Hemoglobina - Subcell Biochem 2020

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Acesso público HHS

Manuscrito do autor
Bioquímica de Subcélulas. Manuscrito do autor; disponível no PMC 2020 em 20 de julho.
Publicado na forma final editada como:

Bioquímica de Subcélulas. 2020; 94: 345-382. doi:10.1007/978-3-030-41769-7_14.
Hemoglobina: Estrutura, Função e Alosteria
Mostafa H. Ahmed
Departamento de Química Medicinal, Escola de Farmácia, Virginia Commonwealth University,

Richmond, VA 23219, EUA
Mohini S. Ghatge
Departamento de Química Medicinal, Escola de Farmácia, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23219,
EUA
Instituto de Biologia Estrutural, Descoberta e Desenvolvimento de Medicamentos, Virginia Commonwealth

University, Richmond, VA 23219, EUA
Martin K. Safo
Departamento de Química Medicinal, Escola de Farmácia, Virginia Commonwealth University,

Richmond, VA 23219, EUA
Instituto de Biologia Estrutural, Descoberta e Desenvolvimento de Medicamentos, Virginia Commonwealth

University, Richmond, VA 23219, EUA
Abstrato
Este capítulo revisa como efetores alostéricos (heterotróficos) e mutações naturais afetam a função
fisiológica primária da hemoglobina (Hb) de ligação e transporte de oxigênio. Primeiro, é fornecida uma
introdução sobre a estrutura da Hb, incluindo o conjunto de estados tensos e relaxados da Hb e o equilíbrio
dinâmico da Hb multiestado. Isto é seguido por uma breve revisão de variantes de Hb com estrutura de Hb alterada
e propriedades de ligação ao oxigênio. Finalmente, uma revisão de diferentes efetores alostéricos endógenos e
exógenos de Hb é apresentada com ênfase particular nas interações atômicas de ligantes sintéticos com função
alostérica alterada de Hb que poderiam ser potencialmente aproveitados para o tratamento de doenças.
Palavras-chave
Hemoglobina; Alostério; Efetores alostéricos; estado T; Estado relaxado; afinidade de oxigênio;

Cristalografia de raio-x; Variantes de hemoglobina
Introdução
A hemoglobina (Hb) é a mais estudada das proteínas globulinas contendo heme e ainda não é totalmente
compreendida. Foi uma das primeiras proteínas a ser estudada por cristalografia de raios X e rendeu a Max
Perutz o Prêmio Nobel de Química em 1962. Os estudos estruturais forneceram uma
MK Safo, msafo@vcu.edu.
Divulgação de conflitos de interesse A Virginia Commonwealth University e Martin K. Safo têm patentes relacionadas a vários
aldeídos aromáticos mencionados no capítulo.
Ahmed et ai. Página 2
uma infinidade de dados que ofereciam vislumbres dos magníficos mecanismos moleculares por trás
das funções fisiológicas da Hb. A hemoglobina é uma molécula polifuncional que está envolvida em
diversas funções, como catalítica (nitrito redutase, NO dioxigenase, monooxigenase, alquilhidroperoxidase,
esterase, lipoxigenase); metabolismo do óxido nítrico; reprogramação metabólica; Regulação do pH e
manutenção do equilíbrio redox (Kosmachevskaya e Topunov 2018). Este capítulo, no entanto, concentra-
se na função primária da Hb de transporte de oxigênio e como mutações, ligantes ou efetores endógenos
ou exógenos afetam a alosteria da Hb.
Estrutura e Função da Hemoglobina
A função primária da Hb é transportar oxigênio (O2) do pulmão para os tecidos, ligando e liberando O2 de
forma cooperativa, como demonstrado pela curva de equilíbrio de oxigênio (OEC), que representa a
saturação de O2 da Hb (SO2) em níveis parciais variáveis. pressões de O2 (pO2)
(Fig. 14.1). O pO2 a 50% SO2 (expresso como P50) mede a afinidade de O2 para Hb, que é cerca de 26
mmHg para Hb humana adulta normal (HbA) (Fig. 14.1). Historicamente, a função Hb tem sido explicada
em termos de equilíbrio entre dois estados clássicos: o estado tenso (T) (Hb não ligado) que exibe baixa
afinidade pelo O2, e o estado relaxado (R) (Hb ligado) que exibe alta afinidade pelo O2 , fornecendo uma
base estrutural para efeitos cooperativos que facilitam a absorção e liberação eficientes de O2 in vivo
(Perutz 1972a, b; Perutz et al. 1998; Safo e Bruno 2011; Safo et al. 2011). O equilíbrio entre os estados
T e R é afetado por ligantes heterotrópicos endógenos, como 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BGP), prótons
(H+), dióxido de carbono (CO2), cloreto (Cl-) ou efetores alostéricos sintéticos que modulam a afinidade
de Hb-O2 , seja estabilizando a Hb do estado R (deslocamento para a esquerda do OEC) (Fig. 14.1
colorido em vermelho) ou estabilizando a Hb do estado T (deslocamento para a direita do OEC) (Fig.
14.1; ciano) (Perutz 1972a, b; Perutz et al. 1998; Safo e Bruno 2011; Safo et al. 2011).
Na maioria dos vertebrados, a Hb é um tetrâmero, consistindo de duas subunidades ÿ (ÿ1 e ÿ2) e duas
subunidades ÿ (ÿ1 e ÿ2) que são estruturalmente semelhantes e aproximadamente do mesmo tamanho
(Fig. 14.2a). Os dois dímeros ÿÿ (denominados ÿ1ÿ1 e ÿ2ÿ2) estão dispostos em torno de um eixo de
simetria de 2 vezes, resultando em uma grande cavidade central de água na estrutura T ou não ligada ou
desoxigenada e uma cavidade mais estreita na estrutura R ou ligada ou oxigenada (Fig. 14.2b) (Fermi
1975; Safo e Bruno 2011; Safo et al. 2011). As fendas ÿ e ÿ são os dois pontos de entrada na cavidade
central da água que são maiores na estrutura do estado T do que na estrutura do estado R. A interface
interdímero (ÿ1ÿ1–ÿ2ÿ2) da estrutura do estado T também é caracterizada por mais ponte salina/
interações de ligação de hidrogênio do que a estrutura de estado R. (Fermi 1975; Safo e Bruno 2011;
Safo et al. 2011).
As subunidades ÿ e ÿ são formadas por 7 e 8 hélices, respectivamente denominadas A–H, que são
unidas por segmentos não helicoidais (referidos como cantos). Cada subunidade tem uma bolsa de
ligação para o heme formada pelas hélices E e F. O heme consiste em um íon ferroso mantido no centro
de uma porfirina e coordenado pelos quatro átomos de nitrogênio do anel de porfirina.
O Fe também é ancorado covalentemente à Hb na bolsa proximal do heme por um imidazol de um
resíduo de histidina localizado na hélice F (conhecida como histidina proximal ou His (F8)). Essa
configuração permite que o Fe se ligue ao O2 ou outros gases na bolsa distal do heme por uma ligação
covalente para cumprir a coordenação octaédrica de seis ligantes. A molécula de O2 se liga em uma
geometria “end on bend”, onde um átomo de oxigênio se liga ao Fe e o outro se projeta em um ângulo.

O imidazol de um resíduo de histidina na bolsa distal (His E7) estabiliza o O2 ligado por meio de
interação por pontes de hidrogênio. Na ausência de oxigênio (na Hb desoxigenada) na fenda ÿ, uma
molécula de água com ligações muito fracas preenche o local, formando um octaedro distorcido.
Outros ligantes, como íon nitrito (NO2ÿ), óxido nítrico (NO), monóxido de carbono (CO), cianeto (CNÿ),
monóxido de enxofre (SO), sulfeto (S2ÿ), podem se ligar ao lado distal do heme e atuam como inibidores
competitivos, afetando a ligação do O2 . Alguns desses compostos se ligam com afinidade
significativamente maior que o oxigênio, tornando esses compostos altamente tóxicos para os seres humanos.
Por exemplo, a afinidade de ligação da Hb pelo CO é até 240 vezes maior que o O2, e uma
concentração de 0,1% de CO no ar pode levar à inconsciência e, eventualmente, à morte (Winter e
Miller 1976).
Os eventos de ligação e desvinculação de ligantes têm muito mais ramificações, não apenas no ferro
heme, mas também na estrutura terciária e quaternária da Hb, induzindo mudanças conformacionais na
hélice E da globina, nos cantos CD e FG que se estendem para o ambiente heme. afetando o tamanho
da bolsa distal), cavidade de água central, fendas ÿ e ÿ e interações ponte salina/ligação de hidrogênio
através da interface do dímero ÿ1ÿ1–ÿ2ÿ2 (ÿ1ÿ2 ou ÿ2ÿ1 ou ÿ1ÿ2 ou ÿ1ÿ2) , subsequentemente,
desencadeando a cooperatividade eventos que afetam a transição T ÿ R e dão origem ao fenômeno da
alosteria (Perutz 1972a, b; Baldwin e Chothia 1979; Paoli et al. 1996; Perutz et al. 1998; Safo e Bruno
2011; Safo et al. 2011) .
Modelos alostéricos de hemoglobina
Vários modelos alostéricos foram propostos para explicar a ligação cooperativa de oxigênio a .
hemoglobina Os primeiros são o Monod-Wyman-Changeux (MWC) de dois estados e o

Modelos Koshland–Némethy–Filmer (KNF). O modelo MWC assume que, após a ligação do ligante,
o estado T muda para o estado R sem estados intermediários (Monod et al. 1965), enquanto o modelo
KNF assume uma conformação de Hb na ausência do ligante, que muda a cada ligação do ligante para
a subunidade que são transmitidas sequencialmente para o resto das subunidades (Koshland et al.
1966). A seguir, Max Perutz propôs um mecanismo estereoquímico incorporando aspectos dos modelos
MWC e KNF para explicar o efeito de cooperatividade em Hb (Perutz 1972a, b; Perutz et al. 1998). De
acordo com este modelo combinado, a ligação do ligante a cada subunidade do tetrâmero induz alterações
conformacionais terciárias que são transmitidas a outras subunidades através da comunicação direta
entre as subunidades ÿ1 e ÿ2 ; em última análise, levando a um aumento sequencial na afinidade pelo
ligante em outros sítios heme e mudando o equilíbrio alostérico do estado T para o estado R. O modelo
de dois estados foi baseado em uma infinidade de estruturas cristalinas de Hb ligando e não ligando de
diferentes espécies, como cavalo, humano e bovino (Muirhead e Perutz 1963; Perutz et al. 1968; Fermi
1975; Ladner et al. 1977) . As estruturas de Hb ligadas são principalmente cocristalizadas com CO como
ligante heme, uma vez que a Hb ligada a CO é quimicamente estável, tornando-a mais fácil de manipular
e cristalizar em comparação com a Hb ligada a O2.
No entanto, as estruturas da Hb ligada a O2 ou CO são muito semelhantes. Com base nessas

estruturas cristalinas, Perutz atribuiu parcialmente a baixa afinidade ao oxigênio no estado T à tensão na
ligação Fe-His (F8), que impede o Fe de se mover para o plano da porfirina na ligação do ligante (Perutz
1972a, b; Perutz et. ai. 1998). Esta proposição foi ainda apoiada por Paoli et al. (1996) que publicou pela
primeira vez a estrutura cristalina de

Hb no estado T (através da introdução de ligantes em cristais de Hb desoxigenados na presença do efetor

alostérico estabilizador do estado T) demonstrando a ruptura da ligação Fe-His(F8) nas subunidades ÿ, que foi
citada como a razão por trás do desacoplamento da estrutura mudanças nas subunidades ÿ daquelas nas
subunidades ÿ. Barrick et ai. (1997) também através de estudos de mutagênese sítio-dirigida notaram que a
ruptura da ligação Fe-His(F8) leva a um aumento significativo na afinidade do ligante, redução na cooperatividade,
bem como a desaceleração do switch quaternário.
No entanto, o grupo também sugeriu que existem vias de comunicação adicionais (além da ligação Fe-His(F8))
que é responsável pela cooperatividade residual observada (Barrick et al. 1997).
O modelo estereoquímico de Perutz falhou em explicar as contribuições críticas de ligantes heterotrópicos que
podem modular a estrutura e função da Hb e, além disso, representou a Hb como tendo apenas um estado
binário de T ou R sem a existência de estados intermediários.
Várias variações de modelos alostéricos de Hb foram consequentemente apresentadas. Exemplos são o modelo
MWC Cooperon modificado de Brunori et al. (1986); o modelo SK de Szabo e Karplus (Szabo e Karplus 1972);
o modelo terciário de dois estados (TTS) de Henry e colegas que descreve “terciários t e r” distintos dentro das
conformações dos estados T e R (Henry et al. 2002); e o modelo de alosteria global de Yonetani que também
relaciona mudanças conformacionais à ligação efetora nos estados T e R e propõe que a afinidade de O2 é
dependente de mudanças estruturais terciárias induzidas por efetores heterotrópicos (Yonetani et al. 2002;
Yonetani e Tsuneshige 2003; Yonetani e Kanaori 2013). Existem várias revisões excelentes sobre este tópico, e
o leitor é encaminhado para duas dessas publicações (Yonetani e Kanaori 2013; Gell 2018).
Vários estados que se encontram ao longo da transição de T para R
Os primeiros estudos estruturais de Max Perutz e outros (Muirhead e Perutz 1963; Perutz et al. 1968; Fermi
1975; Ladner et al. 1977) forneceram duas conformações de estado final clássicas de Hb durante a transição T
para R, mas várias linhas de evidências extraídas de experimentos funcionais, computacionais, estruturais,
termodinâmicos e espectroscópicos sugeriram vários estados discretos ao longo da transição T ÿ R (Sawicki e
Gibson 1976, 1978; Samaja et al.
1987; Schumacher et ai. 1995; Jayaraman et ai. 1995; Wilson et ai. 1996; Perrella e Cera 1999; Yonetani e
Tsuneshige 2003; Samuni et ai. 2004; Canção et ai. 2008), o que se espera ser devido ao fato de que as
proteínas são entidades flexíveis, e as estruturas cristalinas podem fornecer apenas um subconjunto dos
conjuntos conformacionais presentes em condições fisiológicas. NMR e espalhamento de raios-X de grande
angular (WAXS), estudos mostraram que é improvável que a estrutura de solução média de Hb ligante seja
idêntica às estruturas cristalizadas (Lukin et al. 2004; Gong et al. 2006; Sahu et al. 2007 ; Song et al. 2008;
Makowski et al. 2011; Fan et al. 2013). Usando fotólise a laser e na presença do potente efetor alostérico de
Hb, inositol hexafosfato (IHP), Sawicki e Gibson observaram mudanças conformacionais quaternárias na Hb
humana ligada a CO (Sawicki e Gibson 1976, 1978). Perrella e Cera (1999) também mostraram, usando a
extinção rápida da reação entre Hb e CO humanos, que existem diferentes intermediários de ligação com
distintas conformações e afinidades de oxigênio. Mozzarelli e colegas relataram duas populações distintas de
Hb humana que tinham diferentes afinidades de ligação ao oxigênio (1000 e 100 vezes menores do que o estado
R de alta afinidade para O2) e não eram cooperativas (Mozzarelli et al. 1991). A primeira espécie foi

propuseram ter o estado T como conformação, enquanto o último apresentou características relaxadas que o
colocaram mais próximo do estado R.
Várias estruturas cristalinas também forneceram evidências de multiestados ao longo da transição T ÿ R. Uma
Hb desoxigenada de cavalo presa no estado relaxado de alta afinidade foi relatada como um intermediário de ligação
do estado R (Wilson et al. 1996). Hb humana reticulada, com ácido trimésico exibindo baixa afinidade ao oxigênio, foi
relatado por Schumacher et al., em que as estruturas cristalinas ainda não atingiram a conformação do estado R,
exibindo várias características intermediárias T e R (Schumacher et al. 1995) . Safo et ai. (2002b) também mostraram
que a estrutura do estado R da Hb humana ligada a CO com uma molécula de fosfato ligada à fenda ÿ exibiu
características de estado T terciário sutis, mas significativas na interface ÿ1ÿ2 . Na presença de efetores heterotrópicos,
Yonetani e Tsuneshinge (2003) observaram que a Hb ligada exibe restrição do estado T dentro de uma estrutura
quaternária semelhante a R.
Outros estudos também mostraram a estrutura do estado T ligado com mudanças significativas nas bolsas de
heme, bem como mudanças na interface ÿ1ÿ2 consistentes com a presença de estados intermediários ao longo da
transição T ÿ R (Abraham et al. 1992a; Paoli et al. 1996; Song et al. 2008). Um conjunto de estruturas quaternárias
semelhantes a T induzidas por mutações em um agrupamento de resíduos na interface ÿÿ e centrado em ÿTrp37 foi
descrito pelo grupo de Arnone (Kavanaugh et al. 2005). Este aglomerado de resíduos foi previamente relatado pelo
grupo de Mozzarelli como sendo a maior região da restrição quaternária (Noble et al. 2001).
Estrutura de Hb totalmente ligada presa em uma conformação tensa
Vários dos modelos alostéricos propostos mantêm o princípio original do MWC de que a ligação cooperativa de
oxigênio não pode ocorrer na ausência de transição quaternária, consistente com o fato de que um heterotetrâmero de
hemoglobina no estado T totalmente ligado, obtido a partir da cristalização de hemoglobina ligada em solução, nunca
foi relatado. Em um estudo recente, relatamos a estrutura de tal variante de mamífero totalmente ligando exclusivamente
s s
Hb ÿ2ÿ2 (formado a partir de Hb S ÿ2ÿ2
substituindo a ÿ-globina adulta por subunidades embrionárias de ÿ-globina), cristalizada a partir de uma solução de Hb
ligada a CO que permanece presa em uma conformação semelhante ao estado T quaternário (Safo et al. 2013, 2015).
s
Hb ÿ2ÿ2 inibe a polimerização de Hb S desoxigenada in vitro e melhora as características
patogênicas da doença falciforme (SCD) em modelos de camundongos (He e Russell 2004a, b).
A estrutura exibiu uma cavidade central de água, interface de dímero e interações ponte de sal/ligação de
hidrogênio, fenda ÿ, etc. que são mais típicas para uma conformação tensa (Safo et al.
s
2013, 2015). É claro que a ligação do ligante à Hb ÿ2ÿ2 é efetuada principalmente por estruturas terciárias
mudanças dentro das estruturas de estado T ou R maiores, fornecendo insights sobre as contribuições das estruturas
terciárias e quaternárias para a ligação cooperativa do ligante Hb-O2, bem como validando a hipótese de que a afinidade
do ligante Hb pode ser dissociada da estrutura quaternária geral (Henry et al. . 2002; Yonetani et al. 2002; Yonetani e
Tsuneshige 2003; Yonetani e Kanaori 2013). Além disso, a estrutura explica Hb ÿ2ÿ2
s
atividades de antipolímero favorecendo
uma estrutura de estado T alternativo que é excluída de polímeros de Hb S desoxigenados patológicos (Safo et al.
2015).

Estados multirrelaxados além da transição T ÿ R
Vários estudos do grupo Safo e outros revelaram diferentes estados relaxados de Hb que parecem
estar além da transição clássica T ÿ R, sugerindo que o estado relaxado não é exclusivo do estado
R clássico, mas sim um conjunto de estados totalmente ligados exibindo conformações quaternárias
distintas (Smith et al. 1991; Doyle et al. 1992; Silva et al. 1992; Janin e Wodak 1993; Smith e
Simmons 1994; Srinivasan e Rose 1994; Schumacher et al. 1997; Fernandez et al. 2000; Mueser
et al. 2000; Lukin et al. 2003; Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011; Abdulmalik
et al. 2011). Exemplos desses estados são o R2, RR2, R3 e RR3. A atribuição desses estados
estruturalmente depende de diferentes parâmetros-chave, como rotação do parafuso de corpo rígido
(definido em termos de ângulo de rotação do parafuso, translação de rotação do parafuso, direção
do eixo de rotação do parafuso e um ponto no eixo de rotação) do dímero ÿ1ÿ1 em relação ao dímero
ÿ2ÿ2 , interações entre ponte salina/ligação de hidrogênio, distância heme-heme, tamanho da bolsa
heme distal, tamanho da cavidade central de água e tamanho da fenda ÿ e fenda ÿ (Baldwin e
Chothia 1979; Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011).
A rotação do parafuso de corpo rígido para quantificar o movimento alostérico entre a estrutura T
e a estrutura R clássica foi relatada pela primeira vez por Baldwin e Chothia que encontraram uma
rotação de ~14° e ~1 Å de translação do dímero ÿ1ÿ1 em relação ao dímero ÿ2ÿ2 (Baldwin e
Chothia 1979). Mais tarde, foi usado por vários pesquisadores para analisar as diferenças
quaternárias entre vários estados de Hb que eram, em alguns casos, tão significativos ou até
maiores do que aqueles entre a estrutura T e a estrutura R clássica (Silva et al. 1992; Mueser et
al. 2000; Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Aqui, descrevemos algumas
dessas diferenças estruturais com Figuras usando estruturas de alta resolução mais recentes do
clássico R (PDB ID: 2DN1), T (PDB ID: 2DN2), R2 (PDB ID: 1QXD ou 1QXE) e R3 (PDB ID: 1YZI).
Após a transição do estado T para o estado R clássico, ocorre um movimento de deslizamento entre
a subunidade ÿ2 e a subunidade ÿ1 oposta na chamada “região de comutação”, com um fulcro,
também na chamada “região de dobradiça”. (Baldwin e Chothia 1979; Silva et al. 1992; Lukin et al.
2003; Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Este movimento coloca o resíduo
de canto ÿ2FG ÿ2His97 entre ÿ1Thr41 e ÿ1Thr38 na estrutura R (de sua localização entre ÿ1Pro44 e
ÿ1Thr41 na estrutura T), onde forma uma interação de ligação de hidrogênio com ÿ1Thr38 (Fig.
14.3a). Além disso, a transição T ÿ R leva ao estreitamento da cavidade central da água e das fendas
ÿ- e ÿ (Fig. 14.3b), bem como um aumento na distância ferro-ferro ÿ1ÿ2 e uma diminuição na distância
ferro-ferro ÿ1ÿ2 -distância (Baldwin e Chothia 1979; Silva et al. 1992; Lukin et al. 2003; Safo e
Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011).
Curiosamente, a transição T ÿ R2 (rotação/translação de ~23°/3,1 Å) e a transição T ÿ RR2

(~17°/2,6 Å) ocorrem aproximadamente na mesma direção do eixo de rotação do parafuso da
transição T ÿ R , na ordem de T ÿ R ÿ RR2 ÿ R2 (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo
et al. 2011). É interessante notar que a transição T ÿ R2 foi proposta pela primeira vez ao longo da
transição T ÿ R, com R como o estado final (Silva et al. 1992).
No entanto, como afirmado acima, uma análise mais aprofundada mostrou que R2 não é um
intermediário, mas sim uma estrutura de estado final com a transição T ÿ R2 passando primeiro pela
transição T ÿ R e depois pela transição R RR2 (Janin e Wodak 1993; Schumacher et. al. 1997; Safo e

Abraão 2005; De acordo com Jenkins et al. 2009; Safo et ai. 2011). A transição RR2 ÿ R2
é caracterizada por uma rotação/translação de ~6°/0,5 Å (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2005).
2009; Safo et ai. 2011). Em ambas as estruturas R2 e RR2, o ÿ2FG ainda girou
perpendicularmente a partir da posição da estrutura R, desengatando a interação de ligação de
hidrogênio entre ÿ2His97 e ÿ1Thr38 (Fig. 14.3a). Isso levou ao alargamento da cavidade central
de água nessas duas estruturas, bem como a trazer os dois resíduos C-terminais de ÿHis146 para
interagir mais perto, resultando em posições ÿHis146 bem definidas (Fig. 14.3b) em comparação
com as altamente ÿHis146 desordenado na estrutura R (Silva et al. 1992; Lukin et al.
2003; Safo e Abraham 2005; Jenkins et ai. 2009; Safo et ai. 2011). Esta observação, como será
discutida mais adiante, é significativa devido à contribuição crítica de ÿHis146 para o efeito Bohr
(Silva et al. 1992).
Ao contrário das estruturas R, RR2 e R2 onde ÿ2His97 está localizado entre ÿ1Thr41 e
ÿ1Thr38, uma rotação do canto ÿ2FG na estrutura R3 afastou ainda mais ÿ2His97 da posição do
estado T, colocando-o entre ÿ1Thr38 e ÿ1Pro37 (Fig. 14.3a), resultando na menor cavidade central
de água e fenda ÿ (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Curiosamente, um
fechamento completo da fenda ÿ é observado na estrutura R3 devido a extensas interações de
ligações de hidrogênio entre os resíduos dos terminais C opostos dos segmentos HC (Safo e Abraham
2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al.
2011). As transições T ÿ R3 e R ÿ R3 envolvem rotação/translação de ~22°/1,7 Å e ~10°/1,1 Å,
respectivamente, e ocorrem aproximadamente na mesma direção, com o estado R mediando a
transição T ÿ R3 (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011).
Outra estrutura ligando exclusivamente, RR3 (PDB ID: 3D17) parece estar entre a transição R ÿ R3
e na ordem T ÿ R ÿ RR3 ÿ R3 (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). A
transição do RR3 para R ou R3 é ~6,2°/1,0 Å.
Curiosamente, a estrutura RR3 mostra rotação significativa do ÿHis63(E7) distal para fora da bolsa
distal, formando o que é chamado de canal ligante His(E7) para o solvente em massa (Fig.
14.4). Uma rotação menor de His(E7) também é observada na estrutura R3 (Fig. 14.4). A posição
girada do ÿHis63 em R3 ou RR3 é estabilizada por uma interação de ponte salina entre a cadeia
lateral do imidazol e o propionato de ÿ-heme (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009). De
interesse é que a distância mais próxima entre o ÿHis63 imidazol e o ligante heme ligado são 6,6
Å e 4 Å nas estruturas RR3 e R3, respectivamente, em comparação com os ~3 Å observados nas
estruturas clássicas R, R2 e RR2, o que permite estabilização do ligante ligado (Safo e Abraham
2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al.
2011). No geral, duas trajetórias foram propostas para a transição entre o T e os estados relaxados
(Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Uma trajetória sugere que R2 seja um
estado final com R e RR2 na transição T ÿ R2. A segunda mostra R3 como outro estado final com R e
RR3 ao longo da transição T ÿ R3 (Fig. 14.5). Várias outras estruturas de Hb ligando também foram
relatadas, como Gower II COHb (PDB ID: 1AJ9), bovino COHb (PDB ID: 1FSX, 1G08 e 1G09) e
formas reticuladas de COHb humano (PDB ID: 1HAB e 1HAC), que possuem estruturas quaternárias
de estado relaxado distintas com características intermediárias entre as transições R ÿ RR2 e RR2 ÿ
R2 (Schumacher et al. 1997; Fernandez et al. 2000; Mueser et al. 2000; Safo e Abraham 2005; Jenkins
et al. . 2009; Safo et al. 2011).

A Controvérsia do Estado R e R2
A descoberta da estrutura R2 no início da década de 1990 (Smith et al. 1991; Silva et al. 1992;
Smith e Simmons 1994) iniciou uma controvérsia sobre a relevância fisiológica do R2 ou estrutura
R clássica, que levou vários anos para ser resolvida. A estrutura R foi sugerida como um artefato
e/ou intermediário preso entre a transição T ÿ R2 e o R2 como o estado final fisiologicamente
relaxado (Srinivasan e Rose 1994; Schumacher et al. 1997). Outros pesquisadores, entretanto,
sugeriram que a estrutura R2 seja um intermediário entre a transição T ÿ R (Smith et al. 1991;
Silva et al. 1992; Smith e Simmons 1994). Estudos posteriores e análises abrangentes das
estruturas R e R2, no entanto, sugeriram que o R2 não é uma estrutura intermediária, mas sim
uma estrutura relaxada de estado final (Doyle et al. 1992; Janin e Wodak 1993; Safo e Abraham
2005; Jenkins et al. al. 2009; Safo et al. 2011).
O argumento para atribuir a estrutura R2 como o estado relaxado fisiologicamente relevante e

a estrutura R como um artefato foi parcialmente devido ao primeiro ser cristalizado com baixo
teor de sal que imita o ambiente in vivo, enquanto o último foi cristalizado com alto teor não
fisiológico. condição de sal. No entanto, Safo e colaboradores posteriormente cristalizaram a
estrutura R2 usando condições de alto teor de sal (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al. 2011). De
interesse é que os cristais R2 só se formam em alto teor de sal quando cocristalizados com aldeídos
aromáticos anti-falciformes (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al. 2011) geralmente em pH entre 6,4 e
6,8. Na ausência do aldeído, apenas R, RR2, RR3 ou R3 ou mistura desses cristais se formam com
alto teor de sal, e sua relação/formação parece ser uma função do pH (Safo e Abraham 2005;
Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Os cristais R e R3 predominam em pH alto (>6,5) e pH baixo
(<6,5), respectivamente, enquanto os cristais RR2 normalmente aparecem em pH em torno de 7 e
não tão abundantes quanto os cristais R e R3 (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al., 2009; Safo et al.
2011). O cristal RR3 foi observado apenas uma vez e apareceu com cristais R e R3 em pH 6,4
(Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Parece que vários estados relaxados
existem em equilíbrio dinâmico e sua fração e/ou distribuição parece ser dependente do pH com
baixa barreira de energia na mudança de um estado para outro. Consistentemente, um estudo de
RMN por Lukin et al. mostraram que a Hb ligada existe como uma mistura de R e R2, e uma
estrutura intermediária entre o R e R2 (Lukin et al. 2003).
A existência de estados multirrelaxados de Hb é ainda mais apreciada quando se considera

estruturas cristalinas de Hb ligando na presença de efetores alostéricos. Os aldeídos aromáticos
ligam-se à fenda ÿ da Hb ligando na forma R2 de uma forma relacionada à simetria que une as
duas subunidades ÿ e estabiliza o estado relaxado em relação ao estado T (Safo et al.
2004, 2011; Abdulmalik et ai. 2011), que como será discutido posteriormente é uma
estratégia farmacológica potencial para tratar a doença falciforme. Como observado acima, em Hb
ligando com alto teor de sal sem aldeído aromático cristaliza na forma R ou RR2 ou RR3
dependendo do pH, mas na presença de aldeído aromático parece deslocar o equilíbrio para a
forma R2 que cristaliza. As bolsas de ligação das estruturas R, R3 e RR3 estão estericamente
lotadas, explicando a ligação preferencial do aldeído aromático ao R2 Hb (Safo et al.
2004; Abdulmalik et ai. 2011). Gong et ai. (2006) usando estudo de RMN relataram que a Hb
ligada na forma R2 se move em direção ao estado R na presença de IHP. Ao contrário dos
aldeídos que se ligam à fenda ÿ de R2Hb, o IHP liga-se à fenda ÿ da R Hb clássica (Song et al.

2008). É interessante notar que o tamanho da fenda ÿ na estrutura R é significativamente maior do

que as outras estruturas relaxadas (Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011),
sugerindo ligação preferencial de IHP a a estrutura R, consistente com a ligação observada de fosfato
na fenda ÿ da estrutura R (Safo et al. 2002b). Tióis e imidazolilacriloílos parecem afetar suas atividades
antifalciformes em parte pela ligação preferencial às estruturas clássicas de R e/ou R3 e formando
interação covalente com ÿCys93 que leva ao aumento da afinidade da Hb pelo oxigênio (Nakagawa et
al. 2014, 2018; Omar et al. 2015).
Não está claro como os diferentes estados relaxados ligandos se encaixam no esquema geral da
função de transporte de oxigênio da Hb. Com base no fato de que o canal ligante His(E7) nas estruturas
R, RR2 e R2 são fechados, enquanto R3 e RR3 são parcial ou totalmente abertos, respectivamente,
Safo e colegas sugeriram que R, R2 e RR2 conformações estão envolvidas no transporte do ligante
heme, enquanto o R3 e RR3 podem estar envolvidos na liberação do ligante (Safo e Abraham 2005;
Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Perutz previu previamente tal rotação de His(E7) para acesso do
ligante (Perutz 1989). Birukou et ai. (2011) substituiu as histidinas distais, ÿHis58 e ÿHis63 por Trp na
Hb humana, o que reduziu significativamente o acesso do ligante aos hemes, levando os pesquisadores
a propor que mais de 90% da entrada do ligante na Hb humana é devido ao His(E7) canal ligante. A
dinâmica da rotação de His(E7) é provavelmente dependente do pH, pois o pH relativamente baixo
parece estabilizar a conformação do canal de ligante aberto como observado na estrutura RR3,
enquanto o pH alto pode favorecer o fechamento do canal (Safo e Abraham 2005; Jenkins et. al. 2009;
Safo et al. 2011). Consistentemente, a constante de velocidade para a ligação do ligante à mioglobina
aumenta com a diminuição do pH (Traylor et al.
1983). Não é óbvio se a rotação de His(E7) para fora da bolsa distal no estado T também é dependente
do pH, uma vez que não se espera que o pH nos pulmões seja tão baixo quanto nos tecidos.
No entanto, sugere-se que o ligante pode se difundir na cavidade do heme, especialmente o ÿ heme,
através de várias vias hidrofóbicas entre as hélices B, G e H (Czerminski e Elber 1991), embora não
haja concordância de todos os pesquisadores (Elber 2010). .
Variantes de hemoglobina com afinidade de oxigênio alterada
Mais de 1.000 variantes de hemoglobina de ocorrência natural foram identificadas e, embora a maioria
ainda não esteja associada a qualquer estado de doença, um número significativo está implicado em
patologias que variam de leve a grave, como policitemia ou anemia, metemoglobinemia, cianose,
hipóxia tecidual e desconforto respiratório (Reissmann et ai.
1961; Bonaventura e Riggs 1968; Schneider et ai. 1975; Winslow e Charache 1975; Schoenborn
1976; Efremov et al. 1978; Arous et ai. 1981; Dinçol et ai. 1994; Kister et ai.
1995; Borg et ai. 1997; Marengo-Rowe 2006; Thomas et ai. 2013). Descrevemos alguns exemplos
dessas variantes que possuem mutações localizadas na superfície da proteína, bolsa heme, interface
ÿ1ÿ2 ou ÿ1ÿ1, ou no interior hidrofóbico que alteram a estrutura da hemoglobina e afetam suas
propriedades de ligação ao oxigênio. A variante mais conhecida é a Hb falciforme, que resulta de uma
mutação pontual (ÿGlu6Val) na cadeia ÿ-globina da Hb normal para dar Hb falciforme (Bunn 1997). A
mutação está localizada na superfície da proteína. Sob hipóxia ou quando a HbS é desoxigenada, o
ÿVal6 patogênico de uma molécula de HbS desoxigenada se liga a uma bolsa hidrofóbica em uma
molécula de HbS desoxigenada adjacente, unindo as moléculas para formar polímeros insolúveis e
dando origem à morfologia clássica dos glóbulos vermelhos falciformes (RBC). (Eaton e Hofrichter
1990; Bunn 1997; Harrington et al.

1997; Ghatge et ai. 2016). As hemácias falciformes agregam-se, em última análise, causando
obstrução microvascular levando à crise de MSC (Belcher et al. 2003; Aliyu et al. 2008; De
Franceschi 2009; Akinsheye e Klings 2010). Embora a mutação não afete diretamente a
propriedade de ligação ao oxigênio da proteína, uma suposta elevação de 2,3-BPG nos glóbulos
vermelhos falciformes foi proposta para piorar a progressão da doença (Torrance et al. 1970; Grasso et al.
1975). Sob condições fisiológicas, a Hb libera 25-40% de O2 para os tecidos, auxiliado pela ligação de 2,3-BPG à Hb desoxigenada.
Infelizmente, na DF, os ciclos repetitivos de desoxigenação-reoxigenação com falcização celular levam a danos na membrana
eritrocitária e hemólise, reduzindo o tempo de vida para 10-20 dias (de 90 a 120 dias para eritrócitos normais), que se manifesta na anemia
crônica (Zago e Bottura 1983; Connor et al. 1994), levando à elevação compensatória de 2,3-BPG na hemácia falciforme que diminui a afinidade
da HbS pelo O2 (P50 de 34 vs 26 mmHg em indivíduos normais) para descarregar mais O2 para o tecido (Torrance et al. 1970; Grasso et ai.,
1975). Essa resposta contraproducente aumenta a concentração de HbS desoxigenada, piorando a polimerização da HbS e, portanto, o processo
concomitante de falcização das hemácias. A manipulação in vitro para reduzir o teor de 2,3-BPG foi sugerida como um meio de reduzir a falcização
induzida por hipóxia (Poillon et al. 1986).
Como observado acima, a interface do dímero ÿ1ÿ1–ÿ2ÿ2 (ou interface ÿ1ÿ2 ou ÿ2ÿ1 ) é um dos
mais importantes determinantes estruturais da transição T ÿ R (Baldwin e Chothia 1979; Safo e
Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011). Portanto, não é surpresa que várias mutações
que afetam essa interface tenham sido relatadas como afetando a afinidade de oxigênio da Hb
(Reissmann et al. 1961; Charache et al. 1966; Botha et al. 1966; Jones et al. 1967; Bunn et al. ai. 1972;
Lokich et ai. 1973; Jensen et ai. 1975). Hb Bassett (ÿAsp94Ala), com a mutação ÿAla94 localizada na
interface ÿ1ÿ2 é caracterizada por uma afinidade de oxigênio marcadamente reduzida (P50 de Hb livre
de células em pH 7,0 = 22,0 mmHg em comparação com 10,5 mmHg em HbA) e baixa cooperatividade
de subunidade (n = 1,4 vs. 2,6 em HbA) (Abdulmalik et al. 2004; Safo et al. 2005). É uma das poucas
mutações em que as estruturas T e R do mutante foram elucidadas (Safo et al. 2005). A estrutura
desoxigenada é caracterizada por duas interações únicas de pontes de hidrogênio entre dímeros
(ÿ1Tyr42–ÿ2Asp99 e ÿ1Asn97– ÿ2Asp99) que são conhecidas por contribuir para a estabilização da Hb
no estado T. Curiosamente, a estrutura R ligando mantém essas duas interações de ligação de
hidrogênio, além de perder um estado R nativo estabilizando a interação de ligação de hidrogênio entre
ÿ1Asp94 e ÿ2Asn102.
Essas características únicas do estado T na estrutura R explicam a baixa afinidade da Hb Bassett
pelo oxigênio (Safo et al. 2005). Outras variantes de Hb de baixa afinidade para O2 com mutação na
interface ÿ1ÿ2 incluem Hb Kansas (ÿAsn102Thr), Hb Saint Mande Â (ÿAsn102Tyr), Hb Setif
(ÿAsp94Tyr), Hb Capa (ÿAsp94Gly) e Hb Titusville (ÿAsp94Asn) (Bonaventura e Riggs 1968 ;
Schneider et al. 1975; Arous et al. 1981; Dinçol et al. 1994; Huisman et al.
1996; Borg et ai. 1997).
Hb Thionville, uma variante com uma mutação ÿVal1Glu foi relatada como apresentando uma
estabilização aumentada em relação à Hb normal (Vasseur et al. 1992). Estruturalmente, esta mutação
resulta na inibição da clivagem do iniciador metionina, que se torna acetilada. Isso resulta em várias
mudanças estruturais terciárias na forma de uma extensão do terminal N da cadeia ÿ, a formação de
novos contatos intra e inter-subunidades na interface ÿ1ÿ2 que estabilizam o estado T e, finalmente,
resultam na diminuição da ligação Hb-O2 afinidade. No entanto, a afinidade reduzida de oxigênio não
foi grave o suficiente para produzir qualquer anormalidade hematológica

no portador masculino (Vasseur et al. 1992). Em contraste, uma mutação semelhante nas cadeias ÿ da Hb
(ÿVal1Glu; Hb Doha) resultou em anemia significativa em uma portadora do sexo feminino ao dar à luz,
que era saudável (Kamel et al. 1985). A introdução de um resíduo de ácido glutâmico em Hb Doha também
impediu a remoção do iniciador metionina estendendo o terminal N por um resíduo (Kamel et al. 1985).
Infelizmente, não temos conhecimento de nenhum dado estrutural para Hb Doha.
Várias variantes de ÿAsp99 Hb, como Hb Ypsilanti (ÿAsp99Tyr), Hb Radcliffe (ÿAsp99Ala), Hb Coimbra
(ÿAsp99Glu) são conhecidas por exibir maior afinidade por O2 e menor cooperatividade (Jorge et al. 2018).
Esses indivíduos são clinicamente caracterizados por eritrocitose (Hardison et al. 1994, 2001; Riemer et
al. 1998). O resíduo ÿAsp99 está localizado na região de troca da interface do dímero ÿ1ÿ2 e forma
interações únicas de pontes de hidrogênio com ÿ1Tyr42 e ÿ1Asn97, estabilizando a estrutura T. Mutações
de ÿAsp99 anulam essas interações de ligações de hidrogênio, deslocando o equilíbrio alostérico para o
estado R e aumentando a afinidade da Hb pelo oxigênio (Jorge et al. 2018).
A Hb Rothschild é caracterizada por uma mutação (ÿTrp37Arg) na região de dobradiça da interface

do dímero ÿ1ÿ2, levando a uma perturbação estrutural significativa na interface ÿ1ÿ2 .
Curiosamente, esta variante exibe afinidades de oxigênio variáveis, incluindo baixa e alta afinidade
(Sharma et al. 1980; Nienhuis 1987). A estrutura do estado T mostrou um íon cloreto ligado na interface
ÿ1ÿ2 como um contra-íon para ÿArg37 (Kavanaugh et al. 1992, 2001). O íon cloreto foi sugerido para
afetar as propriedades da solução deste mutante, especialmente em concentrações variáveis de cloreto
que podem explicar as variações nas propriedades de ligação de oxigênio (Kavanaugh et al. 1992, 2001).
Mutações na bolsa do heme também são conhecidas por afetar as propriedades de ligação ao oxigênio
da Hb (Thom et al. 2013). Um exemplo é a Hb Kirklareli (ÿHis58Leu), que está associada à deficiência de
ferro e aumento da ligação de CO (Bissé et al. 2017). A cadeia lateral de imidazol de ÿHis58 fornece
estabilidade ao O2 ligado ao heme por meio de interações de ligações de hidrogênio, que são perdidas
com ÿLeu58. De fato, a estrutura cristalina da Hb Kirklareli mostra que o O2 ligado não é mais estabilizado,
consistente com o aumento observado de autooxidação e perda de hemina ~200 vezes mais rapidamente
do que as subunidades ÿ nativas (Bissé et al. 2017). Curiosamente, a subunidade ÿ da Hb Kirklareli tem
uma afinidade ~80.000 vezes maior pelo CO do que o O2, fazendo com que ela absorva e retenha
rapidamente o monóxido de carbono (Bissé et al. 2017).
Várias variantes de Hb com mutações na interface ÿ1ÿ1 (ÿ2ÿ2) foram identificadas, com algumas dessas
mutações causando alterações significativas na interface ÿ1ÿ1 que se manifestam em alterações nas
propriedades de ligação ao oxigênio da Hb. Exemplos são Hb Philly (ÿTyr35Phe), que é caracterizada por
afinidade aumentada de oxigênio e cooperatividade diminuída, Hb Peterborough (ÿVal111Phe) e Hb
Stanmore (ÿVal111Ala) também caracterizadas por afinidades de oxigênio diminuídas (Rieder et al. 1969;
King et al. 1972; Como et al. 1991; Thom et al. 2013). Essas mutações causam anemia hemolítica e/ou
reticulocitose (Thom et al. 2013).
Finalmente, mutações, deleções ou inserções nas regiões não polares centrais da Hb foram relatadas
como produtoras de hemoglobinas instáveis (Carrell et al. 1966; Dacie et al. 1967; Murari et al. 1977;
Sakuragawa et al. 1984; Plaseska et al. 1991) que tendem a sofrer

oxidação causando precipitação e a formação de inclusões insolúveis chamadas corpos de Heinz

levando à anemia hemolítica.
Moduladores de hemoglobina
Moduladores Endógenos
2,3-Bisfosfoglicerato (2,3-BPG)-2,3-Bisfosfoglicerato (Fig. 14.6) desempenha um papel central

na alosteria da hemoglobina, reduzindo a afinidade Hb-O2 e permitindo oxigenação tecidual eficiente
(Arnone 1972; Perutz et al. 1986 ; Marden e outros 1990; Richard e outros 1993). Seu efeito na
afinidade de oxigênio da Hb foi relatado pela primeira vez por Benesch e Benesch (1967). A base
atômica de seu mecanismo de ação foi elucidada com a estrutura cristalina da Hb que mostrou 2,3-
BPG se ligar preferencialmente à fenda ÿ da Hb desoxigenada fazendo interações com ÿHis2, ÿLys82,
ÿHis143 e ÿHis146, e ligando os dois ÿ-subunidades para estabilizar o estado T (Fig. 14.7) (Arnone
1972; Richard et al. 1993). Em contraste com a estrutura T, as estruturas relaxadas do conjunto têm
fendas ÿ relativamente menores, explicando sua menor afinidade para 2,3-BPG, embora a Hb do
estado R ligando com a maior fenda ÿ entre as estruturas relaxadas seja conhecida por se ligar a 2,3
-BPG, embora com uma afinidade menor do que a Hb desoxigenada (Gupta et al. 1979). Estudos
cristalográficos e de RMN com fosfato e IHP (Fig. 14.6) também sugerem que as estruturas R e RR2
são capazes de ligar 2,3-BPG na fenda ÿ (Gupta et al. 1979; Safo et al. 2002b; Safo e Abraão 2005).
É bastante óbvio que a estrutura R3, com sua fenda ÿ completamente fechada devido a elaboradas
interações de ligações de hidrogênio entre subunidades ÿ1–ÿ2 , deve impedir a ligação de 2,3-BPG
(Safo e Abraham 2005). Como observado acima, o 2,3-BPG foi proposto para estar envolvido na
patogênese da doença falciforme por sua elevação na hemácia falciforme, o que leva a uma
diminuição adicional da afinidade da Hb pelo oxigênio para aumentar a concentração do polímero
formando HbS desoxigenada.
Esfingosina-1-Fosfato (S1P)-S1P (Fig. 14.6) é uma importante molécula de sinalização que é

enriquecida em eritrócitos e é conhecida por regular diversos processos biológicos por meio da
ativação de receptores S1P da superfície celular e/ou pela interação com proteínas reguladoras
críticas dentro células (Spiegel e Milstien 2003; Hänel et al. 2007; Ito et al. 2007). A interação entre
S1P e hemoglobina foi descoberta pela primeira vez pelo grupo Xia depois que uma triagem
metabolômica identificou o papel patológico de S1P elevado em SCD (Zhang et al. 2014). S1P em
concentrações ÿM foi encontrado para regular a ligação de Hb desoxigenada à proteína de membrana
Banda 3 (cdB3) e, finalmente, resultando em reprogramação metabólica em SCD (Sun et al. 2017). A
estrutura cristalina da Hb desoxigenada em complexo com S1P mostrou que S1P se liga à superfície
da proteína perto da bolsa heme (fazendo interações hidrofílicas/hidrofóbicas na interface de troca)
(Fig. 14.8) (Sun et al. 2017). S1P só se liga à superfície da Hb após a ligação de 2,3-BPG na fenda ÿ.
O complexo ternário leva a uma mudança conformacional significativa que não apenas aumenta o
caráter do estado T da estrutura T, mas também impede estericamente a difusão de ligantes
diatômicos (O2) na bolsa heme (Sun et al. 2017). Essas mudanças estruturais foram propostas para
explicar em parte a diminuição observada na afinidade Hb-O2 de HbS e a concomitante falcização de
eritrócitos (Sun et al.
2017). Uma observação estrutural interessante é que os últimos 3-4 átomos de carbono do S1P
ligado não fazem nenhuma interação com o resíduo de Hb, mas ficam no solvente a granel. Esses
átomos de carbono são hipotetizados para mediar as interações hidrofóbicas com cdB3, para também

promover a patogênese da SCD (Sun et al. 2017). Essas descobertas adicionam novos insights
significativos à patologia e fisiologia dos eritrócitos, o que abre caminho para novas intervenções
terapêuticas na DF.
O Efeito Bohr - Dióxido de Carbono, Próton e Cloreto - Para a maioria das hemoglobinas de
mamíferos, a afinidade do heme pelos ligantes depende do pH ambiente (efeito Bohr), devido a
perturbações estruturais terciárias (Shibayama e Saigo 2001; Yonetani et al. 2002; Yonetani e
Tsuneshige 2003; Yonetani e Kanaori 2013), bem como o equilíbrio entre as estruturas quaternárias
T e R (Perutz 1972a, b; Perutz et al. 1998). Em 1904, o CO2 foi descoberto por Christian Bohr para
diminuir a afinidade de oxigênio da Hb, permitindo a entrega eficiente de oxigênio aos tecidos (Bohr
et al. 1904). No tecido, onde a concentração de CO2 é alta, sua conversão em carbamato e/ou
bicarbonato libera íons de hidrogênio que, por sua vez, baixam o pH, fazendo com que a afinidade de
oxigênio da Hb diminua. Max Perutz e outros propuseram uma base molecular para este efeito de
Bohr dependente de prótons que envolve os resíduos C terminal de ambas as cadeias ÿ e ÿ (ÿArg141
e ÿHis146, respectivamente) (Perutz 1976; O'Donnell et al. 1979; Mozzarelli et al., 1991; Kavanaugh
et al., 1992; Perutz et al.
1993, 1994, 1998; Bettati e Mozzarelli 1997; Bettati et al. 1998; Safo e Abraham 2005; Jenkins et ai.
2009; Safo et ai. 2011). Em pH alto na Hb desoxigenada, ÿHis146 faz interações intra-subunidade e
ponte salina inter-subunidade com ÿAsp94 (Fig. 14.3b) e ÿLys40, enquanto ÿArg141 também participa
de interações de ponte salina inter-subunidades separadas com ÿLys127 e ÿAsp126 (Fig. . 14.9).
Essas interações estabilizam a estrutura T de baixa afinidade, consequentemente, facilitando a
liberação de O2 . Em pH baixo, especialmente nos tecidos, essas interações ponte-sal são quebradas
(Figs. 14.3b e 14.9), o que aumenta a mobilidade de ÿArg141 e ÿHis146, facilitando a transição T ÿ R
e, consequentemente, aumentando a afinidade da Hb com o oxigênio. Outros resíduos, como ÿVal1,
ÿHis122, ÿHis2, ÿLys82, ÿHi143, também são conhecidos por contribuir para o efeito Bohr através da
ligação de prótons ligada à desoxigenação (Perutz et al. 1969; Kilmartin et al. 1978; Perutz 1983;
Lukin e Ho 2004 ; Berenbrink 2006).
O excesso de resíduos carregados positivamente, como ÿVal1 e ÿLys82 na cavidade central da

água, repelem-se mutuamente, aumentando a energia livre da Hb (Bonaventura et al. 1994; Perutz
et al. 1998). Os íons cloreto contribuem para o efeito Bohr neutralizando essas cargas positivas para
estabilizar a Hb (Perutz et al. 1993, 1994; Fronticelli et al. 1994). Mais íons cloreto são encontrados
na cavidade de água central de estrutura T maior quando comparada à cavidade de água central de
estrutura R menor, levando a uma maior estabilização do estado T com concomitante diminuição da
afinidade de oxigênio da Hb. Várias histidinas localizadas na superfície da Hb também foram sugeridas
para contribuir para o efeito Bohr (Busch e Ho 1990; Sun et al. 1997). Para uma discussão mais
detalhada do efeito Bohr, o leitor pode consultar um artigo de revisão de Mairbäurl & Weber (2012).
A contribuição para o efeito Bohr pelas várias estruturas relaxadas de Hb pode ser diferente devido
a diferenças terciárias e quaternárias óbvias. Nas estruturas R, R3 e RR3, ÿHis146 é altamente
desordenado, enquanto nas estruturas RR2 e R2, esse resíduo é resolvido devido à proximidade
dos dois resíduos ÿHis146 relacionados à simetria que interagem entre si (Fig. 14.3b) (Silva et al.
1992; Safo e Abraham 2005; Jenkins et al. 2009; Safo et al. 2011), levando Arnone e colaboradores
a sugerirem que a contribuição de ÿHis146 para o efeito Bohr é diferente nos estados R e R2 (Silva
et ai. 1992).

Moduladores Exógenos
Moduladores Mudando o Equilíbrio Alostérico para a Baixa Afinidade de O2—Uma

importância fundamental da alosteria de Hb é aproveitá-la para desenvolver terapêutica para doenças.
A descoberta do 2,3-BPG levou à busca de efetores sintéticos de Hb para o tratamento de doenças
isquêmicas. Um dos primeiros compostos a serem estudados foi o inositol hexafosfato (IHP) (Fig. 14.6),
que se liga de forma semelhante ao 2,3-BPG à fenda ÿ da Hb desoxigenada e mostrou ser 1000 × mais
potente que o 2,3 -BPG na diminuição da afinidade da Hb pelo oxigênio (Yonetani et al. 2002). IHP tem
perfil de absorção limitado para uma aplicação terapêutica útil (Stucker et al. 1985; Biolo et al. 2009).
No entanto, tem sido benéfico na investigação das propriedades alostéricas da Hb. Análogos do IHP,
como o trispirofosfato de mioinositol, que são capazes de atravessar a membrana dos eritrócitos,
demonstraram aumentar a capacidade de exercício em camundongos com insuficiência cardíaca grave
(Biolo et al. 2009).
Os propionatos são uma classe de efetores sintéticos que também induzem baixa afinidade ao O2
ligando-se à Hb e estabilizando o estado T. Exemplos desses compostos incluem a droga antilipidêmica
bezafibrato (BZF) e vários de seus derivados de ureia (L35, L345, LR16) (Abraham et al. 1983a; Perutz
e Poyart 1983; Lalezari et al. 1988, 1990; Shibayama et al. 2002 ). ; Yokoyama et al. 2006 ), RSR-13 e
vários de seus derivados (KDD3-138, RSR-40, RSR-4, TB-27, etc.) (Fig. 14.10); O último grupo de
compostos foi descoberto e estudado por Abraham e colaboradores (Randad et al. 1991; Wireko et al.
1991; Abraham et al. 1992b; Khandelwal et al. 1993; Phelps Grella et al. 2000; Safo et al. . 2000). .
2001, 2002a; Youssef et al.
2002). Esses compostos, ao contrário do IHP ou do 2,3-BPG, exercem sua atividade alostérica em
parte pela ligação ao meio da cavidade central da água da Hb desoxigenada. O RSR-13 (também
conhecido como Efaproxiral), o propionato mais conhecido, foi originalmente sintetizado para imitar os
efeitos alostéricos vistos pela primeira vez com BZF, mas com menos ligação às proteínas no soro
(Randad et al. 1991; Abraham et al. 1992b). O modo de interação atômica dos propionatos com a Hb
desoxigenada é muito semelhante. As estruturas de cristal de raios-X indicaram que um par de RSR-13
forma interações não covalentes com três subunidades do tetrâmero de Hb desoxigenado dentro da
cavidade de água central de uma forma relacionada à simetria (Fig. 14.11a), efetivamente estabilizando
o estado T da transição para o estado R e, assim, reduzindo a afinidade de Hb para O2
(_S1_Reference188Wireko et al. 1991; Abraham et al. 1992a; Safo et al. 2001). Cada molécula de
RSR-13 faz ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas com duas subunidades ÿ e uma subunidade
ÿ da proteína. Suas interações específicas com a proteína são ilustradas na Fig. 14.11b (Safo et al.
2001). Os efeitos alostéricos do RSR-13 são aditivos aos do 2,3-BPG, uma vez que os compostos
possuem sítios de ligação de Hb distintos (Laberge et al. 2005).
O RSR-13 foi submetido a testes pré-clínicos em condições induzidas por hipóxia e isquemia, bem
como testes humanos em estágio avançado como adjuvante para aumentar os efeitos induzidos por
O2 durante a radiação de todo o cérebro (Abraham et al. 1992b; Khandelwal et al. 1993; Pagel et al.
1998; Woods et al. 1998; Kleinberg et al. 1999; Shaw et al. 2003).
Além de suas interações com Hb desoxigenada como descrito acima para RSR-13, BZF e L35 também
se ligam à cavidade central de água e/ou superfície de Hb ligando próximo ao ÿ-heme (na forma do
clássico R), que impedem estericamente o acesso do ligante ao heme (Shibayama et al. 2002; Chen et
al. 2005; Yokoyama et al. 2006).

Claramente, esses efetores são capazes de se ligar tanto à Hb ligada quanto à desoxigenada, e seu
efeito regulador na alosteria da Hb parece resultar de suas interações com ambas as formas de Hb.
O grupo de Safo desenvolveu recentemente novas pró-drogas de liberação de óxido nítrico (NO)
de derivados de RSR-13 anexando as porções de liberação de NO nitrooxietil, nitrooxipropil e 1-
(pirrolidin-1-il)diazen-1-ium-1,2-diolato, respectivamente, ao carboxilato de RSR-13 (Xu et al. 2015).
Estudos cristalográficos com os pró-fármacos mostraram RSR-13, o produto da hidrólise dos pró-
fármacos ligados à cavidade de água central da Hb desoxigenada (como descrito acima) que explicou a
capacidade desses compostos de diminuir a afinidade da Hb pelo oxigênio (Xu et al.
2015). Além disso, o NO liberado foi observado exclusivamente ligado aos dois ÿ hemes, o que foi
sugerido ser devido ao RSR-13 diminuir a afinidade da proteína pelo ligante nos ÿ hemes (Xu et al.
2015).
Ácidos ariloxialcanóicos são outra classe de compostos de deslocamento para a direita que se
ligam não covalentemente à Hb (Omar et al. 2016). O efeito desses compostos na afinidade de oxigênio
da Hb depende do local de interação. Os ácidos ariloxialcanóicos que se ligam à bolsa hidrofóbica ÿTrp14
da Hb demonstraram aumentar a afinidade pelo oxigênio, enquanto aqueles que se ligam à cavidade
aquosa central da proteína para estabilizar o estado T na maioria dos casos mostraram o efeito oposto
de diminuir a afinidade da proteína pelo oxigênio. (Abraham et ai. 1982, 1983b, 1984; Patwa et ai. 1987;
Mehanna e Abraham 1990).
Recentemente, uma campanha de triagem de alto rendimento identificou IRL-2500 (Fig. 14.12a),
um peptídeo sintético, que diminuiu a afinidade da Hb por O2 (Goldstein et al. 2018). Estudos estruturais
com Hb desoxigenada mostraram que este composto se sobrepõe ao sítio de ligação de 2,3-BPG na
fenda ÿ, engajando-se em ligações de hidrogênio diretas e mediadas por água, bem como interações
hidrofóbicas com os resíduos da fenda ÿ de ÿHis2, ÿLys82 , ÿAsn139 e ÿHis143 (Fig. 14.12b), que
fornecem interações adicionais através da interface de duas subunidades ÿ de Hb desoxigenada, levando
a uma maior estabilização do estado T (Goldstein et al. 2018).
Moduladores Mudando o Equilíbrio Alostérico para a Afinidade Alta-O2 – Vários compostos

sintéticos e naturais também foram mostrados, na maioria dos casos, ligando-se covalentemente à Hb
para mudar o equilíbrio alostérico para o estado R e aumentar a afinidade do oxigênio da proteína. Alguns
destes compostos foram clinicamente avaliados como agentes anti-falciformes para o tratamento da
doença falciforme, uma vez que as moléculas de Hb falciforme de alta afinidade para O2 são resistentes
à formação de polímeros.
Os aldeídos aromáticos (Fig. 14.13), os efetores mais bem estudados, interagem com a Hb e
aumentam a afinidade da proteína pelo oxigênio. O agente aromatizante de alimentos vanilina foi um
dos primeiros a ser estudado (Fig. 14.13) (Zaugg et al. 1977; Abraham et al. 1991). Embora
relativamente não tóxico, sua biodisponibilidade limitada e a grande dose necessária para aumentar
a afinidade da Hb pelo oxigênio e induzir efeitos terapêuticos anti-falciformes in vivo não foram
clinicamente aceitáveis.
Furfural e vários de seus análogos, como 5-hidroximetil-2-furfural (5-HMF) (Fig.

14.13) (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al. 2005; Xu et al. 2017).

interagem com a Hb e aumentam sua afinidade pelo oxigênio. O 5-HMF mostrou melhora farmacológica
significativa em relação à vanilina tanto in vitro quanto in vivo e foi posteriormente estudado em ensaios
clínicos de fase II para o tratamento de SCD (Abdulmalik et al. 2005; Stern et al. 2012; Kato et al.
2013). O estudo foi encerrado devido em parte ao problema de biodisponibilidade in vivo. No entanto, o
estudo do 5-HMF ajudou a desencadear um aumento dramático no interesse comercial no desenvolvimento
de medicamentos para DF que apresentam um mecanismo de ação semelhante. É importante notar que
antes dos estudos de 5-HMF, o mecanismo de ação anti-falciforme dos aldeídos aromáticos foi sugerido
como sendo devido à ligação à Hb desoxigenada e desestabilização do estado T e/ou ligação à Hb ligante
e estabilização do estado R clássico. Beddell e outros 1984; Abraham e outros 1991; Wireko e Abraham
1991). Safo e colaboradores, no entanto, mostraram que mecanicamente, 5-
HMF e outros aldeídos aromáticos anti-falciformes aumentam a afinidade da Hb pelo O2 ligando-se à
estrutura R2 e não ao T ou R clássico como proposto (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al. 2005, 2011;
Xu et al. 2017; Pagare et al. 2018; Deshpande et al. 2018).
Duas moléculas dos aldeídos aromáticos ligam-se de forma simétrica na fenda ÿ da estrutura R2, cada
molécula formando interação de base de Schiff entre sua porção aldeído e o nitrogênio ÿVal1 N-terminal
da Hb, e por meio de hidrogênio- ligações e/ou interações hidrofóbicas unem as duas subunidades ÿ e
restringem a transição para o estado T (Fig. 14.14) (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al. 2005, 2011; Xu et
al. 2017; Pagare et al. . 2018; Deshpande et al. 2018).
Para melhorar a potência de deslocamento à esquerda da vanilina e do 5-HMF e, portanto,

suas atividades anti-falciforme, vários derivados desses compostos principais foram desenvolvidos.
Derivados de 5-HMF incorporam diferentes substituintes na fração álcool de 5-HMF para interações
adicionais com a proteína, o que levou a um aumento significativo em sua atividade alostérica, traduzindo-
se em efeitos anti-falciformes 1,5-4,0 vezes maiores do que 5-HMF (Xu et al. 2017).
Vários grupos também embarcaram na modificação estrutural da vanilina para efetores alostéricos
de alta afinidade para O2 mais potentes. Alguns desses novos compostos incluem derivados de piridil
de benzaldeídos que foram estudados por Safo e colegas e demonstraram exibir várias vezes a
potência de deslocamento à esquerda sobre a vanilina (Nnamani et al. 2008; Abdulmalik et al. 2011;
Pagare et al. 2018 ; Deshpande et al. 2018). As estruturas cristalinas de alguns desses compostos,
como SAJ-310, INN-312, INN-298 e TD-7 (Fig. 14.13) complexados com Hb foram elucidadas (Abdulmalik
et al. 2011; Pagare et al. 2018 ; Deshpande et al. 2018) e mostram que os compostos se ligam de forma
semelhante à estrutura R2, conforme observado com 5-HMF. De notar é que a ligação covalente entre
o aldeído e o ÿVal1 N forçou as moléculas com
meta grupo metoxi-piridina posicionado, tal como em INN-298 para direcionar
a cavidade central de água (Fig. 14.15), enquanto aqueles orto metoxipiridina posicionado para baixo,
com INN-312 ou TD-7 estão dispostos em direção à boca da cavidade ÿ (Fig. 14.16)
(Abdulmalik et al. 2011; Pagare et al. 2018; Deshpande et al. 2018). O último grupo de compostos
faz interações com a ÿF-hélice exposta ao solvente para exibir um segundo mecanismo anti-
falciforme de desestabilização direta do polímero que é independente do mecanismo primário de
aumento da afinidade de HbS-O2 (Pagare et al. 2018; Deshpande et al. 2018 ). A ÿF-hélice demonstrou
desempenhar um papel importante na estabilização do polímero, e acredita-se que sua perturbação
desestabiliza o polímero (Safo et al. 2004, 2011; Abdulmalik et al.
2011). De acordo com esta hipótese, a variante de Hb Stanleyville (ÿAsn78ÿÿLsy78) inibe a polimerização
de HbS (Benesch et al. 1979; Nagel et al. 1980; Rhoda et al. 1983). Quatro selecionar

representantes desses compostos, VZHE-039, PP-6, PP-10 e PP-14, estão atualmente passando
por estudos pré-clínicos in vivo por Safo e colaboradores (Safo, estudos não relatados).
GBT-440 (Voxelotor; Fig. 14.13) é outro análogo de aldeído sintético da vanilina desenvolvido pela
Global Blood Therapeutics, Inc. que também aumenta a afinidade de oxigênio da Hb estabilizando o
estado relaxado (Oksenberg et al. 2016; Metcalf et al. 2017 ). GBT-440 se liga de forma semelhante ao
ÿVal1 N-terminal de uma das cadeias ÿ da estrutura R2, mas por causa da
substituinte pirazol volumoso, uma segunda molécula é impedida de se ligar à cadeia ÿ oposta,
resultando em uma única molécula GBT-440 ligada por tetrâmero de Hb, que contrasta com a
estequiometria 2:1 observada de outros aldeídos aromáticos anti-falciformes (Fig. 14.17) .
GBT-440 está atualmente sendo estudado em ensaios clínicos de fase III para o tratamento de
SCD (NCT03036813) (Oksenberg et al. 2016; Metcalf et al. 2017, p. 440; Vichinsky et al. 2019).
A triagem de alto rendimento de uma pequena biblioteca de moléculas identificou efetores

contendo tiol de hemoglobina, TD-1 e TD-3 (Fig. 14.18) (Nakagawa et al. 2014, 2018). Esses
compostos, ao contrário dos aldeídos aromáticos, agem via formação de ligação dissulfeto covalente
com ÿCys93 de Hb desoxigenada que inibe a formação de ponte salina no estado T entre ÿAsp94 e
ÿHis146, deslocando o equilíbrio para o estado relaxado e aumentando a afinidade da Hb pelo oxigênio
(Fig. 14.19a ) (Nakagawa et al. 2014, 2018). Os compostos também se ligam às estruturas R e/ou R3
que estabilizam o estado relaxado, contribuindo para o aumento da afinidade pelo oxigênio da Hb (Fig.
14.19b) (Nakagawa et al. 2014, 2018).
Efetores alostéricos que visam o mesmo local, mas induzem mudanças de equilíbrio opostas
Acima, descrevemos vários aldeídos aromáticos que aumentam a afinidade do oxigênio da Hb

formando interação da base de Schiff com o nitrogênio da Hb ÿVal1 na fenda ÿ. No entanto, nem
todos os adutos à base de Schiff ÿVal1 com aldeídos aromáticos resultam em aumento da afinidade
da Hb pelo oxigênio. O grupo de Abraham testou vários efetores de mono-aldeído-ácido de Hb, como 5-
FSA, 2-BF e 2-PEF (Fig. 14.20), que foram hipotetizados para produzir uma Hb de alta afinidade para
O2 (Abraham et al. 1995). Inesperadamente, esses compostos mostraram o efeito oposto ao reduzir a
afinidade da Hb pelo oxigênio, apesar de formar interação da base de Schiff com o nitrogênio da Hb
ÿVal1. A análise estrutural mostrou que, devido ao substituinte carboxilato no anel benzênico (em relação
ao aldeído), esses compostos se ligam preferencialmente à fenda ÿ da Hb desoxigenada, onde formam
interação da base de Schiff com nitrogênio ÿVal1, bem como uma interação inter- interação da ponte
salina da subunidade entre o carboxilato e o grupo guanidínio do ÿArg141 oposto da Hb, fornecendo
restrições adicionais ao estado T (Fig. 14.21)
(Abraham et ai. 1995). A estrutura R2 não tem ÿArg141 na posição correta para fazer tal interação
da ponte salina com o carboxilato dos compostos, enquanto as estruturas R, RR2 e R3 impedem
estericamente a ligação em suas respectivas fendas ÿ. A remoção do carboxilato dos compostos anula
a interação ÿArg141 na estrutura T desoxigenada, resultando nessas moléculas ligando-se
preferencialmente à Hb ligando na forma de estrutura R2, como observado com vanilina e vários de
seus análogos (Abdulmalik et al. 2011; Pagare et al. . 2018; Deshpande et al. 2018). No entanto, esses
aldeídos aromáticos não carboxilatos ainda se ligam à Hb desoxigenada, embora significativamente
mais fracos devido à falta de interações fortes entre subunidades (Safo et al. 2004; Abdulmalik et al.
2011). Além disso, a ligação à Hb desoxigenada não parece contribuir para a estabilidade do estado T,
mas

em vez disso, desestabiliza-o ainda mais, substituindo um íon cloreto estabilizador do estado T na
cavidade central da água (Safo et al. 2004).
O resultado cristalográfico com os compostos monoaldeído-ácido levou Abraham et al. para projetar derivados
dialdeído-ácido adicionando um segundo aldeído aromático na posição para do primeiro aldeído, como
compostos TB (Fig. 14.20), que se esperava formar um segundo aduto de base de Schiff com ÿLys99 do ÿ
oposto -subunidade para restringir ainda mais a estrutura T (Boyiri et al. 1995). Diferentes classes desses
compostos foram sintetizadas que mostraram um aumento de várias vezes na redução da afinidade da Hb pelo
oxigênio em comparação com os análogos de monoaldeído (Boyiri et al. 1995). Estudos cristalográficos com os
compostos dialdeídos mostraram um par de compostos ligados à Hb desoxigenada conforme planejado (Boyiri
et al. 1995). O primeiro aldeído fez uma interação da base de Schiff com o nitrogênio ÿ1Val1, enquanto o
segundo aldeído fez uma interação da base de Schiff entre as subunidades com a amina do ÿ2Lys99. A fração
meta-carboxilato engajou em uma interação de ponte salina inter-subunidade com ÿ2Arg141 semelhante aos
compostos mono-aldeído-ácido de origem. No geral, essas interações forneceram estabilização adicional ao
estado T, reduzindo ainda mais a afinidade de oxigênio da Hb. Vale a pena notar que os efetores com as pontes
mais curtas exibiram o efeito mais potente, sugerindo que, quanto mais apertadas as duas subunidades ÿ são
mantidas juntas, maior o grau de restrição na estrutura T. Tais reticulantes covalentes de subunidades de Hb,
com otimização adicional da permeabilidade celular, têm potencial para serem usados como substitutos de
sangue à base de Hb isentos de células.
Observações Finais
A Hb é uma molécula fascinante que nunca deixa de surpreender os cientistas. Ajudou a moldar nossa
compreensão de uma das teorias mais complexas da biologia molecular, que é a alosteria, embora ainda não
tenha sido totalmente desvendada. Os avanços notáveis em técnicas de biologia estrutural, como microscopia
crio-eletrônica e métodos espectroscópicos resolvidos no tempo, irão, esperançosamente, fornecer mais
vislumbres do fenômeno da alosteria de Hb. Neste capítulo, fornecemos uma visão geral da estrutura molecular
da Hb, relacionada à sua função primária de transporte de oxigênio. Discutimos o conceito de alosteria e os
diferentes modelos que foram propostos ao longo dos anos para explicar esse fenômeno. É claro que a função
de transporte de oxigênio da Hb envolve um conjunto de estados, embora suas funções específicas,
especialmente os estados relaxados, ainda não sejam totalmente compreendidas. Finalmente, fornecemos uma
visão geral dos mecanismos moleculares de como as diferentes variantes de Hb, bem como os efetores
modulam a propriedade de ligação ao oxigênio da Hb, e o esforço que está sendo feito para aproveitar o último
para a terapêutica.
Esses efetores alostéricos, dependendo de seu modo de interação com T ou Hb relaxada, podem diminuir ou
aumentar a afinidade da Hb pelo oxigênio, sendo o último útil para o tratamento da doença falciforme e o
primeiro para condições induzidas por hipóxia e isquemia. De interesse é que a fenda ÿ das estruturas T e R2
da Hb agem como sumidouros para aldeídos aromáticos, e a ligação preferencial à fenda ÿ T ou R2 pode ter
um efeito profundo na afinidade do oxigênio da Hb, dando origem a um novo entendimento de que um efetores
alostéricos podem se ligar ao mesmo sítio, mas produzem efeitos alostéricos opostos. Esses estudos
descobriram papéis cruciais desempenhados por vários resíduos de Hb, como ÿVal1, ÿLys99, ÿArg141, G
hélice, resíduos de hélice F na modulação da alosteria de Hb.

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24837436]

Fig. 14.1.
Curva de equilíbrio de oxigênio da Hb. O valor normal de P50 é indicado por linhas tracejadas. O deslocamento para a
esquerda e o deslocamento para a direita nas curvas são coloridos em vermelho e azul, respectivamente

Fig. 14.2.
Estrutura cristalina da hemoglobina. a Estrutura quaternária geral da Hb com as duas cadeias
ÿ e ÿ coloridas em cinza e castanho, respectivamente. b Estrutura da Hb oxigenada (estado R)
(magenta) sobreposta à estrutura da Hb desoxigenada (estado T) (azul). Observe a maior
cavidade central de água na estrutura T

Fig. 14.3.
Estruturas sobrepostas de T (azul), R (magenta), R3 (amarelo), RR2 (verde), R2 (preto) e RR3
(salmão) em seus dímeros ÿ1ÿ1 . a Transições entre os diferentes estados levam a mudanças
significativas (movimento de deslizamento) nas regiões de comutação da interface do dímero ÿ1ÿ2 .
b As transições do estado T para os estados relaxados quebram um estado T estabilizando a
interação da ponte salina entre ÿAsp94 e ÿHis146. Nas estruturas R2 e RR2, ÿ1His146 faz contato
próximo com ÿ2His146, enquanto nas outras estruturas relaxadas, ÿHis146 torna-se altamente
desordenado. Há também uma diminuição significativa no tamanho da fenda ÿ das estruturas relaxadas
em comparação com a estrutura T

Fig. 14.4.
Estruturas ÿ heme superpostas de R (magenta), R3 (amarelo), RR2 (verde), R2 (preto) e RR3
(salmão) mostrando as posições de ÿHis63. Observe a rotação de ÿHis63 para fora da bolsa distal
na estrutura RR3, criando um canal de ligante para o solvente em massa, enquanto nas estruturas
R, RR2 e R2, ÿHis63 ainda está localizado na bolsa fazendo interação por ligação de hidrogênio
com o ligante. A estrutura R3 mostra um canal ligante parcialmente aberto

Fig. 14.5.
Representação esquemática da via alostérica proposta entre os diferentes estados de Hb

Fig. 14.6.
Estruturas químicas de IHP, 2,3-BPG e S1P

Fig. 14.7.
Ligação de 2,3-BPG (roxo) na fenda ÿ da Hb. As subunidades ÿ estão coloridas em cinza e as subunidades
ÿ estão coloridas em castanho

Fig. 14.8.
Ligação de S1P (roxo) na superfície da Hb desoxigenada. As subunidades ÿ estão coloridas em
cinza e as subunidades ÿ estão coloridas em castanho. Observe que o S1P só se liga à superfície
da proteína quando o 2,3-BPG se liga à fenda ÿ

Fig. 14.9.
Estruturas sobrepostas de T (azul), R (magenta), R3 (amarelo), RR2 (verde), R2 (preto) e RR3
(salmão) em seus dímeros ÿ1ÿ1 . ÿArg141 participa da interação da ponte salina entre subunidades
com ÿAsp126 (assim como ÿLys127—não mostrado) na Hb desoxigenada estabilizando o estado T
de baixa afinidade e facilitando a liberação de O2 . Em pH mais alto, essa interação é quebrada
aumentando a mobilidade de ÿArg141, o que facilita a transição T ÿ R, e aumenta a afinidade da Hb
com o oxigênio

Fig. 14.10.
Estruturas químicas de BZF (e derivado L35) e RSR-13 e derivados (RSR-4 e TB-27)

Fig. 14.11.
a Ligação de um par de RSR-13 (roxo) na cavidade central de água desoxigenada (estado T)
Hb. b Interações detalhadas entre uma das moléculas de RSR-13 e a proteína. A outra molécula
faz interações relacionadas à simetria semelhantes. As duas subunidades ÿ são de cor cinza,
enquanto a subunidade ÿ é de cor castanha

Fig. 14.12.
a Estrutura química de IRL-2500. b Ligação de IRL-2500 (roxo) na fenda ÿ de Hb. As subunidades ÿ
estão coloridas em cinza e as subunidades ÿ estão coloridas em castanho

Fig. 14.13.
Estruturas químicas de aldeídos aromáticos anti-falciformes de alta afinidade para O 2

Fig. 14.14.
Ligação de 5-HMF (roxo) de uma forma relacionada à simetria na Hb da fenda ÿ. As subunidades ÿ estão
coloridas em cinza e as subunidades ÿ estão coloridas em castanho. As moléculas de água são esferas vermelhas

Fig. 14.15.
a Ligação de INN-298 (roxo e ciano) de forma relacionada à simetria na Hb da fenda ÿ.
Ao contrário da maioria dos aldeídos aromáticos, quatro moléculas de INN-298 se ligam por uma
molécula de Hb. As moléculas em roxo fazem interações de base de Schiff com nitrogênio ÿVal1
(primário), enquanto as moléculas em ciano (secundário) se ligam de forma não covalente e
significativamente mais fraca. b Interações detalhadas de duas das moléculas INN-298meta
(roxo e ciano)
com Hb. O grupo metoxi-piridina posicionado do INN-298 ligado primário dispõe mais abaixo da
cavidade central de água

Fig. 14.16.
Ligação de INN-312 (roxo) de forma simétrica na fenda ÿ de Hb. As subunidades ÿ
são coloridas em cinza. O grupoorto
metoxi-piridina
à superfícieposicionado
da Hb para se
fazer
dispõe
interação
em direção
com o
resíduo ÿF-hélice de Pro77

Fig. 14.17.
Ligação de GBT-440 (roxo) na Hb da fenda ÿ. As subunidades ÿ estão coloridas em cinza e as subunidades
ÿ estão coloridas em castanho. Ao contrário de outros efetores de aldeído, apenas uma molécula de
GBT-440 se liga por uma molécula de Hb

Fig. 14.18.
Estruturas químicas de agentes contendo tiol anti-falciforme

Fig. 14.19.
Estrutura cristalina de TD-3 em complexo com estruturas T e R, onde TD-3 forma ligação
dissulfeto com átomo de enxofre ÿCys93. As subunidades ÿ e ÿ da Hb são mostradas em cinza
e castanho, respectivamente. a A ligação de TD-3 com ÿCys93 em Hb desoxigenada leva à
ruptura da interação da ponte salina estabilizadora do estado T entre ÿAsp94 e ÿHis146. b A
ligação de TD-3 na Hb CO-ligada (estrutura R) previne a possível interação entre ÿAsp94 e
ÿHis146 que é necessária para mudar a transição alostérica para o estado T

Fig. 14.20.
Estruturas químicas de aldeídos aromáticos de deslocamento para a direita (baixa afinidade para O 2 )

Fig. 14.21.
(A) Estruturas cristalinas de Hb desoxigenada em complexo com a molécula mono-
aldeído-ácido de 5-FSA

Hemoglobina - Subcell Biochem 2020

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Hemoglobina: Estrutura, Função e Alosteria

Departamento de Química Medicinal, Escola de Farmácia, Virginia Commonwealth University,

Instituto de Biologia Estrutural, Descoberta e Desenvolvimento de Medicamentos, Virginia Commonwealth

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Hemoglobina; Alostério; Efetores alostéricos; estado T; Estado relaxado; afinidade de oxigênio;

Ahmed et ai. Página 2

Estrutura e Função da Hemoglobina

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Ahmed et ai. Página 3

Modelos alostéricos de hemoglobina

hemoglobina Os primeiros são o Monod-Wyman-Changeux (MWC) de dois estados e o

No entanto, as estruturas da Hb ligada a O2 ou CO são muito semelhantes. Com base nessas

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Hb no estado T (através da introdução de ligantes em cristais de Hb desoxigenados na presença do efetor

Vários estados que se encontram ao longo da transição de T para R

Bioquímica de Subcélulas. Manuscrito do autor; disponível no PMC 2020 em 20 de julho.

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colocaram mais próximo do estado R.

Estrutura de Hb totalmente ligada presa em uma conformação tensa

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Estados multirrelaxados além da transição T ÿ R

Curiosamente, a transição T ÿ R2 (rotação/translação de ~23°/3,1 Å) e a transição T ÿ RR2

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O argumento para atribuir a estrutura R2 como o estado relaxado fisiologicamente relevante e

A existência de estados multirrelaxados de Hb é ainda mais apreciada quando se considera

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2008). É interessante notar que o tamanho da fenda ÿ na estrutura R é significativamente maior do

Variantes de hemoglobina com afinidade de oxigênio alterada

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induzida por hipóxia (Poillon et al. 1986).

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A Hb Rothschild é caracterizada por uma mutação (ÿTrp37Arg) na região de dobradiça da interface

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oxidação causando precipitação e a formação de inclusões insolúveis chamadas corpos de Heinz

2,3-Bisfosfoglicerato (2,3-BPG)-2,3-Bisfosfoglicerato (Fig. 14.6) desempenha um papel central

Esfingosina-1-Fosfato (S1P)-S1P (Fig. 14.6) é uma importante molécula de sinalização que é

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O excesso de resíduos carregados positivamente, como ÿVal1 e ÿLys82 na cavidade central da

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Moduladores Mudando o Equilíbrio Alostérico para a Baixa Afinidade de O2—Uma

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Ahmed et ai. Página 15

Moduladores Mudando o Equilíbrio Alostérico para a Afinidade Alta-O2 – Vários compostos

Furfural e vários de seus análogos, como 5-hidroximetil-2-furfural (5-HMF) (Fig.

Bioquímica de Subcélulas. Manuscrito do autor; disponível no PMC 2020 em 20 de julho.

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Para melhorar a potência de deslocamento à esquerda da vanilina e do 5-HMF e, portanto,