UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB

LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA

REVISADO EM 26/07/2017

Protocolo padrão de técnicas histológicas animal

Para microscopia de luz

GERAL:
 1 - Coleta e Dissecação
 2 - Fixação
 3 - Processamento (desidratação, diafanização e inclusão em parafina)
 4 - Emblocamento
 5 - Microtomia
 6 - Coloração
 7 - Montagem das Lâminas com Resina

PASSO A PASSO:

1) COLETA E DISSECAÇÃO

 Se o órgão for muito grande deve-se fazer a macrotomia deste antes;

 Colocar as secções em cassetes e identifica-los a lápis.

2) FIXAÇÃO

 Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular,

estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo
assim a arquitetura normal do tecido. Além disso, os fixadores também fornecem maior
resistência ao tecido para suportar as demais etapas;
 Dependendo do tipo de análise deve-se optar por um fixador específico, por exemplo,
para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído
tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência.
Para microscopia de luz branca o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode-se utilizar
também o paraformaldeído. A formalina tamponada também é utilizada para microscopia de
luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais
detalhadas;
 O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras.

FIXADORES:

 PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO – PH 7,2:

PFA (Paraformaldeído) .............................................. 12 g

Água destilada ........................................................... 150 mL
PBS 0,2M ................................................................... 150 mL
Hidróxido de Sódio ..................................................... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N)
Preparo:
 Aquecer a água destilada até 70°C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo,
acrescentando aos poucos o PFA;
 Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de
sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente);
 Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M;
 Medir o pH (pH ~ 7,2) e filtrar a solução.

Observações:
 O material deve permanecer no fixador de 12-24h;
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.

 FORMALINA NEUTRA TAMPONADA – PH 7,2:

Formol 37% ................................................................. 100 ml

Água destilada ............................................................. 900 ml
Fosfato de Sódio Monobásico (1H2O) ......................... 4,0 gramas
Fosfato de Sódio Dibásico (7H2O) .............................. 12,2 gramas

ou

Formol 37% ............................................................... 100 ml

Água destilada ............................................................ 900 ml
Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro) ...................... 4,0 gramas
Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro) ............................ 6,5 gramas

Observações:
 O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h;
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.

 GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO – PH 7,2:

Glutaraldeído 25% .................................................................. 5mL
Tampão Fosfato de Sódio 0,1M ............................................. 45mL

Observações:
 O material deve permanecer no fixador de 4-24h;
 O Glutaraldeído não deve ser usado para testes de imunofluorescência;
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.
 Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,2M)

Água destilada .......................................................... 1 L

Fosfato de Sódio dibásico anidro .............................. 11g
Fosfato de Sódio monobásico monohidratado ...........2,75g

Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,1M)

Água destilada ........................................................... 1 L

Tampão PBS 0,2M .................................................... 1 L

3) PROCESSAMENTO
 Esta etapa consiste na impregnação do tecido por uma substância de consistência firme que
permita, posteriormente, a realização de secções finas (5 a 10 m);
 Devido ao preço, fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste
procedimento;
 Como a parafina não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a
desidratação das amostras, quando ocorre então a retirada da água dos tecidos através da
substituição por álcool etílico;
 A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos,
por xilol, solvente que é ao mesmo tempo miscível em álcool e parafina;
 Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60°.

 1ª DESIDRATAÇÃO

Sequência:
 Álcool etílico 30 % ________________________ 1 hora
 Álcool etílico 50 % ________________________ 1 hora
 Álcool etílico 70 % ________________________ 1 hora
 Álcool etílico 80 % ________________________ 1 hora
 Álcool etílico 90 % ________________________ 1 hora
 Álcool etílico 100 % I ______________________ 1 hora
 Álcool etílico 100 % II _____________________ 1 hora

Observação:
 A amostra pode ser conservada no álcool 70% por alguns dias.

 2º DIAFANIZAÇÃO

Seqüência:
 1º Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) ________ 40 minutos
 2º Xilol II (Puro) ________________________________ 40 minutos

Conseqüências:
 O tecido torna-se transparente. Retira a gordura dos tecidos.

Observações:
 A ausência de turvação indica boa desidratação.
 Os tecidos não podem ficar muito tempo no Xilol.
 O Xilol é hidrofóbico, por isso os órgãos inicialmente ficam mergulhados no álcool.
 Usa-se o Xilol para retirar o álcool, pois este não é miscível em parafina.
  3º INCLUSÃO NA PARAFINA

 Parafina I ___________________________ 3 horas

 Parafina II ___________________________ 3 horas
 Parafina III __________________________ 3 horas

Importante:
 A partir da etapa do álcool 70%, O LAMEB
disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Processador de
Amostras Leica TP1020.

4) EMBOCAMENTO

 Colocar a parafina no molde de metal e então posicionar a amostra de acordo com o

corte que se pretende realizar (longitudinal, transversal...);
 Após os blocos estarem duros, esperar pelo menos 24 horas para iniciar o
seccionamento. O ideal é colocar os blocos na geladeira antes de utilizá-los no micrótomo.

Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB
disponibiliza, aos usuários cadastrados, o
Emblocador de Amostras Leica
EG1150H.

05) MICROTOMIA

 Fazer os cortes de 5 a 10 micrômetros

utilizando um micrótomo rotativo;
 Pegar a fita e colocar em água aquecida com gelatina a aproximadamente 45 °C, pegar o
corte com a lâmina.

Solução para distender o corte no banho-maria

 Gelatina em pó incolor _________________ 4 gramas

 Água aquecida (55ºC) ____________________ 2 litros

Observação:
 Antes da coloração, colocar previamente as lâminas em
estufa entre 40 °C e 55 °C, ideal 50°C, ou placa aquecida
para derretimento da parafina, por aproximadamente 1
hora. Isto ajuda a fixar o corte na lâmina.

Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos
usuários cadastrados, o Micrótomo Rotativo Leica
RM2255.
 06) COLORAÇÃO

 Nesta etapa ocorre a desparafinização (retirada da parafina) dos cortes na lâmina, em seguida é
realizada a hidratação para então ocorrer a coloração do tecido.

 COLORAÇÃO H.E. (HEMATOXILINA E EOSINA)

Sequência:
 1º - Xilol Puro I (desparafinização) __________________________ 10 minutos
 2º - Xilol Puro II (desparafinização) __________________________ 10 minutos
 3º - Álcool 100 % I (hidratação) _____________________________ 5 minutos
 4º - Álcool 100% II (hidratação) _____________________________ 5 minutos
 5º - Álcool 90% (hidratação) ________________________________ 5 minutos
 6º - Álcool 80% (hidratação) ________________________________ 5 minutos
 7º - Álcool 70% (hidratação) ________________________________ 5 minutos
 8º - Álcool 50% (hidratação) ________________________________ 5 minutos
 9º - Água (hidratação) _____________________________________ 10 minutos
 10º - Hematoxilina de Meyer (coloração) _______________________ 3 minutos
 11º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 10 minutos
 12º - Eosina amarelada (coloração) ___________________________ de 8 a 20 minutos
 13º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 1 minuto
 14º - Álcool 70% (desidratação) _____________________________ 2 minutos
 15º - Álcool absoluto I (desidratação) _________________________ 3 minutos
 16º - Álcool Absoluto II (desidratação) ________________________ 3 minutos
 17º - Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) _______________ 5 minutos
 18º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) __ 10 minutos

Observação:
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10
minutos.

Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos
usuários cadastrados, o Sistema de Coloração de
Lâminas Leica AutoStainer XL.

07) MONTAGEM DA LÂMINA COM LAMÍNULA

Sequência:
 1º - Pingar 2 gotas de resina líquida (Entelan,
Permount, Bálsamo do Canadá...);
 2º - Colocar a lamínula sobre a lâmina;
 3º - Pressionar levemente para tirar as bolhas;
 4º - Levar as lâminas até a estufa para secagem ou
deixar secando ao ar livre;
 5º - etiquetar as lâminas.

Importante:
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários
cadastrados, o Aplicador de Lamínulas Leica CV5030.