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Carlini
As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relaes entre a estrutura e a funo das protenas.
O ambiente hidrofbico em torno do heme fundamental para a atividade biolgica das globinas, que depende de uma interao reversvel com oxignio.
Fe++ Fe++.O2
Comparao das seqncias de aminocidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e das globinas a (Hba, 141 aa) e b (Hbb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo.
As seqncias comeam com o resduo N-terminal NA1 ( esquerda, em cima), antes da hlice A, composta por 16 aminocidos. Segue a hlice B, tambm com 16 resduos, e assim at a hlice H. Os aminocidos idnticos nas trs protenas esto marcados em cinza, e os que interagem com o heme aparecem em rosa. Entre esses ltimos esto a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posio espacial nas 3 molculas, apesar de terem posies diferentes nas seqncias correspondentes. Observe que o grau de identidade da seqncia entre as trs globinas relativamente baixo, da ordem de 20% (27 resduos).
globina a hemoglobina
globina b
mioglobina
Observe a semelhana estrutural das 3 globinas, formadas por 7 segmentos de a-hlice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.
Considerando: 1) que a seqencia de aminocidos o que determina a estrutura 3D de uma protena, 2) e o baixo grau de identidade das 3 sequncias globnicas, Como se explica o fato delas possurem estrutura 3D to semelhantes ?
Como visto na aula anterior, os radicais dos aminocidos no participam das ligaes que estabilizam a a-hlice. Assim, pode haver mudanas na seqncia primria de uma protena sem afetar a estrutura secundria, no caso dessas ocorrerem numa regio de a-hlice ou de folha b. Como as globinas contm grande proporo de a-hlices, ao longo da evoluo acumularam nmero significativo de mutaes pontuais sem alterao de sua forma 3D. .
O heme das globinas responsvel pela ligao ao oxignio. O heme, tambm presente nos citocromos, sintetizado nas clulas aerbicas atravs de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na ltima etapa, um tomo de ferro introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.
+ Fe2+
Heme sintase
Outros derivados porfirnicos no hemnicos importantes so a cobalamina ou vitamina B12, que contem Co2+ ao invs de ferro, e clorofilas, que contm Mg2+
Nas globinas, o Fe2+ hemnico faz 6 ligaes de coordenao: 4 ligaes planares com os nitrognios dos anis pirrlicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano do heme. A 5. ligao permanentemente ocupada com um dos N imidazlico da histidina F8 (proximal). A sexta coordenao pode ser ocupada pelo oxignio, ou pela histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas.
Fe
No desenho ao lado, a globina a. Observar os resduos hidrofbicos (em preto) que forram o bolso do heme nas globinas.
A estrutura tetramrica da hemoglobina confere molcula maior controle da afinidade por oxignio
A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptdica, uma protena armazenadora de oxignio presente no tecido muscular de mamferos.
1 heme = 1 O2
A Hemoglobina, composta por quatro cadeias polipeptdicas (dois dmeros ab), uma protena transportadora de oxignio. apresenta afinidade varivel por O2
A curva de saturao com O2 mostra diferenas importantes na afinidade da hemoglobina e da mioglobina pelo oxignio.
A curva de saturao descreve a percentagem de molculas carregando O2 (eixo y) medida que se aumenta a presso parcial do gs (pO2, eixo x).
A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperblica, e atinge 50% de saturao (p50) com uma pO2 de ~1 torr. A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmide, indicando alosteria ou cooperativadade entre suas subunidades. Sua pO2 de ~ 26 torr e sua afinidade pelo O2 varia com o grau de saturao da molcula.
Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxignio 26 vezes menor do que a da mioglobina, se as protenas possuem as estruturas 3D de suas cadeias globnicas (ambiente onde est o complexo heme-Fe2+ ~ O2) to semelhantes ?
Quais so os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar conforme o grau de saturao em O2 ? Por que isso no ocorre com a miglobina ?
A hemoglobina passa por vrias alteraes conformacionais na transio do estado desoxigenado para oxigenado.
O2
Observar a expanso da cavidade central do tetrmero e as mudanas nos contactos entre as subunidades
O estado de oxigenao afeta propriedades fsicas da Hemoglobina como a interao com a luz visvel.
A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absoro no comprimento de onda de 600-650 nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (no sangue sujo !), quando comparado ao sangue arterial.
As alteraes conformacionais que ocorrem nas cadeias globnicas da hemoglobina na transio oxigenao-desoxigenao so transmitidas de uma cadeia a outra, atravs de contactos nas interfaces das subunidades. Esse fenmeno a base molecular da cooperatividade, uma forma de alosteria caracterstica de protenas oligomricas. Por ser monomrica, a mioglobina no tem essa propriedade. A cooperatividade na hemoglobina positiva. Isso significa que quando uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alteraes conformacionais que essa molcula sofre so sentidas pelas cadeias vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuio de sua afinidade pelo oxignio, facilitando a desoxigenao da hemoglobina. O mesmo tipo de fenmeno ocorre na oxigenao da molcula, que tambm acontece de forma positivamente cooperativa. A cooperatividade na transio oxigenao-desoxigenao da hemoglobina a causa de sua curva de saturao ter aspecto sigmide, e uma das razes da afinidade varivel da hemoglobina pelo oxignio.
Vrios mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxignio. O efeito Bohr um dos mais importantes em termos fisiolgicos.
O efeito Bohr a modulao da afinidade da Hb por O2 pelo pH do meio, facilitando a desoxigenao da Hb a nvel tecidual.
O sangue venoso mais cido do que o arterial, pela presena de CO2 vindo dos tecidos. Esse forma cido carbnico H2CO3, que se dissocia liberando H+ para o meio. A curva ao lado mostra como a % de saturao da Hb, em uma pO2 prxima aos valores nos tecidos (20 torr), diminue em funo do pH do meio. Para a mesma pO2, a saturao da Hb diminue de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampo.
1. Nos tecidos, a pO2 de 25 a 40 torr e o pH ligeiramente mais cido (7,2-7,3). O CO2 produzido difunde-se para o plasma e para as hemcias. Nas hemcias, o CO2 convertido a H2CO3 pela enzima anidrase carbnica. O H2CO3 se dissocia no on bicarbonato HCO3- e um prton H+. Parte do HCO3(~60%) difunde para o plasma, onde constitue o principal sistema tampo. Uma parte pequena (~8%) do CO2 liga-se diretamente ao resduo N-terminal de cada globina, formando a carbamino-Hb.
TECIDOS
PLASMA
HEMCIAS
CO2
DIFUSO
(1)
O HCO3transportado no plasma representa 60% do CO2 formado nos tecidos
CO2
(2) Anidrase (3)
carbnica
+H2O
2.
H2CO3
HCO3-
HCO3-
+ H+
3.
Cl
Cl
Hb
pO2 25 a 40 torr
Hb
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampo.
5. O prton H+ gerado da dissociao do H2CO3 tamponado por histidinas que ligam o heme.
Ao receber o prton, a HbO2 sofre o efeito Bohr, que resulta em uma diminuio da afinidade pelo o O2, facilitando a desoxigenao. Concordando com o efeito Bohr, a Hb oxigenada mais cida (pK ~7.4) do que a Hb desoxigenada (pK ~7.6 ).
TECIDOS
PLASMA
HEMCIAS
CO2
DIFUSO
CO2
Anidrase carbnica
6. +H2O
H2CO3 HCO3HCO3-
+ H+
7.
Cl
Cl FeO
(6)
O2
DIFUSO
(6)
Fe2+
(5)
H C
H C
(5)
N HC
NH3+
NH C
N
HC
NHCOO-
N NH2
C
Hb
pO2 25 a 40 torr
Hb
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se do as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampo.
8. No pulmo, a pO2 de 100 torr e o pH mais alcalino (pH ~7.6).
A Hb desoxigenada recebe O2 e libera os prtons H+ recebidos no tecido. O efeito Bohr agora resulta em um aumento da afinidade pelo o O2, facilitando a oxigenao.
ALVOLOS
PLASMA
HEMCIAS
9.
CO2
DIFUSO
(12)
O HCO3transportado no plasma representa 60% do CO2 formado nos tecidos
CO2
Anidrase carbnica
+ H2O (10)
H2CO3 HCO3(10)
HCO3-
+ H+
Cl
Cl Fe2+
H C N HC
NHCOO(9)
O2
DIFUSO
10. Esses fatores fazem a anidrase carbnica catalizar a reao reversa, formando CO2 e H2O a partir de H2CO3, resultante da associao bicarbonato e H+. 11. O CO2 ligado FeO2 Hb liberado.
H C
NH2 NH C
N
HC
NH3+
NH N
C
Hb
(11) pO2 100 torr
Hb
Vrios mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxignio. O 2,3-difosfoglicerato um regulador alostrico negativo da hemoglobina.
O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) um produto exclusivo do metabolismo das hemcias, formado a partir de um dos intermedirio da via glicoltica, por uma enzima mutase especfica.
Glicose
2,3-BPG
(s em hemcias)
piruvato
O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrmero da hemoglobina, estabilizado por interaes eletrostticas com resduos de carga positiva.
Na oxihemoglobina, a cavidade central menor, expulsando o 2,3-DPG e aumentando a afinidade da molcula por O2.
A mudana conformacional que ocorre na primeira desoxigenao torna essa cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligao do 2,3-DPG.
A regulao da afinidade da hemoglobina pelo O2 um somatrio do efeito Bohr e do 2,3 bifosfoglicerato, alm da cooperatividade positiva.
A figura ilustra a somatria de efeitos moduladores negativos do 2,3 BPG e do CO2 (efeito Bohr) sobre a afinidade da hemoglobina para o oxignio.
Observe como a P50 (presso parcial de O2 que satura 50% das molculas) aumenta progressivamente a medida que os moduladores so adicionados ao meio. O efeito Bohr (presena de CO2) e o 2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de 2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O2.
50%
heme
mioglobina
hemoglobina
Na evoluo das globinas, houve um evento de duplicao gnica, e depois, divergncia de cada um dos genes atravs de mutaes pontuais, que acabaram originando as duas cadeias globnicas da atual hemoglobina.
A hemoglobina A (HbA), composta das cadeias a e b, corresponde a 96-98 % da hemoglobina total de um adulto. Um variante normal da hemoglobina A, correspondente a 2-3% da hemoglobina total em adultos, a HbA2, formada por cadeias a e d (delta), ou seja, a2d2.
No adulto, a Hemoglobina A resulta da expresso co-dominante de 2 genes que codificam a cadeia b e de 4 genes que codificam a cadeia a.
Durante a vida embrionria e fetal, diferentes genes para as globinas so expressos sucessivamente.
idade ps-natal
(semanas)
O grfico e a tabela mostram a sucesso de diferentes hemoglobinas e a sua composio em cadeias globnicas presentes no embrio, feto (aps a 12a. semana) e no adulto. Aps o nascimento, com a represso da sntese da cadeia g e aumento da sntese da cadeia b, ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o ms de vida. Nessa fase so muito importantes os banhos de luz dados na criana, pois estes auxiliam na degradao de derivados txicos do heme, formados na destruio das hemcias fetais.
Hemoglobinopatias
42 92 93
Hemoglobinopatias podem resultar de mutaes nos genes estruturais das globinas, ou ainda nos genes reguladores da sntese das diferentes globinas, que o caso das talassemias. Mutaes pontuais nos genes das globinas a e b so relativamente frequentes. Em outubro de 2003 j eram conhecidos mais de 900 tipos de hemoglobinas anmalas contendo a troca de 1 aminocido na cadeia a ou na cadeia b. Mutaes duplas, inseres e delees so casos mais raros.
145 143
63
23 73 76 79 121
Como existem 4 alelos de cadeia a e 2 de cadeia b expressos co-dominantemente, so conhecidos mais mutantes de cadeia b (produzem 50 % de Hb anmala) do que de cadeia a (produo de 25 % de Hb anmala).
A figura acima ilustra posies na sequncia primria de cadeias a ou b para as quais so conhecidos mutantes pontuais de Hb com alteraes na estabilidade e/ou solubilidade da protena ou na afinidade por oxignio, que resultam em patologias. Observe que a grande maioria dessas posies esto em cotovelos da molcula, onde as a-hlices no existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posies 92 e 63 na cadeia b, respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O2.
Substituio
Hemoglobinas M apresentam substituies nas histidinas proximal ou distal, ou resduos hidrofbicos do bolso do heme. Como resultado, nas HbM ocorre a oxidao do Fe2+a Fe3+, tornando-as incapaz de ligar O2.
Metahemoglobina uma HbA normal oxidada a Fe3+, situao que pode ser causada por fumaa de cigarro, cianetos, etc. No confundir metahemoglobina com HbM.
Hemoglobina S ou falciforme apresenta uma troca de uma resduo cido por um apolar, causando alteraes na solubilidade da protena, que passa a ter tendncia de polimerizar. No h alteraes na afinidade pelo O2.
Hemoglobina
* Existem outros variantes de HbG de cadeia a. A HbG Philadelphia um variante de cadeia a que frequentemente traz deleo dos alelos no afetados. Quando no ocorre deleo, existe ~20% de HbG, com deleo de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleo de 2 alelos, ~40% HbG. *** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutao. # No uma mutao pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.
Hemcia falcmica
Fibra de HbS
Hemoglobina S: a valina na posio 6 da cadeia b da HbS faz interao hidrofbica com resduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia b de outra molcula de HbS, determinando polimerizao da HbS desoxigenada. A polimerizao reverte quando a HbS fica 100% saturada. No h alterao da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligao do 2,3-BPG e a cooperatividade no so afetados.
Tetrmero de HbPA