Eletroforese DNA - Sequenciação

Para que serve a eletroforese de DNA?
Para que serve a eletroforese de DNA?

Para analisar/visualizar o DNA
Video eletroforese de DNA (~10min)
https://www.youtube.com/watch?v=MWKuEYpnstI&feature=youtu.be
1. Qual é a carga do DNA?
O DNA tem carga negativa (grupos fosfatos)
2. Qual a malha do gel?


Pode ser de agarose ou de poliacrilamida

3. O que determina qual a malha do gel a utilizar?


3. O que determina qual a malha do gel a utilizar?

- o tamanho dos fragmentos a analisar e/ou
- a diferença de tamanho entre eles
A poliacrilamida tem maior resolução do que a agarose, ou seja, a poliacrilamida é
melhor para analisar fragmentos de DNA muito pequenos ou quando a diferença entre
fragmentos é muito pequena (consegue discriminar fragmentos de DNA que diferem em
1pb enquanto a agarose necessita de uma diferença de pelo menos 50-100pb). No
entanto a agarose é muito mais utilizada no dia a dia dos laboratórios, pois a maioria
dos fragmentos analisados difere em mais de 50pb, é simples de utilizar, é mais barata
e não é tóxica (poliacrilamida líquida é neurotóxica por acumulação).
4. Para que serve o tampão de amostra?
4. Para que serve o tampão de amostra?
A eletroforese de DNA decorre submersa em tampão de transferência. Como o DNA
encontra-se numa solução aquosa há necessidade de adicionar um tampão de amostra para
conferir cor e densidade à amostra (para que esta vá para o fundo do poço e não difunda no
tampão). Por esta razão este tampão contém:
-glicerol (para conferir densidade)
-corante para visualizar a amostra (este corante não cora o DNA, cora a água – como é tudo
transparente o corante permite ver a amostra, quando aplicamos a amostra o poço fica
colorido e já sabemos quais os poços que já foram utilizados, se a amostra “fugir” do poço
conseguimos ver o corante a sair do poço, quando migramos a amostra o corante também
migra e indica que a eletroforese está a migrar). Os corantes mais utilizados são:
- azul de bromofenol (azul escuro, migra ”ao pé” dos fragmentos de tamanho
médio),
- xileno cianol (azul claro, migra “ao pé” dos fragmentos grandes de DNA)
- laranja G (cor de laranja, migra “ao pé” dos fragmentos pequenos de DNA).
Consoante o corante utilizado temos uma ideia de onde andam os fragmentos de
DNA numa eletroforese.
5. Como migram os diferentes fragmentos de DNA numa eletroforese?
A agarose é uma malha através da qual os fragmentos menores atravessam mais

facilmente do que os fragmentos maiores, logo, os fragmentos menores migram mais
do que os fragmentos maiores. A relação é inversamente proporcional (ao logaritmo do
tamanho dos fragmentos), ou seja, quanto mais migram mais pequenos são.

6. O que é uma banda num gel?


6. O que é uma banda num gel?
Uma banda são vários fragmentos de DNA com o mesmo tamanho. Todos os
fragmentos de DNA que têm o mesmo tamanho estão sobrepostos formando uma única
banda.
7. Como se pode visualizar os fragmentos de DNA após eletroforese?
Para visualizar os fragmentos de DNA o gel tem que conter um corante do DNA.
Antes utilizava-se muito o brometo de etídeo, agente intercalante do DNA (intercala-
se na dupla cadeia), cancerígeno e quando irradiado com luz U.V. fica fluorescente,
permitindo a visualização do DNA.
Atualmente existem variantes “não cancerígenas”, que também intercalam o DNA

mas as moléculas são maiores e não atravessam a membrana plasmática: RedSafe,
GelRed e GreenSafe.

GelRed e GreenSafe.
8. É possível estimar o tamanho de determinado fragmento de DNA?


GelRed e GreenSafe.
8. É possível estimar o tamanho de determinado fragmento de DNA?

Sim, em todas as eletroforeses, para além das amostras é aplicado um padrão
(marcador) que contém fragmentos de DNA de tamanho conhecido. Desta forma,
por comparação com o marcador, é possível estimar o tamanho de um fragmento de
DNA.
Exemplo de um
marcador:
1 2
3 4
5 6
7 7
8
9
Método de Sanger
(síntese de DNA)
O que deve conter uma reação de sequenciação?

Método de Sanger
(síntese de DNA)
DNA molde
1 primer
DNA polimerase
dNTPs (desoxinucleótidos)
Método de Sanger
(síntese de DNA)
DNA molde
1 primer
DNA polimerase
dNTPs (desoxinucleótidos)
ddNTPs (didesoxinucleótidos)
São desoxinucleótidos sem o grupo OH 3’
O que é a ligação fosfodiéster?
Ligação que ocorre entre 2 nucleótidos na mesma cadeia, entre o grupo OH 3’ de
um nucleótido e o P 5’ de outro nucleótido
A que extremidade do primer são adicionado nucleótidos?


A síntese de DNA ocorre no sentido de 5’ para 3’, logo os nucleótidos são
adicionados à extremidade 3’ do primer.

O que acontecerá à síntese de DNA quando for inserido um ddNTP?


O que acontecerá à síntese de DNA quando for inserido um ddNTP?

Ao não ter o grupo 3’ OH, um ddNTP irá interromper a síntese de DNA pois não
será possível estabelecer uma nova ligação fosfodiéster com o nucleótido
seguinte.
Método de Sanger
(síntese de DNA)
DNA molde DNA molde DNA molde DNA molde

1 primer 1 primer 1 primer 1 primer
DNA polimerase DNA polimerase DNA polimerase DNA polimerase
dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs
1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo
+ + + +
ddATP ddGTP ddTTP ddCTP
O que vai acontecer de diferente em cada um dos tubos?

Método de Sanger
(síntese de DNA)
DNA molde DNA molde DNA molde DNA molde

1 primer 1 primer 1 primer 1 primer
DNA polimerase DNA polimerase DNA polimerase DNA polimerase
dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs
1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo 1 dNTP radioativo
+ + + +
ddATP ddGTP ddTTP ddCTP
A síntese de A síntese de A síntese de A síntese de

todos os todos os todos os todos os
fragmentos fragmentos fragmentos fragmentos
terminarão em A terminarão em G terminarão em T terminarão em C
A quantidades de dNTPs versus ddNTPs devem ser iguais ou diferentes?
Devem ser diferentes
Se forem diferentes quem deveria estar em quantidades limitantes e quem

deveria estar em excesso?
Se forem diferentes quem deveria estar em quantidades limitantes e quem

deveria estar em excesso?
DNA molde
1 primer
DNA polimerase
dNTPs (em excesso)
1 dNTP radioativo
+
ddNTPs (em quantidades limitantes)
Se os ddNTPs estivessem em excesso, não haveria síntese de DNA porque

esta estaria “sempre” a ser interrompida, uma reação de sequenciação pode
ler até 700pb, o que quer dizer que é possível sintetizar fragmentos dessa
ordem de grandeza antes de ser inserido um ddNTP
Como escolher primers para sequenciar determinada região ?
(1) 5’ Região A Região B 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’
A síntese de DNA tem que “passar” pela sequência “alvo”

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’
Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:


3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’

- F1 ou R2 ou ainda R3 (dependo da distância em pb)

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:


3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’


- R3 ou F2 ou ainda F1 (dependendo da distância em pb)

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’


Se quiser sequenciar a “cadeia 1” da “região B” :


3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’



- R3

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’



- R3
Se quiser sequenciar a ”cadeia 2” da “região A”:


3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
R1 R2 R3
F1 F2 F3 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
(2) 3’ 5’



- R3
Se quiser sequenciar a ”cadeia 2” da “região A”:

- F1
Escolha um primer para sequenciar esta cadeia:
5’ GTCGACTAAGCTCGAATCACTAGTCGAATCGAGTCC 3’
R 5’GGACTCGATTCGACTAGTG 3’
19 nts 58ºC
GTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
R 5’GGACTCGATTCGACTAGTG 3’
19 nts 58ºC
Com esta sequência e com este primer, quantos fragmentos de DNA vão
se formar dentro do tubo que contém o ddATP?
Com esta sequência e com este primer, quantos fragmentos de DNA vão
se formar dentro do tubo que contém o ddATP?
Vão se formar 4 fragmentos:

- A síntese é complementar (insere um ddATP onde existe um dTTP)
- Os fragmentos são contabilizados a partir do primer
AGCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
AGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
AGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
ATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
GAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
GATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
GCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
GCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
TGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CAGCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
35pb AGCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
Tubo A
25pb AGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
20pb AGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
30pb ATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
26pb GAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
Tubo G
31pb GATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
34pb GCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
24pb GCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
21pb TAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
22pb TTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
Tubo T
28pb TCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
29pb TTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
32pb TGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
36pb CAGCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
Tubo C
33pb CTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
27pb CGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
23pb CTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
Como podemos analisar os fragmentos originados?
Por eletroforese de DNA
Qual deve ser a malha do gel?

Qual deve ser a malha do gel?

Poliacrilamida, fragmentos diferem em 1pb
Como é feita a leitura do gel?
A G T C
Como é feita a leitura do gel?
A G T C
3’
- os fragmentos pequenos migram mais, logo os
fragmentos que estão no incío (onde a síntese foi
interrompida mais cedo) estão em baixo)
- assim de baixo para cima vamos no sentido em
que correu a síntese, dos fragmentos pequenos
para os maiores e consequentemente de 5’ para 3’
CAGCTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CTGATTCGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
5’ CGAGCTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5’
CTTAGTGATCAGCTTAGCTCAGG 5
3’ 5’
A G T C
3’ Qual a sequência do gel?
5’
A G T C
5’ ATTCGAGCTTAGTCGAC 3’
5’
A G T C
Qual a sequência da cadeia molde?
5’
A G T C
Qual a sequência da cadeia molde?
5’ GTCGACTAAGCTCGAAT 3’
A cadeia molde é complementar invertida

da sequência que está no gel, porque a
síntese de DNA é complementar.
5’ Sequência original que foi sequenciada:
A sequenciação automática também se baseia no método de Sanger.
Quais as diferenças?
A sequenciação automática também se baseia no método de Sanger.
Quais as diferenças?
-Os ddNTPs estão marcados com moléculas fluorescentes (cada um tem uma
cor diferente)
-Como é possível distinguir os ddNTPs pelas cores já não há necessidade de
fazer 4 reações, basta fazer uma com todos os ddNTPs juntos
-Deixou de se usar radioatividade
-O computador lê a sequência diretamente do gel
Cromatograma

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Para que serve a eletroforese de DNA?

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2. Qual a malha do gel?

2. Qual a malha do gel?

2. Qual a malha do gel?

3. O que determina qual a malha do gel a utilizar?

2. Qual a malha do gel?

3. O que determina qual a malha do gel a utilizar?

A agarose é uma malha através da qual os fragmentos menores atravessam mais

A agarose é uma malha através da qual os fragmentos menores atravessam mais

6. O que é uma banda num gel?

A agarose é uma malha através da qual os fragmentos menores atravessam mais

6. O que é uma banda num gel?

Atualmente existem variantes “não cancerígenas”, que também intercalam o DNA

Atualmente existem variantes “não cancerígenas”, que também intercalam o DNA

8. É possível estimar o tamanho de determinado fragmento de DNA?

Atualmente existem variantes “não cancerígenas”, que também intercalam o DNA

8. É possível estimar o tamanho de determinado fragmento de DNA?

O que deve conter uma reação de sequenciação?

O que deve conter uma reação de sequenciação?

O que deve conter uma reação de sequenciação?

A que extremidade do primer são adicionado nucleótidos?

A que extremidade do primer são adicionado nucleótidos?

A que extremidade do primer são adicionado nucleótidos?

O que acontecerá à síntese de DNA quando for inserido um ddNTP?

A que extremidade do primer são adicionado nucleótidos?

O que acontecerá à síntese de DNA quando for inserido um ddNTP?

DNA molde DNA molde DNA molde DNA molde

O que vai acontecer de diferente em cada um dos tubos?

DNA molde DNA molde DNA molde DNA molde

A síntese de A síntese de A síntese de A síntese de

Se forem diferentes quem deveria estar em quantidades limitantes e quem

Se forem diferentes quem deveria estar em quantidades limitantes e quem

Se os ddNTPs estivessem em excesso, não haveria síntese de DNA porque

(1) 5’ Região A Região B 3’

(1) 5’ Região A Região B 3’

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “cadeia 1” da “região B” :

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “cadeia 1” da “região B” :

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “cadeia 1” da “região B” :

Se quiser sequenciar a ”cadeia 2” da “região A”:

(1) 5’ Região A Região B 3’

Se quiser sequenciar a “região A” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “região B” poderia utilizar os primers:

Se quiser sequenciar a “cadeia 1” da “região B” :