanoligenes_group e
Monoglobaceae) foram significativamente enriquecidas no grupo HC
(Figura 4B ) .
Biomarcadores microbianos intestinais para
discriminar DM, RD e HC As famílias bacterianas
foram analisadas usando um classificador florestal aleatório para identificar
assinaturas microbianas capazes de discriminar grupos de DM, RD e HC.
Utilizando a avaliação do modelo, escolhemos as principais características
importantes com os maiores valores de AUC como biomarcadores para
distinguir os três grupos. No total, foram selecionadas 33 famílias
importantes (17 para DM vs. HC, 10 para DR vs. HC e seis para DM vs.
DR; Figuras Suplementares S3A-C). Após a remoção das categorias
duplicadas, 25 famílias foram identificadas como biomarcadores
microbianos intestinais. Então, para avaliar o valor potencial do modelo
de microbiota intestinal como biomarcadores, utilizamos a análise da
curva ROC para quantificar sua capacidade de classificação com base
no valor da AUC. Esses painéis de biomarcadores microbianos nos
permitiram distinguir indivíduos com DM daqueles com RD ou HC com
precisão diagnóstica confiável (DM vs. HC, AUC = 0,85; RD vs. HC, AUC
= 0,79; DM vs. RD, AUC = 0,69; Figuras 5A–C). Descobrimos que as
famílias Pasteurellaceae, Oxalobacteraceae e Gallionellaceae foram os
principais biomarcadores que distinguem DM e RD (Tabela Suplementar
S5). Curiosamente, usar apenas a família Pasteurellaceae como preditor
gerou uma AUC mais alta de 0,74 (IC 95% 0,63–0,85) (Figura 5C).
Para determinar ainda mais se esses biomarcadores discriminativos
poderiam refletir o status da doença, realizamos a análise de correlação
de postos de Spearman e descobrimos que 14 famílias estavam associadas

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Huang et al. Microbiota intestinal na retinopatia diabética

FIGURA 4 | Abundância relativa da comunidade bacteriana em pacientes diabéticos sem retinopatia (DM), pacientes diabéticos com retinopatia (RD) e controles saudáveis (HC).
(A) À esquerda, análise LEfSe da composição da microbiota fecal desde o nível do filo até o gênero nos três grupos. À direita, a análise do tamanho do efeito LDA mostrou a abundância
relativa de gêneros nos grupos DM, DR e controle. No total, 63 táxons bacterianos apresentaram diferenças significativas na abundância relativa, com 11 e 18 táxons microbianos
distintos nos grupos DM e DR, respectivamente (pontuação LDA> 2,5, p <0,05, teste de Kruskal-Wallis). (B) As 15 principais famílias significativas de alta abundância; três
famílias enriqueceram-se no grupo DM; quatro famílias enriqueceram no grupo DR; e oito famílias foram enriquecidas no grupo HC.
LEfSe, tamanho do efeito da análise discriminante linear; LDA, análise discriminante linear. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

com dois parâmetros clínicos: GJ e duração. Com exceção de DISCUSSÃO

Eubacteriaceae, que foi enriquecida no grupo DR e teve correlação
positiva com GJ e duração, as demais famílias apresentaram correlações
negativas. Essas famílias pertenciam principalmente aos filos Firmicutes
e Actiobacteriota e a maioria delas foi enriquecida no grupo HC (Figura
6A e Tabela Suplementar S6). Com base em quatro famílias
representativas, os níveis de Clostridiaceae e Peptostreptococcaceae
foram mais baixos nos grupos DM e DR do que no grupo HC. Quando
comparamos os grupos DM e DR, descobrimos que os táxons estavam
presentes em maior abundância no DR do que no DM, embora essa
diferença não tenha alcançado significância estatística (Figura 6B).
Eubacteriaceae apresentou a maior abundância relativa, enquanto
Pasteurellaceae apresentou a menor abundância relativa no grupo DR
em comparação com os grupos DM e HC (Figura 6C). Juntos,
identificamos os biomarcadores bacterianos que permitiram a
discriminação dos grupos DM, DR e HC, e alguns marcadores
microbianos intestinais refletiram a anormalidade da glicose e a duração
da doença.
A ocorrência de diabetes e retinopatia relacionada está intimamente
relacionada à disbiose microbiana intestinal. Aqui, aplicamos o
sequenciamento do gene 16S rRNA para obter uma composição
abrangente da microbiota intestinal em pacientes com DM e DR e em indivíduos saud
Além dos gêneros microbianos únicos identificados em cada grupo,
também comparamos gêneros e famílias distintas de bactérias nos
grupos DM e DR com o grupo HC e entre si. Além disso, selecionamos
e confirmamos 25 biomarcadores em nível familiar usando o modelo de
predição florestal aleatória, que poderia distinguir RD de DM, e ambos
de CH, com uma precisão diagnóstica confiável. Portanto, nossos
resultados devem ser mais explorados em ensaios clínicos. Além disso,
os biomarcadores selecionados podem ser utilizados não apenas para
diagnóstico clínico, mas também como alvos de novas intervenções
terapêuticas para a retinopatia diabética.
Neste estudo descobrimos que os pacientes dos grupos DM e RD
tinham microbiota intestinal distinta em comparação com os controles

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Huang et al. Microbiota intestinal na retinopatia diabética

A B C

FIGURA 5 | Classificação de doenças com base em biomarcadores microbianos intestinais. A capacidade de classificação foi quantificada por meio da análise da curva ROC e avaliada
pelos valores de AUC em (A) DM versus HC (AUC = 0,85), (B) RD versus HC (AUC = 0,79) e (C) DM versus RD (AUC = 0,69) . A linha vermelha representa o resultado
quando apenas a família Pasteurellaceae foi usada como preditor para distinguir os grupos DM e DR (AUC = 0,74, IC 95% 0,63–0,85).

A B

FIGURA 6 | A análise de rede bidirecional e famílias representativas. (A) A rede bidirecional mostrou coeficientes de correlação de Spearman entre os biomarcadores selecionados e
dois parâmetros clínicos; glicemia de jejum (FBG) e duração do diabetes tipo 2 (ano DM2). Além de Eubacteriaceae, que teve correlação positiva com GJ e duração, as demais
famílias tiveram correlações negativas. Essas famílias pertenciam principalmente aos filos Firmicutes e Actinobacteria.
(B) Os níveis de Clostridiaceae e Peptostreptococcaceae nos grupos DM e DR foram menores em comparação com o grupo HC. (C) A maior abundância relativa em
Eubacteriaceae e a menor abundância relativa em Pasteurellaceae foram observadas no grupo DR. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

com base na diversidade reduzida e na composição microbiana alterada.
No geral, os índices de diversidade (Invsimpson, Shannoneven e Heip)
foram mais baixos em DM e DR do que em HC. Outros índices (Ace,
Chao e Shannon) foram menores no grupo DM, mas não
significativamente menores no grupo DR. Quando a RD foi comparada
com o DM, observou-se tendência de aumento da RD, embora não tenha
alcançado diferença estatística. A DR foi caracterizada por alterações
em OTUs específicas atribuídas principalmente às famílias
Acidaminococcaceae, Muribaculacea, Atopobiaceae e
norank_o_Coriobacteriales. Aqui encontramos vinte e dois
gêneros em DR apenas em comparação com oito em DM e treze em HC
(Figura 3C). Especulamos que a possível explicação seria que a
microbiota na RD poderia tender a exibir uma diversidade patológica
mais complexa e maior. Além disso, foram observadas diferenças na
diversidade b (PLS-DA) nos três grupos. Nossos resultados foram
consistentes com os de estudos anteriores, que relataram que índices
de diversidade a mais baixos (Shannon e Chao) da microbiota intestinal
e diversidade b diferente foram observados em pacientes com DM2 em
comparação com indivíduos não diabéticos (Nuli et al., 2019 ; Zhao et
al., 2019; Reitmeier et al., 2020). Portanto, nós

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postulam que o início e a progressão do diabetes e suas complicações retinianas
estão relacionados a alterações na microbiota intestinal.
Descobrimos também que DM e RD estavam associados a perturbações dos filos
Firmicutes, Bacteroidetes e Desulfobacterota. Um estudo anterior mostrou que as
proporções de Firmicutes e Clostridia (pertencentes ao filo Firmicutes) foram
significativamente reduzidas, enquanto a de Bacteroidetes foi aumentada, no intestino
de pacientes com DM2 (Larsen et al., 2010). Da mesma forma, observamos que a
abundância de Firmicutes e Clostridiaceae relacionadas nos grupos DM e DR foi
menor do que nos participantes saudáveis. Além disso, descobrimos que Bacteroidetes
era mais abundante nos grupos DR do que nos grupos DM e HC, o que está de
acordo com outros resultados do estudo (Moubayed et al., 2019). Bacteroidetes são
bactérias gram-negativas cujas paredes celulares são compostas principalmente por
LPS. Os LPS derivados de membros de Bacteroidetes não apenas inibem a sinalização
imune inata e a tolerância a endotoxinas, mas também estão associados à patogênese
diabética (Davis-Richardson et al., 2014; Vatanen et al., 2016). Vagaja et al. (Vagaja
et al., 2013) relataram que a exposição sistêmica ao LPS em camundongos
hiperglicêmicos poderia acelerar a lesão do endotélio capilar da retina e o
adelgaçamento da retina.
Curiosamente, notamos que, em comparação com o grupo HC, a Desulfobacterota
foi enriquecida no grupo DR, mas reduzida no grupo DM. Desulfobacteota é composto
por muitos organismos que podem reduzir compostos de enxofre através da via de
redução dissimilatória de sulfito DsrAB (Waite et al., 2020), e esses organismos
participam da degradação do butirato realizando uma via de beta-oxidação do butirato,
indicando que Desulfobacteota está envolvido no equilíbrio da reação catabólica (Hao
et al., 2020). Portanto, pode-se levantar a hipótese de que as bactérias dos filos
Bacteroidetes e Desulfobacterota podem liberar LPS para desencadear lesões
inflamatórias ou agravar anormalidades do metabolismo energético, sendo que ambas
são características patológicas do diabetes.
No nível de gênero, diminuição dos gêneros Faecalibacterium, Eubacterium_
hallii_group e Clostridium (Clostridium_sensu_stricto_1 e
norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014) e aumento de Blautia, Bifidobacterium e
Lactobacillus foram observados nos grupos DM e DR. Para gêneros com abundância
diminuída, Faecalibacterium, Eubacterium_hallii_group e Clostridium são conhecidos
colonizadores intestinais humanos e produtores de butirato e são altamente
discriminantes para DM2 (Karlsson et al., 2013; Hiippala et al., 2018). Estas bactérias
fermentam as fibras alimentares para produzir butirato através do metabolismo
microbiano intestinal, desempenhando assim um papel regulador na melhoria da
sensibilidade à insulina, no alívio da inflamação e na melhoria da diabetes em
humanos e ratos (Vrieze et al., 2012; Udayappan et al., 2016; Hiippala et al., 2012;
Udayappan et al., 2016; Hiippala et al., 2012; Udayappan et al., 2016; Hiippala et al.
al., 2018).
Da mesma forma, a redução de Clostridium também foi encontrada em pacientes
chineses e europeus com DM2 (Qin et al., 2012; Karlsson et al., 2013).
Karlsson et al. (2013) relataram ainda que Clostridium correlacionou-se negativamente
com glicemia de jejum, insulina e triglicerídeos plasmáticos, e positivamente com
adiponectina e lipoproteína de alta densidade, todos intimamente relacionados ao
DM2. Assim, especulamos que a ocorrência de diabetes e retinopatia pode estar
associada à redução destas bactérias benéficas.
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Microbiota intestinal na retinopatia diabética
Os gêneros Blautia e lactobacillus foram enriquecidos em participantes com
diabetes e foram mais abundantes no grupo DM do que no grupo DR. Este aumento
dos gêneros Blautia e lactobacillus em pacientes diabéticos também foi observado em
outros estudos (Larsen et al., 2010; Karlsson et al., 2013; Wang et al., 2020). Wang
et al. (2020) relataram que Blautia estava positivamente correlacionado com os níveis
de ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA). TUDCA, um antagonista do receptor
farnesóide X (FXR), regula o metabolismo glicolipídico através de seu receptor para
FXR e receptor de membrana acoplado à proteína G de ácido biliar (TGR5). O TGR5
pode ser encontrado em células ganglionares primárias da retina, e a ativação do
TGR5 poderia prevenir a retinopatia e prolongar a sobrevivência em camundongos db/
db (Beli et al., 2018). Isto pode explicar porque os pacientes diabéticos com maior
Blautia têm menor probabilidade de desenvolver retinopatia. Níveis aumentados de
lactobacilos foram positivamente correlacionados com glicemia de jejum, hemoglobina
glicosilada e uma medida de longo prazo do controle da glicemia (Karlsson et al.,
2013). Assim, o aumento de Lactobacillus no intestino pode ser consequência do
aumento dos níveis de glicose em pacientes diabéticos. No entanto, o gênero
lactobacillus representa um probiótico comum com boas propriedades
imunomoduladoras e antioxidantes, que está envolvido no mecanismo da retinopatia
diabética. Zeuthen et al.
(Zeuthen et al., 2006) relataram que as bactérias do ácido láctico (pertencem
principalmente aos lactobacilos) regulam positivamente os marcadores de maturação
da superfície das células dendríticas e potencialmente contribuem para a regulação
da inflamação crônica. Outro estudo revelou que a administração oral de cepas de
lactobacilos melhorou a capacidade antioxidante em camundongos diabéticos (Dang
et al., 2018). Esses efeitos benéficos do lactobacilo poderiam explicar parcialmente o
resultado de que ele era mais abundante no grupo DM do que no grupo DR. O
presente estudo descobriu que alguns medicamentos para o tratamento do diabetes
tiveram efeitos importantes nas alterações do microbioma intestinal. Por exemplo, Wu
et al. (2017) relataram que a metformina influenciou significativamente o microbioma
intestinal (incluindo aumento de Bifidobacterium) para melhorar a tolerância à glicose
e aumentar os efeitos antidiabéticos da droga. A maioria dos indivíduos dos grupos
DM e DR do nosso estudo utilizou metformina, e notamos que a abundância de
Bifidobacterium foi maior nesses grupos do que no grupo HC. Portanto, o aumento da
abundância de Bifidobacterium pode ser atribuído ao efeito da metformina.
Além disso, além de identificar a microbiota intestinal, devem ser rastreados
biomarcadores microbianos que possam ser utilizados para distinguir doenças. Neste
estudo, identificamos 25 famílias importantes que poderiam distinguir indivíduos com
RD daqueles com DM ou HC, com valores de AUC variando de 0,69 a 0,85. Para
desenvolver ainda mais a confiabilidade potencial desses biomarcadores como
ferramentas de diagnóstico, avaliamos a duração e os níveis de glicose plasmática
em jejum e determinamos sua correlação com biomarcadores selecionados.
Encontramos 14 famílias diferentes, além de Eubacteriaceae, que apresentaram
correlação positiva com parâmetros clínicos relacionados ao diabetes; todas as outras
famílias apresentaram correlações negativas.
A maioria das famílias, como Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae,
norank_o_Clostridia_UCG-014 e Butyricicoccaceae foram altamente expressas no
grupo HC. Geralmente Clostridiaceae e Peptostreptococcaceae estão negativamente
correlacionadas com doenças metabólicas e participam da produção de AGCCs
9 Março de 2021 | Volume 11 | Artigo 646348
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Huang et al.
como acetato, propionato e butirato (Fei et al., 2019; Oliphant e Allen-Vercoe,
2019). Estudos anteriores relataram que os SCFAs poderiam melhorar a
homeostase da glicose e estavam associados à redução do risco de DM2,
obesidade e doenças cardiovasculares (Chambers et al., 2018; Zhao et al., 2018).
Isso pode explicar a observação de porque suas abundâncias diminuíram nos
grupos DM e DR em comparação aos controles.
No entanto, também notamos que algumas bactérias na RD estavam mais
próximas do HC em comparação com o grupo DM; era parcialmente contraditório
com a expectativa. Presumimos que uma explicação possível seja o crescimento
compensatório bacteriano. Às vezes, a abundância de bactérias produtoras de
SCFA e as concentrações fecais de SCFA não são consistentes. Por exemplo,
Zhao et al. (2019) relataram que na maioria dos pacientes com DM2 com
complicações diabéticas, a abundância de bactérias produtoras de SCFA
aumentou, enquanto as concentrações fecais de SCFA, que refletem um estado
de equilíbrio entre a produção intestinal e a absorção de SCFAs (Fernandes et
al., 2014), foram diminuídos. Por outro lado, a hiperglicemia provoca a ruptura da
barreira intestinal e a disfunção das células epiteliais intestinais, que absorvem e
utilizam SCFAs como sua principal fonte de energia (Thaiss et al., 2018; Yao et
al., 2020). A maior parte desta microbiota contraditória são bactérias produtoras
de SCFA; presumimos que possam apresentar crescimento compensatório para
promover a colheita de energia através da produção de SCFAs mais benéficos.
Outra possível razão é que o papel destas bactérias não era simplesmente
produzir SCFAs.
No entanto, são necessárias mais pesquisas, uma vez que ainda não existe uma
explicação mecanicista desta microbiota para o desenvolvimento diabético. Além
disso, identificamos algumas microbiotas, incluindo norank_o_Clostridia_UCG-014
e Butyricicoccaceae, que merecem uma análise mais aprofundada, embora não
tenham sido relatadas anteriormente.
Eubacteriaceae foi a única família que apresentou correlação positiva com o
nível de glicemia de jejum e foi significativamente enriquecida em pacientes
diabéticos, principalmente no grupo DR.
Geralmente, as Eubacteriaceae são um dos componentes predominantes da
microbiota intestinal humana e são abundantes em pessoas saudáveis (Arrieta &
Finlay, 2012). No entanto, as Eubacteriaceae também são abundantes em
algumas doenças imunológicas e metabólicas. Por exemplo, o nível de
Eubacteriaceae foi elevado no momento da replicação aguda do vírus da
imunodeficiência símia da mucosa e foi mais abundante no pré-operatório, entre
aqueles que entraram em remissão do DM2 no pós-operatório (Allers et al., 2020;
Davies et al., 2020; Davies et al., 2020; Davies et al., 2020; Davies et al. al., 2020).
As descobertas acima indicam que as Eubacteriaceae podem desempenhar um
papel importante nas doenças imunológicas e metabólicas. Embora não possamos
explicar o motivo do aumento observado de Eubacteriaceae nos grupos DM e DR,
esta observação é consistente com a relação entre Eubacteriaceae e doenças
metabólicas. Além disso, um estudo anterior mostrou que Pasteurellaceae, que
coloniza principalmente a superfície mucosa dos tratos respiratório e genital, é um
importante patógeno humano e animal, e pode iniciar a infecção empregando
múltiplos mecanismos moleculares de adesão (Jacques e Paradis, 1998).
Paradoxalmente, descobrimos que Pasteurellaceae foi significativamente
enriquecida no grupo DM, mas significativamente reduzida no grupo DR. Além
disso, usando apenas Pasteurellaceae como biomarcador para
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Microbiota intestinal na retinopatia diabética
distinguir entre os grupos DM e DR alcançou a maior precisão (AUC: 0,74).
Propomos que Pasteurellaceae possa ser a principal microbiota, e seus efeitos
sobre DM e RD requerem mais estudos envolvendo amostras maiores.
O principal ponto forte deste estudo é que os indivíduos recrutados foram
rigorosamente pareados por controle, com informações clínicas bem caracterizadas,
reduzindo assim o viés decorrente de potenciais efeitos de confusão, como idade,
sexo e IMC. Além disso, estudos anteriores mostraram que a composição
microbiana intestinal pode ser influenciada por antibióticos (Mikkelsen et al., 2015;
Ianiro et al., 2016). Recrutamos indivíduos sem histórico recente de uso de
antibióticos. No entanto, houve algumas limitações em nosso estudo. Por exemplo,
existe um certo viés na taxa de admissão porque uma grande proporção de
indivíduos foi selecionada no hospital. Além disso, devido à falta de informações
dietéticas detalhadas para os sujeitos, nosso estudo não pôde controlar ou avaliar
se e como os hábitos alimentares influenciaram a composição microbiana intestinal
nos grupos DM, DR ou HC. Como a província de Hunan está localizada no sul da
China, e o arroz é o alimento predominante aqui, se os hábitos alimentares de
diferentes regiões têm algum efeito nas alterações microbianas, serão necessários
mais estudos multicêntricos controlados. Além disso, nossos achados não
mostram uma relação causal entre a composição microbiana intestinal diferencial
identificada em cada grupo, o que é uma limitação inerente aos estudos
transversais. Para ampliar e avançar o trabalho atual, uma coorte amostral maior
e outras estratégias analíticas emergentes precisam ser consideradas em estudos
futuros.
CONCLUSÃO
Nós caracterizamos e identificamos composições microbianas intestinais distintas
em indivíduos dos grupos DR e DM e as comparamos com controles saudáveis.
Além disso, desenvolvemos e validamos um modelo de classificador microbiano
intestinal que pode efetivamente discriminar o RD dos grupos DM e HC.
As descobertas atuais lançam as bases para estudos futuros, baseados em
microbiota intestinal distinta, para desenvolver melhores métodos de diagnóstico
clínico e identificar potenciais alvos terapêuticos da retinopatia diabética.
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Os conjuntos de dados apresentados neste estudo podem ser encontrados em
repositórios online. Os nomes dos repositórios e número(s) de acesso podem ser
encontrados abaixo: NCBI BioProject, número de acesso: PRJNA688998.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA
Os estudos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados pelo
Comitê de Ética do Grupo AIER Eye Hospital (Ética nº AIER2018IRB21). Os
pacientes/participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para
participar deste
10 Março de 2021 | Volume 11 | Artigo 646348
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Huang et al.
estudar. O consentimento informado por escrito foi obtido do(s) indivíduo(s) para
a publicação de quaisquer imagens ou dados potencialmente identificáveis
incluídos neste artigo.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
YH esteve envolvido na concepção e desenho do estudo. YH, ZW, HM, SJ, ZCh
e ZCu estiveram envolvidos na coleta e montagem dos dados. YH, JC e ST
estiveram envolvidos na interpretação dos dados e redigiram o manuscrito. Todos
os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
FINANCIAMENTO
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China
(81871495) e pelo projeto de Ciência e Tecnologia de Changsha, Hunan
(kh1901251), Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de
Jiangxi (20203BBGL73193) e Fundação de Pesquisa Científica do Aier Eye
Hospital Group (AM2001D1).
REFERÊNCIAS
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Microbiota intestinal na retinopatia diabética
MATERIAL SUPLEMENTAR
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Figura Suplementar 1 | Comparações da diversidade b com PCoA em DM, DR e controles
saudáveis. (A) PCoA das distâncias de Bray-curtis (R²=0,048, p=0,007).
(B) PCoA de distâncias UniFrac ponderadas (R²=0,045, p=0,029). (C) PCoA de distâncias
UniFrac não ponderadas (R²=0,051, p=0,004). Abreviatura: PCoA, análise de
coordenadas principais.
Figura Suplementar 2 | Variações na composição da microbiota fecal nos grupos DM, DR e HC.
(A) Circos representam os grupos e gêneros bacterianos. O lado direito mostra os gêneros
bacterianos e o lado esquerdo mostra os três grupos de estudo. As linhas mais internas
indicam as conexões entre a bactéria e o grupo. A espessura das linhas indica a abundância
das bactérias. As diferentes cores representam grupos e diferentes gêneros. Os gêneros cujas
abundâncias relativas foram inferiores a 0,01 foram agrupados em um grupo separado
(denominados outros). (B) As parcelas mostram as diferenças nos gêneros representativos nos
três grupos.
Figura Suplementar 3 | Biomarcadores escolhidos com base na análise do classificador
Random Forest. As principais características importantes com os valores mais elevados de
AUC foram escolhidas como biomarcadores para distinguir os três grupos. (A) Dezessete
famílias importantes foram selecionadas para DM versus HC. (B) Dez famílias importantes foram
selecionadas para DR versus HC. (C) Seis famílias importantes foram selecionadas para DM versus DR.
de Groot, P., Nikolic, T., Pellegrini, S., Sordi, V., Imangaliev, S., Rampanelli, E., et al.
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11 Março de 2021 | Volume 11 | Artigo 646348
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Conflito de interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de
quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como
potencial conflito de interesses.
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12 Março de 2021 | Volume 11 | Artigo 646348