Aula Prática

Testes Bioquímicos
para identificação de
bactérias

São Carlos, 24 de Junho de 2020

 Identificação de bactérias

Coloração simples, diferenciais ou estruturais, Tais métodos não

mesmo combinadas com diferentes cultivos, não são, revelam a fisiologia ou a
geralmente, suficientes para identificação de filogenia das células
bactérias
Testes Bioquímicos

Classificação das bactérias segundo tipo de metabolismo e atividade enzimática

Combinado com outras

técnicas, tais como os
testes bioquímicos, que
permitem a identificação de
bactérias, de acordo com suas
propriedades metabólicas que
são únicas para cada espécie.
Testes Bioquímicos

Meios de Cultura

Favorece o crescimento de alguns

Seletivo organismos, mas suprime o crescimento
de outros.

Possui um constituinte que causa uma

Diferencial mudança observável no meio quando
ocorre uma reação bioquímica específica.

Contém nutrientes especiais que

Enriquecimento favorecem o crescimento de um
organismo específico.
Testes Bioquímicos
 Classificação das bactérias em relação às suas características bioquímicas:

Diferentes vias metabólicas para Ex: Fermentação e Respiração

obtenção de energia

Enzimas específicas utilizadas

no processo de metabolização Ex: Enzimas Triptofanase e Catalase
de diferentes substratos

•Formação de produtos
específicos nas reações Ex: Ácidos estáveis e Indol
catabólicas
Resultados de Testes Bioquímicos

Resultados
expressos como
positivo (+) ou
negativo (-)

Identificação da
bactérias de
acordo com suas
características já
pré-estabelecidas
Atividade Prática: Execução de 5 testes bioquímicos:
1. Fermentação de carboidratos

2. Produção de indol

3. Hidrólise do amido

4. Teste de oxidação e fermentação

5. Teste da catalase
1. Fermentação de carboidratos
Forma de catabolismo anaeróbio, no qual um composto orgânico é um
doador de elétrons e um aceptor de elétrons

Utilizado para identificação de

bactérias entéricas

• Bacilos Gram negativos;

• Aeróbios facultativos;
• Exigência nutricional simples (fermentadores de açúcares);
• Podem ser patogênicos ao homem, animais e plantas;
• Importância industrial.
1. Fermentação de carboidratos
Aplicação do teste é válido pois existem características que
permitem distinguir vários gêneros de bactérias entéricas

Tipo e proporção de produtos de fermentação

3 ácidos são formados em  Bactérias Entéricas

Fermentação
quantidades significativas:
Ácido-Mista acético, láctico e succínico Fermentação
Escherichia
Salmonella
Ácida Mista
Proteus

Enterobacter
Quantidades menores de Fermentação

Fermentação ácidos são formadas, sendo

do Butanodiol Klebsiella
Serratia
Butanodiol butanodiol, etanol, os
principais produtos.
1. Fermentação de carboidratos
a. FERMENTAÇÃO ÁCIDO-MISTA

 Formação de diferentes tipos de ácidos

e etanol;
 CO2 e H2 produzidos na mesma
proporção;

Isto porque o CO2 é produzido somente

do ácido fórmico por meio da enzima
formate hydrogenase

HCOOH  H2 + CO2
1. Fermentação de carboidratos
b. FERMENTAÇÃO DO BUTANODIOL

Reação geral
1. Fermentação de carboidratos

IMPORTANTE
Razões
Ácido : Neutro
CO2 : H2
1. Fermentação de carboidratos

Fermentam com produção de ácidos

A fermentação de
Usa-se meio (fórmico, acético, láctico e succínico) e
carboidratos é
básico contendo gás, até que o pH do meio chegue a
evidenciada pela
Detecção apenas uma cerca de 5,0.
produção de
fonte de Exemplo: E. coli
ácido e/ou gás no
carbono e um
meio de cultura
indicador de pH
em pH neutro. Ocorre conversão em produtos neutros
como 2,3 butanodiol, não provocando
Vermelho redução tão drástica de pH.
de Metila Exemplo: Enterobacter
1. Fermentação de carboidratos

2x Leitura

Incubação à
30°C por 48 h

Meio Clark e Lubs F. de

F. Ácido
Proteose peptona 5g butanodiol
KH2PO4 5g
mista
Glicose 5g
Água destilada 1L
1. Fermentação de carboidratos
Indicador vermelho de metila
Cor amarela: indica pH>5, portanto - para
Leitura fermentação ácido mista. Mas se observar formação
de gases é porque provavelmente ocorreu a
fermentação de butanodiol.

Cor rosa/avermelhado: indica pH<5, portanto + para

fermentação ácido mista (geração de maior
proporção de ácidos)
F. Ácido F. de
mista butanodiol
2. Produção de Indol
Identificar bactérias entéricas que são capazes de degradar o aminoácido
triptofano até indol através da ação enzimática da triptofanase

Hidrolisar o triptofano
com a produção de
indol não é uma
característica de todos
os microrganismo, por
isso pode ser utilizado
como marcador
bioquímico
2. Produção de Indol
2. Produção de Indol
2x
Adição de
0,5 ml do
reagente
Incubar à
30°C por
48 h
de Kovac
+ Leitura
-
Caldo Indol
Triptona 5g
NaCl 2,5 g
Água destilada 1L
3. Hidrólise do amido
Forma linear da
molécula do amido
Forma ramificada da
molécula do amido
O amido juntamente com
a celulose são os dois
polissacarídeos naturais
mais abundantes
O que diferencia estes
polissacarídeos são as
ligações entre as
moléculas de glucose
As enzimas amilase e
oligo-1,6-glicosidase
catalisam a hidrólise
do amido, formando
maltose. A maltose
pode então entrar na
célula, onde é
hidrolisada à glicose
3. Hidrólise do amido
Diferencia bactérias que hidrolisam o amido
Iodo presente na solução é
usado para detectar a
presença ou ausência de
amido na periferia ao redor
do crescimento bacteriano

Iodo reage com o amido e

produz uma coloração azul-
violácea intensa

Zona clara ao redor do

crescimento representa
Leitura resultado positivo para o
teste
 3. Hidrólise do amido
1ª Etapa do experimento
1) Abrir a placa com meio ágar amido próximo ao gramado atrás e a frente do prédio da Eng. Ambiental;
2) Deixar aberto por 10 minutos. Reativo Lugol
5 -10 ml
(contém iodo)
2ª Etapa do experimento

Incubar à 30°C
por 48 h
SE (+) SE (-)

Meio ágar amido

Amido 2g
Na2HPO4 1g
Extrato de carne 10g
NaCl 5g
Agar 15g
Água destilada 1L
3. Hidrólise do amido

AMIDO
+ LUGOL Azul 5 -10 ml
Reativo Lugol
(contém iodo)

DEXTROSE
MALTOSE
GLICOSE + LUGOL Incolor

SE (+) SE (-)
4. Oxidação/Fermentação
Fermentação
CARBOIDRATOS Produtos ácidos

Aerobiamente

O teste de oxidação/fermentação é utilizado para diferenciar

microrganismos que oxidam ou fermentam açúcares específicos e
determina se a bactéria é aeróbia ou anaeróbia facultativa
4. Oxidação/Fermentação Azul de bromotimol
Tubos selados com óleo mineral
(ambiente anaeróbio)

Microrganismos são capazes de

degradar o açúcar
(alteração no pH)

Microrganismos não são

capazes de degradar o açúcar
(sem alteração do pH)
4. Oxidação/Fermentação
Azul de bromotimol

Microrg. Microrg.
Microrg.
capazes de capazes de
capazes de
promover promover
oxidar e
apenas apenas
fermentar
oxidação fermentação
4. Oxidação/Fermentação
Aeróbio Leitura
Rodilhão de
algodão
2X
Incubar à 30°C
por 48 h

Anaeróbio
2 ml de óleo

+ -
mineral

Meio com ágar e azul de

bromotimol
NaCl 5,0g
Peptona 2,5g
Glicose 10g
Ágar 5g
Corrigir o pH para 7,1 Azul de Bromotimol 40ml (solução 1:500)
Água destilada 1000mL
4. Oxidação/Fermentação
5. Catalase
Permite identificar microrganismos produtores da enzima
catalase que protege a célula de formas tóxicas do oxigênio.

A toxicidade do oxigênio para anaeróbios estritos

deve-se a certas moléculas produzidas durante as
reações que envolvem o oxigênio.
 5. Catalase
Reações tóxicas do oxigênio para anaeróbios estritos

Adição de 1 elétron a molécula de oxigênio:

O2 + e- O2- Superóxido Altamente reativos
Superóxidos dão origem: e podem destruir
componentes vitais
2O2- + 2H+ O2 + H2O2 Peróxido de da célula, como o
hidrogênio DNA

O2- + H2O2 O2 + OH- + OH- Hidroxilas

5. Catalase
Reações de proteção dos aeróbios e anaeróbios
facultativos:

Produção de enzimas que eliminam os superóxidos e peróxidos de hidrogênio:

Enzimas
Superóxido
Superóxido O2- dismutase H2O2 Peróxido de hidrogênio
Catalase
H2O2 O2 e H2O
Peroxidase
H2O2 H2O
5. Catalase
Água oxigenada
(3%)

Incubar à
30°C
18-24 h

Ágar nutriente
Água oxigenada reage com a
catalase liberando bolhas de
oxigênio (Catalase +)
 RESUMO GERAL
Fermentação de Produção de Hidrólise de Fermentação/
Carboidratos Indol amido Oxidação Catalase

Degradação do Degradação do
Cor amarela: Detecção da Reação da água
indica pH>5 aminoácido açúcar
triptofano até
presença ou
(alteração no pH) oxigenada com a
ausência de enzima catalase
Cor indol através da
amido na Incapacidade de
avermelhada: ação
periferia ao degradar o
liberando bolhas
indica pH<5 enzimática da de oxigênio
redor do açúcar
triptofanase
crescimento (sem alteração do (Catalase +)
bacteriano pH)

F. Ácido F. de
mista butanediol
+ -Leitura
+ -
Dúvidas???